Diante do aumento global da resistência microbiana, cada vez mais as combinações de antimicrobianos são utilizadas na tentativa de obter uma atividade sinérgica eficaz que possa ser utilizada na prática clínica. O objetivo deste trabalho foi comparar a atividade de polimixina B isoladamente e em combinação com tigeciclina e carbapenêmicos (ertapenem e meropenem), frente a isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos. Foram selecionados quatro isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos, sendo três isolados produtores de carbapenemases (KPC, NDM, OXA-48-like) e um não produtor de carbapenemases (NPC). A avaliação da atividade sinérgica antimicrobiana foi realizada por ensaio de time-kill com as seguintes concentrações de cada antimicrobiano: tigeciclina 1mg/L, meropenem 1mg/L e ertapenem 0,5mg/L, que correspondem aos pontos de corte de sensibilidade do CLSI (2016). Para polimixina B, foram utilizadas diferentes concentrações de acordo com o perfil de susceptibilidade do isolado: para os isolados sensíveis, utilizou-se 0,5x; 1x e 2x a CIM do isolado; para o isolado resistente, foram utilizados 0,5x; 1x e 2x o ponto de corte de sensibilidade do CLSI (2 mg/L). Foi considerada sinérgica a combinação com redução ≥ 2 logs do inoculo inicial em comparação ao antimicrobiano sozinho mais ativo. As combinações de polimixina B em diferentes concentrações (0,5; 1 e 2mg/L) com meropenem apresentaram atividade sinérgica para a cepa produtora de NDM (CIM polimixina B 1 mg/L; CIM meropenem 8 mg/L) As combinações de polimixina B com tigeciclina foram sinérgicas apenas na concentração de polimixina B de 0,125 mg/L para cepa produtora de OXA-48-like (CIM polimixina B 0,25 mg/L; CIM tigeciclina 2 mg/L) e na concentração de 1 mg/L para a cepa produtora de NDM. Para a cepa NPC (CIM polimixina B 0,5 mg/L; CIM tigeciclina 4 mg/L; CIM meropenem 4 mg/L), apenas a tripla combinação com polimixina B (1 mg/L), tigeciclina e meropenem apresentou atividade sinérgica. A combinação de dois carbapenêmicos não apresentou atividade sinérgica para nenhum isolado, porém, quando acrescentado tigeciclina ao esquema, observou-se sinergismo no isolado produtor de OXA-48-like, o que leva ao questionamento da efetividade da terapia “carbapenem suicida”. Para o isolado produtor de KPC e com padrão de resistência a polimixina B, nenhuma das combinações testadas apresentou sinergismo. Esta situação é bastante preocupante devido à alta prevalência de infecções por bactérias produtoras de KPC nos hospitais brasileiros, juntamente com as crescentes taxas de resistência as polimixinas. / Due to the increase in microbial resistance, combinations of antimicrobials are increasingly being used to improve the therapeutic response. The objective of this study was to compare the activity of polymyxin B alone and in combination with tigecycline and carbapenem (ertapenem and meropenem) against to carbapenem-resistant Enterobacter sp isolates. Four isolates were selected, three were carbapenemase-producing (KPC, NDM, OXA-48-like) and a non-carbapenemase-producing (NCP). The evaluation of synergistic antimicrobial activity was performed by time-kill assay with the following concentrations of each antimicrobial: tigecycline 1mg/L, meropenem 1mg/L and ertapenem 0.5mg/L, which correspond to the breakpoints of CLSI (2016). For polymyxin B, different concentrations were used according to the susceptibility profile of the isolate: for susceptible isolates, it was used 0.5x; 1x and 2x the MIC of the isolate, for the resistant isolates it was used 0.5x; 1x and 2x the breakpoint of CLSI (2 mg/L). The combination with reduction ≥ 2 logs of the initial inoculum compared to the most active antimicrobial alone was considered synergies. Combinations of polymyxin B at different concentrations (0.5; 1 and 2 mg/L) with meropenem showed synergistic activity for the NDM-producing isolate (MIC polymyxin B 1 mg/L, MIC meropenem 8 mg/L) Combinations of polymyxin B with tigecycline were synergistic only at the concentration of polymyxin B of 0.125 mg/L for the OXA-48-like-producing isolate (MIC polymyxin B 0.25 mg/L, MIC tigecycline 2 mg/L) and at the concentration of 1 mg/L for the NDM-producing isolate. For the NCP isolate (MIC polymyxin B 0.5 mg/L; MIC tigecycline 4 mg/L; MIC meropenem 4 mg/L), only the triple combination of polymyxin B (1 mg/L) plus tigecycline and meropenem presented synergistic activity. The combination of two carbapenems was not synergic for the four isolates; however, when tigecycline was added to the regimen, synergies for the OXA-48-like-producing isolate were observed. Therefore, the so called, "carbapenem suicide" therapy was not effective in vitro against our isolates. For the KPC-producing isolate that it is polymyxin B resistant, none of the combinations tested showed synergies. This situation is very worrisome due to high prevalence of infections by KPC-producing in the Brazilian hospitals, associate with the increasing rates of polymyxins resistance.

