O fosfato inorgânico é um composto essencial por estar relacionado com diversos processos metabólicos e biossíntese de moléculas relevantes à sobrevivência celular. Em bactéria são conhecidos dois tipos principais de transportadores específicos de fosfato inorgânico, o sistema Pit, de baixa afinidade, e o sistema Pst de alta afinidade, um ABC transportador, ativado sob carência de fosfato extracelular. A interação deste sistema com a fisiologia e patogênese de Streptococcus mutans, o principal agente etiológico da cárie dental, foi estudada neste trabalho. Os genes que codificam o sistema Pst de S. mutans UA159, estão organizados em um óperon policistrônico (pstS, C1, C, B, smu.1134 e phoU). A análise das sequências de aminoácidos das proteínas do sistema Pst de S. mutans com ortólogos do gênero Streptococcus, demonstrou maior identidade com bactérias da cavidade oral. Análise de prevalência do gene pstS, que codifica a proteína ligadora, demonstrou conservação entre todas as cepas laboratoriais e clínicas avaliadas. A deleção de pstS reduziu a capacidade de incorporação de ortofosfato que se refletiu na diminuição da taxa de replicação celular em meios com diferentes concentrações de fosfato inorgânico. A mutação também reduziu a capacidade da bactéria em aderir à superfícies abióticas e diminuiu sua hidrofobicidade de superfície, além de aumentar a resistência intrínseca a ácido. No entanto, não houve alteração na eficiência de transformação bacteriana. Por fim, o gene pstS de S. mutans foi clonado, expresso e a proteína purificada utilizada para obter anticorpos que inibiram o crescimento de S. mutans in vitro. Deste modo, segere-se que o sistema Pst é relevante na fisiologia e patogênese de S. mutans. / Inorganic phosphate is an essential compound related to several metabolic process and biosynthesis of molecules relevant to cellular survival. Bacteria are known to posses two main types of specific inorganic phosphate transporters, the low-affinity Pit system, and the high affinity Pst system, an ABC transporter family constituent, activated by extracellular phosphate starvation. The aim of this work was to study the role of Pst system in physiology and pathogenesis of Streptococcus mutans, the main etiological agent of dental caries. The genes of the Pst system of S. mutans UA159, are organized in a polycistronic operon (pstS, C1, C, B, smu.1134 and phoU). The amino acid sequence analysis of Pst proteins of S. mutans related to orthologs of Streptococcus genus, showed the highest identity value when compared to oral cavity bacteria. The PstS binding protein was present in all tested clinical and laboratory strains of S. mutans. The pstS mutant showed a decreased capacity of ortophosphate uptake which leaded to growth deficiency in different phosphate concentrations. The mutation also reduced the bacteria adherence to abiotic surfaces and the hydrophobicity of the cell surface, diverging from the increase the intrinsic acid resistance. Otherwise, there was no change in the bacterial transformation eficiency. Finally, the S. mutans pstS gene was cloned, expressed and the purified protein was used to obtain antibodies that inhibited the growth of S. mutans in vitro. Taking together, these results suggesting that the Pst transport system is relevant to S. mutans physiology and pathogenesis.

