Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. / Made available in DSpace on 2012-10-17T11:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Este trabalho teve como objetivo o estudo do sistema imune do camarão branco Litopenaeus schmitti, enfatizando as aglutininas/lectinas plasmáticas. O soro apresentou atividade aglutinante contra uma variedade de eritrócitos. Esta atividade caracterizou-se por ser parcialmente dependente de cálcio, termosensível e pouco estável a pH abaixo de 7. A atividade aglutinante não mostrou afinidade por hexoses simples, mas revelarou-se específica para açúcares N-acetilados, em especial o AcNeu. A atividade aglutinante do soro foi também inibida por glicoproteínas contendo ácido siálico, como a fetuína e a BSM. O potencial envolvimento das lectinas no reconhecimento de microorganismos foi investigado, incubando-se o soro com diferentes tipos de LPS e com b-1,3-glicanas. Os LPS de Pseudomonas aeruginosa e de duas diferentes cepas de Escherichia coli (0128:B12 e 0111:B4) foram capazes de inibir a atividade aglutinante do soro. Contudo, as b-1,3-glicanas não causaram nenhuma inibição desta atividade. A atividade aglutinante do plasma de L. schmitti foi isolada através de uma coluna de fetuína-agarose e resultou na purificação parcial de uma lectina presente na hemolinfa (LPP), com massa molecular aparente estimada em 153 kDa, por gel filtração. Sob condições redutoras, LPP par mostrou duas subunidades com massa molecular de 31 e 34 kDa em SDS/PAGE. A atividade aglutinante, cálcio-dependência e especificidade da LPP foram testadas e resultaram num padrão muito semelhante ao obtido para o soro.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Gradução em Aqüicultura. / Made available in DSpace on 2012-10-19T21:57:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O presente trabalho teve por objetivo investigar a ocorrência e o mecanismo de ativação da enzima PO na hemolinfa de 4 bivalves marinhos: o mexilhão Perna perna, a ostra Crassostrea rhizophorae, a lambreta Lucina pectinata e o berbigão Anomalocardia brasiliana, avaliando ainda sua relação com o sistema imune destes animais. Foi observada uma atividade de PO (tipo-lacase) tanto no PL quanto no SLH das 4 espécies, utilizando-se o substrato L-DOPA (3mg/mL) e acompanhando espectrofotometricamente (490nm) a formação de DOPA-cromo. Curiosamente, esta atividade foi muito mais pronunciada em pH alcalino (9,0), do que em pH fisiológico (7,5) para todas as espécies. A confirmação citoquímica da presença de PO nos hemócitos (monocamadas celulares) só mostrou resultados positivos em C. rhizophorae e P. perna. A maior atividade específica da PO foi observada no PL de A. brasiliana e a menor em L. pectinata (460 e 50U/mg proteína, respectivamente). Não houve correlação evidente entre a variação da atividade da PO nestes bivalves e seus hemogramas. Com exceção de A. brasiliana, a PO dos outros bivalves foi induzida por tripsina, sugerindo a ocorrência de uma forma zimogênica proPO. A atividade da PO foi também estimulada pelo detergente SDS mas não por Triton. Por outro lado, componentes da superfície de microrganismos, como LPS e b-glicanas, só induziram a atividade de PO no SLH de C. rhizophorae, deixando pouco claro o papel desta enzima no sistema imune de bivalves. A presença de proteases endógenas, dependentes de cálcio, foi demonstrada na hemolinfa de todos bivalves analisados. Com exceção de A. brasiliana, a atividade destas proteases foi induzida por componentes da superfície microbiana. Os inibidores da PO, PTU e tropolone, foram capazes de inibir especificamente a atividade desta enzima em todos os bivalves. Anticorpos policlonais anti-proPO do inseto Manduca sexta reconheceram especificamente duas bandas protéicas (64 e 66kDa) na hemolinfa dos bivalves estudados (western-blot), sugerindo uma homologia molecular desta enzima com aquela dos insetos. O mecanismo de ativação da PO em bivalves e sua relação com o sistema imune requer ainda elucidação. Este conhecimento torna-se fundamental para estabelecer se esta enzima poderá ser utilizada como parâmetro de saúde em bivalves de interesse para Aquicultura.

