As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

INTRODUÇÃO: A principal causa de mortalidade em pacientes com fibrose cística é o declínio da função pulmonar, relacionada à infecção respiratória de repetição. A rinossinusite crônica pode contribuir na deterioração da função pulmonar, porque o nariz e seios paranasais podem representar um reservatório de potenciais patógenos que causam as infecções pulmonares recorrentes ou crônicas. Métodos como o sequenciamento de nova geração, na identificação do microbioma, mostraram a natureza polimicrobiana das infecções respiratórias em fibrose cística, com a caracterização de agentes infecciosos não detectados nos métodos convencionais de cultura. Ainda muito pouco se sabe a respeito da composição e diversidade do microbioma desses pacientes. OBJETIVO: Descrever a composição do microbioma bacteriano do meato médio e do escarro de pacientes adultos com fibrose cística. Comparar riqueza, diversidade e dominância do microbioma dos pacientes com doença pulmonar discreta ou moderada com pacientes com doença pulmonar grave. PACIENTES E MÉTODOS: Foi avaliado o microbioma do meato médio e escarro de 31 adultos com fibrose cística, utilizado a análise do gene 16S rRNA por meio do sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: Staphylococcus, Streptococcus e Corynebacterium foram os gêneros mais abundantes no meato médio e Pseudomonas, Haemophilus e Prevotella, no escarro. Nos pacientes com doença grave, observamos um aumento na prevalência de Pseudomonas nos dois sítios estudados isoladamente. Na análise pareada de escarro e meato médio, obtivemos concordância na composição do microbioma apenas em pacientes com doença discreta a moderada, o mesmo não foi observado no grupo com doença grave. CONCLUSÃO: O avanço nos conhecimentos da composição e diversidade do microbioma nas vias aéreas dos pacientes com fibrose cística é fundamental para o entendimento da fisiopatologia da doença, além de seu papel na criação novas perspectivas e possibilidades de tratamentos. Esse é o primeiro trabalho brasileiro a estudar o microbioma de vias aéreas em pacientes com fibrose cística. Nossos achados estão em concordância com a literatura internacional, ao apontar a Pseudomonas como importante elemento na fisiopatologia da doença, presente tanto no escarro como no meato médio dos pacientes com doença pulmonar grave / INTRODUCTION: The main cause of mortality in patients with cystic fibrosis is the decline in lung function, related to recurrent respiratory infection. Chronic rhinosinusitis leads to significant morbidity and contributes to the pathophysiology of lung disease. In cystic fibrosis, the nose and paranasal sinuses may represent a reservoir of potential respiratory pathogens and contribute to recurrent or chronic lung infections. Culture independent molecular detection methods of microbiome have shown the polymicrobial nature of respiratory infections in cystic fibrosis, with the characterization of undetectable pathogenic agents in conventional culture methods. Composition and diversity of the airway microbiome is still poor explored. METHODS: This study evaluated the airway microbiome of 31 adult cystic fibrosis patients, with the analysis of the 16S rRNA by the next generation sequencing. RESULTS: Staphylococcus, Streptococcus e Corynebacterium were the most abundant genera in middle meatus and Pseudomonas, Haemophilus e Prevotella, in sputum. In patients with advanced disease, we noticed an increase in Pseudomonas prevalence in both sample types studied separately. In paired analysis, sputum and middle meatus have shown a similarity in microbiome composition in patients with mild or moderate disease. This was not observed in patients with advanced disease. CONCLUSION: Advances in the knowledge of the composition and diversity of the airway microbiome of cystic fibrosis patients are essential for understanding the pathophysiology of the disease. It has an important role in creating new perspectives and possibilities of treatments. There is a lack in the literature of studies with evaluation of the airway microbiome of these patients in Brazil. This is the first Brazilian study to evaluate the airway microbiome of cystic fibrosis patients. Our finds agreed with international literature, when point at Pseudomonas role in disease pathophysiology, present in sputum and middle meatus of patients with advanced disease