Orientadores: Francisco Carlos Groppo, Maria Cristina Volpato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T15:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_LuizEduardoNunes_D.pdf: 2235875 bytes, checksum: d1b942d7d03f2d1dc4c61cfc22f19c59 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A associação de anestésicos locais a sistemas de liberação modificados tem sido proposta visando prolongar o efeito anestésico e reduzir a citotoxicidade e indução da apoptose sobre diversos tipos celulares. Novas formulações anestésicas produziram uma baixa toxicidade sistêmica e maior duração da anestesia, porém também foram observados efeitos adversos como o aparecimento de processos inflamatórios. Desta maneira, o objetivo do estudo foi comparar os efeitos dos anestésicos locais livres em relação aos associados a carreadores sobre a modulação dos mediadores IL-6, IL1-?, IL-8, TNF-?, IL-10 e PGE2, além de sua ação sobre a viabilidade celular e indução da apoptose. Células HaCaT e FGH em cultura foram expostas a diferentes concentrações dos anestésicos bupivacaína, lidocaína e ropivacaína livres ou associados a lipossomos ou HP-?-CD, por 6h e 24h. A quantificação das citocinas e PGE2 foi realizada utilizando o teste de ELISA de captura. A viabilidade celular foi quantificada pelo método do XTT e avaliada qualitativamente por microscopia de fluorescência (LIVE/DEAD). A indução da apoptose foi estimada através de citometria de fluxo. A lidocaína associada com carreadores aumentou a liberação de citocinas, onde nos FGH a formulação lipossomal 100 µM estimulou um aumento significativo na liberação de TNF-?, IL-8 e IL-6, já as formulações em HP-?-CD conduziram a um aumento na liberação destes mediadores após 24h. Os tratamentos com lidocaína induziram aumento na liberação de PGE2 e pouco afetaram a viabilidade celular, onde apenas a formulação 100 µM livre apresentou perda de viabilidade após 24h nas células HaCaT. As formulações de ropivacaína em lipossomos aumentaram a liberação de IL-1?, TNF-? e IL-6 nos FGH e IL-8 nas células HaCaT. A liberação de PGE2 foi semelhante aos tratamentos com lidocaína. As formulações de ropivacaína reduziram significativamente a viabilidade celular nas células HaCaT após 24h. As formulações de bupivacaína apresentaram uma resposta inflamatória mais acentuada que a lidocaína, porém com características semelhantes em relação a associação a carreadores. A liberação de PGE2 variou de acordo com o tipo celular. As formulações de bupivacaína causaram maior perda de viabilidade celular em comparação com a lidocaína, sendo mais acentuada pela complexação com HP-?-CD. A indução da apoptose nas células HaCaT apresentaram resultados semelhantes entre os tratamentos e o controle, onde as formulações lipossomais de bupivacaína e ropivacaína apresentaram maiores alterações quando somados os percentuais de apoptose e necrose. Concluí-se que o tipo celular, a molécula de anestésico local e o carreador utilizado foram fatores determinantes sobre a liberação de citocinas e PGE2. Os anestésicos locais associados aos carreadores apresentaram um maior potencial inflamatório estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias. A viabilidade celular avaliada após tratamentos associados a carreadores variou em função do potencial citotóxico da molécula de anestésico local. Desta maneira, este estudo obteve resultados inéditos contribuindo para o aperfeiçoamento de novas formulações anestésicas / Abstract: Local anesthetics association to modified drug release systems have been proposed in order to prolong the anesthetic effect and reduce the toxicity. These new anesthetics formulations produced a low systemic toxicity and a longer anesthesia duration, however side effects were also observed such as local inflammation. The aim of this study was compare the effects of plain and carriers association local anesthetics formulations on the modulation of IL-6, IL1-?, IL-8, TNF-?, IL-10 and PGE2 release, their effects on cell viability and apoptosis induction in HaCaT and FGH. Cells were exposed to different concentrations of bupivacaine, lidocaine and ropivacaine in a plain formulation or associated with liposome or HP-?-CD for 6h and 24h. Cytokines and PGE2 quantification was performed by ELISA. Cell viability was measured by XTT assay and qualitatively assessed by fluorescent microscopy (LIVE/DEAD). Apoptosis induction was estimated by flow cytometry. Lidocaine in association with carriers increased cytokines release. The 100 µM liposomal formulations stimulated a significant increase in the TNF-?, IL-8 and IL-6 release by FGH cells. HP-?