Ureases são enzimas que catalisam a hidrólise de ureia para formar amônia e dióxido carbono, sendo produzidas por plantas, fungos e bactérias. A toxina de estudo, Jaburetox, é um peptídeo recombinante derivado de uma das isoformas de urease presentes em Canavalia ensiformis. Esta molécula mostrou toxicidade a insetos de diferentes ordens quando administrada oralmente ou por injeção e, além disso, apresenta atividades antifúngica e bacteriostática, não exibindo efeitos tóxicos para mamíferos, demonstrando um enorme potencial biotecnológico. Em estudos realizados com Rhodnius prolixus, um dos principais vetores da Doença de Chagas na América Latina, observamos que o Jaburetox é capaz de interagir com hemócitos, células do sistema imune. Concomitante a esta interação, também demonstramos que o peptídeo é capaz de induzir a agregação de hemócitos, característica da resposta celular, e também é capaz de aumentar a atividade da fenoloxidase (PO), enzima envolvida na resposta humoral dos insetos. Estes efeitos sugerem que o peptídeo é capaz de ativar o sistema imune dos insetos. Os insetos apresentam somente imunidade inata, sendo esta subdividida em resposta celular e humoral. A resposta celular, mediada por hemócitos, é caracterizada pela fagocitose, agregação e encapsulação de patógenos. Em contraste, a resposta humoral é representada pela produção de peptídeos antimicrobianos, melanização desencadeada pela enzima PO e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Recentemente, outro mecanismo de resposta imune inata tem sido estudado: as armadilhas extracelulares - Extracellular Traps (ETs), sendo bem caracterizadas em mamíferos, porém pouco estudadas em insetos. As ETs são armadilhas de ácidos nucleicos extracelulares associados a proteínas citoplasmáticas, que podem auxiliar na captura e na morte de patógenos. Essa resposta é desencadeada por receptores extracelulares de células granulares que induzem o aumento de Ca2+ intracelular, levando à produção de ROS, que parece ser parte fundamental para liberação dos ácidos nucleicos, permitindo com que estes passem para o citoplasma e associem-se com as proteínas. O presente estudo tem como objetivo avaliar o papel de ácidos nucleicos extracelulares na resposta imune e na proteção contra o peptídeo entomotóxico Jaburetox. As respostas imunológicas foram avaliadas por meio da contagem de agregados, através de hemocitômetro, e por ensaio colorimétrico para dosar alterações da resposta humoral, 6 e 18 h após injeção de Jaburetox e/ou RNA extracelular (RNAet). A liberação de RNA e DNA foi avaliada 6 h pós injeção de tratamentos para ensaios in vivo e 1 h pós incubação para ensaios in vitro, através do kit Qubit RNA HS e Qubit dsDNA HS. Para avaliar a liberação de ROS e viabilidade celular, realizamos culturas de hemócitos, que foram tratados por 24 h com Jaburetox. Por fim, avaliamos a imunocompetência dos insetos após tratamentos com Jaburetox, RNAet ou Jaburetox + RNAet e desafiamos o inseto contra uma bactéria patogênica. A hemolinfa dos insetos foi coletada e unidades formadoras de colônia foram mensuradas pelo método de drop-plate. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o RNAet é capaz de ativar as defesas do organismo, tanto celular quanto humoral e, quando associado à toxina, apresentam um efeito protetor. Jaburetox não foi capaz de induzir alterações na liberação de ácidos nucleicos em nenhuma das abordagens, mas modificou a liberação de ROS na dose de 6 M. A viabilidade celular não foi alterada em nenhuma das condições testadas. Nos ensaios de imunocompetência, observamos que o peptídeo modula a resposta do organismo, deixando-o mais susceptível a infecções. Os tratamentos com RNAet desencadeiam uma resposta protetora. Nossos dados sugerem que o RNAet modula as defesas do organismo de forma benéfica para combater patógenos, enquanto que o Jaburetox, nas condições testadas, não induz resposta imune através de ETs, mas torna o inseto mais susceptível a infecções por patógenos. Os presentes achados enfatizam a importância dos ácidos nucleicos extracelulares para as defesas imunológicas em insetos. Também elucidamos os efeitos desencadeados pelo peptídeo, aprimorando os conhecimentos referentes a esta toxina, enfatizando o potencial uso deste composto como um bioinseticida. / Ureases are enzymes that catalyze the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide, being produced by plants, fungi and bacteria. The studied toxin, Jaburetox, is a recombinant peptide derived from one of the urease isoforms present in Canavalia ensiformis. This molecule showed toxicity to insects of different orders when administered orally or by injection and, in addition, presents antifungal and bacteriostatic activities, not exhibiting toxic effects to mammals, demonstrating an enormous biotechnological potential. Studies with Rhodnius prolixus, one of the main vectors of Chagas' disease in Latin America, have shown that Jaburetox is capable of interacting with hemocytes, the cells of the immune system. Concomitant with this interaction, we also demonstrated that the peptide induces hemocyte aggregation, a characteristic of the cellular response, and is also capable of increasing the activity of phenoloxidase (PO), an enzyme involved in the humoral response in insects. These effects suggest that the peptide is able of activating the insect immune system. Insects present only innate immunity, which is subdivided into cellular and humoral responses. The cellular response, mediated by hemocytes, is characterized by phagocytosis, aggregation and encapsulation of pathogens. In contrast, the humoral response is represented by the production of antimicrobial peptides, melanization triggered by the PO enzyme and the production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). Recently, another mechanism of innate immune response has been studied: the Extracellular Traps (ETs), being well characterized in mammals, but little studied in insects. ETs consist of extracellular nucleic acids associated with cytoplasmic proteins that may aid in the capture and killing of pathogens. This response is triggered by extracellular granular cell receptors that induce the increase of intracellular Ca2+, leading to the production of ROS, which appear to play a key role in the release of nucleic acids, allowing them to pass into the cytoplasm and associate with proteins. The present study aims to evaluate the role of extracellular nucleic acids in the immune response and protection against the entomotoxic peptide Jaburetox. Immunological responses were evaluated by means of hemocytometer counting and by colorimetric assays to measure changes in the humoral response, 6 and 18 h after injection of Jaburetox and/or extracellular RNA (RNAet). The release of RNA and DNA was evaluated 6 h post injection of treatments for in vivo assays and 1 h post incubation for in vitro assays, using the Qubit RNA HS and Qubit dsDNA HS kits. In order to evaluate the release of ROS and 14 the cell viability, hemocyte cultures were treated for 24 h with Jaburetox. Finally, the immunocompetence was evaluated after treatment with Jaburetox, RNAet or Jaburetox + RNAet and challenging the insects with a pathogenic bacterium. Hemolymph of the insects was collected and colony forming units were measured by the drop-plate method. The results obtained in this work indicated that RNAet is able to activate the organism defenses, both cellular and humoral, and displays a protective effect when associated with the toxin. Jaburetox was not able to induce changes in the release of nucleic acids in any of the approaches, but modified the release of ROS at the dose of 6 μM. Cell viability was not altered in any of the conditions tested. In the immunocompetence assays, we observed that the peptide modulates response of the organism, making it more susceptible to infections. RNAet treatments elicit a protective response. Our data suggest that RNAet modulates the insect defenses in a beneficial way to fight pathogens, while Jaburetox, in the conditions tested, does not induce an immune response through ETs, but makes the insect more susceptible to pathogen infections. The present findings emphasize the importance of extracellular nucleic acids for immune defenses in insects. We also elucidate the effects triggered by the peptide, improving the knowledge regarding this toxin, reinforcing its potential use as a bioinsecticide.