INTRODUÇÃO: As osteocondrodisplasias constituem um grupo heterogêneo de doenças que comprometem a formação, crescimento e desenvolvimento do sistema esquelético. O diagnóstico definitivo, principalmente nas formas com acometimento de coluna, epífise e/ou metáfise, é desafiador, devido à heterogeneidade genética, raridade de algumas formas específicas e da sobreposição de fenótipos clínico-radiológicos. OBJETIVOS: avaliar as características clínico-radiológicas e as bases moleculares de um grupo de pacientes com osteocondrodisplasias com envolvimento do esqueleto axial associado a anomalias epifisárias e/ou metafisárias. MÉTODOS: Foram avaliados clínica-radiologicamente 65 pacientes de 58 famílias (com mediana de idade de 9 anos e 2 meses) com osteocondrodisplasias de acometimento espôndilo-epi-metafisários pertencentes a 15 diferentes grupos da Nosologia de anomalias ósseas genéticas. Os pacientes foram classificados em cinco categorias (I,IIA,IIB,III,IV), levando-se em consideração a certeza do diagnóstico de uma determinada displasia esquelética pelos aspectos clínico-radiológicos (I,IIA,IIB,IV), o conhecimento (I,IIA,IIB) ou não (III,IV) da base molecular e o tamanho/número de éxons a serem analisados. De acordo com esta classificação, um fluxograma foi estabelecido para a decisão de qual técnica de sequenciamento seria empregada: Sanger (I) ou sequenciamento de nova geração, sob a forma de um painel de genes customizado (IIA,III) ou do exoma (IIB,III,IV). RESULTADOS: dentre os 64 pacientes analisados por um teste molecular, variantes consideradas causativas do fenótipo foram encontradas em 61 (95%). De acordo com as categorias estabelecidas, a positividade do teste genético inicial e o número de indivíduos analisados foram: categoria I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), IV (6/6). Em sete casos (três na categoria I, dois na categoria IIA e dois na categoria III), nos quais a estratégia molecular inicial não obteve sucesso, testes moleculares adicionais foram realizados como complementação, possibilitando a identificação da base molecular das osteocondrodisplasias em questão. Em um paciente na categoria I e nos dois indivíduos da categoria IIA, nos quais não foi possível identificar uma variante patogênica, nenhum teste genético adicional foi realizado. Dentre os casos com resultados positivos, em um paciente na categoria IIB, o resultado final mudou a hipótese diagnóstica inicial; dois pacientes classificados como IIA e III, o quadro clínico presente era leve, contrastando com o quadro típico descrito nas osteocondrodisplasias causadas por mutações nos genes INPPL1 e HSPG2. No grupo de osteocondrodisplasias sem etiologia conhecida (categoria IV), foram identificadas variantes em três novos genes (PCYT1A, FN1 e LONP1). Uma re-análise nos casos negativos permitiu a identificação de mais um paciente com mutação em FN1. Mutações novas em genes previamente conhecidos foram encontradas nos genes COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR e CANT1. CONCLUSÕES: o presente estudo mostrou que uma caracterização clínico-radiológica bem elaborada permite uma maior concordância com os testes moleculares. Em algumas situações, a sobreposição fenotípica impediu que o diagnóstico definitivo fosse estabelecido apenas por critérios clínico-radiológicos, exigindo o emprego de testes moleculares adicionais para o correto diagnóstico e, consequentemente, um aconselhamento genético mais preciso. Os achados clínico-radiológicos e moleculares contribuíram para ampliar o espectro fenotípico de algumas osteocondrodisplasias, particularmente aquelas decorrentes de variantes nos genes HSPG2 e INPPL1, além de desvendar as bases genéticas de três osteocondrodisplasias / INTRODUCTION: Osteochondrodysplasias comprise a heterogeneous group of bone disorders affecting formation, growth, and development of the skeleton. An accurate diagnosis could be challenging due to the genetic heterogeneity, rarity of specific types, and overlapping of clinical and radiographic phenotypes. OBJECTIVES: to evaluate the clincal and radiographic characteristics, as well as the molecular basis of a group of patients with spondylo-epi and/or metaphyseal osteochondrodyplasias. METHODS: Sixty-five patients from 58 families (with a median age of 9 years 2 months) with spondylo-epi-metaphyseal osteocondrodysplasias, from 15 different groups from the Nosology of Genetic Bone Disorders, were enrolled. Patients were classified into five categories (I,IIA,IIB,III,IV), considering the diagnostic certainty of a specific osteochondrodysplasia, based on clinical and radiographic findings (I,IIA,IIB,IV), the previous knowledge (I,IIA,IIB), or not (III,IV) of the molecular basis, as well as, the size/number of exons to be tested. According to this classification, a flowchart was established to aid on the molecular testing strategy: Sanger sequencing (I), or next generation sequencing, at the form of a custom targeted gene panel (IIA,III), or exome sequencing (IIB,III,IV). RESULTS: Phenotype causing variants were found in 61 out of 64 patients (95%). Based on the category system described above, the initial molecular testing positivity was: category I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), and IV (6/6). In seven cases (three in category I, two in category IIA, and two in category III), additional genetic tests applied were able to find the causative mutation, when the initial testing strategy was not successful. For one patient in category I and two in category IIA, in whose no pathogenic mutation was found, no further molecular studies were performed. Among the