La presente tesis trata del diseño y fabricación de un nuevo dispositivo para registrar la actividad eléctrica neuronal espontánea y estimulada farmacológicamente, en redes neuronales in vitro. La forma de operar esta herramienta es simple, su producción es de bajo coste y además, ofrece una interfaz neurona-electrodo estable a largo plazo más allá de lo posible con tecnologías electrofisiológicas basadas en micropipeta. El dispositivo es una pieza polimérica (polidimetilsiloxano) con dos compartimientos (zona de sembrado de los cultivos neuronales) comunicados entre sí a través de un microcanal de dimensiones comparables a las dimensiones de los axones y dendritas. La actividad eléctrica neuronal es registrable tras el crecimiento espontáneo de las neuritas dentro del microcanal (10 a 14 días de sembradas las neuronas). Un par de electrodos, ubicados de extremo a extremo del microcanal, aprovechan las propiedades conductoras del medio extracelular para registrar los potenciales eléctricos. La tecnología para microfabricar el dispositivo es una combinación de la técnica de fotolitografía (para crear los másteres) y de la técnica de elastomer casting (para fabricar las piezas poliméricas). El procesamiento de datos de las señales es un algoritmo matemático diseñado para analizar la información registrada por el dispositivo; este algoritmo es ejecutado con el software de “Matlab”. El procesamiento de datos asigna y contabiliza como potenciales de acción a las señales que sobrepasen el umbral predeterminado (170 μV) de los registros y presenta los resultados en gráficas de barras de número de potenciales de acción por unidad de tiempo (minuto) / The thesis describes the design and manufacturing of a new tool to support electrophysiological investigation of both individual neuronal electrical activity and neuronal networks electrical activity in vitro. The operation mode is simple, easy to learn and the device can be produced at low cost. Neuron-electrode interface stability is better than electrophysiology micropipette interface. The device is a two compartments polymeric (polydimetilsiloxane) structure (neurons are placed) interconnected by a microchannel. The microchannel aperture is comparable to axon and dendrites diameter. The neuronal electrical activity is recorded after spontaneous neurites grew inside the microchannel (10 to 14 days of neurons be culturated). Each compartment has an electrode and the conductivity electrical propriety of the extracellular medium supports to record electrical potentials end-to-end of the microchannel. The device microfabrication process is a combination of photolithography technique (to create masters) and elastomer casting technique (to manufacture the polymeric parts). Spike frequency analysis is a mathematical algorithm designed. The algorithm runs at Matlab software. Spike frequency analysis counts electrical activity higher than 170 μV as action potential. Results frequency are presented as graphic bars of spike amount per time (minute).

El objetivo ha sido contribuir mediante la aplicación de Musicoterapia de Neurorrehabilitación (NMT), a desarrollar estrategias que redunden en la mejora funcional de los miembros superiores, de personas jóvenes afectadas severamente con diversos trastornos asociados a los desórdenes motores que han sido provocados por una lesión cerebral irreversible que caracteriza la Parálisis Cerebral. En el ámbito de la neurorrehabilitación se considera de fundamental importancia, la implicación activa del paciente, la utilización de objetos reales y la atención individualizada en la que se tenga en cuenta sus preferencias. Sin embargo, la persona con PC severa tiene graves dificultades para realizar el movimiento voluntario y funcional. La implementación de las técnicas terapéuticas en esta población se complica, además de las dificultades motoras, por otros condicionantes de tipo comunicativo, cognitivo, emocional y motivacional. La Música y sus elementos proporcionan diversas experiencias de lenguaje, emociones, empatía y movimiento que activan procesos fisiológicos, psicológicos, comunicativos, cognitivos y emocionales. Estos procesos son empleados en la NMT, potenciando la neuroplasticidad mediante el aprendizaje de movimientos que optimicen la recuperación funcional. En la presente investigación se ha aplicado una metodología en la que se han utilizado eclécticamente diferentes recursos metodológicos musicoterapéuticos, con el fin de optimizar la aplicación para solventar los factores condicionantes. Mediante un equipo formado por dos musicoterapeutas, que han interactuado con la participación activa de los pacientes, se ha combinado la práctica de la “Improvisación Musical”, que a través del juego, la creatividad y la motivación aporta diversos beneficios comunicativos y socio-emocionales; con la interpretación de instrumentos con fines terapéuticos, práctica ordenada y estructurada que se ha utilizado para señalizar, orientar y estructurar la realización del movimiento. Después de un proceso de evaluación, secuenciación, análisis y planificación, se han entrenado diversas tareas específicas, realizadas sobre los componentes individuales del movimiento para su posterior entrenamiento final en actividades funcionales. Para comprobar las mejoras obtenidas se ha realizado un diseño analítico-experimental con grupo control, sobre una población de 24 chicas y chicos de entre 4 y 16 años, que presentan formas mixtas de PC bilateral de tipo severo. Previa la clasificación GMFCS (IV-V), MACS (IV-V) y CFCS, se realizó la evaluación pre-test y post-test de forma ciega por un evaluador especialista en fisioterapia neurológica pediátrica y metodología Vojta. Se determinó un grupo experimental (n=18) y un grupo control (n=9) para evaluar las posibles mejoras experimentadas en cuanto a la capacidad funcional de los miembros superiores, así como su persistencia en el tiempo a lo largo de 16 semanas. Para ello, se utilizaron la escala validada “Chailey Levels of Ability” y los “estadios de locomoción de Vojta”. Los resultados obtenidos han mostrado (prueba de Wilcoxon) mejoras significativas (p<0.05) en la “valoración total” del test de Chailey, en las variables “posición del brazo y mano” y “actividades”, así como en la evaluación Vojta. También se mantuvieron las mejoras, aunque no significativamente, en la evolución del tratamiento tras 16 semanas sin su aplicación, incrementándose los valores incluso en la “posición de brazo y mano”, “posición de pierna” y “posición y movimiento de tronco”, además del valor total “Chailey” y “Vojta”. La conclusión es que mediante la aplicación optimizada por un equipo de dos musicoterapeutas de las técnicas activas de NMT, se consiguen mejoras significativas en la capacidad funcional de los miembros superiores, de jóvenes afectados severamente con PC de tipo bilateral. Una metodología eclética y flexible en el tratamiento, que ha atendido los diversos niveles de desarrollo y que ha estado orientada hacia la mejora de las diferentes condiciones motoras, cognitivas, comunicativas, psicológicas y socio-emocionales, ha contribuido de modo decisivo a la consecución de los objetivos.