Jaburetox é um peptídeo recombinante (~11 kDa) derivado de uma das isoformas de ureases da planta Canavalia ensiformis, popularmente conhecida como feijão-de-porco. O peptídeo induz efeitos variados em diferentes ordens de insetos, incluindo interferência na contração muscular em baratas da espécie Nauphoeta cinerea, ativação do sistema imunitário do vetor da doença de Chagas, Rhodnius prolixus e também, modula a atividade da enzima UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP) e da óxido nítrico sintase (NOS) no sistema nervoso central de R. prolixus e Triatoma infestans. Além disso, quando injetado, o Jaburetox é letal para ninfas de R. prolixus e insetos adultos de T. infestans. No presente trabalho foi avaliado o efeito inseticida do Jaburetox em baratas adultas da espécie N. cinerea, assim como, exploramos os efeitos induzidos pelo peptídeo no sistema nervoso central, focando na atividade enzimática das enzimas UAP, NOS, fosfatases ácidas (ACP) e acetilcolinesterase (AChE). Os ensaios enzimáticos foram realizados após tratamentos in vivo e in vitro com o Jaburetox, utilizando homogenatos de sistema nervoso central. Técnicas espectrofotométricas foram utilizadas para mensurar a atividade enzimática e a expressão proteica foi avaliada através de Western blot. Para o ensaio inseticida, Jaburetox foi administrado via oral e via injeção no inseto, utilizando uma dose de 50 μg de Jaburetox por g de inseto, ou o mesmo volume de tampão como controle. Em N. cinerea, ambos os tratamentos, in vivo e in vitro, inibiram parcialmente a atividade da NOS, sem modificar os níveis proteicos da mesma. Nenhuma alteração foi observada nos níveis da ACP após tratamentos com Jaburetox. A enzima UAP apresentou diminuição da atividade após 18 h de tratamento in vivo com o Jaburetox. Além disso, em todos os tratamentos in vivo com o peptídeo foi observado um aumento da atividade da AChE, sugerindo um possível mecanismo de resposta aos inseticidas. Contudo, mesmo após injeção e ingestão de Jaburetox as baratas adultas não tiveram taxas de mortalidade significativas, indicando resistência ao efeito inseticida do peptídeo. Em suma nossos resultados sugerem que o Jaburetox afeta as vias nitrinérgica, assim com a atividade da UAP e da AChE na barata. O fato do peptídeo afetar diferentemente as atividades enzimáticas dos R. prolixus e da N. cinerea podem explicar o porquê as baratas não são susceptíveis ao Jaburetox. / Jaburetox is a recombinant peptide (~11 kDa) derived from one of the Canavalia ensiformis (Jack bean) urease isoforms. The peptide induces several effects on insects of different orders, including the interference on muscle twitch tension in the cockroach Nauphoeta cinerea, the activation of the immune system in the Chagas’ disease vector Rhodnius prolixus, and the modulation of the enzyme activities of the UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP) and nitric oxide synthase (NOS) in the central nervous system of R. prolixus and the related triatomine Triatoma infestans. Moreover, when injected, the peptide is lethal for R. prolixus nymphs and T. infestans adults. Here, we evaluated the insecticidal effect of Jaburetox on N. cinerea adult cockroaches and explored the effects induced by Jaburetox on the central nervous system, focusing on the enzymatic activities of UAP, NOS, acid phosphatases (ACP), and acetylcholinesterase (AChE). The enzymatic experiments were performed after in vitro and in vivo treatments with Jaburetox using central nervous system homogenates from adult cockroaches. Spectrophotometric assays were employed to measure the enzyme activities and the protein expression of UAP and NOS was evaluated by Western blot. The insecticidal assay was conducted by injection and ingestion of 50 μg of Jaburetox per g of insect or the same volume of buffer for the controls. In N. cinerea, both in vivo and in vitro treatments with the peptide partially inhibited the activity of NOS, without modifying the protein levels. No alterations on ACP activity were observed upon Jaburetox treatment. In addition, the enzyme activity of UAP only had its activity affected at 18 h after injection. The peptide increased the AChE activity, suggesting a possible mechanism involved in overcoming the toxic effects of the insecticide. Moreover, the cockroaches did not die after Jaburetox injection and ingestion, indicating resistance to the toxic action of the peptide. Taken together, our findings indicate that Jaburetox alters the nitrinergic signaling as well as the AChE and UAP activities. The fact that Jaburetox affects differently the enzyme activities in R. prolixus and N. cinerea may explain why the cockroach is not susceptible to the lethal effect of the peptide.

