Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-09T03:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336850.pdf: 4039664 bytes, checksum: cbc6c96957200c358eb257cc7593d3c3 (MD5) Previous issue date: 2015 / A espermatogênese, processo que ocorre nos túbulos seminíferos (TS), é controlada por uma rede de fatores endócrinos e outros fatores regulatórios. Dentre eles, os hormônios da tireoide (HT), a 1a,25(OH)2-vitamina D3 (1,25-D3), e o 17ß-estradiol (E2) são críticos para a manutenção da reprodução. Os resultados obtidos neste estudo, utilizando células de Sertoli de ratos de 11 dias de idade, mostraram que concentrações muito baixas de T3 reverso (T3r) estimulam a captação de cálcio nestas células depois de 1 minuto de exposição. Este efeito estimulatório envolve alterações no fluxo iônico, uma vez que canais de cálcio dependentes de voltagem, canais de potássio, canais de cloreto e o cálcio intracelular estão envolvidos no efeito do hormônio. Além disso, sugere-se que a integrina avß3 atue como um receptor para o T3r, evidenciado pelo bloqueio do influxo de cálcio na presença do RGD (um inibidor da interação integrina-ligante). Também foi demonstrado que a entrada de cálcio estimulada pelo hormônio é dependente de PKC e ERK e que o T3r estimula a secreção celular, mediada pelo receptor de integrina. Além do T3r, o metabólito T2 também apresentou um efeito estimulatório na captação de cálcio tanto em testículos (10-13 M e 10-7 M) quanto em células de Sertoli isoladas (10-12 M e 10-15 M). Este efeito ocorreu com apenas 30 segundos de exposição ao hormônio. Estes dados apontam que os metabólitos T3r e T2 apresentam efeitos importantes nas células de Sertoli de ratos imaturos. O T3r modula a entrada de cálcio e a secreção celular, o qual pode ter uma função na regulação de uma variedade de processos intracelulares envolvidos na fisiologia da reprodução masculina, por outro lado, mais estudos devem ser realizados para compreender as funções do T2 nestas células. Neste estudo, também foi demonstrado que o E2 (10-6 M), assim como a 1,25-D3 (10-9 M), estimulam a captação de cálcio em testículos de ratos de 30 dias de idade e parece que ambos os hormônios dependem dos receptores clássicos do E2 (ESR1 e ESR2) para que este efeito ocorra. Este evento estimulado pelo E2 envolve a participação de canais de cálcio dependentes de voltagem, canais de cloreto e do cálcio intracelular. Além disso, PLC, PKA, PKC e MAPK estão envolvidas neste efeito estimulatório. Resultados semelhantes já foram descritos para a 1,25-D3 em testículos de ratos de 30 dias. Como estas vias de sinalização são utilizadas por diferentes hormônios esteróides para ligar ações iniciadas na membrana com ações nucleares, verificou-se o envolvimento da 1,25-D3 na expressão de genes envolvidos na sinalização do E2 e no ciclo celular. A quantificação dos níveis detranscritos de genes relacionados à sinalização do E2 e ao ciclo celular, em cultura de TS, foi realizada usando o método quantitativo de PCR em tempo real. Investigando os efeitos da 1,25-D3 na expressão dos receptores de estrogênio (ESR), observou-se que a expressão de ESR1 e ESR2 foi inibida quando os TS foram tratados com 1,25-D3, E2, ou ambos. Além disso, a 1,25-D3 inibiu a expressão gênica e protéica das ciclinas A1 e B1, enquanto que o E2 inibiu somente a expressão do gene da ciclina A1, porém inibiu a expressão de ambas proteínas (ciclinas A1 e B1). Para a expressão das proteínas p16 e p53, o tratamento dos TS com a 1,25-D3 aumentou a expressão das mesmas, já o tratamento com E2 aumentou somente os níveis da proteína p16. Estes resultados mostram que a 1,25-D3 pode regular a sinalização do E2, uma vez que este secosteróide estimula a expressão do gene Cyp19, assim como, diminui a expressão dos genes ESR1 e ESR2. Em TS, as ciclinas A1 e B1 são altamente expressas nas células germinativas que progridem através da espermatogênese, assim, a diminuição da expressão dos genes destas ciclinas e o aumento da expressão das proteínas p16 e p53 induzida pela 1,25-D3 em TS sugere que este metabólito ativo da vitamina D possa controlar o balanço entre proliferação/diferenciação na espermatogênese.