positive cases, one patient in category IIB had his former clinical diagnosis changed through the molecular testing; two patients form categories IIA and III showed a milder phenotype, in contrast to the expected clinical findings in INPPL1 and HSPG2 osteochondrodysplasias. The molecular basis of three different osteochondrodysplasias (category IV) was unraveled by this study (genes PCYT1A, FN1 e LONP1). A re-analysis of the negative cases allowed the identification of another patient harboring mutation in FN1. Novel variants were found in previously known genes: COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR, and CANT1. CONCLUSIONS: The present study showed that a well-elaborated clinical-radiological characterization allows greater correspondence with the molecular testing. In some cases, phenotypic overlap prevented the definitive diagnosis from being established only by clinical-radiological criteria, requiring the use of additional molecular tests for the correct diagnosis, and consequently, a more accurate genetic counseling. The clinical-radiographic, as well as the molecular findings, contributed to expand the clinical phenotype in certain groups, especially the variants found in patients with HSPG2 and INPPL1 osteochondrodysplasias, besides unraveling the molecular basis of three osteochondrodysplasias

INTRODUÇÃO: As osteocondrodisplasias constituem um grupo heterogêneo de doenças que comprometem a formação, crescimento e desenvolvimento do sistema esquelético. O diagnóstico definitivo, principalmente nas formas com acometimento de coluna, epífise e/ou metáfise, é desafiador, devido à heterogeneidade genética, raridade de algumas formas específicas e da sobreposição de fenótipos clínico-radiológicos. OBJETIVOS: avaliar as características clínico-radiológicas e as bases moleculares de um grupo de pacientes com osteocondrodisplasias com envolvimento do esqueleto axial associado a anomalias epifisárias e/ou metafisárias. MÉTODOS: Foram avaliados clínica-radiologicamente 65 pacientes de 58 famílias (com mediana de idade de 9 anos e 2 meses) com osteocondrodisplasias de acometimento espôndilo-epi-metafisários pertencentes a 15 diferentes grupos da Nosologia de anomalias ósseas genéticas. Os pacientes foram classificados em cinco categorias (I,IIA,IIB,III,IV), levando-se em consideração a certeza do diagnóstico de uma determinada displasia esquelética pelos aspectos clínico-radiológicos (I,IIA,IIB,IV), o conhecimento (I,IIA,IIB) ou não (III,IV) da base molecular e o tamanho/número de éxons a serem analisados. De acordo com esta classificação, um fluxograma foi estabelecido para a decisão de qual técnica de sequenciamento seria empregada: Sanger (I) ou sequenciamento de nova geração, sob a forma de um painel de genes customizado (IIA,III) ou do exoma (IIB,III,IV). RESULTADOS: dentre os 64 pacientes analisados por um teste molecular, variantes consideradas causativas do fenótipo foram encontradas em 61 (95%). De acordo com as categorias estabelecidas, a positividade do teste genético inicial e o número de indivíduos analisados foram: categoria I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), IV (6/6). Em sete casos (três na categoria I, dois na categoria IIA e dois na categoria III), nos quais a estratégia molecular inicial não obteve sucesso, testes moleculares adicionais foram realizados como complementação, possibilitando a identificação da base molecular das osteocondrodisplasias em questão. Em um paciente na categoria I e nos dois indivíduos da categoria IIA, nos quais não foi possível identificar uma variante patogênica, nenhum teste genético adicional foi realizado. Dentre os casos com resultados positivos, em um paciente na categoria IIB, o resultado final mudou a hipótese diagnóstica inicial; dois pacientes classificados como IIA e III, o quadro clínico presente era leve, contrastando com o quadro típico descrito nas osteocondrodisplasias causadas por mutações nos genes INPPL1 e HSPG2. No grupo de osteocondrodisplasias sem etiologia conhecida (categoria IV), foram identificadas variantes em três novos genes (PCYT1A, FN1 e LONP1). Uma re-análise nos casos negativos permitiu a identificação de mais um paciente com mutação em FN1. Mutações novas em genes previamente conhecidos foram encontradas nos genes COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR e CANT1. CONCLUSÕES: o presente estudo mostrou que uma caracterização clínico-radiológica bem elaborada permite uma maior concordância com os testes moleculares. Em algumas situações, a sobreposição fenotípica impediu que o diagnóstico definitivo fosse estabelecido apenas por critérios clínico-radiológicos, exigindo o emprego de testes moleculares adicionais para o correto diagnóstico e, consequentemente, um aconselhamento genético mais preciso. Os achados clínico-radiológicos e moleculares contribuíram para ampliar o espectro fenotípico de algumas osteocondrodisplasias, particularmente aquelas decorrentes de variantes nos genes HSPG2 e INPPL1, além de desvendar as bases