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T17:47:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016CamileWunsch.pdf: 1221188 bytes, checksum: d4f164f1168ed40c958561be1e994dc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:42:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016CamileWunsch.pdf: 1221188 bytes, checksum: d4f164f1168ed40c958561be1e994dc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:42:58Z (GMT). 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Metodologia: A amostra foi composta por 707 indivíduos adultos submetidos ao exame de cateterismo cardíaco no Hospital Bruno Born, de Lajeado, RS. Todos os indivíduos assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido e responderam a um questionário semiestruturado. Os indivíduos foram classificados entre casos e controles, por um médico cardiologista, com base no seguinte critério: presença de estenose, com comprometimento maior do que 50%, em pelo menos uma das artérias coronárias. Foram também coletadas amostras de sangue periférico para análises bioquímicas e moleculares. A extração de DNA foi realizada pelo método de salting out. Os polimorfismos dos genes CD14, TLR4 e TNFα foram genotipados pelo sistema de discriminação alélica TaqMan, em equipamento de reação em cadeia da polimerase (PCR) em Tempo Real (StepOnePlus®). O polimorfismo rs28362491, no gene NFKB1, foi amplificado através da técnica convencional de PCR. Resultados: Identificamos uma associação dos polimorfismos rs2569190, localizado no gene CD14, e rs28362491, no gene NFKB1, com a DAC. Além disso, foram detectados efeitos dos polimorfismos dos genes TLR4 e TNFα nos níveis glicêmicos e dos polimorfismos nos genes TLR4, NFKB1 e TNFα no perfil lipídico. Conclusão: Nossos achados sugerem a participação de polimorfismos nos genes CD14 e NFKB1 no desenvolvimento da DAC na nossa amostra, corroborando evidências prévias do envolvimento de genes do processo inflamatório nessa patologia. / Introduction: Coronary artery disease (CAD) is the main cause of morbidity and mortality in the world, being characterized as a chronic, multifactorial inflammatory disease, whose pathophysiology is atherosclerosis. Considering the high heritability of the disease, several genetic polymorphisms have been investigated and associated with CAD and, among them, there are variants in the CD14, TLR4, NFKB1 and TNFα genes, which regulate cell signaling pathways of the innate immune system and inflammatory process in CAD. Objective: The main objective of this study is to verify the association beteween polymorphisms in the CD14 (rs2569190), TLR4 (rs4986790 and rs4986791), NFKB1 (rs28362491) and TNFα (rs1800629 and rs361525) genes and CAD. Methods: The sample group was composed of 707 adult individuals, recruited at the time when they were bought in for coronary angiography procedures at the Hemodynamic Center of the Hospital Bruno Born, City of Lajeado, Rio Grande do Sul. The individuals were classified between cases and controls by a cardiologist, based on the following criteria: presence of stenosis, greater than 50% of the luminal diameter, in at least one of the coronary arteries. Peripheral blood samples were also collected for biochemical and molecular analyzes. DNA extraction was performed using the salting out method. The polymorphisms in the CD14, TLR4 e TNFα genes were genotyped by Taqman® allelic discrimination assays. The rs28362491 polymorphism in the NFKB1 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Results: We identified an association between the polymorphisms rs2569190, located in the CD14 gene, and rs28362491, located in the NFKB1 gene, and CAD. In addition, there were detected significant effects of TLR4 and TNFα gene polymorphisms on glycemic levels and TLR4, NFKB1 and TNFα gene polymorphisms on the lipid profile. Conclusion: Our findings suggest a role for the polymorphisms in CD14 and NFKB1 genes in CAD susceptibility in our sample, corroborating previous evidence of the envolviment of inflamotory process genes in this patology.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-08-30T16:55:37Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO MArcia de miguel.pdf: 2399875 bytes, checksum: eba9d8dc3e7929c3ed0ddaf185e0151f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T16:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO MArcia de miguel.pdf: 2399875 bytes, checksum: eba9d8dc3e7929c3ed0ddaf185e0151f (MD5) / A dor crônica é um problema de saúde pública, pois apresenta alta prevalência ao redor do mundo e está associada a prejuízos físicos, emocionais, sociais e laborais. Seu tratamento está associado a custos elevados e, em muitos casos, a resposta às alternativas terapêuticas atuais não são adequadas. O conhecimento da relação entre a dor crônica e o sistema imune ainda não é compreendida de forma ampla a fim de possibilitar o desenvolvimento de tratamentos mais efetivos. A despeito das tentativas anteriores de desvendar essa relação, os trabalhos realizados com humanos apresentam dados controversos e limitados. Objetivo: Esta pesquisa tem o objetivo de comparar os níveis séricos de citocinas inflamatórias e a fenotipagem de subpopulações de linfócitos de pacientes com dor crônica do Ambulatório de Dor do Hospital Universitário Professor Edgard Santos, em Salvador, e indivíduos sem dor. Metodologia: Foi realizado um estudo observacional do tipo inquérito epidemiológico e foram avaliados os níveis séricos das citocinas inflamatórias IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α pelo método de Cytometric Bead Array (CBA) (eBioscience/BD®) e a fenotipagem das subpopulações de linfócitos T CD4, T CD8, células NK e linfócitos B pelo método de citometria de fluxo Lymphogram® em sangue periférico de 20 pacientes com dor crônica e 10 indivíduos sem dor. Resultados: Com relação às citocinas, foram encontrados níveis elevados de IFN-γ e níveis reduzidos IL-10 no grupo com dor crônica quando comparado aos indivíduos sem dor. Não houve diferença entre os grupos quanto às citocinas IL-1β, IL-4 e TNF-α e IL-6. Com relação à fenotipagem de linfócitos, a contagem de linfócitos T CD8 foi menor nos pacientes com dor crônica, enquanto que a contagem de células NK e linfócitos B no mesmo grupo foi maior que nos indivíduos sem dor. A contagem de T CD4 foi discretamente maior nos pacientes com dor crônica e o mesmo grupo mostrou aumento da relação CD4/CD8 quando comparado aos indivíduos sem dor. Conclusão: Apesar do número reduzido de indivíduos avaliados e do estudo não ter sido realizado com seleção aleatória, foi possível observar diferenças entre o perfil imunológico de pacientes com dor crônica quando comparados a indivíduos sem dor, conforme descreve a literatura. No entanto, estudos posteriores são necessários para melhor compreensão da relação entre o sistema imune e a dor crônica.