<br> / Abstract : Spermatogenesis which takes place in the seminiferous tubules (ST) is a complex process controlled by a network of endocrine and other regulatory factors. In this context, thyroid hormones (TH), 1a,25(OH)2-vitamin D3 (1,25D3), and 17ß-estradiol (E2) are critical for the maintenance of normal reproduction. The results here presented show that very low concentrations of reverse T3 (rT3) are able to increase calcium uptake in 11 day-old rat Sertoli cells after 1 min of exposure. This stimulatory effect involves changes in ionic flow since voltage-dependent calcium channels, potassium and chloride channels and intracellular calcium are involved in the hormone effect. Also, our findings suggest that calcium uptake stimulated by rT3 may be mediated by integrin avß3 receptor in as much as that effect was blocked in the presence of the RGD peptide (an inhibitor of integrin-ligand interactions). In addition, it was demonstrated that calcium uptake stimulated by rT3 is PKC and ERK-dependent and the outcomes indicate that rT3 also stimulates cellular secretion via integrin receptor. Beyond rT3, the T2 metabolite also showed a stimulatory effect on calcium uptake in both testes (10-13 M and 10-7 M) and in isolated Sertoli cells (10-12 M and 10-15 M). This effect occurred with only 30 seconds of exposure to the hormone. These data indicate that rT3 and T2 metabolites have significant effects on Sertoli cells of immature rats.The rT3 modulates the calcium entry and cellular secretion, which might play a role in the regulation of a plethora of intracellular processes involved in male reproductive physiology, on the other hand, further studies must be conducted to understand the functions of T2 in these cells. Our study also demonstrated that E2 (10-6 M), as well as 1,25-D3 (10-9 M), stimulated calcium uptake in 30-day-old rat testis and it seems that the classical E2 receptors (ESR1 and ESR2) are necessary for this effect to occur. The event stimulated by E2 involves the voltage-dependent calcium channels, chloride channels and intracellular calcium participation. In addition, PLC, PKA, PKC and MAPK are involved in this stimulatory effect. Similar results have been described for 1,25-D3 in 30-day-old rat testis. In so far as these signaling pathways are used by various steroid hormones to connect membrane-initiated actions to nuclear actions, the involvement of 1,25-D3 in the expression of genes involved in E2 signaling and in the cell cycle was verified. The quantification of transcripts levels from genes related to the E2 signal and the cell cycle was performed in TS culture using the RT-PCR. Investigating the 1,25-D3 effects on the estrogen receptor (ESR)expression, it was observed that ESR1 and ESR2 expression was inhibited when TS were treated with 1,25-D3, E2, or both. Moreover, 1,25-D3 inhibited the cyclin A1 and B1 gene and protein expression while E2 only inhibited the cyclin A1 gene expression but inhibited the expression of both proteins (cyclin A1 and B1). TS treatment with 1,25-D3 increased the expression of p16 and p53 proteins whereas the E2 treatment only increased p16 protein levels. These results show that 1,25-D3 can regulate E2 signal, since this secosteroid stimulates Cyp19 gene expression as well as decreases ESR1 and ESR2 gene expression. In TS, cyclins B1 and A1 are highly expressed in germ cells that progress through spermatogenesis, thus the decrease of these cyclins genes expression and the increase of the p16 and p53 proteins expression induced by 1,25-D3 suggests that the active metabolite of vitamin D can control the balance between proliferation / differentiation in spermatogenesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T07:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:05:38Z : No. of bitstreams: 1 186849.pdf: 14591937 bytes, checksum: 07a90acb1d52b51a7873c4af3e16ac65 (MD5) / As células de Sertoli têm um importante papel no desenvolvimento e na manutenção da espermatogênese em testículos de mamíferos. A expressão de receptores funcionais para T3 no testículo e a demonstração de que este hormônio afeta as funções das células de Sertoli sugerem estas células como um modelo para o estudo da regulação hormonal das proteínas do citoesqueleto. Foram descritos vários estudos sobre os efeitos dos hormônios da