Caracterizar el estado nutricional y la calidad de vida en pacientes de Esclerosis Múltiple (EM), y su relación con el grado de discapacidad física. Material y Métodos: Se realizó un estudio de tipo descriptivo y transversal, en el que se incluyeron 31 pacientes diagnosticados de Esclerosis Múltiple. Dichos pacientes pertenecían al Centro Integral de Enfermedades Neurológicas de la ciudad de Albacete o a la Asociación de Esclerosis Múltiple de Almería. Para la caracterización nutricional se emplearon: a) Datos analíticos (bioquímica clásica, perfil lipídico y perfil hepático); b) Medidas antropométricas; c) Cuestionario de frecuencia de consumo; d) Recordatorio de 24 horas; e) Cuestionario Nutrition Screening Initiative Check List. Para la caracterización de la calidad de vida se emplearon: a) Cuestionario EuroQol-5D; b) Cuestionario MSQOl-54; c) Índice de Barthel; d) Índice de Katz; e) Test de Tinetti para evaluar la movilidad y la marcha. Resultados: 14 pacientes presentaban un grado de discapacidad física leve y 17 pacientes un grado de discapacidad moderado-severo. Los pacientes con EM presentaron unos valores en la analítica (bioquímica general, perfil lipídico y perfil hepático) dentro del intervalo óptimo, sin diferencias significativas entre los dos grupos de estudio. Los datos antropométricos fueron similares en ambos grupos. Tampoco se observaron diferencias, atendiendo al grado de discapacidad, en la evaluación nutricional realizada mediante el Cuestionario de frecuencia de consumo y el Recordatorio de 24 horas. En relación a los macronutrientes, destacó un alto aporte de lípidos, principalmente ácidos grasos saturados, y un alto contenido en proteínas. Además, era una dieta pobre en hidratos de carbono y algo baja en fibra. Respecto a los micronutrientes, el contenido en zinc, iodo, folato y retinol también se encontró por debajo de los requerimientos diarios. Mediante el Cuestionario Nutrition Screening Initiative Check List se comprobó que los pacientes con grado de discapacidad moderado-severo presentaron un riesgo de malnutrición más elevado que los pacientes con grado de discapacidad leve, sin que esta diferencia fuese estadísticamente significativa. Los pacientes con grado de discapacidad moderado-severo presentaron una evaluación inferior de calidad de vida que los pacientes con grado de discapacidad leve. Las dimensiones en las que se observaron diferencias estadísticamente significativas fueron la movilidad (p=0.028), salud física (p=0.04), energía (p=0.019), percepción de salud (p=0.026), calidad de vida en su conjunto (p=0.029) y dimensión física (p=0.026). La dimensión mental no se vio tan afectada por el grado de discapacidad. Los pacientes con grado de discapacidad moderado-severo presentaron un nivel de dependencia mayor que los pacientes con grado de discapacidad leve para realizar las actividades básicas de la vida diaria. Atendiendo al índice de Barthel, los ítems más afectados fueron: baño, movilidad, subir y bajar escaleras y el control de la vejiga. Atendiendo al índice de Katz, el nivel de dependencia fue mayor en los pacientes con grado de discapacidad moderado-severo, aunque sin alcanzar la significación estadística. Los pacientes con grado de discapacidad leve no presentaron riesgo de caídas, sin embargo los pacientes con grado de discapacidad moderado-severo tenían un alto riesgo de caídas. Conclusiones: La caracterización nutricional de los pacientes con EM es similar en ambos grupos de estudio. Existen desequilibrios en la alimentación por un aporte insuficiente de hidratos de carbono, zinc, iodo, folato y retinol. Por el contrario, existe un alto consumo de proteínas y grasas. Se recomienda aumentar el consumo de frutas, verduras, cereales integrales y reducir el consumo de mantequilla, bollería, embutidos y otros alimentos ricos en grasas saturadas. Los pacientes con grado de discapacidad moderado-severo presentan una peor puntuación en la calidad de vida, una menor capacidad para realizar las actividades básicas de la vida diaria y un mayor riesgo de caídas. / Characterize nutritional condition and quality of life in patients with multiple sclerosis (ME), and their connection with the degree of physical capacity. Material and methods: It was carried out a study of descriptive and transversal type, on which 31 patients diagnosed of Multiple Sclerosis were included. Such patients belonged to the Integral Centre of Neurological Diseases of Albacete city or to the Multiple Sclerosis Association of Almería. For the nutritional characterization it was employed: a) Analytic data (classic biochemistry, lipid profile and hepatic profile; b) Anthropometric measures; c) Questionnaire of consumption frequency; d) 24 hour reminder; e) Nutrition questionnaire “Nutrition Screening Initiative Check List”. For the quality of life characterization it was employed: a) EuroQol-5D questionnaire; b) MSQOl-54 questionnaire; c) Barthel index ; d) Katz index ; e) Tinetti test to assess mobility and walk. Results: 14 patients showed a degree of slight physic disability and 17 patients a degree of moderate-severe disability. Patients with ME showed some values in the analytics (general biochemistry, lipid profile and hepatic profile) within the peak interval, without significant differences between the two study groups. Anthropometric data were similar in both groups. Paying attention to the degree of disability, there were not observed differences either in the nutritional assessment, carried out through Questionnaire of consumption frequency and 24 hour reminder. With regard to macronutrients, it was stressed a high contribution of lipids, mainly saturated fat acids, and a high content in proteins. Besides, it was a poor diet in carbohydrates and a bit low in fibre. With regard to micronutrients, content in zinc, iodine, folate and retinol was also found below the daily requirements. Through Nutrition Screening Initiative Check