A identificação de epitopos e motivos virais para serem utilizados na imunização de humanos e animais é um objetivo importante e essencial em pesquisa imunológica. No momento, com novas ferramentas de bioinformática, diferentes abordagens são possíveis. A importância da bioinformática reside na possibilidade de trabalhar com grandes quantidades de dados de forma que, várias etapas experimentais do desenvolvimento de vacinas podem ser abreviadas. Quando buscamos por motivos virais (objetivando a vacinação) é necessário estar ciente de todos os passos envolvidos na seleção e apresentação de peptídeos ao sistema imune. Devemos considerar que muitos peptídeos podem ser gerados a partir de uma única proteína, mas apenas uma fração destes peptídeos é realmente apresentada ao sistema imune, pois os peptídeos devem ser capazes de atravessar diferentes “bottlenecks” e apenas aqueles apresentando características específicas serão capazes de estimular o sistema imune. As abordagens apresentadas nesta tese incluem o estabelecimento de um banco de dados de epitopos virais descritos na literatura e a comparação desses epitopos buscando identificar características similares entre eles. Os epitopos selecionados foram classificados de acordo com suas propriedades físico-químicas (polaridade e carga dos grupos R de seus aminoácidos). Das 69 sequências de epitopos incluídas em nossa base de dados, 31 (44,93%) apresentaram, em sítios potenciais de ancoragem ao MHC, aminoácidos com resíduos não-polares. A partir desses resultados é possível inferir o seguinte motivo consenso: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM] para epitopos virais. As sequências virais foram então comparadas àquelas de outras proteínas buscando verificar se elas são exclusivamente representadas em vírus: 1) primeiro os epitopos foram comparados a todas as sequências depositadas no GenBank (independente da origem); 2) a seguir, as comparações foram direcionadas a sequências de origem humana. A segunda abordagem foi usada para verificar o potencial de indução de reações autoimunes. As sequências de saída foram classificadas de acordo com seu organismo de origem. Das 31 sequências alinhadas de acordo com a similaridade dos resíduos de ancoragem, 29 (93,54%) apresentaram similaridade significante (estabelecida como 80% ou mais) com outras sequências virais. Destas, 12 (38,71%) apresentavam similaridade apenas com outras sequências de origem viral, nove (29,03%) apresentavam similaridade com sequências de origem bacteriana e duas (6,45%) apresentavam similaridade com sequências humanas, sugerindo que a grande maioria dos epitopos virais pode ser utilizada no desenvolvimento de vacinas. A habilidade dos epitopos serem gerados pela via de processamento de antígenos foi também testada. Uma parte das proteínas citosólicas sofre o processo de ubiquitinação que as dirige para o complexo enzimático proteolítico, denominado proteossomo. Do total de epitopos, cinquenta (73,53%) apresentaram uma sequência que permitia um corte exato na extremidade carbóxi terminal. Este número alcançou 86,67% (26 epitopos), quando restringimos a análise aos epitopos apresentando os resíduos de ancoragem compartilhados, sugerindo que a maioria dos epitopos apresentava os requerimentos clássicos para o processamento antigênico. Das estruturas do Protein Data Bank e de dados de modelagem, foi possível observar que os sítios de clivagem preditos na região amino terminal dos epitopos eram estruturalmente relacionados a alças na estrutura da proteína original (66,7%). Estes dados sugerem que há uma clivagem preferencial em alças (χ2=6.09 p=0.047). O banco de dados de ligantes peptídicos do EpiJen foi utilizado para avaliar a capacidade dos epitopos em serem carreados pelo complexo da TAP. A partir dessa comparação observamos que o motivo predito estava mais representado do que todas outras possíveis sequências entre as saídas, sugerindo novamente que estas características são necessárias à seleção e apresentação de epitopos. Concluindo, sugerimos que é possível identificar padrões entre epitopos derivados de virus e que a predição de motivos virais conservados pode ser aplicada ao desenvolvimento de vacinas. Além disso, considerando a existência de reatividade cruzada, sugerimos que é possível imunizar contra uma quantidade consideravelmente grande de alvos virais utilizando um número de epitopos reduzido. Estudos sobre os aspectos e características dos epitopos virais são o primeiro passo rumo a uma nova geração de vacinas. / The identification of epitopes and viral motifs to be used in the immunization of both humans and other animals is an important and essential objective in immunology research. At present, with the new tools of the bioinformatics different approaches are possible. The importance of the bioinformatics is exemplified by its capacity to handle a large amount of data in order to bypass several methodological steps in vaccine development. When searching for conserved viral motifs it is necessary to be aware of all the steps involved in peptide selection and presentation. In this way, we should consider that many different peptides can be generated from a given protein, but only a fraction of these peptides will actually be presented to the immune system. The approaches presented in this thesis include the establishment of a viral epitope databank from sequences described in the literature and the comparison of these epitopes in order to identify similar features among then. The selected epitopes were classified according to their physicochemical properties (i.e. polarity and charge of their amino acid–R groups). From the 69 sequences of epitopes included in our database, 31 (44.93%) presented, in potential MHC anchor sites, amino acids whit non-polar residues. From this, it is possible to infer the following consensus motif: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM]. The viral sequences were then compared to those of other proteins in order to verify if they are exclusively represented in viruses: 1) first, the epitopes were compared to all sequences stored in GenBank (disregarding their origin); 2) then, the comparisons were directed to the sequences from human origin. The output sequences were classified according to the organism of origin. From the 31 sequences aligned according to their anchor residues, 29 (93.54%) presented significant similarity (established as 80% or above) with other viral sequences. From these, 12 (38.71%) presented similarity only with other sequences from viral origin, nine (29.03%) presented