-CD formulations led to an increase of these mediators in the FGH cells after 24h. Lidocaine treatments induced an increase in the release of PGE2 and low effect on cell viability, where only 100 the µM plain lidocaine showed cell viability loss after 24h in HaCaT cells. Liposomal ropivacaine formulations increased the release of IL-?, TNF-? and IL-6 by FGH and IL-8 by HaCaT cells. PGE2 release was similar to lidocaine treatments. Ropivacaine formulations significantly reduced cell viability in HaCaT cells after 24h. Bupivacaine formulations showed a stronger inflammatory response than lidocaine, but with similar characteristics after carriers association. PGE2 release varied according to cell type. Bupivacaine formulations caused more cell viability loss when compared with lidocaine, being more accentuated by HP-?-CD complexation. Control and treatments showed similar results in apoptosis induction in HaCaT cells. Liposomal bupivacaine and ropivacaine formulations showed more alterations when aggregating the percentage of apoptosis and necrosis. In conclusion, cell type, local anesthetic molecule and the kind of carrier were determinants factors for cytokines and PGE2 release. Local anesthetics associated with carriers showed a higher inflammatory potential by an increased in the pro-inflammatory cytokines. The benefits of carriers association on cell viability varied with the cytotoxic potential of the local anesthetic molecule. In fact, this study produced a first reported of the effects of liposomal and HP-?-CD local anesthetics formulations on the inflammatory mediators release in HaCaT and FGH. Others aspects such as cell viability and apoptosis were also evaluated, contributing to the development and improvement of new local anesthetics formulations / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Orientadores: Maria Cristina Volpato, Francisco Carlos Groppo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Muniz_BrunoVilela_M.pdf: 860734 bytes, checksum: 815e06c4724e0ee7ed82f780fce50958 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A articaína não encapsula em proporção significativa em lipossomas sem gradiente de pH transmembranar. O objetivo deste estudo foi preparar e realizar a caracterização inicial de formulação de articaína associada a lipossomas unilamelares (400nm) com gradiente de pH transmembranar, com sulfato de amônia como tampão interno sobre a viabilidade celular em culturas de queratinócitos humanos (HaCaT) e sobre a liberação de uma interleucina pró-inflamatória (IL-6), comparando com formulações de articaína livre. As células foram expostas às formulações de articaína nas concentrações 0,1%, 0,2% e 0,3% na forma de solução e em suspensão lipossomal (lipossomas unilamelares), além dos controles (soro fisiológico, suspensão lipossomal e meio de cultura). A avaliação da viabilidade celular (redução do MTT - espectrofotometria) foi realizada após 10 min e 4h e a quantificação da IL-6 (imunoensaio de ELISA) após 4h da exposição às formulações. Os resultados foram submetidos aos testes de Kruskal-Wallis com post-hoc de Dunn (viabilidade celular) e de Student-Newman-Keuls (IL-6) com significância de 5%. As vesículas lipossomais mantiveram-se integras após a encapsulação de articaína, apresentando 18,95% de eficiência de encapsulação. A polidispersão dos lipossomas sem anestésico foi de 0,2 ± 0,0, enquanto a dos liposomas contendo articaína variou de 0,56 ± 0,03 a 0,66 ± 0,10. O potencial Zeta variou de -10,5 ± 0,9 a -21,2 ± 0,9 mV. O tamanho das vesículas variou de 622 ± 71,5 a 796 ± 111,95 nm. A viabilidade celular foi diminuída após 10 min de exposição às formulações lipossomais (com e sem articaína) em relação aos demais tratamentos (p<0,05); as formulações lipossomais não diferiram entre si (p>0,05). Não houve diferenças entre os demais tratamentos (p>0,05), os quais não alteraram a viabilidade nesse tempo de exposição. Após exposição por 4h houve diminuição na viabilidade em todas as formulações lipossomais e nas formulações de articaína livre 0,2% e 0,3% (p<0,05), à exceção dos grupos controle e articaína 0,1% (p>0,05). A liberação de IL-6 não foi afetada pelas formulações lipossomais (p>0,05); a articaína livre em todas as concentrações testadas aumentou a liberação de IL-6, tanto em relação ao controle, quanto às formulações lipossomais com a mesma concentração de articaína (p<0,05). Conclui-se que a