tireóide na proliferação e diferenciação das células de Sertoli. Entretanto, ainda não forma descritas as ações do T3 especificamente no citoesqueleto testicular durante o desenvolvimento sexual de ratos. Os objetivos deste trabalho foram estudar a ontogenia da vimentina, o efeito dos tratamentos in vivo e in vitro com T3 no imunoconteúdo e na incorporação in vitro de 32P ortofosfato na vimentina em testículos de rato durante o desenvolvimento sexual, avaliar os efeitos do tratamento in vivo com T3 nos níveis séricos dos hormônios tireoidianos, do TSH e do triacilglicerol nas fases imatura, púbere e adulta e avaliar as alterações morfológicas causadas pelo tratamento in vivo nos túbulos seminíferos na fase imatura. Para a ontogenia do imunoconteúdo e da fosforilação da vimentina, e para os estudos de tratamento in vitro foram utilizados ratos de 15, 35 e 45 dias de idade. No estudo dos efeitos in vivo foram utilizados ratos de 8, 28 e 38 dias de idade que foram tratados com T3 80 µg/Kg de peso corporal durante 7 dias consecutivos, até atingirem os 15, 35 e 45 dias respectivamente. No dia do experimento o sangue foi coletado para as determinações dos níveis hormonais e de triacilglicerol. O tratamento in vivo com hormônio T3 produziu alterações no níveis de T3, T4, TSH e triacilglicerol condizentes com um estado de hipertireoidismo induzido. Para análise morfológica, um testículo foi fixado para microscopia óptica e o contralateral para eletrônica. A fração citoesquelética enriquecida em filamentos intermediários foi obtida, e o imunoconteúdo e a incorporação in vitro de ortofosfato radioativo forma quantificados por densitometria óptica da banda correspondente à vimentina, Os estudos morlógicos apresentaram túbulos seminíferos mantendo a integridade funcional e estrutural de epitélio seminífero com lúmen tubular formado. Nas células de Sertoli da ratos tratados, observou-se aumento na quantidade de retículo endoplasmático rugoso, aparelho de Golgi mais desenvolvido e presença de lipídeos dispersos dentro e fora das células, indicando que a célula estava com intensa atividade de síntese e processamento de proteínas e que o tratamento estimulou a maturação celular. Os resultados também demonstraram que a vimentiva é expressa ao longo do desenvolvimento sexual, onde o imunoconteúdo diminui da fase imatura para a púbere e volta a aumentar na idade adulta. Tanto o tratamento in vivo quanto in vitro com o hormônio promoveram aumento no imunoconteúdo e na fosforelação da vimentina de testículos de retos nas fases imatura e adulta do desenvolvimento sexual. Nos estudos do efeito in vitro, demonstrou-se que a dose de 0,1 µM de T3 estimulou a fosforilação sem afetar o imunoconteúdo da vimentina, enquanto a dose de 100 µM apresentou o efeito oposto. Todavia, as doses intermediárias (1 µM e 10 µM) induziram aumento na fosforilação e no imunoconteúdo da vimentina insolúvel em Triton X-100. O T3 pode estar envolvido em uma variedade de processos que regulam a organização do citoesqueleto ou com os elementos envolvidos em transdução de sinais intracelulares. Nossos resultados sugerem que durante a maturação sexual, os mecanismos de regulação hormonal são importantes no equilíbrio entre polimerização e despolimerização dos filamentos intermediários de testículos de ratos. Desse modo, os mecanismos pelos quais o T3 estimula a fosforilação e o imunoconteúdo da vimentina parecem envolver diretamente atividade de quinases e/ou fosfatases mediando vias de transdução de sinais.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276693.pdf: 1653605 bytes, checksum: 92e108206ef61f401325ee0b2476c79f (MD5) / Tendo em mente que a 1,25D3, produto final do metabolismo da vitamina D3 é essencial para a integridade do sistema reprodutor masculino, e que, a homeostase do Ca+2 desempenha papel chave em muitos processos envolvidos na espermatogênese, avaliamos o efeito em nível membranar da 1,25D3 sobre o metabolismo do Ca+2 em testículo inteiro e célula de Sertoli de ratos imaturos. Foi demonstrado que em após 60 minutos de pré-incubação com o hormônio, não hove variação da captação basal de 45Ca+2 nos tempos de incubação de 30, 60, 150, 300 e 600 segundos. No tempo de incubação de 60 segundos, foi verificado que a 