List Questionnaire it was checked that patients with a degree of moderate-severe disability showed a higher malnutrition risk than patients with a degree of slight physic disability, without that this difference were statistically significant. Patients with a degree of moderate-severe disability showed a lower assessment of quality of life than patients with a degree of slight disability. The dimensions on which there were observed statistically significant differences, were mobility (p=0.028), physic health (p=0.04), energy (p=0.019), health perception (p=0.026), quality of life as a whole (p=0.029) and physic dimension (p=0.026). Mental dimension was not seen so affected by the disability degree. Patients with a degree of moderate-severe disability showed a higher level of dependence than patients with a degree of slight disability, for executing daily life basic activities. With regard to Barthel index, the items more affected were: bathing, mobility, going up/down the stairs, and bladder control. With regard to Katz index, dependence level was higher in patients with a degree of moderate-severe disability, although without reaching the statistic significance. Patients with a degree of slight disability did not showed fall risk, however patients with a degree of moderate-severe disability had a high risk of falls. Conclusions: Nutritional characterization of ME patients is similar to both study groups. There exist imbalances in diet by an insufficient contribution of carbohydrates, zinc, iodine, folate and retinol. On the contrary, there exists a high consumption of proteins and fats. It is recommended to increase fruit consumption, vegetables, wholemeal cereals and to reduce butter consumption, pastries, sausages and other foods rich in saturated fats. Patients with a degree of moderate-severe disability show a worse mark on quality of life, a less capacity to carry out daily life basic activities and a higher risk of falls.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina las variaciones de la anisotropía fraccional y del coeficiente de difusión aparente por el uso del gadolinio en la vía cortico espinal en pacientes sin alteración de la barrera hemato-encefálica del Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas (INCN), durante noviembre y diciembre del 2017. Desarrolla un estudio de tipo observacional, analítico, longitudinal, de cohorte única, donde se consideraron todos los estudios de resonancia magnética cerebral que no evidenciaron lesiones macroscópicas ni alteración de la barrera hematoencefálica, se utilizó un resonador de 3Teslas ACHIEVA XT de Philips. Con la secuencia de tensor de difusión se obtuvieron los valores del coeficiente de difusión aparente (CDA) y de la anisotropía fraccional (AF). Para el análisis de datos se calculó promedios, desviación estándar, pruebas de normalidad y paramétricas. Encuentra que no hubo variación significativa de la anisotropía fraccional ni del coeficiente de difusión aparente del lado derecho, ni del lado izquierdo (p=0.159, p= 0.158, p=0.728 y p=0.187 respectivamente) de la vía córtico espinal en cada uno de los momentos de la aplicación del contraste. Por otro lado, no se halló variación de la anisotropía fraccional, ni del coeficiente de difusión del lado derecho ni del lado izquierdo de la vía córtico espinal en cada uno de los momentos de la aplicación del contraste según sexo (p=0.598 y p=0.299, p=0.481 y p=0.499). Concluye que no hubo variaciones significativas de la anisotropía fraccional y del coeficiente de difusión aparente por el uso del gadolinio en la vía cortico espinal en pacientes sin alteración de la barrera hematoencefálica del INCN durante noviembre y diciembre del 2017. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el potencial neuroprotector de los péptidos obtenidos mediante hidrólisis enzimática de forma secuencial de la proteína soluble aislada de las semillas de tarwi. Las semillas fueron sometidas a un proceso de deslupinizado para la eliminación de alcaloides y a un proceso de deslipidizado con etanol previo a la obtención del concentrado proteico el cual incrementó su contenido proteico hasta 76.74% y que fueron hidrolizadas utilizando de forma secuencial las enzimas pepsina 0,7 FIP (Federación Internacional de Farmacia)- U/mg (HP), pancreatina 350 FIP- U/g (HPP) y Alcalasa 2,4 U/g proteína (HPPA), durante 30, 60 y 138 min, respectivamente. El HPPA presentó un buen grado de hidrólisis (46.12 ± 2.77%), y se separó en tres fracciones peptídicas UF1, UF2 y UF3 de tamaños, > a 10 kDa, 3-10 kDa y < a 3 kDa, respectivamente. La UF3 presentó mayor actividad antioxidante con valores de 5.34 ± 0.45 y 7.62 µmol ET / mg proteína según los métodos ABTS y ORAC, respectivamente y una actividad quelante de Fe +2 de 96.39 ± 2.56% con 5 µg de proteína. Para evaluar el potencial neuroprotector de las fracciones se utilizó un modelo celular de peroxidación lipídica inducida con sulfato ferroso en tejido cerebral de ratón. La UF3 fue capaz de inhibir la peroxidación lipídica en 40.52 ± 1.13% a una concentración de 0.0125 mg/mL (p <0.05). Por tanto, la fracción menor a 3 kDa obtenida se podría utilizar como ingrediente de alimentos funcionales con potencial en la prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. / Tesis