similarity with sequences from bacterial origin and two (6.45%) presented significant similarity to human sequences, suggesting that a great majority of these viral epitopes could be used in vaccine development. The hability of the epitopes to be generated by antigen processing pathway was also tested. A fraction of all cytosolic proteins suffers the ubiquitination process that directs them to the proteolytic enzymatic complex, called proteasome. From the whole databank, fifty epitopes (73.53%) presented a sequence that allowed a precise cut at the carboxy terminal region. This number reached 86.67% (26 epitopes) when we restricted this analysis to the epitopes presenting the shared anchor residues, suggesting that the majority of the epitopes presented the classical requirements to antigenic processing. From the Protein Data Bank structures and from the modelling data, we could observe that the predicted cleavage sites on the amino-terminal region of the epitopes were structurally related to loops on the structure of the original protein (66.7%), suggesting a preferential cleavage at loops (χ2=6.09 p=0.047). The TAP ligands peptide database of EpiJen was used in order to evaluate the epitopes capacity to be carried by the TAP complex. We were able to observe that our predicted motif was present more frequently than every other possible sequence among the outputs, again suggesting that this feature is necessary to epitope selection and presentation. In conclusion, we suggest that it is possible to identify patterns among virus-derived epitopes and that the prediction of viral conserved motifs would allow the development of vaccines. Also, considering the existence of cross reactivity, we suggest that it will be possible to cover a considerably large amount of targets using a limited number of viral peptides. Equally important is the immunogenicity of viral peptides, since only a fragment and not the whole viral particle will challenge the immune system, therefore reducing risks of undesired immune responses. Studies on viral epitopes features and characteristics are the first step towards a new generation of vaccines.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-01-29T18:19:03Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_HemocompatibilidadeEfeitoSistema.pdf: 2208570 bytes, checksum: acb77550e215beb05ad2fc60501c516c (MD5) / Approved for entry into archive by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2016-02-01T15:43:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_HemocompatibilidadeEfeitoSistema.pdf: 2208570 bytes, checksum: acb77550e215beb05ad2fc60501c516c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-01T18:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_HemocompatibilidadeEfeitoSistema.pdf: 2208570 bytes, checksum: acb77550e215beb05ad2fc60501c516c (MD5) Previous issue date: 2015 / Lipossomas são sistemas de vetorização constituídos basicamente por fosfolipídios e colesterol e que têm sido amplamente usados como carreadores de fármacos, apresentando, dentre outras vantagens, a redução de efeitos adversos em comparação aos observados pelo uso de fármacos na forma livre. Devido ao fato possibilidade dos lipossomas serem naturalmente direcionados aos macrófagos, os quais são alvos da infecção por Leishmania, seu uso apresenta-se promissor para o tratamento das leishmanioses. Como ainda não existe disponível nenhuma formulação lipossomal contendo antimoniato de meglumina (AM), fármaco de primeira escolha na terapia das leishmanioses, a proposição de uma formulação contendo esse fármaco que apresente bons resultados no tratamento da doença e segurança adequada é alvo de inúmeras pesquisas. Formulações promissoras contendo AM têm sido propostas, porém algumas reações adversas têm sido apontadas pelo uso desse sistema, as quais parecem estar relacionadas ao uso do fosfolipídio dicetilfosfato (DCP). Assim, foi proposta uma nova formulação lipossomal em que o DCP foi substituído pelo fosfolipídio dipalmitoilfosfatidilgicerol (DPPG) com o objetivo de tentar reduzir as reações adversas observadas. Dessa forma, neste trabalho, foram realizados testes in vitro para avaliar o efeito das duas formulações vazias sobre componentes celulares e plasmáticos, a saber, a avaliação do efeito sobre as hemácias e sobre a hemostasia. Também foram realizados testes para avaliação do efeito das vesículas lipossomais sobre a linhagem J774 de macrófagos, através da determinação da viabilidade celular e da produção de óxido nítrico, e o efeito sobre o sistema complemento, avaliado pela formação de C3a e de SC5b-9. Os resultados encontrados no presente estudo mostraram que as duas formulações não tiveram efeito sobre a maioria dos testes realizados. Porém, a formulação lipossomal constituída por DCP provocou ativação do sistema complemento, com aumento da formação de C3a. Além disso, essa formulação provocou uma diminuição da viabilidade de macrófagos. Esses dados sugerem que as reações adversas observadas em estudos anteriores podem ser devido ao DCP presente na vesícula lipossomal. ____________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : Liposomes are a type of vectoring system consisting primarily of phospholipids and cholesterol. These particles have the advantage to reduce the adverse effects observed with drugs encapsulated in comparison to free drugs. Due to the fact that liposomes are naturally targeted to macrophages of the mononuclear phagocytic system (FMS), which are targets of infection by parasites of the genus Leishmania, they are adequate for the treatment of leishmaniasis. Since there is not any liposomal formulation containing meglumine antimoniate (AM), drug of choice in the treatment of leishmaniasis, the proposition of a formulation containing this drug that presents good results in the treatment of disease and adequate security is target of numerous research. Promising formulations containing AM have been proposed, however, some adverse reactions have been identified, such as hematological disorders. Some of these changes seem to be related to the use of dicetylphosphate phospholipid (DCP). Thus, a new liposomal formulation was testes in which DCP was replaced by dipalmitoilfosfatidilgicerol phospholipid (DPPG) in order to reduce adverse reactions observed. Thus, in vitro tests were performed to evaluate the effect of the two formulations over cellular components and plasmatic components, namely the evaluation of the hemolytic effect and influence on hemostasis. Furthermore, tests were performed to evaluate the effect of liposome vesicles on the J774 macrophage lineage, by determining the cell viability and the production of nitric oxide, as well as the effect on complement system, measured by the formation of C3a and SC5b-complex -9. The results of this study showed that both formulations had no effect on most of the tests. However, liposomal formulation comprised of DCP was capable of activating the complement system, with increased formation of C3a. In addition, this formulation caused a decrease in the viability of macrophages. These data suggest that the adverse effects observed in previous studies may be due to phospholipid DCP present in the liposomal vesicle.