1,25D3 tem a capacidade de aumentar a captação de 45Ca+2 do meio extracelular em diferentes doses em ambos modelos experimentais, sendo este evento independente da ação genômica. Em testículos, observou-se que doses entre 10-15M e 10-9M foram eficazes em aumentar a captação de 45Ca+2, sendo o maior efeito evidenciado da dose de 10-10M (106%). Utilizando esta dose, foi demonstrado que os canais de CCDV do tipo L e T são as principais vias de entrada do íon nas células testiculares, e que há necessidade da manutenção das correntes de K+ e Cl- para que ocorra este evento. Em células de Sertoli também não foi verificada a variação da captação basal de 45Ca+2. Neste sistema, foi verificado que no tempo de 60 segundos de incubação, o hormônio foi capaz de elevar a captação de 45Ca+2 entre as doses de 10-12M e 10-8 M, onde a dose de 10-12 M aumentou em torno de140% a capatação do íon. Já a dose de 10-10 M elevou em 89% o influxo do íon. Desta forma, utilizando a dose de 10-10 M, verificamos que as células de Sertoli comportam- se assim como os testículos: há necessitadade da ativação dos CCDV-L e T para a entrada do Ca+2 assim como das correntes de K+ e Cl-. Também foi verificado que em células de Sertoli há necessidade da ativação das proteínas PKC e p38MAPK para a capatação de Ca+2 estimulada pela 1,25D3. Alé, disso, as proteínas PI3K e ERK1/2 também estão em parte envolvidas neste processo. Por fim, avaliamos que a integridade dos microtúbulos e a atividade dos canais ClC3 faz-se necessária para que ocorra a entrada do íon nas células de Sertoli, sendo esta elevação do íon necessária para que ocorra o processo de secreção celular já demosntrada anteriormente pela 1,25D3.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T14:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221517.pdf: 138242 bytes, checksum: 3e675de5f0d60d02b1a2e6bcdf1cf546 (MD5) / Os hormônios tireoideos classicamente atuam através da ligação com receptores nucleares. No entanto, estas iodotironinas também podem atuar por mecanismos não-genômicos ou extranucleares sinalizando novas vias de regulação celular. O objetivo deste estudo foi investigar o envolvimento da síntese de proteínas na ação estimulatória dos hormônios tireoideos no transporte de aminoácidos e caracterizar os canais de potássio envolvidos no efeito hiperpolarizante destes hormônios em células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. O sistema A de transporte de aminoácidos e a técnica eletrofisiológica são metodologias utilizadas neste trabalho para os estudos moleculares de hormônios e fármacos em ensaios biológicos in vitro. Recentemente foi demonstrado que o T3 estimula o transporte de aminoácidos e induz uma hiperpolarização no potencial de repouso de células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. Os resultados do presente trabalho demonstraram que o T4 (tiroxina) estimula o transporte do aminoácido neutro [4C]-MeAIB e induz uma hiperpolarização no potencial de repouso de células de Sertoli, assim como demonstrado anteriormente pelo hormônio T3. O T4 estimulou o transporte de [14C]-MeAIB numa faixa de concentração mil vezes menor do que o melhor estímulo observado para o T3 e a ação estimulatória do T4 no transporte de aminoácidos não foi alterada com a síntese protéica inibida por ciclo-heximida. Já, para o T3, o efeito estimulatório no transporte de aminoácidos foi parcialmente inibido com a síntese protéica previamente bloqueada, sugerindo que este hormônio necessita da síntese protéica ativa para regular eficientemente esta ação. Nos estudos eletrofisiológicos, o T4 demonstrou um efeito hiperpolarizante nas células de Sertoli menor quando comparado com o T3. O efeito hiperpolarizante do T3 no potencial de repouso das células de Sertoli foi totalmente inibido pelo verapamil e parcialmente inibido por tolbutamida, indicando o envolvimento de canais de cálcio dependentes da voltagem e de canais de K+ ATP, respectivamente, neste mecanismo. Na presença de TEA, o efeito hiperpolarizante do T4 e do T3 no potencial de repouso das células de Sertoli foi totalmente inibido, caracterizando o envolvimento de canais de K+ dependentes da voltagem nesse mecanismo. Na presença de apamina, o efeito hiperpolarizante do T4 foi totalmente bloqueado, caracterizando o envolvimento de canais de K+ dependentes de Ca++ neste mecanismo. Destes resultados podemos concluir que o T4 e o T3 estimulam o transporte de aminoácidos por mecanismos diferentes, uma vez que a ação estimulatória do T4 no transporte de aminoácidos é mais potente e independe da síntese protéica ativa.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T07:24:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:05:23Z : No. of bitstreams: 1 186336.pdf: 9976751 bytes, checksum: 23f7b81ec4c22498bdd30e552cb9d3b0 (MD5)