El desarrollo neural ocurre mediante el proceso de neurulación originando el sistema nervioso central y la médula espinal. Durante este proceso las células de la cresta neural (CCN) son especificadas en la región más dorsal del tubo neural; posteriormente, las CCN delaminan del epitelio neural, migran a diferentes regiones del embrión y se diferencian en diversos tipos celulares. Defectos en el desarrollo del tubo neural y de las CCN generan desórdenes congénitos como espina bífida, encefalocelia, y neurocristopatías (paladar-labio hendido, albinismo, entre otras). Una vitamina importante durante el desarrollo embrionario temprano es el folato, el cual se encuentra en el sistema circulatorio en forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) e ingresa a la célula por medio del receptor de membrana FOLR1 y el transportador RFC1. El 5-MTHF participa en la síntesis de nucleótidos y en la generación de Sadenosilmetionina (SAM) para la metilación de ácidos nucleicos y proteínas. La metilación de ácidos nucleicos y proteínas son importantes mecanismos de regulación epigenética durante el normal desarrollo embrionario de los vertebrados. Considerando lo dicho se plantea determinar el efecto epigenético de la deficiencia del folato en el desarrollo del tubo neural y de las CCN. Para esto realizamos la pérdida de función del receptor FOLR1 y transportador RFC1 mediante el uso de los morfolinos FolR1spMO y RFC1spMO en embriones de pollo. Posteriormente se evalúan los niveles de 5mC en el ADN y 6mA en el ARN mediante dot blots, observando una clara disminución en ambas marcas epigenéticas. El análisis de expresión del marcador de CCN Sox10 en embriones inyectados evidenció una disminución en el número de CCN. Adicionalmente, el marcador neural Sox2 presentó una expresión ectópica en el territorio de las CCN. Estos resultados muestran que la deficiencia de folato afecta la metilación global del ADN y ARN generando un cambio en el destino celular de los progenitores de las CCN hacia un destino neural. Los resultados obtenidos pueden sentar las bases para un mejor entendimiento y desarrollo de tratamientos capaces de prevenir o disminuir las anomalías ocasionadas por la deficiencia de folato en mujeres embarazadas. / Tesis

El desarrollo neural ocurre mediante el proceso de neurulación originando el sistema nervioso central y la médula espinal. Durante este proceso las células de la cresta neural (CCN) son especificadas en la región más dorsal del tubo neural; posteriormente, las CCN delaminan del epitelio neural, migran a diferentes regiones del embrión y se diferencian en diversos tipos celulares. Defectos en el desarrollo del tubo neural y de las CCN generan desórdenes congénitos como espina bífida, encefalocelia, y neurocristopatías (paladar-labio hendido, albinismo, entre otras). Una vitamina importante durante el desarrollo embrionario temprano es el folato, el cual se encuentra en el sistema circulatorio en forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) e ingresa a la célula por medio del receptor de membrana FOLR1 y el transportador RFC1. El 5-MTHF participa en la síntesis de nucleótidos y en la generación de Sadenosilmetionina (SAM) para la metilación de ácidos nucleicos y proteínas. La metilación de ácidos nucleicos y proteínas son importantes mecanismos de regulación epigenética durante el normal desarrollo embrionario de los vertebrados. Considerando lo dicho se plantea determinar el efecto epigenético de la deficiencia del folato en el desarrollo del tubo neural y de las CCN. Para esto realizamos la pérdida de función del receptor FOLR1 y transportador RFC1 mediante el uso de los morfolinos FolR1spMO y RFC1spMO en embriones de pollo. Posteriormente se evalúan los niveles de 5mC en el ADN y 6mA en el ARN mediante dot blots, observando una clara disminución en ambas marcas epigenéticas. El análisis de expresión del marcador de CCN Sox10 en embriones inyectados evidenció una disminución en el número de CCN. Adicionalmente, el marcador neural Sox2 presentó una expresión ectópica en el territorio de las CCN. Estos resultados muestran que la deficiencia de folato afecta la metilación global del ADN y ARN generando un cambio en el destino celular de los progenitores de las CCN hacia un destino neural. Los resultados obtenidos pueden sentar las bases para un mejor entendimiento y desarrollo de tratamientos capaces de prevenir o disminuir las anomalías ocasionadas por la deficiencia de folato en mujeres embarazadas. / Tesis

La enfermedad de Parkinson (PD) es un desorden progresivo del movimiento y es la segunda enfermedad relacionada con la edad más común, luego de la enfermedad de Alzheimer. Se la considera como un desorden multifactorial y complejo que involucra tanto factores epidemiológicos como genéticos y toxicológicos, y cuya principal característica es la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas. A pesar de los recientes avances que intentan comprender las bases moleculares de esta patología, el mecanismo exacto que desencadena la degeneración de las neuronas dopaminérgicas todavía no se conoce. Numerosos estudios previos destacan dos características comunes de las lesiones de la substancia nigra pars compacta de los cerebros con PD: i) alteraciones en el contenido de los metales de transición y, en consecuencia, aumento del estrés oxidativo (OS) y ii) sobreexpresión y agregación patológica de la proteína α-sinucleína (α-sin). El desbalance en los niveles de los metales de transición ha sido reportado como uno de los principales factores que contribuyen a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la PD. Específicamente, se ha descripto que la sobrecarga de hierro (Fe) y la desregulación de los niveles de cobre (Cu) estarían involucradas en el daño de las neuronas dopaminérgicas en esta patología. En la primera parte de este trabajo de tesis, nuestro objetivo fue caracterizar los mecanismos de reparación de membrana mediante el estudio de las reacciones de acilación y deacilación y su rol en la injuria oxidativa en la neuronas dopaminérgicas N27 expuestas a sobrecarga de Fe y suplementación con Cu. Las neuronas N27 incubadas en presencia de Fe2+ (1 mM) por 24 hs mostraron elevados niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), peroxidación lipídica y aumentada permeabilidad de membrana plasmática. Por otro lado, en las neuronas que fueron suplementadas con Cu2+ (10,50 μM) no se observaron alteraciones en los marcadores de OS. Se observó un perfil de acilación diferencial en las neuronas N27 premarcadas con [3H]ácido araquidónico (AA) o [3H]ácido oleico (OA). En las neuronas expuestas a Fe2+, la incorporación de AA aumentó en la fracción de triacilglicéridos (TAG), mientras que su incorporación en la fracción de fosfolípidos (PL) se vio disminuida. El contenido de TAG resultó más elevado (40 %) en las neuronas expuestas a Fe2+ que en los controles. Este aumento fue acompañado por la aparición de cuerpos lipídicos Nile Red positivos. En contraposición, la incorporación de OA se vio incrementada en la fracción de PL y no mostró cambios en los TAG. El perfil de acilación lipídica en las neuronas que fueron suplementadas con Cu mostró una mayor acumulación de AA en el PL fosfatidilserina y ningún cambio con respecto a su incorporación en TAG. La inhibición de las reacciones de acilación/deacilación desencadenaron un aumento en los niveles de los marcadores de OS y disfuncionalidad mitocondrial en las neuronas expuestas a sobrecarga de Fe2+. Estos hallazgos brindan evidencia acerca de la participación de los mecanismos de acilación frente a la injuria oxidativa inducida por Fe2+ y postulan que las neuronas dopaminérgicas preservan, inteligentemente, el AA en los TAG en respuesta al OS. Como se mencionó anteriormente, la sobreexpresión patológica de la α-sin está involucrada en la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la PD. En la segunda parte de este trabajo, caracterizamos el rol de dos variantes de la α-sin, WT (en su forma nativa) y A53T (una mutación que se encuentra en la PD familiar de aparición temprana), durante el OS inducido por Fe2+ y estudiamos como el metabolismo lipídico estaría involucrado en el destino neuronal. Para ello, utilizamos la línea celular neuronal dopaminérgica N27 sin transfectar (UT) y dos líneas celulares N27 transfectadas de forma estable con WT-α-sin (WT) o A53T-α-sin (A53T). Estas células fueron expuestas a daño inducido por Fe2+ y luego, se analizaron los marcadores de OS y el estado del metabolismo lipídico. Dependiendo del tipo de α-sin expresado, se obtuvieron distintas respuestas neuronales a la sobrecarga de Fe2+. Las células A53T expuestas a injuria inducida por Fe2+ mostraron menores niveles de ROS y menor alteración en la permeabilidad de la membrana plasmática respecto a las neuronas WT. La presencia de A53T-α-sin provocó un aumento en el contenido de TAG, el cual fue aún mayor luego de la exposición de las neuronas a sobrecarga de Fe2+. Por otro lado, las neuronas WT no mostraron alteraciones en el contenido de TAG, respecto a las células UT. Las neuronas A53T también presentaron un aumento en la expresión de la sintasa de ácidos grasos (FAS), junto con una mayor resistencia a la cerulenina, un potente inhibidor de la FAS. El contenido de PL y colesterol (Chol) fue similar en las neuronas UT, WT y A53T. La inhibición farmacológica de la síntesis de novo de los TAG provocó un aumento en la muerte celular de las células A53T durante el daño inducido por Fe2+ mientras que la inhibición de los mecanismos de acilación/deacilación no afectaron ni el contenido de TAG ni la viabilidad celular en la medida en que se afectaron estos parámetros en las células UT. Nuestros resultados brindan nueva evidencia acerca del rol diferencial de las variantes de α-sin en el metabolismo lipídico neuronal, que está relacionado a la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe2+. En conclusión, hemos demostrado que la respuesta neuronal al daño oxidativo y a la sobreexpresión de A53T-α-sin, es dependiente de los mecanismos de acilación/deacilación lipídica e involucra acumulación de TAG. Aunque la inhibición de la síntesis de TAG en las neuronas A53T promueva la muerte celular, nuestros resultados sugieren que la aparición de TAG, algo inusual para el fenotipo neuronal, podría constituir un marcador temprano de daño neuronal. / Parkinson’s disease (PD) is a progressive movement disorder and is the second most common age-related neurodegenerative illness after Alzheimer’s disease. PD is a multifactorial and complex disorder including epidemiological, genetic and toxicological factors whose main characteristic is the progressive loss of dopaminergic neurons. Despite all the effort to understand the molecular basis of this pathology, the exact molecular mechanism that triggers the degeneration of dopaminergic neurons remains still unknown. Cumulative evidence highlights two common facts that occur in the substantia nigra pars compacta lesions in the brain of PD patients: i) alterations in transition metal content and, in consequence, increased oxidative stress (OS) and ii) overexpression and pathological aggregation of the protein α-synuclein (α-syn). Metal-imbalance has been reported as one of the main contributing factor for the degeneration of dopaminergic neurons in PD. Specifically, iron (Fe) overload and copper (Cu) mis-compartmentalization have been reported to be involved in the injury of dopaminergic neurons in this pathology. In the first part of this work, our aim was to characterize the mechanisms of membrane repair by studying lipid acylation and deacylation reactions and their role in oxidative injury in N27 dopaminergic neurons exposed to Fe-overload and Cu-supplementation. N27 dopaminergic neurons incubated with Fe2+ (1 mM) for 24 hs displayed increased levels of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation and elevated plasma membrane permeability. Cu2+-supplemented neurons (10, 50 μM) showed no evidence of OS markers. A different lipid acylation profile was observed in N27 neurons pre-labeled with [3H]arachidonic acid (AA) or [3H]oleic acid (OA). In Fe-exposed neurons, AA uptake was increased in triacylglycerols (TAG) whereas its incorporation into the phospholipid (PL) fraction was diminished. TAG content was 40 % higher in Feexposed neurons than in controls. This increase was accompanied by the appearance of Nile red positive lipid bodies. Contrariwise, OA incorporation increased in the PL fractions and showed no