utilização de lipossomas com gradiente de pH transmembranar aumentou a encapsulação de articaína, entretanto, apresentou toxicidade intrínseca no modelo avaliado / Abstract: Articaine is not encapsulated in significant proportion in liposomes without transmembrane pH gradient. The aim of this study was to perform the initial characterization of a formulation of articaine in unilamelar liposome with transmembranarpH gradient and to observe its effects on human keratinocytes (HaCaT) regarding cellular viability and liberation of interleukin 6 (IL-6) in comparison to plain articaine. HaCaT cells were exposed to plain articaine solutions and liposomal suspensions (0.1%, 0.2% and 0.3% articaine concentrations) and to the controls (saline, liposomal suspension and culture medium). Cell viability (MTT reduction - spectrophotometry) was evaluated at 10 min and 4h after exposure to the treatments; IL-6 was determined after 4 h of cell treatments. Cell viability results were submitted to Kruskal-Wallis test, followed by Dunn post-hoc test; IL-6 results were analyzed by Kruskal-Wallis and Student-Newman-Keuls tests. Significance was set at 5%. Liposome vesicles remained intact after articaine loading and presented encapsulation efficiency of 18.95%. Liposome without anesthetic presented polydispersity index of 0.2 ± 0.0, while liposomes with articaine showed values of 0.56 ± 0.03 to 0.66 ± 0.10. Zeta potentials varied from -10.5 ±0.9 to -21.2 ± 0.9 mV and vesicle sizes from 622 ± 71.5 to 796 ± 111.95 nm. Cell viability decreased after 10 min exposure to the liposomal formulations (with and without articaine) in relation to the other treatments (p<0.05); liposomal formulations did not differ from each other (p>0.05). No differences were found among the other treatments (p>0.05), which did not interfere in cell viability after this exposure time. After 4h exposure cell viability was diminished by all liposomal formulations and by 0.2% and 0.3% plain articaine (p<0.05), except for control groups and 0.1% plain articaine (p>0.05). IL-6 release was not affected by liposomal formulations (p>0.05); all concentrations of plain articaine increased IL-6 release in relation to the controls and to each correspondent liposomal formulation (p<0.05). In conclusion, liposome with transmembrane pH gradient increases articaine encapsulation in relation to that described in the literature, however it presented intrinsic in the model evaluated / Mestrado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Mestre em Odontologia

Orientador: Irene Gyongyver Heidemarie Lorand Metze, Ângela Cristina Malheiros Luzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira-Cunha_FernandaGoncalves_D.pdf: 2398726 bytes, checksum: 1eeb61b74ea6dfdcea43770d6371aae0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O sangue de cordão umbilical (SCU) é uma fonte de células-tronco para terapia celular e transplante de medula óssea. Devido a grande extensão territorial do Brasil, muitas vezes acontecem problemas logísticos na coleta de inúmeras unidades de SCU (USCU). Nosso objetivo foi estudar a mudança de proporções e a viabilidade dos diversos subtipos celulares do SCU, especialmente das células-tronco CD34+ até 96 horas após a coleta de amostras mantidas à temperatura ambiente (T.A.). Avaliamos ainda a modificação destes dados após o descongelamento das amostras. Cada subtipo celular foi identificado fenotipicamente usando citometria de fluxo. A viabilidade celular foi estudada utilizando o corante 7-aminoactinomicina (7-AAD). A funcionalidade das células-tronco CD34+ foi examinada através de ensaios clonogênicos. Num primeiro estudo foram analisadas trinta e seis USCU em 24, 48 e 96 horas após a coleta. As células-tronco CD34+ e os linfócitos T maduros aumentaram a porcentagem durante o período de estocagem. Os linfócitos B maduros e as células mesenquimais diminuiram, mantendo a viabilidade. Os granulócitos diminuíram a porcentagem com perda da viabilidade. Os monócitos e precursores B mantiveram-se estáveis. Os ensaios clonogênicos demonstraram diminuição no número de unidades formadoras de colônias (CFU) nas USCU estocadas até 96 horas (média 194/ 24 horas e 168/ 96 horas), mas todas as USCU apresentaram bom número de colônias. No segundo estudo foram analisadas vinte USCU em 24 e 96 horas após a coleta. Essas amostras foram congeladas e descongeladas após seis meses para serem reavaliadas. Os resultados das amostras pré-congelamento foram semelhantes aos encontrados no primeiro