A.baumannii é um importante patógeno em infecções nosocomiais principalmente por sua capacidade de se tornar resistente aos antimicrobianos. Surtos de A.baumannii resistente aos carbapenêmicos (ABRC) têm sido descritos em todo mundo. Devido à emergência de resistência aos antimicrobianos e ausência de novas opções de tratamento, as polimixinas reemergiram como opção de terapia contra infecções causadas por A.baumannii. O uso de polimixina é associado a maior mortalidade e menor eficácia comparada a outros antimicrobianos. Alguns estudos in vitro têm avaliado a combinação de polimixina com outros antimicrobianos a fim de aumentar a eficácia dos tratamentos. O objetivo deste estudo foi avaliar o sinergismo entre a polimixina B com outros antimicrobianos em isolados de ABRC, pelo método de Curvas Tempo-Morte bacteriana (Time- Kill Curves). Os isolados foram provenientes de banco de amostras e foram avaliadas as combinações de polimixina B com carbapenêmicos (imipenem e meropenem), tigeciclina, rifampicina, amicacina e ceftazidima. As combinações foram testadas nos tempo 0, 30’, 1,4,12 e 24 h. Sinergismo entre polimixina B foi demonstrado contra todos antimicrobianos para ambos isolados, exceto para ceftazidima e imipenem no isolado 1. Nosso estudo mostrou que tigeciclina, amicacina e rifampicina são agentes mais ativos combinados com polimixina B, sendo assim estes agentes podem apresentar efeito benéfico em combinação com a polimixina no tratamento de ABRC. / A.baumannii is an important pathogen in nosocomial infections primarily for its ability to become resistant to antimicrobials. Outbreaks carbapenem- resistant A.baumannii (CRAB) has been described worldwide. Due to the emergence of antimicrobial resistance and the absence of new treatment options, the polymyxins reemerged as an option therapy against infections caused by A.baumannii. The use of polymyxin is associated with higher mortality and lower effectiveness compared to other antimicrobials. In vitro studies have evaluated the combination of polymyxin with other antimicrobial agents to enhance the effectiveness of the treatments. This study was to evaluate the synergy between polymyxin B with other antimicrobials in isolates from ABRC, by Time-Kill Curves. The isolates were from stool samples and were evaluated combinations of polymyxin B with carbapenems (imipenem and meropenem), tigecycline, rifampin, amikacin and ceftazidime. The combinations were tested at time 0, 30 ', 1,4,12 and 24 h. Synergism between polymyxin B was demonstrated against all antimicrobials for both isolates, except for ceftazidime and imipenem in isolated 2. Our study showed that tigecycline, amikacin and rifampicin more active agents are combined with polymyxin B, and thus these agents may have a beneficial effect in combination with a polymyxin in treating CRAB.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

A demanda por fontes renováveis de energia juntamente com o esgotamento das reservas de combustíveis fósseis e do aquecimento global tem despertado grande interesse. A degradação da biomassa lignocelulósica para a produção de biocombustíveis tem se revelado uma alternativa viável, contudo tem enfrentado desafios em função de sua recalcitrância. Novos preparados enzimáticos envolvendo não só celulases com mecanismo hidrolítico, mas também proteínas com atividade auxiliares têm sido desenvolvidas e comercializadas. Contudo a adição de enzimas oxidativas nestes coquetéis ainda é passível de desenvolvimento e otimização. Nesse âmbito, o objetivo desse trabalho foi analisar três possíveis abordagens para a resolução desse problema. A primeira através do isolamento de fungos filamentosos de compostagem com o intuito de obter novas enzimas com função oxidativa. A segunda, constituiu o estudo de sinergismo de uma enzima acessória da família GH43 com o coquetel enzimático industrial Accellerase e a terceira no estudo da enzima oxidativa monooxigenases lítica de polissacarídeo (Lpmo) assim como sua interação sinérgica com uma endoglucanase de Trichoderma harzianum. A atividade celulolítica dos fungos foi determinada por análise do halo hidrolítico, assim como por reações enzimáticas utilizando substratos específicos. Os potenciais fungos produtores de enzimas oxidativas foram identificados por amplificação e sequenciamento da região ITS3. Dezesseis fungos foram isolados e testados, destes três apresentaram atividade positiva