changes in TAG. Lipid acylation profile in Cu-supplemented neurons showed AA accumulation into phosphatidylserine and no changes in TAG. The inhibition of deacylation/acylation reactions prompted an increase in OS markers and mitochondrial dysfunction in Fe-overloaded neurons. These findings provide evidence about the participation of lipid acylation mechanisms against Fe-induced oxidative injury and postulate that dopaminergic neurons cleverly preserve AA in TAG in response to OS. As previously mentioned, pathological α-syn overexpression is involved in the death of dopaminergic neurons in PD. In the second part of this work, we characterized the role of α-syn variants, Wild Type (WT) and A53T (a dominant mutation found in familial early onset PD) during Fe-induced OS and investigated whether lipid metabolism has implications for neuronal fate. To this end, we used the N27 dopaminergic neuronal cell line non-transfected (UT) and two stably transfected N27 cell lines with WT α-syn (WT) or mutated A53T α-syn (A53T). Cells were exposed to Fe-induced injury and OS markers and the status of lipid metabolism were analyzed. Neuronal response to Fe-induced overload is dependent on the type of α-syn expressed. A53T cells exposed to Fe-induced injury showed lower ROS levels and diminished plasma membrane permeability alteration than WT neurons. The presence of A53T α-syn promoted an increase in TAG content that was enhanced during Fe-induced OS. On the contrary, WT neurons did not display changes in TAG levels with respect to UT cells. A53T neurons also exhibited an increase in fatty acid synthase (FAS) expression, and higher resistance to the potent FAS inhibitor cerulenin. PL and cholesterol (Chol) content were similar in UT, WT and A53T neurons. Pharmacological inhibition of de novo synthesis of TAG increased A53T cell death during Fe-induced injury whereas the blockage of PL and Chol acylation/deacylation affected neither TAG content nor cell viability to the same extent as that observed in UT neurons. Our results bring new evidence about a differential role of α-syn variants on neuronal lipid metabolism that is related to the neuronal response to Fe-overload. In conclusion, we have demonstrated that the neuronal response to OS injury and A53T α-syn overexpression is dependent on lipid acylation and deacylation mechanisms and also involves TAG accumulation. Even though the inhibition of TAG synthesis in A53T neurons promoted cell death, our findings suggest that TAG appearance, rather unusual for the neuronal phenotype, could constitute an early marker of neuronal injury.

Objetivos.- 1- Analizar la Calidad de Vida Relacionada con la Salud física y mental (CVRS) de personas con Esclerosis Múltiple mediante el cuestionario MSQOL-54. 2- Evaluar la CVRS en función de las variables sociodemográficas. 3- Analizar la salud de los cuidadores informales respecto a características sociodemográficas y situación de cuidado. 4- Explorar la relación entre CVRS de las personas con EM y la salud mental, autopercepción de salud y las enfermedades del cuidador. Metodología.- Mediante un diseño descriptivo y correlacional para identificar y describir las relaciones hipotéticas planteadas se ha utilizado una muestra de 115 personas (34 varones y 81 mujeres) con diagnóstico de Esclerosis Múltiple y 79 cuidadores informales (55 mujeres y 24 varones) sometidos a estrictos criterios de inclusión y exclusión. Se han utilizado Cuestionarios sociodemográficos, el cuestionario(GHQ-12) y el (MSQOL-54) Resultados.- En cuanto a las características clínicas y sociodemográficas de los pacientes con Esclerosis Múltiple (EM), encontramos que la mayoría de los pacientes ( 75,7%) sufrió EM remitente-recurrente, con una discapacidad física, de acuerdo con criterios de EDSS, de 3,19, el tiempo de enfermedad esta en una media de 4 años. En cuanto a las características sociodemográficas, de los 115 pacientes, 81 son mujeres y 34 hombres, el rango mayor de edad se encuentra entre 31 y 50 años (33.8%; 32.4%), la mayoría tienen estudios primarios (34.6%) y están casados ( 60%) y el 61.2% tienen uno o dos hijos. Las variables que presentaron una relación significativa con la CVRS física fueron: La situación laboral; las medias de los pacientes que trabajan fueron significativamente mas altas que las de los que no trabajan. El rango más joven de edad (20-30 años) presenta una relación significativa con la CVRS física . El tiempo de enfermedad solo mostró una relación estadísticamente significativa con la subescala de salud física (r= .-299,p<.05), una duración mayor de la enfermedad su CVRS física es menor. El grado de discapacidad presentó una relación significativa (p<.05) a medida que la discapacidad fue mayor la CVRS se vio reducida en todas sus dimensiones. En cuanto a los resultados obtenidos por las personas cuidadoras en función de las características sociodemográficas, de las 79 personas cuidadoras, 55 son mujeres y 24 son hombres, el mayor porcentaje se encuentran en el rango de edad de 41 a 50 años, el porcentaje mayor lo tienen los que han cursado estudios primarios, también los que están trabajando y las personas casadas. En cuanto a la salud mental, la puntuación total obtenida en el GHQ-12 fue de 12.89 con una desviación típica de 5.49. En relación a la autopercepción de la salud el 48.7% indicó que su salud es buena, presentado una media de 2.27 con una desviación típica de 0.86. En cuanto al número de enfermedades el 70% de los cuidadores padecían 3 o menos, lo que significa que el 30% padecen al menos 4 enfermedades. En cuanto a la relación de la salud mental del cuidador medida a través del GHQ-12 y las variables demográficas, los resultados mostraron que el sexo esta relacionado con la salud mental de la persona cuidadora, siendo menor en las mujeres que en los hombres. Con respecto a la relación que se establece entre la CVRS del paciente con EM y la salud de la persona que lo cuida, los resultados mostraron relación significativa entre el número de enfermedades del cuidador y la CVRS física de la persona con EM. CONCLUSIONES 1. La Calidad de Vida Relacionada con la Salud en la muestra de nuestro estudio es menor que la de la población general. 