estudo. Os resultados pós-descongelamento demonstraram que as células CD34+ diminuíram, mas não significativamente, quando comparamos amostras estocadas 24 e 96 horas antes de processar. As células-tronco mesenquimais, precursores B, linfócitos B maduros e monócitos não apresentaram alterações estatísticas significantes. Os linfócitos T e granulócitos diminuíram significativamente. Houve crescimento de CFU em todas as amostras, embora o número de colônias tenha sido menor nas amostras estocadas 96 horas pré-congelamento quando comparadas às processadas após 24 horas (mediana 68 x 57; p <0.0001). No entanto, a maior diminuição foi observada pós-descongelamento (mediana 36 x 27 respectivamente). A diminuição do número de CFU estocadas 96 horas apresentou correlação com a porcentagem de células CD34+ inviáveis pré-congelamento. As células-tronco CD34+ e mesenquimais apresentaram boa viabilidade até 96 horas à T.A., mesmo pós-descongelamento. O processo de descongelamento diminuiu a porcentagem, mas não a viabilidade dessas células. O crescimento de CFU durante todo o período analisado comprovou a funcionalidade das células CD34+. A manutenção da viabilidade e funcionalidade das células-tronco do SCU estocados até 96 horas após a coleta à T.A., provendo número considerável de CFU mesmo após o congelamento e descongelamento poderá possibilitar a coleta de USCU de lugares mais distantes dos Bancos Públicos de SCU (BSCUP), o que seria muito importante para seu armazenamento. Portanto, as USCU poderiam ser manipuladas até 4 dias após a coleta quando necessário. Isto aumentaria consideravelmente o recrutamento de bolsas de SCU nos BSCUP, mantendo a segurança da fonte de células-tronco para uso na medicina regenerativa / Abstract: Umbilical cord blood (UCB) is a good source of stem cells for cell therapy and has been successfully used for bone marrow transplantation. In 2004, the Brazilian Public Network of Cord Blood Banks was founded. However, because our country is large, logistic problems could hamper the collection of numerous samples. Our aim was to evaluate the variation in proportion and viability of several UCB cell subsets, especially CD34+ stem-cells and their viability until 96 hours after collection of samples stored at room temperature. We evaluated also all cell subtypes and their viability and functionality kept frozen for 6 months and then thawed. Each cell subtype was identified by immunophenotyping and the viability was studied by 7-AAD incorporation and CD34+ stem-cell functionality was studied by clonogenic assay. In the first study we analysed thirty-six UCB units at 24, 48 and 96 hrs after collection and we demonstrated that CD34+ stem cells and mature T lymphocytes percentages increased during this period. Mature B lymphocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) decreased, maintaining viability. Granulocytes decreased with loss of viability. Monocytes and immature B lymphocytes remained stable. Clonogenic assays showed a decrease in colony-forming unit (CFU) number in UCB units stored for 96 hours. But even so, an acceptable number CFU was maintained. In the second study we analysed twenty UCB units at 24 and 96 hrs after collection, frozen for 6 months and thawed for reevaluation. Pre freezing (PF) results were similar to those found in the first study. Post-thaw (PT) results showed that the number of CD34+ cells tended to decrease in kept 96 hrs at room temperature before processing. PT /24 and 96 hrs results of MSCs, immature and mature B cells and monocytes had no significant variation. T lymphocytes and granulocytes had a significant decrease. CFU growth was observed in all samples. Delay of 96 hrs PF was associated with a decrease in CFU number (median 68 x 57; p <0.0001). Moreover, a larger decrease was observed in PT samples (median 36 x 27 respectively). CFU loss at 96 hrs PF showed a correlation with the proportion of non-viable CD34+ before processing. CD34+ and MSCs stem-cells remained viable until 96 hrs after collection at room temperature even after freezing and thawing. CFU growth during all period analyzed confirming CD34+ functionality. The maintenance of viability and functionality of UCB stem cells stored until 96 hrs after collection at room temperature, providing a good number of colonies even after freezing and thawing could possibly allow the collection of UCBUs from places far away from UCB Banks, which would be of great value for increasing the number of Units in Umbilical Cord Blood Banks / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