Resumo:Estudar o desenvolvimento das gônadas, permite entender alguns fatores que podem interferir no seu desenvolvimento e futuramente no perfil reprodutivo do animal na vida adulta. Considerando a influência da condição corporal e fisiológica das vacas sobre o desenvolvimento dos órgãos fetais durante a gestação, este trabalho avaliou o desenvolvimento morfológico testicular e ovariano de fetos bovinos da raça Nelore e comparou-os com a condição corpórea materna (revestimento de gordura - RGC; e peso da carcaça - PC; idade, população folicular ovariana total - PFOT; e antral - PFOA). Foram coletados 372 fetos (210 fêmeas e 168 machos), com idade gestacional de 3 a 8 meses, de bovinos da raça Nelore, abatidos em frigorífico da região de Araçatuba, SP. Amostras de sangue das vacas foram coletadas para quantificação de leptina, insulina e progesterona plasmática. O peso (g) e o volume (mm³) das gônadas fetais foram mensurados. As gônadas fetais foram processadas com técnica de histologia clássica e foram feitos cortes histológicos de 3 μm de espessura, em intervalos médios de 210 μm. Durante toda a gestação o peso e o volume total dos ovários dos fetos apresentam correlação positiva com a quantidade de folículos ovarianos fetais (QFOF) (r=0,78, p<0,0001 e r=0,80, p<0,0001) e o peso e volume testicular com a quantidade de células de Sertoli (CS; r=0,84, p<0,0001 e r=0,92, p<0,0001), de Leydig (CL; r=0,80, p<0,0001 e r=0,90, p<0,0001) e germinativas (CG; r=0,84, p=<0,0001 e r=0,93, p<0,0001). A idade materna foi correlacionada com a quantidade de folículos ovarianos primários (r=0,14, p=0,05) e de CG nos testículos fetais (r=0,10, p=0,04). A PFOT foi correlacionada negativamente nas fêmeas com a QFOF (r=- 0,31, p=0,001) e nos machos com a quantidade de CS nos testículos (r=0,18 e p=0,03), e a insulina das vacas com a QFOF (r=-0,18 e p=0,02) e com...(Resumo Completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:The study of gonadal development allows to understand some factores that can interfere in its development and futurely, in animal reproductive profile, in adult life. Considering the cows body condition and physiological influences on the development of fetal organs during the pregnancy, This experiment aimed to evaluate the fetal testicular and ovarian morphological development in beef cattle of Nelore breed and compare it to maternal body condition (carcass weight - CW, carcass yield grade - CYG, age and antral follicle counts - ACF). There were collected 372 bovines fetus from Nellore cows (210 females and 162 males), aging between 3 and 8 months, obtained from a slaughterhouse in Araçatuba region - SP. Blood samples from the cows were collected to leptin, insulin and progesterone plasmatic quantification. The gonadal weight (g) and volume (mm³) were measured. The fetal gonads were submitted to classical histology proceedings and 3 μm thickness were cut, in 210 μm intervals. During gestation, both fetus ovarian weight and volume were correlated with the number of ovarian follicles (NOF) (r=0,78, p<0,0001 and r=0,80, p<0,0001) and in male, both testicular weight and volume were correlated with Sertoli cells count (CS; r=0,84, p<0,0001 and r=0,92, p<0,0001), Leydig cells count (LC; r=0,80, p<0,0001 and r=0,90, p<0,0001) and germ cells count (GC; r=0,84, p=<0,0001 and r=0,93, p<0,0001). Maternal age was correlated with primary follicles count (r=0,14, p=0,05) in the fetal ovaries...(Complet4 abstract click eletronic acess below) / Orientador:Guilherme de Paula Nogueira / Banca:Manoel Francisco de Sá Filho / Banca:Flávia Lombardi Lopes / Mestre