para a enzima lacase. O sequenciamento revelou que todos os fungos pertencem à mesma espécie patogênica Scedosporium prolificans, A enzima BlAbn1 (GH43) foi expressa em células de E. coli (BL21) e purificada para análise do sinergismo com o coquetel enzimático Accellerase em diferentes condições como sinergismo sequencial ou simultâneo, diferentes pH´s, tempo de reação e concentração enzimática. No sinergismo simultâneo e análises em pH 5 e pH 8 a taxa de sinergismo encontrada foi muito baixa apenas 4 %. Contudo no sinergismo sequencial com diferentes tempos e concentrações enzimáticas foi encontrado um aumento de 30 % na liberação de açúcares redutores na reação de 20 horas, mostrando que há ação sinérgica. O estudo da enzima oxidativa Lpmo foi realizado utilizando a enzima purificada após expressão heteróloga em Aspergillus nidulans. Análises com diferentes substratos e doadores de elétrons assim como sinergismo com uma endoglucanases foram realizados. Ácido ascórbico e pirogalol apresentaram-se como doadores de elétrons utilizando celulose amorfa (PASC), xilano e arabinoxilano como substratos. Ação sinérgica entre a endoglucanase e Lpmo foi observada, apresentando um aumento na liberação de açúcares redutores na ordem de 15 %. Em habitats naturais os microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas e auxiliares apresentam ação sinérgica como demonstrado para enzimas da família GH43 com coquetéis enzimáticos e de enzimas oxidativas com endoglucanases. Este efeito pode ser explorado e utilizado na melhora da composição dos coquetéis enzimáticos dedicados á produção de biocombustíveis lignocelulósicos. / The demand for renewable energy sources coupled with the depletion of fossil fuel reserves and global warming has aroused great interest. The degradation of lignocellulosic biomass for the production of biofuels has proved to be a viable alternative, however it has faced challenges due to its recalcitrance. New enzymatic preparations involving not only cellulases with a hydrolytic mechanism, but also proteins with an auxiliary activity have been developed and commercialized. However the addition of oxidative enzymes in these cocktails is still amenable to development and optimization. In this context, the objective of this work was to analyze three possible approaches to solve this problem. The first one through the isolation of filamentous fungi from composting in order to obtain new enzymes with oxidative function. The second was the synergism study of an accessory enzyme of the GH43 family with the industrial enzymatic cocktail Accellerase and the third in the study of lytic polysaccharide monooxygenases (Lpmo) oxidative enzyme as well as its synergistic interaction with a Trichoderma harzianum endoglucanase. The cellulolytic activity of the fungi was determined by analysis of the hydrolytic halo, as well as by enzymatic reactions using specific substrates. Potential fungi producing oxidative enzymes were identified by amplification and sequencing of the ITS3 region. Sixteen fungi were isolated and tested, of these three showed positive activity for the lacase enzyme. Sequencing revealed that all fungi belong to the same pathogenic species Scedosporium prolificans. The enzyme BlAbn1 (GH43) was expressed in E. coli cells (BL21) and purified for synergism analysis with the enzymatic cocktail Accellerase under different conditions such as sequential synergism or Different pH, reaction time and enzymatic concentration. In simultaneous synergism and analyzes at pH 5 and pH 8 the synergism rate found was very low, only 4%. However in the sequential synergism with different times and enzymatic concentrations a 30% increase in the release of reducing sugars in the reaction of 20 hours was found, showing that there is synergistic action. The study of the oxidative enzyme Lpmo was performed using the enzyme purified after heterologous expression in Aspergillus nidulans. Analyzes with different substrates and electron donors as well as synergism with an endoglucanase were performed. Ascorbic acid and pyrogallol were presented as electron donors using amorphous cellulose (PASC), xylan and arabino-xylan as substrates. Synergistic action between endoglucanase and Lpmo was observed, with an increase in the release of reducing sugars approximately 15%. In natural habitats, the microorganisms producing hydrolytic and auxiliary enzymes present synergistic action as demonstrated for enzymes of the GH43 family with enzymatic cocktails and oxidative enzymes with endoglucanases. This effect can be exploited and used in improving the composition of the enzymatic cocktails dedicated to the production of lignocellulosic biofuels.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