A estomatite protética é uma patologia que acomete muitos usuários de prótese total. Um dos principais fatores da sua etiologia é a fácil adesão de microrganismos, como a Candida albicans, à resina acrílica, principalmente devido às características de superfície facilitadoras deste material. Por esta razão, estuda-se materiais que possam modificar as características de superfície da resina acrílica sem alterar as suas propriedades mecânicas. A investigação das propriedades desses materiais, como a biocompatibilidade e como eles influenciam as células de C. albicans, é de extrema importância para uma futura aplicação clínica. Dessa forma, a proposta desta pesquisa foi avaliar a citotoxicidade sobre fibroblastos gengivais humanos (FGH) e o estresse oxidativo causado em células de C. albicans por 6 produtos (etil-cianoacrilato convencional -ECAc; etil-cianoacrilato em forma de gel formulação a -ECAga; etil-cianoacrilato em forma de gel formulação b -ECAgb; butil-cianoacrilato - BCA; octil-cianoacrilato OCA; selante tissular a base de veneno de cobra-VC;), que quando aplicados na superfície da resina acrílica, modificam suas características de superfície, visando diminuir a formação do biofilme de C. albicans. Espécimes de resina acrílica foram confeccionados e duas camadas de cada produto foram aplicadas nas superfícies. Cada espécime foi deixado em 1, 066 mL de meio de cultura durante 24 horas para extração e utilização do meio condicionado para os dois ensaios. Para a investigação da citotoxicidade, os FGH foram cultivados em placas de 96 poços, meios condicionado de cada grupo foram depositados em cada poço onde permaneceram em contato por 24, 48 e 72 h. Após o processamento para o ensaio de MTT as placas foram analisadas em espectrofotômetro a 500 nm. Foram realizados quatro experimentos independentes em triplicata (n=12). Para a investigação de estresse oxidativo (ERO) causado em C. albicans, biofilme foi desenvolvido em placas de 96 poços durante 24 h. Então, os meios condicionados foram adicionados aos poços e a placa foi mantida em agitadora durante 1 h. Após a retirada dos meios condicionados, foi adicionado a cada poço o reagente CellRox® Deep Red e leituras foram realizadas a cada 30 min durante 3 h em fluorímetro a 640/665nm. Amostras foram coletadas e ensaio de cultura microbiológica foi executado para a realização da normalização dos valores. Foram realizados 3 experimentos independentes em triplicata (n=9). Os resultados obtidos pelo ensaio MTT foram analisados por meio de ANOVA a 2 critérios, seguido pelo teste Tukey para a comparação entre grupos (p<0,05). Para o ensaio ROS, a análise estatística realizada foi ANOVA a 1 critério, seguida, igualmente, por Tukey (p<0,05). Os resultados mostraram que todos os grupos apresentaram certo grau de citotoxicidade quando comparados ao controle, com exceção do VC (ECAc&lt;ECAgb&lt;BCA&lt;OCA&lt; ECAga). O grupo ECAc em 24 e 48 h apresentou viabilidade em torno de 80%. Avaliando os tempos experimentais, a citotoxicidade demonstrou uma característica progressiva. O resultado do ERO demonstrou que todos os grupos induzem estresse oxidativo em células de C. albicans (OCA&lt;ECAc&lt;VC&lt;BCA&lt;ECAgb). Para a utilização clínica de tais produtos experimentais, estudos mais aprofundados devem ser realizados. / Denture stomatitis is a disease that affects many denture wearers. One of the main factors of its cause is the easy adhesion of microorganisms, such as Candida albicans, to acrylic resin, mainly due to its permissive surface characteristics. For this reason, materials that can modify surface characteristics of acrylic resin without changing its mechanical properties are being studied. The investigation of these materials features, such as biocompatibility and how they affect Candida albicans, is of utmost importance for future clinical application. Thus, the purpose of this study was to evaluate the cytotoxicity of human gingival fibroblasts (HGF) and oxidative stress in C. albicans cells after contact with 6 experimental products (conventional ethyl-cyanoacrylate -ECAc; ethyl-cyanoacrylate in gel formulation \"a\" -ECAga; ethyl-cyanoacrylate in gel formulation \"b\" -ECAgb; butyl- cyanoacrylate - BCA; octyl-cyanoacrylate -OCA; tissue adhesive based on snake venom -VC) applied to the surface of the resin acrylic, modifying its surface characteristics, in order to decrease C. albicans biofilm formation. Acrylic resin specimens were manufactured