genéticas de três osteocondrodisplasias / INTRODUCTION: Osteochondrodysplasias comprise a heterogeneous group of bone disorders affecting formation, growth, and development of the skeleton. An accurate diagnosis could be challenging due to the genetic heterogeneity, rarity of specific types, and overlapping of clinical and radiographic phenotypes. OBJECTIVES: to evaluate the clincal and radiographic characteristics, as well as the molecular basis of a group of patients with spondylo-epi and/or metaphyseal osteochondrodyplasias. METHODS: Sixty-five patients from 58 families (with a median age of 9 years 2 months) with spondylo-epi-metaphyseal osteocondrodysplasias, from 15 different groups from the Nosology of Genetic Bone Disorders, were enrolled. Patients were classified into five categories (I,IIA,IIB,III,IV), considering the diagnostic certainty of a specific osteochondrodysplasia, based on clinical and radiographic findings (I,IIA,IIB,IV), the previous knowledge (I,IIA,IIB), or not (III,IV) of the molecular basis, as well as, the size/number of exons to be tested. According to this classification, a flowchart was established to aid on the molecular testing strategy: Sanger sequencing (I), or next generation sequencing, at the form of a custom targeted gene panel (IIA,III), or exome sequencing (IIB,III,IV). RESULTS: Phenotype causing variants were found in 61 out of 64 patients (95%). Based on the category system described above, the initial molecular testing positivity was: category I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), and IV (6/6). In seven cases (three in category I, two in category IIA, and two in category III), additional genetic tests applied were able to find the causative mutation, when the initial testing strategy was not successful. For one patient in category I and two in category IIA, in whose no pathogenic mutation was found, no further molecular studies were performed. Among the positive cases, one patient in category IIB had his former clinical diagnosis changed through the molecular testing; two patients form categories IIA and III showed a milder phenotype, in contrast to the expected clinical findings in INPPL1 and HSPG2 osteochondrodysplasias. The molecular basis of three different osteochondrodysplasias (category IV) was unraveled by this study (genes PCYT1A, FN1 e LONP1). A re-analysis of the negative cases allowed the identification of another patient harboring mutation in FN1. Novel variants were found in previously known genes: COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR, and CANT1. CONCLUSIONS: The present study showed that a well-elaborated clinical-radiological characterization allows greater correspondence with the molecular testing. In some cases, phenotypic overlap prevented the definitive diagnosis from being established only by clinical-radiological criteria, requiring the use of additional molecular tests for the correct diagnosis, and consequently, a more accurate genetic counseling. The clinical-radiographic, as well as the molecular findings, contributed to expand the clinical phenotype in certain groups, especially the variants found in patients with HSPG2 and INPPL1 osteochondrodysplasias, besides unraveling the molecular basis of three osteochondrodysplasias

Introdução: A Neoplasia endócrina múltipla do tipo 2 (NEM-2) é uma síndrome tumoral de herança autossômica dominante, na qual os tumores associados são carcinoma medular de tireoide (CMT), feocromocitoma (FEO) e hiperparatireoidismo primário (HPT). Esta síndrome ocorre devido a mutações ativadoras no proto-oncogene RET que alteram a via do receptor tirosina quinase RET. Essas mutações levam à ativação constitutiva de vias de sinalização desregulando o ciclo celular. Segundo os Consensos Internacionais de 2001 e 2009 sobre CMT/NEM-2, portadores de mutações no gene RET, inclusive indivíduos assintomáticos, devem ser submetidos a tireoidectomia total (TT) preventiva, aumentando a chance de cura da doença. Não é recomendado rastreamento clínico em portadores que apresentem somente polimorfismos isolados (variante não patogênica). No entanto, existem indivíduos que carregam variantes genéticas de significado clínico desconhecido (VUS), gerando dúvida quanto à conduta clínica. Atualmente, não se tem conhecimento se essas variantes podem ou não estar envolvidas no aumento do risco ao desenvolvimento de CMT. Dessa forma, o presente projeto analisou diversos aspectos como frequência alélica, estudo in silico, dados na literatura e nos bancos genéticos com o intuito de abranger o entendimento dessas variantes e auxiliar na indicação de conduta clínica adequada aos portadores de RET VUS. Objetivo: Expandir o conhecimento do potencial patogênico das VUS do gene RET, focando na classificação controversa da variante p.Y791F. Métodos: Foi realizado o rastreamento dos exons hotspots do gene RET em indivíduos adultos/idosos-controle e em pacientes com CMT através da técnica de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) e Sequenciamento