Submitted by Etelvina Domingos (etelvina.domingos@ufpe.br) on 2015-04-09T19:51:49Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Fábio José dos Santos Aguiar.pdf: 859548 bytes, checksum: 26707ed652529cbd3f3d6a6142b5b0dd (MD5) license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T19:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Fábio José dos Santos Aguiar.pdf: 859548 bytes, checksum: 26707ed652529cbd3f3d6a6142b5b0dd (MD5) license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) Previous issue date: 2014 / O objetivo deste estudo foi avaliar a ação sinérgica entre o ácido úsnico extraído de Cladonia substellata Vainio e cinco agentes antimicrobianos (ciprofloxacino, gentamicina, oxacilina e penicilina) sobre dez cepas de Staphylococcus aureus com fenótipo de resistência previamente definido. Cinco destas cepas de S. aureus (ATCC 33591, AM 13, AM 18, AM 20, AM 21) apresentaram resistência a todos os agentes antimicrobianos avaliados e desta forma foram selecionadas para o estudo do sinergismo entre o ácido úsnico e os agentes antimicrobianos através do método do tabuleiro de xadrez (checkerboard method). Os critérios utilizados para avaliar a atividade sinérgica foram definidos pelo Índice da Concentração Inibitória Fracionada (FICI). Todas as cepas de S. aureus foram suscetíveis ao ácido úsnico, determinado pelo método de microdiluição. O FICI variou de 0,25 – 1,0, sugerindo uma interação sinérgica frente as cepas de S. aureus MRSA. A associação do ácido úsnico com o ciprofloxacino apresentou efeito sinérgico sobre todas as cepas S. aureus MRSA. A oxacilina apresentou sinergismo em associação com ácido úsnico sobre as cepas de S. aureus ATCC 33591, AM 13, AM18 e AM24 e exibiu os menores valores FICI. A associação do ácido úsnico com a gentamicina foi sinérgica sobre as cepas AM18, AM21 e AM24. A associação do ácido úsnico com a penicilina apresentou-se indiferente para todas as cepas exceto para S. aureus AM13. Este estudo demonstrou que o ácido úsnico, quando associado à antimicrobianos fluoroquinolônicos, betalactâmicos e aminoglicosídeos pode agir sinergicamente, inibindo cepas de S. aureus MRSA.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-29T15:20:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) dissertaçao1.2novaantimicrobiana1final1.2.pdf: 1493025 bytes, checksum: 3516ce495abc1dca6a61ef9a8cbe8786 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-29T15:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) dissertaçao1.2novaantimicrobiana1final1.2.pdf: 1493025 bytes, checksum: 3516ce495abc1dca6a61ef9a8cbe8786 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / FACEPE / Propriedades farmacológicas de plantas são reconhecidas, empiricamente, há séculos. Neste aspecto, o interesse por vegetais deve-se, sobretudo, à aptidão destes em produzir compostos biologicamente ativos. As samambaias, apreciadas pelo uso ornamental, são utilizadas para a cura de doenças. Além da atividade antimicrobiana, várias outras, tais como antioxidante, antinociceptiva, antitumoral, anti-inflamatória, citotóxica são relatadas como propriedades biológicas destes vegetais. Com a ascensão das doenças crônicas não transmissíveis, especialmente das doenças do aparelho circulatório e das neoplasias, e a persistência das doenças infecciosas e parasitárias, marcadas pela resistência microbiana a antibióticos, a busca por novos fármacos com ação antimicrobiana e citotóxica torna-se imprescindível. Diante deste contexto, este estudo objetivou avaliar a atividade antimicrobiana e citotóxica dos extratos de Asplenium serratum L. e Marsilea minuta L., samambaias ocorrentes no Brasil, e descritas na terapêutica popular. Os extratos metanólico de A. serratum e etanólico de M. minuta foram obtidos, respectivamente, por esgotamento a frio e maceração. A análise fitoquímica foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para os padrões quercetina e cafeína. Na atividade antimicrobiana foram utilizadas bactérias padrão, Escherichia coli, Shigela flexneri, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus MSSA, e a Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada pelo método de microdiluição, com concentrações variando de 5mg/mL a 0,005mg/mL. O sinergismo, testado contra E. coli e S. aureus MSSA, foi realizado pelo método checkerboard. A citotoxicidade foi verificada através do método MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), frente a células tumorais humanas NCI-H29, HEp-2, MCF-7 e HL-60. A quercetina e cafeína foram sugeridas como constituintes de M. minuta. Os extratos apresentaram CIM de 5,0 mg/mL frente à S. aureus MSSA e S. typhimurium, e de 2,5 mg/mL contra E. coli e S. flexneri. Em sinergismo, perante S. aureus MSSA, apresentaram atividade bactericida em concentrações ≥ 2,56 mg/mL (A. serratum) e ≥ 0,33 mg/mL (M. minuta). No caso de E. coli, a ação bactericida foi ≥ 1,31 mg/mL (A. serratum) e ≥ 2,62 mg/mL (M. minuta). Os extratos foram considerados inativos frente às células tumorais testadas, com percentuais de inibição inferiores a 50 % para concentração de 50 μg/ mL. Portanto, foi possível concluir que os extratos das espécies em estudo possuem potencial antimicrobiano e exibem efeito sinérgico, além de apresentarem metabólitos, ainda a serem identificados. / Pharmacological properties of plants are recognized, empirically, for centuries. In this aspect, interest in plants is mainly because their ability to produce biologically active compounds. Ferns, appreciated by their ornamental use, are utilized to cure diseases. Besides antimicrobial activity, several others properties such as antioxidant, anti-nociceptive, antitumor, anti-inflammatory, cytotoxic and biological are reported for these plants. With the rise of non-communicable chronic diseases, especially circulatory diseases and neoplasms, and the persistence of infectious and parasitic diseases, marked by microbial resistance to antibiotics, the search for new drugs with antimicrobial and cytotoxic action becomes imperative. In front of this context, this study aimed to evaluate antimicrobial and cytotoxic activity of extracts from Asplenium serratum L. and Marsilea minuta L., occurring ferns in Brazil, described in popular therapy. Extracts, methanolic of A. serratum and ethanolic of M.minuta, were obtained, respectively, by cold exhaustion and maceration. Phytochemical analysis was performed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for standards of quercetin and caffeine. Default bacteria Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus MSSA, were used in antimicrobial activity. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) was determined by the microdilution method, with concentrations ranging from 5mg / mL to 0.005 mg / mL. Synergism tested against E. coli and S. aureus MSSA was executed by checkerboard method. Cytotoxicity was assessed by MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) against human tumor cells, NCI-H29, HEp-2, MCF-7 and HL -60. Quercetin and caffeine have been suggested as constituents of M. minuta. The extracts showed MIC of 5.0 mg / mL against S. aureus MSSA and S. typhimurium, and 2.5 mg / mL against E. coli and S. flexneri. In synergism, against S. aureus MSSA, fern extracts showed bactericidal activity at concentrations ≥ 2.56 mg / mL (A. serratum) and ≥ 0.33 mg / mL (M. minuta). In the case of E. Coli, the bactericidal action was ≥ 1.31 mg / mL (A. serratum) and ≥ 2.62 mg / mL (M. minuta). The extracts were considered inactive in front of the tumor cells tested, with percentages lower than 50% inhibition at concentration of 50 μg / ml. Therefore, the extracts of studied species have antimicrobial potential and exhibits synergistic effect, besides having metabolites, yet to be identified.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Bothrops asper is one of the main species of Central America because of its medical importance in countries such as Panamá and Costa Rica, where they cause a high number of accidents. A great number of basic phopholipase A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) this species have been characterized, but a few number of studies have been carried out with acidic isoforms. Moreover, as the snake venom is a rich source of bioactive, the investigation of the biotechnological potential is required. Therefore, from the B. asper venom, this study shows three main lines of research: the caracterization of novel PLA2s isoforms; the study of PLA2s in poisoning pathophysiology and the study of potential