2. Las características clínicas y sociodemográficas que más influyen en la CVRS Física de las personas con EM son: La edad, el nivel educativo, el estado civil, el tener o no tener hijos, la situación laboral, el tiempo de enfermedad y el grado de discapacidad (EDSS). 3. Las características clínicas y sociodemográficas que más influyen en la CVRS Mental de las personas con EM son: El sexo, la edad, la situación laboral, el nivel educativo, el estado civil, el tiempo de enfermedad y el grado de discapacidad (EDSS). 4. El factor sociodemográficas que menos influyen en la CVRS Mental de las personas con EM de nuestro estudio es : el tener o no tener hijos 5. Las características sociodemográficas, de las personas cuidadoras, son similares a las de la población general de personas cuidadoras informales y a las de las personas cuidadoras de pacientes con EM. 6. Las personas cuidadoras informales de los pacientes de EM, tiene un nivel de salud menor que la población cuidadora general. 7. En la relación entre la persona cuidadora y el paciente con EM, en la medida que el numero de enfermedades de la persona cuidadora fue mayor, la CVRS Física del paciente con EM, se vio reducida. 8. La disminución de la salud mental de la persona cuidadora, influye negativamente en la CVRS Mental del paciente con EM. Aims.- / 1- Analyzing the Quality of Life related to the physical and mental Health (QLRH) of people with Multiple Sclerosis through the survey MSQOL-54. 2- Evaluating the QLRH depending on the socio-demographic variables. 3- Analyzing the health of the informal carers regarding the socio-demographic features and care situation. 4- Exploring the relationship between the QLRH of people with MS and mental health and the carer’s illnesses. Methodology.- Carrying out a descriptive correlational design to identify and describe the considered hypothetical relationships, a sample of 115 people (34 men and 81 women) diagnosed with Multiple Sclerosis and 79 informal carers (55 women and 24 men) subjected to inclusion and exclusion judgment has been used. Socio-demographic surveys such as (GHQ-12) and (MSQOL-54) have been implemented. Results.- Regarding the clinical and socio-demographic features of the patients with Multiple Sclerosis (MS), we have found that, most of the patients (75,7 %) suffered from MS sender-recurring, with a physical disability, according to EDSS criteria of 3,19, the time of the illness is set around 4 years. In accordance with the socio-demographic features, out of 115 patients, 81 are women and 34 men, the oldest age range is between 31 and 50 (33,8% and 32,4%), most of them with primary studies (34,6%) and they are married (60%) and a 61,2% has one or two children. The variables which presented a significant relationship with the Physical QLRH were: work situation; the average of patients working was higher than in those who are not working. The youngest age range is (20-30) has a very significant relationship with the physical QLRH. The time of illness only showed a statistically significant relationship with the sub-scale of physical health (r=,-299,p ˂.05), a longest duration of the illness has a lower physical QLRH. The amount of disability brought a very significant relationship (p˂.05) so when there was a higher disability the QLRH was reduced in all its dimensions. According to the results obtained by the carers regarding the socio-demographic features, out of 79 carers, 55 are women and 24 men, being the highest age range from 41 to 50 and for those with primary studies, those who are working and married people. In accordance with mental health, the total result obtained in the GHQ-12 was 12.89 with a typical deviation of 5.49. Regarding the self-perception of health, a 48,7 % stated that their health is good, having an average of 2.27 with a typical deviation of 0.86. Regarding the number of illnesses a 70% of carers have 3 or less, which means that a 30% suffer, at least, 4 illnesses. According to the mental health of the carer measured through the GHQ-12 and the demographic variables, the results showed that the gender is related to the mental health of the carer, being lower in women than men. If taking into account the relationship set between the QLRH of the patient with MS and the health-status of the carer, results showed a significant relationship between the number of the carer’s illnesses and the QLRH of the person with MS. CONCLUSIONS 1. The Quality of Life related to Health in the sample of our study is lower than the one in a general population. 2. The most influential clinical and socio-demographic features in the Physical QLRH of people with MS are: age, educational level, civil status, having or not having children, work situation, time of illness and degree of disability (EDSS). 3. The most influential clinical and socio-demographic features in the Mental QLRH of people with MS are: gender, age, work situation, educational level, civil status, time of illness and degree of disability. 4. The least influential socio-demographic factor in Mental QLRH of people with MS of our study is: having or not having children. 5. The socio-demographic features of the carers are similar to those in the general population of informal carers and to the carers of patients with MS. 6. The informal carers of patients with MS have a lower level of health than the general population of carers. 7. In the relationship between the carer and the patient with MS, where the number of illnesses was higher in the carer, the Physical QLRH of the patient with MS was reduced. 8. The decrease of mental health in the carer has a negative impact on the Mental QLRH of the patient with MS.