de Sanger. Foi também analisada a predição computacional da patogenicidade dessas variantes em seis diferentes programas preditivos. Foi feito o levantamento de dados em diversos bancos genéticos. Resultados: As variantes p.Y791N, p.Y791F e p.E511K foram encontradas no rastreamento genético das amostras-controle sequenciadas. Além dessas variantes, foram identificadas e estudadas famílias de pacientes com CMT portadoras das variantes p.V648I e p.K666N. A variante p.Y791F foi identificada em um novo caso somente com FEO. A análise in silico demonstrou que 4/6 programas foram mais informativos, e que 25/48 VUS demonstram alterar a estrutura físico-química da proteína RET. A frequência alélica encontrada nos bancos de dados de indivíduos-controle e indivíduos com tumores foram bastante baixas. Apenas 15/48 VUS possuem dados sobre estudos in vitro. Conclusão: Nossos dados sugerem que a variante RET p.Y791F, quando isolada e sem coocorrência com mutações conhecidas RET, se comporta como um polimorfismo benigno raro, sem associação do aumento do risco ao CMT. Já a associação de p.Y791F com mutações conhecidas RET, como a C634Y, pode levar ao desenvolvimento de fenótipos atípicos, como maior risco ao feocromocitoma. A variante p.V648I é provavelmente um polimorfismo benigno raro, evidenciado pelo seguimento clínico de aproximadamente 15 anos de uma família portadora dessa variante, sem evidências de CMT, FEO ou HPT. Há necessidade de mais dados para classificar apropriadamente as demais VUS; no entanto, devido a possibilidade das variantes p.E511K, K666N e Y791N poderem ser patogênicas, portadores devem ser monitorados clinicamente / Introduction: Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN-2) is a tumor syndrome with autosomal dominant inheritance, in which tumors are associated with medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (FEO) and primary hyperparathyroidism (HPT). This syndrome occurs due to activating mutations in the RET proto-oncogene, which lead to constitutive activation of tyrosine kinase signaling pathways that deregulate the cell cycle. According to the International Consensus on MTC/MEN-2 of 2001 and 2009 one should recommend that RET mutation carriers, including asymptomatic individuals, should undergo prophylactic total thyroidectomy (TT), increasing the chance of cure of the disease. It is not recommended clinical screening in patients that show only isolated polymorphisms (non-pathogenic variant). However, there are individuals who carry genetic variants of unknown clinical significance (VUS), generating doubt about the best clinical management. Currently, there is no consistent knowledge whether these variants may or may not be involved with the increased risk to MTC. The present project has approached the several aspects of these VUS, such as the allele frequency, in silico pathogenic prediction, published data and public databases, in order to increase our knowledge about VUS, in an attempt to contribute by offering appropriate clinical management to VUS carriers. Objective: To expand the knowledge of the pathogenic potential of some of the VUS of the RET gene, focusing especially on the controversial genetic variant p.Y791F. Methods: We performed the mutation screening of hotspots exons of the RET gene of DNA samples of 2061 adult/elderly healthy individuals and of patients with CMT by Sanger sequencing and Next Generation Sequencing (NGS) techniques. Pathogenic predictions of the studied variants were generated using six genetic softwares. Allelic frequency of RET VUS was assessed in different public databanks. Results: Genetic screening of control samples identified the presence of p.Y791N, p.Y791F and p.E511K germline variants. Patients with MTC carrying p.V648I and p.K666N germline variants were localized and family members were screened and clinically investigated. In addition, a new case with pheochromocytoma was found to carry the p.Y791F germline variant. The in silico analyses showed that 4 out of 6 packages were more informative, suggesting physico-chemical structure alteration caused by 25 out of 48 RET VUS. Very low allele frequencies were found in the public databases including healthy individuals and tumor samples. In vitro studies have been performed only for 15 out of 48 RET VUS. Conclusion: Our data strongly suggest that the p.Y791F variant, when occurring in an isolated form, is a benign polymorphism not associated with increased risk of MTC. Conversely, its co-occurrence with bona fide RET mutations as C634Y may lead to modulation of the phenotype, as increasing the frequencies of large and bilateral pheochromocytomas in MEN2A families. Family members carrying the p.V648I variant isolate have been followed clinically for approximately 15 years. As no indication of MCT, pheochromocytoma or hyperparathyroidism development has been documented, we conclude that this variant is a rare RET benign polymorphism. More information is needed to a better characterization of other VUS as E511K, K666N and Y791N. Thus, carriers with these variants should be necessarily examined through a periodic clinical follow up