antiparasitic of PLA2s. The snake venom was fractionated on three chromatographic methods that have proved effective in purification: ion exchange, hydrophobic interaction and reversed phase, giving rise to nine PLA2, four acidic (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) and five basic (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). The molecular weight was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) showed values ranging between 13.8 and 14.3 kDa. The isoelectric point of the acidic PLA2 were determined by 2D SDS-PAGE, showing pI values between 4.6 and 5.0. The N-terminal sequence of nine PLA2 was determined, and 05 are new [four Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) and one Lys49 (BaspB-II)]. The enzymatic activity and the evaluation of the preferred substrates by PLA2 Asp49 was performed using fluorescent phospholipids which was observed that, among the tested phospholipids, acid PLA2 catalyzed all substrates, however, the basic PLA2 showed the highest specificity for phosphatidyl glycerol and phosphatidic acid. A discussion about the role of acidic PLA2 in case of poisoning by snake bite is performed based on myotoxicity assay. Moreover, it is demonstrated the antiparasitic action of these molecules, since the acidic PLA2 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) showed effects against epimastigote and pomastigotes forms of Trypanossoma cruzi and Leishmania infantum respectively. On the other hand, the basic PLA2, BaspB-II and IV-BaspB showed activity against Plasmodium falciparum. Furthermore, for the first time it demonstrated the synergistic action between Lys49 and Asp49 PLA2s against the malaria parasite, demonstrating that these molecules might be important targets in the development of new therapeutics. Keywords: Snake Venoms, Bothrops Asper, Phospholipase A2, Venomics, Synergism in Parasiticide Action / A serpente Bothrops asper é uma das espécies mais importantes da América Central, principalmente, por sua importância médica em países como Panamá e Costa Rica, onde causam um número elevado de acidentes. Diversas fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) básicas desta espécie já foram caracterizadas, porém poucos estudos foram realizados com as isoformas ácidas. Além disso, sendo o veneno de serpente uma rica fonte de bioativos, faz-se necessária a investigação de seu potencial biotecnológico. Desta forma, a partir do veneno de B. asper, o presente trabalho teve objetivos principais: a caracterização de novas isoformas de PLA2s, o estudo das PLA2s na fisiopatologia do envenenamento e o estudo do potencial antiparasitário das PLA2s. Para tanto, o veneno foi fracionado em três métodos cromatográficos que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa, dando origem a nove PLA2 isoladas, quatro ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e cinco básicas (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). As massas moleculares foram determinadas por espectrometria (MALDI TOF) com valores variando entre 13,8 e 14,3 kDa. Os pontos isoelétricos das PLA2s ácidas foram determinados por 2D-SDS-PAGE com valores de pI variando entre 4,6 e 5,0. A sequência N-terminal das nove PLA2s foram determinadas, sendo observado que dentre as nove, 05 são inéditas [quatro Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e uma Lys49 (BaspB-II)]. A atividade enzimática e a avaliação dos substratos preferenciais das PLA2s Asp49 foram realizadas utilizando-se fosfolipídeos fluorescentes e observou-se que, dentre os fosfolipídeos testados, as PLA2s ácidas catalisaram a degradação de todos os substratos, entretanto, para a PLA2 básica houve preferência para o fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico. Uma discussão a respeito do papel das PLA2s ácidas no envenenamento ofídico é conduzida com base no ensaio de miotoxicidade. Ademais, é demostrado a ação antiparasitária dessas moléculas, já que as PLA2s ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc- IV) tiveram ação contra as formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. infantum e as PLA2s básicas BaspB-II e BaspB-IV apresentaram atividade contra Plasmodium falciparum. Posto isto, pela primeira vez, foi demonstrado a ação sinérgica entre uma PLA2 Lys49 e uma PLA2 Asp49 contra o parasita da malária, demonstrando que estas moléculas podem ser importantes alvos no desenvolvimento de novos terapêuticos.