Orientador: Wellerson Rodrigo Scarano / Banca: Flávia Karina Delella / Banca: Glaura Scantamburlo / Resumo: A infertilidade acomete 10-15% dos casais em idade reprodutiva e o fator masculino pode ser responsável por 30-50% dos casos. A fertilidade masculina e o processo de espermatogênese estão diretamente relacionados à capacidade das células de Sertoli em produzir fatores determinantes para o desenvolvimento das células germinativas. Apenas as célulasde Sertolipossuem receptores paratestosteronaeFSHe, portanto, estascélulassão as principais reguladoras da espermatogênese. Estudos sugerem que 60-70% dos casos de infertilidade masculina são considerados idiopáticos, uma vez que os mecanismos moleculares envolvidos na espermatogênese ainda são desconhecidos. Estudos recentes relatam que homens oligozoospérmicos apresentam mudança no padrão de metilação do DNA nos espermatozoides,nas regiões que controlam a expressão dos genes regulados por imprintingH19 e IGF-2. Um dos grandes responsáveis para a alteração do padrão de metilação desses genes são os fatores ambientais, especialmente compostos orgânicos de alta toxicidade, como o 2,3,7,8- Tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD). Modelos experimentais de exposição (camundongos) demonstraram que o TCDD ocasiona baixa contagem espermática e atraso na puberdade. O presente estudo correlacionou a ação do composto TCDD sobre as células de Sertoli humanas (in vitro) e sua ação na região controladoras de imprinting (ICR1) dos genes H19 e IGF-2. Inicialmente foi realizada a caracterização da amostra em estudo e foi constatado que esse tipo celular apresentrameilação entre 0 a 25% e é homozigota para os sítios polimórficos dos SNPsrs2839704 e rs10732516. Após 48 de exposição ao TCDD obervou-se tendência de aumento da metilação global do DNA da linhagem HSeC e discreto aumento da metilação dos sítios 4 e 7 de ligação do fator CTCF. A análise da expressão dos genes H19 e IGF2 deve ser finalizada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Infertility affects 10-15% of couples on reproductive age and male factor may be responsible for 30-50% of cases. Male fertility and the spermatogenesis process are directly related to the ability of Sertoli cells to produce factors for germ cells development. Only Sertoli cells have receptors for testosterone and FSH, and therefore, these cells are the main regulators of spermatogenesis. Studies suggest that 60-70% of male infertility cases are considered idiophatic, once molecular mechanisms involved in spermatogenesis are still unknown. Recent studies report that oligozoospermic men showed an alteration of the DNA methylation pattern in the sperm, specifically in regions that control gene expression of genes regulated by imprinting: H19 and IGF2. Largely responsible for changing the methylation pattern of these genes are environmental factors, specialy organic compounds with high toxicity, such as 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin (TCDD). Experimental models of exposure (mice) showed that TCDD causes low sperm count and delayed puberty. This study correlated the action of the compound TCDD on human Sertoli cells (in vitro) and its action on imprinted control region region (ICR1) of H19 and IGF-2 genes. It was initially performed the sample characterization and it was found that this cell type shows methylation between 0-25% and it is homozygous for the polymorphic sites of SNPs rs2839704 and rs10732516. After 48h of exposure to TCDD we observed a trend to increase global DNA methylation in HSEc lineage and also a slight increase in methylation status in the CTCF binding sites 4 and 7. Analysis of H19 and IGF2 expression must be completed to the best correlation between changes in the DNA methylation pattern and expression of these genes. Despite the important results obtained in this work, it is necessary to deepen the studies involving toxic agents such as TCDD and changes... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Wellerson Rodrigo Scarano / Resumo: A fertilidade masculina e a espermatogênese estão diretamente ligadas à capacidade das células de Sertoli em produzir fatores associados ao desenvolvimento das células germinativas. As células de Sertoli expressam receptores para FSH e testosterona e são os principais reguladores da espermatogênese. Aproximadamente 60-70% dos casos de infertilidade masculina são considerados idiopáticos, devido aos mecanismos moleculares envolvidos na espermatogênese ainda serem desconhecidos. Estudos recentes relatam que os microRNAs (miRNAs), são capazes de modular a função testicular durante a espermatogênese e sua expressão alterada pode estar envolvida na infertilidade masculina. miRNAs podem desempenhar papel importante na resposta aos xenobióticos que têm todas as consequências adversas para a saúde. Um grupo importante de compostos orgânicos com potencial tóxico são as dioxinas, como o 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD). Modelos experimentais de exposição ao TCDD, em camundongos, demonstraram que sua exposição provoca baixa contagem de espermatozóides e atraso na puberdade. Neste estudo, analisamos o efeito do TCDD nas células de Sertoli humanas in vitro após 72h a uma dose de 10nM. Nossos resultados mostraram que as enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase diminuíram sua atividade e confirmaram o estresse oxidativo causado pelo TCDD nesse tipo celular. 78 miRNAs apresentaram expressão alterada, com regulação positiva de 73 e regulação negat... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Male fertility and spermatogenesis are directly linked to the ability of Sertoli cells to produce factors associated with the development of germ cells. Sertoli cells express receptors for FSH and testosterone, and are the major regulators of spermatogenesis. Approximately 60-70% of male infertility cases are considered idiopathic, due to the molecular mechanisms involved in spermatogenesis are still unknown. Recent studies report that microRNAs (miRNAs) are capable of modulating spermatogenesis in testicular function and its altered expression may be involved in male infertility. miRNAs may play a role in response to xenobiotics that have all the adverse consequences for health. An important group of organic compounds that are potentially toxic are the dioxins such as 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Experimental models of exposure to TCDD in mice showed that its exposure causes low sperm count and delayed puberty. In this study, we analyzed the effect of TCDD on human Sertoli cells after a exposure of 72h in vitro at a dose of 10nM. Our results showed that the antioxidant enzymes catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase decreased their activity and confirmed the oxidative stress caused by TCDD in this cell type. 78 miRNAs showed altered expression with upregulation of 73 miRNAs and downregulation of 5 miRNAs compared to the control group. Regarding the gene expression profile, 51 genes showed deregulated, of which 46 genes with upregulation and d... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T16:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 265413.pdf: 3730048 bytes, checksum: f61fcefd12bae9a7111b586b424409ab (MD5) / Hormônios esteróides, vitamina D, retinóides e hormônios da tireóide estimulam respostas celulares através de mecanismos genômicos e não-genômicos. No presente trabalho, hormônios com ação genômica: Tiroxina (T4) e 1?,25-diidróxivitamina D3 (1?,25(OH)2D3 ou 1,25D), foram estudados sob o ponto de vista não-genômico através de dois diferentes sistemas de membrana plasmática: transporte de aminoácidos em testículos de ratos e fluxo de cloreto em células de Sertoli TM4. As células de Sertoli de testículos de mamíferos são células secretoras que além de proteínas, nutrientes e fatores de crescimento, secretam um fluido rico em cloreto (Cl-) e potássio (K+) no lúmen dos túbulos seminíferos que são críticos para espermatogênese. Primeiramente, os resultados desse trabalho demonstraram que os canais de Ca2+ e os canais de K+ dependentes de ATP (K+ATP) são requeridos para o efeito estimulatório do hormônio T4 no transporte de aminoácidos em testículos de ratos imaturos. Além disso, os canais de Cl- e os canais de K+ dependentes da baixa condutância de Ca2+ (SKCa) estão parcialmente envolvidos nesse mecanismo. Esse efeito não-genômico do T4 é dependente da proteína cinase C (PKC) e aponta o T4 como um importante regulador metabólico da função testicular. Posteriormente foi demonstrado o