OBJETIVOS Desarrollar luz nocturnal respetuosa con el sistema circadiano, explorando los efectos no visuales de la luz, validando la metodología para evaluar cronodisrupción. Objetivos específicos: 1. Investigar efecto antiproliferativo de la melatonina en un amplio rango de concentraciones en melanoma y fibroblastos 2. Validar sistema de monitorización circadiana ambulatoria, proponeiendo un nuevo marcador de fase equivalente al DLMO. 3. Determinar la utilidad de la pupilometría para evaluar el efecto de la luz sobre el sistema circadiano y su posible relación con los ritmos de salida de este sistema. 4. Evaluar los efectos cronobiológicos de una luz nocturna, basada en tecnología LED, en la que se reemplaza la parte azul del espectro por longitudes de onda más cortas en un animal diurno (Octodon degus) y uno nocturno (Rattus norvegicus). METODOLOGÍA - Monitorización circadiana ambulatoria y análisis circadiano - Cuantificación de melatonina - Pupilometría - Monitorización actividad de rueda en modelos animales - Inmunohistoquímica CONCLUSIONES 1. La melatonina, a bajas concentraciones tuvo un efecto antiproliferativo sobre una línea celular de melanoma murino, mientras que protegió la viabilidad en el caso de los fibroblastos, no tumorales. Sin embargo, a altas concentraciones, tuvo mayor efecto antiproliferativo en la línea no tumoral. El mecanismo de acción, a altas concentraciones de melatonina, podría estar mediado por el incremento de ROS intracelular. 2. El método alternativo de actimetría (AA) desarrollado puede utilizarse para evaluar también la fase circadiana. La monitorización circadiana ambulatoria que integra este método alternativo de actimetría (que permite evaluar también la postura corporal), junto con el ritmo de temperatura de la muñeca y el patrón de exposición a la luz, constituye un buen método para evaluar el estado del sistema circadiano. 3. Se ha comprobado la utilidad del software desarrollado, PupiLabWare®, para procesar y analizar los datos obtenidos de pupilometría, registrándolo como propiedad intelectual. 4. La respuesta pupilar transitoria y sostenida son más intensas con las longitudes de onda de 460 a 490 nm, y con mayores flujos fotónicos. La sustitución de la luz azul por violeta debería, por tanto, considerarse para el diseño de nuevas fuentes de luz de uso nocturno. 5. La pupilometría constituye una técnica adecuada para predecir el estatus del sistema circadiano y la potencial eficacia de la luminoterapia, ya que la contracción pupilar en respuesta a luces monocromáticas de alrededor de 460 nm es mayor en aquellos sujetos con disrupción circadiana, evaluada a partir de los patrones de temperatura de la piel de la muñeca, actividad motora y exposición de la luz. 6. Una luz nocturna, obtenida reemplazando la parte azul del espectro por violeta (longitud de onda más corta) puede preservar el patrón de actividad diurna en un animal diurno (Octodon degus), pero no el patrón propio de un animal nocturno (Rattus norvegicus), indicando que este tipo de luz nocturna constituye una posible alternativa para su utilización por humanos, minimizando los efectos cronodisruptores de la luz durante la noche. CONCLUSIÓN GENERAL La cronodisrupción se puede medir fácilmente en humanos, con un bajo coste económico y de manera poco invasiva, utilizando un sistema de monitorización circadiana ambulatoria basada en la temperatura de la muñeca, la actividad motora, la postura corporal y la exposición a la luz, mientras que la pupilometría, como tal, constituye una herramienta útil a la hora de evaluar la calidad de la luz como sincronizadora del sistema circadiano. Una luz nocturna en la que se reemplace la parte azul del espectro por longitudes de onda más cortas sería útil para preservar la cromaticidad, evitando los efectos cronodisruptores de la luz azul durante la noche. / This thesis aims to develop a circadian friendly nocturnal light, through exploring non-visual effects of light, validating the necessary methodology to assess chronodisruption in humans. In order to pursue this final goal, the following specific objectives were established: 1. To confirm melatonin antiproliferative effect is also present under a wide range of concentrations tumor and non-tumor cell lines, clarifying its possible mechanism of action. 2. To validate a recent ambulatory circadian monitoring (ACM) system finding a DLMO-equivalent new phase marker. 3. To assess the usefulness of pupillometry for evaluating light circadian power and its possible relation with several circadian system outputs. 4. To evaluate the chronobiological effects on the diurnal Octodon degus and nocturnal Rattus norvegicus of a LED-based nocturnal light consisting of replacing the blue part of the spectrum with shorter wavelengths. METHODOLOGY - Ambulatory circadian monitoring and circadian analysis - Melatonin quantification - Pupillometry - Wheel running activity monitorization in animal models - Immunohystochemistry SPECIFIC CONCLUSIONS 1. Melatonin at low concentrations showed selective antiproliferative effects in tumor murine melanoma cell line, while protecting non-tumor murine fibroblast viability. However, at high concentrations, it produces more marked deleterious effects on non-tumor than in tumor cell line. A possible action mechanism points to the increase of intracellular ROS under high melatonin concentrations. 2. The alternative actigraphy method (AA), can also serve to assess also circadian phase since it presents a higher agreement rate and sensitivity for detecting sleep compared to the classical actigraphy method based on wrist acceleration detection and good correlation with the gold standard phase marker, the DLMO. The ambulatory circadian monitoring integrating this alternative actigraphy method which permits evaluate body position, together with wrist temperature, and light exposure, results in a good method to evaluate the circadian system status. 3. The usefulness of the developed software Pupilabware (R) to process and analyse pupillometry data has been proven and inconsequence, it has been registered in the copyright office. 4. Both transient and sustained pupillary light responses are more marked with wavelengths from 460 to 490 nm and with increasing photon fluxes. Total or partial substitution of blue by purple should be considered in the design of new nocturnal light sources. 5. Pupillometry constitutes a suitable technique to predict the circadian system status and the potential efficacy of light therapy since higher pupilar constriction in response to monochromatic blue lights around 460 nm is found when circadian disruption, assessed by wrist skin temperature, motor activity and light exposure patterns, is present. 6. A nocturnal light, obtained by replacing the blue part of the spectrum by violet (shorter wavelength) has proven to preserve the diurnal pattern in a diurnal animal (Octodon degus), while failing to maintain the circadian pattern in the a commonly used nocturnal rodent model (Rattus norvegicus), indicating that this kind of nocturnal light could constitute a circadian friendly light to be used by humans minimizing the chronodisruptive effects of light at night . GENERAL CONCLUSION Chronodisruption can be easy, inexpensive and unobtrusively measured in humans, using an ambulatory monitoring system based on wrist temperature, motor activity (based in tilt changes), body position and light exposure, while pupillometry, by its own, constitutes a useful tool to evaluate the quality of light as a circadian input. A nocturnal light consisting of replacing the blue part of the spectrum with shorter wavelengths would be able to preserve chromaticity while avoiding chronodisruptive effects of blue light during the night.