Estudos da atividade biológica de produtos naturais visando suas aplicações no controle de microrganismos são estratégicos e de fundamental importância econômica e social. Considerando o grande potencial da biodiversidade brasileira, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do xilitol e dos extratos brutos obtidos das folhas das plantas Eugenia uniflora, Psidum guajava, Punica granatum e Syzygium cumini, bem como da associação entre os extratos e entre o xilitol e os extratos. Os extratos foram obtidos de folhas frescas maceradas em uma solução de etanol 95%, filtrada após 72 horas e concentrada em evaporador rotatório sob pressão reduzida. Foi realizada a técnica de macrodiluição em caldo e o crescimento das bactérias Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922) foi verificado pela leitura da absorbância dos tubos. O crescimento bacteriano normal foi considerado como 100%. A porcentagem de inibição sobre o crescimento bacteriano foi calculada subtraindo-se de 100% a porcentagem de crescimento na presença do extrato, xilitol ou associações. Todos os extratos inibiram o crescimento bacteriano, no entanto a atividade sobre a bactéria E. coli foi inferior aquela obtida para a bactéria S. aureus. Nos ensaios na presença de xilitol apenas a bactéria S. aureus teve seu crescimento inibido. As associações entre os extratos das folhas das espécies E. uniflora e P. guajava e das espécies E. uniflora e P. granatum promoveram inibições superiores e em concentrações menores sobre o crescimento da bactéria S. aureus quando comparadas com as inibições promovidas pelos extratos isolados, indicando um efeito antimicrobiano sinérgico entre estes extratos. As associações entre o xilitol e os extratos das folhas das espécies E. uniflora ou S. cumini e entre o xilitol e os extratos das folhas das espécies P. guajava ou P. granatum apresentaram um efeito antimicrobiano sinérgico sobre as bactérias S. aureus e E. coli, respectivamente. Os resultados do presente estudo contribuem na busca de novas alternativas terapêuticas antimicrobianas, uma vez que pode servir de subsídio para novos estudos químicos e farmacológicos a partir de fontes naturais brasileiras. / Biological activities studies of natural products aiming their applications in microorganisms control are strategic, economic, and socially important. Considering the Brazilian biodiversity&#8223;s large potential, the purpose of this work was to evaluate antimicrobial activity of xylitol and of crude extracts obtained from leaves of the following plants: Eugenia uniflora, Psidum guajava, Punica granatum and Syzygium cumini, as well as from the association of the extracts and of xylitol with the extracts. The extracts were obtained from fresh leaves macerated in a 95% ethanol solution, filtered after 72 hours and concentrated in spinning evaporator under reduced pressure. The broth macrodilution technique was used and growth of Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922) bacteria was observed upon reading of pipes absorption. Regular bacterial growth was considered as 100%. The percentage of inhibition over bacterial growth was calculated by subtracting from 100%, the growth percentage in the presence of the essence, xylitol or associations. All extracts inhibited bacterial growth, but the activity on E. coli bacteria was inferior to the one obtained for S. aureus bacteria. In tests in the presence of xyliol only the S. aureus bacteria had its growth inhibited. Associations between the extracts from leaves of the species E. uniflora and P. guajava and the species E. uniflora and P. granatum promoted superior inhibitions and in inferior concentrations over the growth of S. aureus bacteria in comparison to inhibitions promoted by isolated extracts, indicating a synergetic antimicrobial effect between these extracts. The associations between xylitol and the extracts of E. uniflora or S. cumini species and between xylitol and the extracts from leaves of the species P. guajava or P. granatum presented a synergetic antimicrobial effect over the S. aureus and E. coli bacteria, respectively. The results of the present study contribute in the search of antimicrobial therapeutic alternatives, once it can be used as base for new chemical and pharmacological studies from Brazilian natural sources.