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

[pt] Prever com precisão a resposta a drogas para uma dada amostra baseado em características moleculares pode ajudar a otimizar o desenvolvimento de drogas e explicar mecanismos por trás das respostas aos tratamentos. Nessa dissertação, dois estudos de caso foram gerados, cada um aplicando diferentes dados genômicos para a previsão de resposta a drogas. O estudo de caso 1 avaliou dados de perfis de metilação de DNA como um tipo de característica molecular que se sabe ser responsável por causar tumorigênese e modular a resposta a tratamentos. Usando perfis de metilação de 987 linhagens celulares do genoma completo na base de dados Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC), utilizamos algoritmos de aprendizado de máquina para avaliar o potencial preditivo de respostas citotóxicas para oito drogas contra o câncer. Nós comparamos a performance de cinco algoritmos de classificação e quatro algoritmos de regressão representando metodologias diversas, incluindo abordagens tree-, probability-, kernel-, ensemble- e distance-based. Aplicando sub-amostragem artificial em graus variados, essa pesquisa procura avaliar se o treinamento baseado em resultados relativamente extremos geraria melhoria no desempenho. Ao utilizar algoritmos de classificação e de regressão para prever respostas discretas ou contínuas, respectivamente, nós observamos consistentemente excelente desempenho na predição quando os conjuntos de treinamento e teste consistiam em dados de linhagens celulares. Algoritmos de classificação apresentaram melhor desempenho quando nós treinamos os modelos utilizando linhagens celulares com valores de resposta a drogas relativamente extremos, obtendo valores de area-under-the-receiver-operating-characteristic-curve de até 0,97. Os algoritmos de regressão tiveram melhor desempenho quando treinamos os modelos utilizado o intervalo completo de valores de resposta às drogas, apesar da dependência das métricas de desempenho utilizadas. O estudo de caso 2 avaliou dados de RNA-seq, dados estes comumente utilizados no estudo da eficácia de drogas. Aplicando uma abordagem de aprendizado semi-supervisionado, essa pesquisa busca avaliar o impacto da combinação de dados rotulados e não-rotulados para melhorar a predição do modelo. Usando dados rotulados de RNA-seq do genoma completo de uma média de 125 amostras de tumor AML rotuladas da base de dados Beat AML (separados por tipos de droga) e 151 amostras de tumor AML não-rotuladas na base de dados The Cancer Genome Atlas (TCGA), utilizamos uma estrutura de modelo semi-supervisionado para prever respostas citotóxicas para quatro drogas contra câncer. Modelos semi-supervisionados foram gerados, avaliando várias combinações de parâmetros e foram comparados com os algoritmos supervisionados de classificação. / [en] Accurately predicting drug responses for a given sample based on molecular features may help to optimize drug-development pipelines and explain mechanisms behind treatment responses. In this dissertation, two case studies were generated, each applying different genomic data to predict drug response. Case study 1 evaluated DNA methylation profile data as one type of molecular feature that is known to drive tumorigenesis and modulate treatment responses. Using genome-wide, DNA methylation profiles from 987 cell lines in the Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) database, we used machine-learning algorithms to evaluate the potential to predict cytotoxic responses for eight anti-cancer drugs. We compared the performance of five classification algorithms and four regression algorithms representing diverse methodologies, including tree-, probability-, kernel-, ensemble- and distance-based approaches. By applying artificial subsampling in varying degrees, this research aims to understand whether training based on relatively extreme outcomes would yield improved performance. When using classification or regression algorithms to predict discrete or continuous responses, respectively, we consistently observed excellent predictive performance when the training and test sets consisted of cell-line data. Classification algorithms performed best when we trained the models using cell lines with relatively extreme drug-response values, attaining area-under-the-receiver-operating-characteristic-curve values as high as 0.97. The regression algorithms performed best when we trained the models using the full range of drug-response values, although this depended on the performance metrics we used. Case study 2 evaluated RNA-seq data as one of the most popular molecular data used to study drug efficacy. By applying a semi-supervised learning approach, this research aimed to understand the impact of combining labeled and unlabeled data to improve model prediction. Using genome-wide RNA-seq labeled data from an average of 125 AML tumor samples in the Beat AML database (varying by drug type) and 151 unlabeled AML tumor samples in The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, we used a semi-supervised model structure to predict cytotoxic responses for four anti-cancer drugs. Semi-supervised models were generated, while assessing several parameter combinations and were compared against supervised classification algorithms.