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:26:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 324993.pdf: 1370922 bytes, checksum: 69633f5130beb0a82d0fc07ff88f3382 (MD5) Previous issue date: 2013 / Os cultivos de camarão, tanto nas fazendas quanto nas larviculturas, são susceptíveis à ocorrência de mortalidades causadas por micro-organismos patogênicos, tais como vírus, bactérias e fungos. A grande maioria dos estudos sobre os mecanismos de defesa dos camarões enfocam principalmente a problemática ocorrida nos viveiros de cultivo com animais juvenis e adultos. Por outro lado, tais estudos são ainda escassos nas fases larvais e pós-larvais, mas são igualmente importantes, uma vez que enfermidades nesses estágios podem gerar perdas econômicas consideráveis para as larviculturas. Assim, o presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento sobre a ontogenia do sistema imune durante o desenvolvimento de Litopenaeus vannamei, a espécie de camarão mais cultivada no mundo, através da avaliação da expressão de genes associados ao seu sistema imune utilizando RT-qPCR. Foram analisados 17 genes, de diferentes categorias funcionais, em subestágios de desenvolvimento: ovos fertilizados (0-4h e 7-11h pós-desova), Náuplios (I e V), Protozoeas (I e III), Misis (I e III) e Pós-larvas (2, 9 e 17). Todos os genes avaliados mostraram-se expressos no estágio de Pós-larva, o qual é o mais próximo de camarões juvenis. Os genes associados à defesa antiviral (Lv-Sid 1, LvDcr2 e Lv-Ago 2, LvDcr1, LvSVC1 e Lv-Ago 1), reconhecimento de micro-organismos (LvDscam), antioxidante (Lv-PRX), sinalização intracelular (fatores de transcrição LvDorsal e LvRelish) e apoptose (LvIAP) foram ubiquamente expressos de ovo a pós-larvas. Enquanto a expressão de genes envolvidos no sistema pró-fenoloxidase (LvproPO-1), a homeostasia (LvHHAP), coagulação (LvClot) e peptídeos antimicrobianos (Litvan PEN2, Litvan PEN3 e LvSty-II) não foi detectada em todos os subestágios. De maneira interessante, a expressão de genes de uma mesma família gênica (Litvan PEN2 e Litvan PEN3) não ocorreu simultaneamente em um mesmo subestágio de desenvolvimento. Por outro lado, os genes associados à defesa antiviral (LvDcr1/2, Lv-Ago 1/2 and Lv-Sid-1), fatores de transcrição (LvDorsal e xii LvRelish), defesa antioxidante (Lv-PRX) e apoptose (LvIAP) foram mais expressos no Ovo 0-4h em comparação ao Ovo 7-11h, sugerindo uma contribuição materna. A expressão de genes associados ao sistema imune nas fases larvais e pós-larvais de L. vannamei ressalta a importância de se conhecer o estabelecimento dos diferentes mecanismos de defesa ao longo do seu desenvolvimento. Assim, o presente estudo vem contribuir, de maneira original e pioneira, com informações a respeito da ontogenia de moléculas do sistema imune, especialmente àquelas associadas à defesa antiviral. Conhecimentos desta natureza poderão contribuir, em um futuro próximo, para o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas que servirão para avaliar as condições de saúde de animais nos cultivos (larviculturas e fazendas), bem como para orientar à seleção genética de camarões mais resistentes à infecções microbianas e virais.<br> / Abstract : Shrimp farms and hatcheries are susceptible to mortalities events caused by pathogenic microorganisms, such as virus, bacteria and fungi. The great majority of studies related to the defense mechanisms of shrimp are focused in problems that occur mainly in juvenile and adult shrimp farming. Moreover, studies in the shrimp larval and post-larval stages are very limited but are equally important, since diseases can generate considerable economic losses in those stages. Thus, the present study was aimed to expand the knowledge on the ontogeny of the immune system during the development of Litopenaeus vannamei, the most cultivated shrimp species in the world, through the evaluation of gene expression associated with the immune system using RT-qPCR. The stages examined in this work included the fertilized egg (0h and 7h post spawns), nauplius (I and V), protozoea (I and III), Mysis (I and III) and postlarval (PL2, PL9 and PL17). As result, it was observed that all analyzed genes were expressed in the post-larval stage, which is the previous stage to juvenile shrimp. While genes associated to antiviral defense (LvDcr1, LvDcr2, Lv-Ago 1, Lv-Ago 2, Lv-Sid-1 and LvSVC-1), microorganisms recognition(LvDscam), antioxidant defense (Lv-PRX), intracellular signaling (transcription factors LvDorsal and LvRelish) and apoptosis (LvIAP) were constitutively expressed from egg to postlarvae; genes involved in the prophenoloxidase system (LvproPO-1), homeostasis (LvHHAP), coagulation (LvClot) and antimicrobial peptides (Litvan PEN2, Litvan PEN3 and LvSty-II) were not detected in all stages. Interestingly, the expression of the same gene family (Litvan PEN2 and Litvan PEN3) did not occur simultaneously during the development. In addition, genes associated with antiviral defense (LvDcr1, LvDcr2, Lv-Ago 1, Lv-Ago 2 and Lv-Sid 1), transcription factors (LvDorsal and LvRelish), antioxidant defense (Lv-PRX) and apoptosis (LvIAP) were more expressed in egg 0h compared to egg 7h, which suggests a maternal contribution. The expression of genes associated with the immune system in larval and postlarval stages of L. vannamei highlights the importance of understanding the establishment of different defense mechanisms throughout the organism development. Thus, the present study aims to contribute in an original and pioneering way, with information about the ontogeny of molecules of the immune system, with especial attention given to molecules associated with antiviral defense. Such knowledge can contribute in the near future for the development of biotechnological tools to evaluate the health of animals in culture (hatchery and farm), as well as the genetic selection of shrimps more resistant to microbial and viral infections.