efeito estimulatório da 1,25D no transporte de aminoácidos em testículo de ratos de uma forma dependente da concentração, dependente da idade e específico para esse hormônio. O requerimento dos canais de Ca2+, dos canais SKCa, da proteína cinase A (PKA) e da síntese de proteínas indicam efeitos rápidos e prolongados da 1,25D nesse mecanismo. Através de estudos eletrofisiológicos foi demonstrado que a 1,25D aumenta a permeabilidade ao íon cloreto na membrana plasmática de células de Sertoli TM4 em potenciais despolarizantes através do receptor VDR (receptor de vitamina D) e de uma forma dependente das proteínas PKA e PKC. Com a utilização de análogos esteróis da vitamina D (VDS) específicos para o estudo de respostas não-genômicas, células TM4 individuais foram tratadas com diferentes VDS, 1,25D e 25-diidróxivitamina D3 (25D) (metabólitos naturais); 1?,25(OH)2-lumisterol D3 (JN; agonista não-genômico), e/ou 1?,25(OH)2-vitamin D3 (HL; antagonista não-genômico). Os resultados demonstraram que: 1) 1,25D, 25D e JN são agonistas no estímulo da permeabilidade ao Cl-; 2) HL bloqueia o efeito desses agonistas confirmando a presença de um VDR alternativo de membrana (VDRmem ou VDR-AP). Experimentos de capacitância celular e videomicroscopia demonstraram que a 1,25D estimula processos secretórios em células TM4 importantes para a função reprodutiva. Ensaios de ligação hormônio-receptor e análises computacionais demonstraram que dois curcuminóides, a curcumina (CM) e a bisdemetóxicurcumina (BDC), polifenóis ativos da planta turmérica, se ligam com alta afinidade ao VDR e mais favoravelmente ao VDR-AP. Dessa forma, para verificar a especificidade de ação da 1,25D no VDR-AP, o efeito da CM e da BDC foi testado nas correntes de Cl- em células TM4. Em baixas concentrações, CM e BDC demonstraram um mecanismo de ação similar a 1,25D no aumento da permeabilidade ao íon Cl-. Em altas concentrações, CM e BDC parecem ativar correntes de Cl- através dos canais de cloreto reguladores da condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR). Os dados obtidos com esse trabalho contribuem para o entendimento de novas vias de ação nas células de Sertoli desencadeadas por hormônios e substâncias relacionadas importantes para a homeostasia endócrina e exócrina do testículo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T23:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 295248.pdf: 1309608 bytes, checksum: 877fe2be839c033011ce5cf1e14a4f2b (MD5) / A atividade secretória das células de Sertoli é dependente das funções dos canais iônicos e da síntese de proteínas e é essencial para a espermatogênese. Além das ações genômicas dos hormônios tireóideos (HT), ações não-genômicas da tiroxina (T4) e do 3,5,3'-L-triiodotironina (T3) são relatados em testículos de ratos imaturos. O objetivo deste trabalho foi estudar o mecanismo de ação do T4 no transporte de aminoácidos e investigar a função do receptor de integrina neste evento. Também, esclarecer se o efeito estimulatório do T4 no transporte de aminoácidos e a captação de Ca2+ culminam em secreção celular. Descrevemos que o efeito estimulatório do T4 no transporte de aminoácidos parece ser mediado por um receptor de integrina presente na membrana plasmática, já que o tetrac (inibidor da ação do T4 na integrina), assim como o peptídio RGD (bloqueador da ligação do T4 ao receptor ?v?3) foram capazes de anular o efeito do hormônio. Além disso, o T4 aumenta a captação de Ca2+ e o Ca2+ intracelular aumenta a atividade nuclear, mas esta ação genômica parece não influenciar na função secretória das células de Sertoli iniciada pela interação do T4 ao receptor de integrina. Além do mais, o citoesqueleto e os canais de cloreto do tipo ClC-3, envolvidos na secreção celular, contribuem para as respostas rápidas das células de Sertoli que culminam na exocitose. Uma importante conclusão deste trabalho é que as vias de sinalização ativadas pela interação do T4 ao receptor de integrina convergem para determinar respostas rápidas das células de Sertoli, como a exocitose. A compreensão do mecanismo pelo qual o T4 promove o evento rápido de secreção celular, e independe da atividade nuclear, é um campo de investigação e pode levar à identificação de novos alvos terapêuticos.