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Os begomovÃrus, vÃrus da famÃlia Geminiviridae transmitidos por mosca branca, tÃm emergido como sÃrios patÃgenos de culturas agronÃmicas e hortÃcolas em regiÃes tropicais e subtropicais de muitos paÃses em todo o mundo. A partir da dÃcada de 80, tÃm aumentado os relatos da disseminaÃÃo da mosca branca, Bemisia argentifolii, e de begomovÃrus provocando impacto devastador nas regiÃes em que ocorrem. No Brasil, estes patÃgenos tÃm sido limitantes para a produÃÃo de tomate (Lycopersicon esculentum) em vÃrias Ãreas de cultivo com incidÃncia crescente desde 1994. No presente trabalho, plantas de tomate exibindo sintomas de infecÃÃo provocada por vÃrus como mosaico, clorose internerval, enrolamento do limbo foliar e reduÃÃo do crescimento, foram coletadas em lavouras de tomate indÃstria em AnÃpolis-GO. O vÃrus foi identificado como pertencente ao gÃnero Begomovirus mediante tÃcnica de PCR usando oligonucleotÃdeos especÃficos que amplificaram fragmentos dos componentes A e B do genoma viral. No capÃtulo I sÃo apresentados os resultados da caracterizaÃÃo molecular e no capÃtulo II, os dados da determinaÃÃo do cÃrculo de hospedeiros e da investigaÃÃo da relaÃÃo do begomovÃrus com o vetor Bemisia argentifolii. O isolado denominado GOANPL, foi clonado e parcialmente seqÃenciado tendo sido obtidas as seqÃÃncias nucleotÃdicas dos genes da capa proteica, Rep e de toda a regiÃo intergÃnica, em um total de 2.130 nucleotÃdeos. A anÃlise comparativa das seqÃÃncias revelou que, em geral, o GOANPL possui relacionamento genÃtico distante com begomovÃrus da Ãsia, Europa e Ãfrica sendo mais prÃximo das espÃcies do Brasil, particularmente, com os begomovÃrus identificados em Minas Gerais (TRMV) e no Distrito Federal (DF-BR2). Com este Ãltimo, apresentou alta homologia em todo o genoma podendo vir a constituir, com o mesmo, uma nova espÃcie. A determinaÃÃo do cÃrculo de hospedeiros do GO-ANPL foi realizada inoculando-se 46 espÃcies vegetais pertencentes a nove famÃlias botÃnicas, sob duas modalidades de inoculaÃÃo: mecÃnica e com a mosca branca. Constatou-se que o GO-ANPL infecta, preferencialmente, plantas da famÃlia Solanaceae como Nicotiana benthamiana, Datura stramonium e Nicandra physalodes. O nÃmero de espÃcies infectadas com o inseto vetor foi superior ao obtido pela inoculaÃÃo mecÃnica e diferiu dos resultados obtidos para outros isolados de begomovÃrus de tomate no Brasil. Os testes foram todos confirmados com hibridizaÃÃo com sondas moleculares, em \"dot blot\"No estudo da relaÃÃo vÃrus-vetor, foram investigados o perÃodo de acesso de aquisiÃÃo do vÃrus (PAA), o perÃodo de acesso de inoculaÃÃo do vÃrus (PAI), e o perÃodo de latÃncia do vÃrus na fase adulta do vetor, empregando-se cinco moscas/planta de tomate \'Santa Clara\' em todos os tratamentos. Para a definiÃÃo do PAA e do PAI, foram testados nove diferentes perÃodos de tempo: 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 20 e 24 horas. Nos testes para determinaÃÃo do PAA, apÃs cada um desses perÃodos seguiu-se uma inoculaÃÃo de 48 horas e para definiÃÃo do PAI, antes de cada perÃodo antecedeu-se um perÃodo de acesso de aquisiÃÃo fixo de 72 horas. Constatou-se que o PAA mÃnimo da mosca branca foi de apenas 0,25 hora, com o qual foram obtidas 6% de plantas infectadas. O percentual de plantas aumentou de 6 para 65% com a extensÃo do PAA de 0,25 para 24 horas. Com relaÃÃo ao perÃodo de acesso de inoculaÃÃo do vÃrus, foram registrados 18% de plantas infectadas com o PAI de 0,5 hora. O percentual elevou-se para 67% quando 24 horas de PAI foram concedidos. Valores isolados de 90 e 100% na transmissÃo viral, tambÃm foram observados. O tÃrmino do perÃodo latente do vÃrus no vetor ocorreu 16h apÃs a aquisiÃÃo do mesmo em planta infectada, considerando os 3% de infecÃÃo observados nas plantas inoculadas. Os dados obtidos indicam que a interaÃÃo vÃrus-vetor à estabelecida desde a fase inicial de desenvolvimento do inseto. Como parte do estudo dessa interaÃÃo, avaliou-se a presenÃa do begomovÃrus GO-ANPL em todas as fases de desenvolvimento do inseto vetor (ovo, 1 ao 4 Ãnstar e adulto) na planta infectada, em adultos com diferentes PAA, na progÃnie de fÃmeas virulÃferas e em adultos cujos estÃgios ninfais desenvolveram-se em tomateiro infectado. A tÃcnica PCR foi empregada para a detecÃÃo do GO-ANPL em mais de 2.500 espÃcimens testados. O vÃrus foi detectado em ninfas do 1 ao 4 Ãnstar que se alimentaram em plantas de tomate infectada, contudo, em ovos provenientes de avirulÃferas, os quais foram ovipositados em planta infectada e coletados apÃs sete dias, o vÃrus nÃo foi