A identificação de epitopos e motivos virais para serem utilizados na imunização de humanos e animais é um objetivo importante e essencial em pesquisa imunológica. No momento, com novas ferramentas de bioinformática, diferentes abordagens são possíveis. A importância da bioinformática reside na possibilidade de trabalhar com grandes quantidades de dados de forma que, várias etapas experimentais do desenvolvimento de vacinas podem ser abreviadas. Quando buscamos por motivos virais (objetivando a vacinação) é necessário estar ciente de todos os passos envolvidos na seleção e apresentação de peptídeos ao sistema imune. Devemos considerar que muitos peptídeos podem ser gerados a partir de uma única proteína, mas apenas uma fração destes peptídeos é realmente apresentada ao sistema imune, pois os peptídeos devem ser capazes de atravessar diferentes “bottlenecks” e apenas aqueles apresentando características específicas serão capazes de estimular o sistema imune. As abordagens apresentadas nesta tese incluem o estabelecimento de um banco de dados de epitopos virais descritos na literatura e a comparação desses epitopos buscando identificar características similares entre eles. Os epitopos selecionados foram classificados de acordo com suas propriedades físico-químicas (polaridade e carga dos grupos R de seus aminoácidos). Das 69 sequências de epitopos incluídas em nossa base de dados, 31 (44,93%) apresentaram, em sítios potenciais de ancoragem ao MHC, aminoácidos com resíduos não-polares. A partir desses resultados é possível inferir o seguinte motivo consenso: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM] para epitopos virais. As sequências virais foram então comparadas àquelas de outras proteínas buscando verificar se elas são exclusivamente representadas em vírus: 1) primeiro os epitopos foram comparados a todas as sequências depositadas no GenBank (independente da origem); 2) a seguir, as comparações foram direcionadas a sequências de origem humana. A segunda abordagem foi usada para verificar o potencial de indução de reações autoimunes. As sequências de saída foram classificadas de acordo com seu organismo de origem. Das 31 sequências alinhadas de acordo com a similaridade dos resíduos de ancoragem, 29 (93,54%) apresentaram similaridade significante (estabelecida como 80% ou mais) com outras sequências virais. Destas, 12 (38,71%) apresentavam similaridade apenas com outras sequências de origem viral, nove (29,03%) apresentavam similaridade com sequências de origem bacteriana e duas (6,45%) apresentavam similaridade com sequências humanas, sugerindo que a grande maioria dos epitopos virais pode ser utilizada no desenvolvimento de vacinas. A habilidade dos epitopos serem gerados pela via de processamento de antígenos foi também testada. Uma parte das proteínas citosólicas sofre o processo de ubiquitinação que as dirige para o complexo enzimático proteolítico, denominado proteossomo. Do total de epitopos, cinquenta (73,53%) apresentaram uma sequência que permitia um corte exato na extremidade carbóxi terminal. Este número alcançou 86,67% (26 epitopos), quando restringimos a análise aos epitopos apresentando os resíduos de ancoragem compartilhados, sugerindo que a maioria dos epitopos apresentava os requerimentos clássicos para o processamento antigênico. Das estruturas do Protein Data Bank e de dados de modelagem, foi possível observar que os sítios de clivagem preditos na região amino terminal dos epitopos eram estruturalmente relacionados a alças na estrutura da proteína original (66,7%). Estes dados sugerem que há uma clivagem preferencial em alças (χ2=6.09 p=0.047). O banco de dados de ligantes peptídicos do EpiJen foi utilizado para avaliar a capacidade dos epitopos em serem carreados pelo complexo da TAP. A partir dessa comparação observamos que o motivo predito estava mais representado do que todas outras possíveis sequências entre as saídas, sugerindo novamente que estas características são necessárias à seleção e apresentação de epitopos. Concluindo, sugerimos que é possível identificar padrões entre epitopos derivados de virus e que a predição de motivos virais conservados pode ser aplicada ao desenvolvimento de vacinas. Além disso, considerando a existência de reatividade cruzada, sugerimos que é possível imunizar contra uma quantidade consideravelmente grande de alvos virais utilizando um número de epitopos reduzido. Estudos sobre os aspectos e características dos epitopos virais são o primeiro passo rumo a uma nova geração de vacinas. / The identification of epitopes and viral motifs to be used in the immunization of both humans and other animals is an important and essential objective in immunology research. At present, with the new tools of the bioinformatics different approaches are possible. The importance of the bioinformatics is exemplified by its capacity to handle a large amount of data in order to bypass several methodological steps in vaccine development. When searching for conserved viral motifs it is necessary to be aware of all the steps involved in peptide selection and presentation. In this way, we should consider that many different peptides can be generated from a given protein, but only a fraction of these peptides will actually be presented to the immune system. The approaches presented in this thesis include the establishment of a viral epitope databank from sequences described in the literature and the comparison of these epitopes in order to identify similar features among then. The selected epitopes were classified according to their physicochemical properties (i.e. polarity and charge of their amino acid–R groups). From the 69 sequences of epitopes included in our database, 31 (44.93%) presented, in potential MHC anchor sites, amino acids whit non-polar residues. From this, it is possible to infer the following consensus motif: X [AGPVLIM] X(6) [AGPVLIM]. The viral sequences were then compared to those of other proteins in order to verify if they are exclusively represented in viruses: 1) first, the epitopes were compared to all sequences stored in GenBank (disregarding their origin); 2) then, the comparisons were directed to the sequences from human origin. The output sequences were classified according to the organism of origin. From the 31 sequences aligned according to their anchor residues, 29 (93.54%) presented significant similarity (established as 80% or above) with other viral sequences. From these, 12 (38.71%) presented similarity only with other sequences from viral origin, nine (29.03%) presented similarity with sequences from bacterial origin and two (6.45%) presented significant similarity to human sequences, suggesting that a great majority of these viral epitopes could be used in vaccine development. The hability of the epitopes to be generated by antigen processing pathway was also tested. A fraction of all cytosolic proteins suffers the ubiquitination process that directs them to the proteolytic enzymatic complex, called proteasome. From the whole databank, fifty epitopes (73.53%) presented a sequence that allowed a precise cut at the carboxy terminal region. This number reached 86.67% (26 epitopes) when we restricted this analysis to the epitopes presenting the shared anchor residues, suggesting that the majority of the epitopes presented the classical requirements to antigenic processing. From the Protein Data Bank structures and from the modelling data, we could observe that the predicted cleavage sites on the amino-terminal region of the epitopes were structurally related to loops on the structure of the original protein (66.7%), suggesting a preferential cleavage at loops (χ2=6.09 p=0.047). The TAP ligands peptide database of EpiJen was used in order to evaluate the epitopes capacity to be carried by the TAP complex. We were able to observe that our predicted motif was present more frequently than every other possible sequence among the outputs, again suggesting that this feature is necessary to epitope selection and presentation. In conclusion, we suggest that it is possible to identify patterns among virus-derived epitopes and that the prediction of viral conserved motifs would allow the development of vaccines. Also, considering the existence of cross reactivity, we suggest that it will be possible to cover a considerably large amount of targets using a limited number of viral peptides. Equally important is the immunogenicity of viral peptides, since only a fragment and not the whole viral particle will challenge the immune system, therefore reducing risks of undesired immune responses. Studies on viral epitopes features and characteristics are the first step towards a new generation of vaccines.