Este estudo teve por objetivos conhecer aspectos da toxicidade de Cu e Cd, separadamente e em combinacao (Cu+Cd) em tilapias (Oreochromis niloticus), verificando possiveis efeitos sinergicos ou antagonicos. Determinou-se nessas situacoes, a bioacumulacao dos metais no tecido muscular, branquias e figado dos especimes, enfase ao potencial bioindicador da especie. Para tanto, ensaios de toxicidade aguda na forma estatica foram conduzidos por um periodo de 96 horas. Previamente a esses, foram realizados testes preliminares com as referidas especies quimicas em concentracoes logaritmicas, com o intuito de se determinar os intervalos onde 100% de mortalidade e 100% de sobrevivencia eram observados para a especie. Atraves desta etapa estabeleceram-se para os ensaios de toxicidade aguda, as concentracoes de 0,0, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 e 10,0 mg L-1 para Cu e Cu+Cd e de 0,0, 1,0, 5,0, 10,0, 25,0 e 50,0 mg L-1 para Cd. As variaveis temperatura, pH, amonia, oxigenio dissolvido e metais dissolvidos foram aferidas no inicio e a cada 24 horas. A dureza total foi monitorada apenas para os tratamentos controle, no inicio e termino dos experimentos para fins de verificar a qualidade da agua. Para os ensaios cronicos, conduzidos na forma semi-estatica e com duracao de 21 dias, duas concentracoes de cada metal foram utilizadas, onde o criterio de estabelecimento dos valores foi a CL50/10 e a media dos logaritmos das CL50/10 e CL50/100. Amostragens para verificacao da bioacumulacao foram realizadas em 24 e 96 horas, 07, 14 e 21 dias, sendo que durante essas amostragens, as variaveis pH, temperatura, oxigenio dissolvido, amonia e teores de metais nas solucoes foram determinadas. Como nos ensaios anteriores, a dureza total foi determinada no primeiro e ultimo dia para controle de qualidade da agua. As CL50-96h para o cobre, cadmio e cobre+cadmio foram respectivamente 3,53 mg L-1, 20,13 mg L-1 e 1,36 mg L-1 Pode-se observar durante os ensaios preliminar e agudo, uma acentuada precipitacao do Cu principalmente nas maiores concentracoes, isso em decorrencia do produto de solubilidade do hidroxido de cobre formado nas cubas experimentais. 8 Nessas concentracoes, observou-se que o Cd apresentou reducao quando em combinacao, atribuido a co-precipitacao ocorrida com o Cu. No que diz respeito a bioacumulacao dos metais nos orgaos e tecidos, pode-se observar, com algumas excecoes, que o figado, devido as suas funcoes metabolicas, apresentou uma maior acumulacao, seguido das branquias e tecido muscular. A tilapia apresentou maior resistencia ao CdCl2.H2O do que ao CuCl2 tendo a combinacao das duas especies quimicas potencializado a toxicidade de forma sinergica. Esse estudo possibilitou concluir que a afericao das concentracoes efetivas dos elementos de interesse durante ensaios de toxicidade e de relevante importancia, pois a concentracao esperada para as especies quimicas dissolvidas podem diferir daquelas esperadas, em funcao do elemento analisado e do tempo de duracao do experimento / The aim of this work was to assess for the toxicity of Cu and Cd, separately and in combination (Cu+Cd) in tilapias (Oreochromis niloticus), checking for the possible synergical or antagonic effects. In these situations, the bioaccumulation of metals in muscle tissue, gill and liver were determinated, emphasizing the potential bioindicator of the specie. Acute toxicity test in static mode were carried out for a period of 96 hours. Prior to these, preliminary tests were performed with such chemical species in logarithmic concentration, in order to establish the range of concentrations in which 100% mortality and 100% survival were observed for the specie. Through this step, concentrations of 0.0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 and 10.0 mg L-1 for Cu and Cu+Cd and of 0.0, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0 and 50.0 mgL-1 for Cd were defined in acute toxicity assays. Temperature, pH, ammonia, dissolved oxygen and dissolved metals were measured at the beginning and every 24 hours. Total hardness was monitored only for the control treatments, in the beginning and at the end of the experiments to check the water quality. Semi-static chronic assays, were conducted during 21 days, by using two concentrations of each metal. Concentrations were calculated as CL50/10 and average of logarithms of CL50/10 and CL50/100. Samplings for assessing the metals bioaccumulation were performed at 24 and 96 hours, 07, 14 and 21 days. In a mean time, pH, temperature, dissolved oxygen, ammonia and dissolved metals were also determinated. Like in previous assays, total hardness was determined in the first and in the last day. The LC50 for copper, cadmium and copper+cadmium were respectively 3.53 mg L-1, 20.13 mg L-1 and 1.36 mg L-1. A precipitation of copper hydroxide, moreover for the higher concentrations were observed in both, preliminary and acute assays. On these situations, Cd concentration was decreased when combined, assigned to the co-precipitation occurred with Cu. Liver, due to it metabolic functions, showed higher metals accumulation, followed by gills and musclular tissue. It can be concluded that tilapia showed greater resistance to CdCl2.H2O, than to CuCl2 and with the combination of the two chemical species, potentiated the toxicity of synergic form. This study also enabled to conclud that measurement of effective concentrations of the elements of interest during test of toxicity is relevant, because the concentrations obtained may differ to those expected, according to the element and the duration of the experiment