detectado. A transmissÃo à progÃnie foi constatada pela detecÃÃo do vÃrus em ovos, ninfas e adultos que se desenvolveram em planta nÃo hospedeira do vÃrus. A transmissÃo transestadial ocorreu com Ãndice elevado e, ao lado da transmissÃo à progÃnie, indica que a retenÃÃo do vÃrus à uma etapa importante da interaÃÃo vÃrusâvetor. A transmissÃo do vÃrus para mudas de tomate, a partir de adultos da progÃnie de fÃmeas virulÃferas, nÃo foi constatada. Contudo, transmissÃo para tomateiro em um percentual de 33% foi verificado nos casos em que a inoculaÃÃo das plantas foi realizada pelos adultos que retiveram o vÃrus da sua fase imatura (transestadial) / The whitefly-transmitted viruses from the family Geminiviridae, genus Begomovirus, have been reported as an economically important pathogen group that affect important crops in tropical and subtropical countries. Since the beginning of the 1980 decade, the occurrence of the whitefly associated to Begomovirus infection has drastically increased worldwide. In Brazil, these pathogens have been responsable for severe economical losses in tomato (Lycopersicon esculentum) orchards and the production has hampered since 1994. In this work, infected tomato plants showing symptoms, such as mosaic, intervein clearing, leaf curling and growth reduction were collected in tomato orchards in AnÃpolis, State of GoiÃs. The virus was identified as a member of the genus Begomovirus by PCR reaction, using specific primers to amplify fragments of A and B components of the virus DNA genome. The Chapter I of this thesis presents the results of the molecular characterization of the virus and the Chapter II shows the determination of its host range and the relationship with its natural vector Bemisia argentifolii. The virus isolate denoted GO-ANPL was cloned and partially sequenced. Part of the sequenced genome (2.180 nucleotides long) corresponded to the coat protein and Rep genes and comprised the entire intergenic region. Sequence comparison revealed that the GO-ANPL isolate is distantly related to the begomoviruses found in Asia, Europe and Africa, and it is related to other begomoviruses reported in Brazil. The virus isolate showed to be more closely related to viruses found in the State of Minas Gerais (TRMV isolate) and in the Federal District (isolate DF-Br2). The highest homology was observed with the isolate DF-Br2 and it may represent a new specie of the genus Begomovirus. In order to determine the virus host range, 46 plant species from nine different botanical families were mechanically and using the virus vector inoculated. The GO-ANPL isolate preferentially infected plants of the family Solanaceae as Nicotiana benthamiana, Datura stramonium and Nicandra physalodes. The number of infected plants was higher when they were inoculated by the virus vector, and the results were distinct from those obtained for other begomoviruses reported in Brazil. Viruses infections were all confirmed by dot blot hybridization using specific molecular probes to the virus. 4 To study virus/vector interaction, the acquisition access period (AAP), inoculation access period (IAP), and the latent period were determined transfering five whiteflies per plant and using tomato cv. Santa Clara as the host. For the AAP and IAP, nine different time periods were tested: 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 20 and 24 h. The minimal AAP determined was 0.25 h, after which, 6% of the tested plants became infected. The number of infected plants increased to 65% with an AAP of24h.Afteran IAP of 0.5 h, 18% of the plants were infected and their number increased to 67% after an IAP of 24 hours. The latent period was considered to be 16 h, after which, 3% of the inoculated plants became infected. The results of AAP, IAP and latent period seem to indicate an early interaction between virus and vector starting at early stages of vector development. The presence of the GOANPL was determined in all stages of the vector (eggs, 1st to 4th instar and adults) in infected plants, in adults under different AAPs, in the progenies of viruliferous females, and in adults originated from nymphs developed from infected plants. More than 2.500 insects were tested by PCR to detect the GO-ANPL isolate. The virus was detected in nymphs from the 1st to 4th instar that had fed in infected plants and no virus was found in eggs from aviruliferous female that had been laid in infected plants. Transmission to the progenies was observed, since the virus was detected in all stages of insect development from eggs to adults. High level transmission was also observed in newly emerged adults that had acess to virus-infected plants as immatures. This fact, in addition to the transmission to the progenies, suggests that virus retention is an important part of virus/vector interaction. No transmission was observed from adults originated from viruliferous females. However, 33% of virus transmission was obtained when adults that retained virus from their early larval stages were employed