and two layers of each product were applied to the surfaces. Each specimen was immersed in 1,066 mL of growth media for 24 hours for extraction and the resulting conditioned media were used for both tests. To investigate cytotoxicity, HGF were cultured in 96-well plates and conditioned media from each group were deposited into each well, where they remained in contact for 24, 48 and 72h. After the MTT assay processing, plates were analyzed in a spectrophotometer at 500 nm. Four independent experiments were performed in triplicate (n=12). To investigate oxidative stress (ROS), C. albicans biofilm was developed in 96-well plates for 24 h, conditioned media were added to the wells and the plate was allowed to stir for 1 h. Then, conditioned media were removed and CellRox® Deep Red reagent was added to each well. Readings were performed every 30 min for 3 h in fluorometer at 640/665nm. Samples were collected and microbiological culture test was executed to values normalization. Three independent experiments were performed in triplicate (n=9). Results obtained in MTT assay were analyzed by two-way ANOVA and Tukey\'s test for comparison between groups (p<0.05). for comparison between groups (p<0.05). For ROS results, one-way ANOVA was performed followed by Tukey test, as well (p<0.05). The results showed that all groups presented different degrees of cytotoxicity when compared to control group, except for VC (ECAc&lt;ECAgb&lt;BCA&lt;OCA&lt;ECAga). ECAc group at 24 and 48 h showed viability about 80%. Evaluating experimental periods, the cytotoxicity showed a progressive characteristic. ROS results showed that all groups induced oxidative stress in C. albicans cells (OCA&lt;ECAC&lt;VC&lt;BCA&lt;ECAgb). For clinical use of such experimental products, further studies should be conducted.

O fator 2 derivado de células estromais, SDF2 (do inglês Stromal cell derived fator 2) é um gene de função ainda desconhecida, conservado em mamíferos e descrito primeiramente por Hamada et al. (1996). Neste estudo, observamos que a proteína Sdf2 de camundongo possui a alta similaridade de sequência em relação ao SDF2-like(L)1 humano e murino e de estrutura preditiva também similar em relação ao SDF2-like de Arabidopsis thaliana. A proteína mostrou-se sublocalizada no retículo endoplasmático e apresentou ampla distribuição nos tecidos e órgãos de camundongos. O mapeamento da expressão de Sdf2 ao longo da gestação humana e de camundongo nos mostrou que a proteína está presente em todas as etapas e compartimentos da placenta, com expressão em diversos tipos celulares. Nossos resultados sugerem que o SDF2 participa dos processos de diferenciação de células trofoblásticas humanas e murinas de maneira oposta. Em humanos, onde o processo é dependente da ativação de caspase-8 observou-se um aumento da expressão de SDF2. Em camundongos, onde o processo é por endoreduplicação, houve diminuição da expressão da proteína. A participação do SDF2 na via de estresse de retículo endoplasmático (RE) nas células trofoblásticas também foi analisada. Fatores adversos que podem levar à perda da homeostase do RE e levar a um acúmulo de proteínas mal enoveladas geram o fenômeno conhecido como Estresse de RE. O estresse de RE ativa a via de Resposta a Proteínas Mal Enoveladas (UPR, em inglês Unfolded Protein Response), que atua em diferentes vias de sinalização para aumentar a produção de chaperonas, a degradação das proteínas mal enoveladas e a diminuição da produção de novas proteínas. Estas respostas aumentam as chances de sobrevivência celular. Se, no entanto, a célula não recuperar sua homeostase, vias que levam à apoptose serão ativadas. A geração de estresse de RE pelo agente tunicamicina alterou significativamente a expressão de SDF2. Além disso, o silenciamento do gene SDF2 alterou a expressão dos principais fatores de controle de sobrevivência e apoptose da UPR. Desta forma, estes achados sugerem que o SDF2 desempenha um papel na regulação de sobrevivência/apoptose das células trofoblásticas pela via UPR. / The stromal cell derived factor 2 (SDF2) was first described by Hamada et al.(1996), is well conserved in mammals but its function is still unknown. In this study, we observed the predicted aminoacid sequence os Sdf2 is similar to human and mouse SDF2L1 sequence and the predicted Sdf2 structure is similar to SDF2-like from Arabidopsis thaliana. The protein is sublocalizes in the ER and it is widely expressed in mouse tissue and organs. The expression of Sdf2 throughout human and mouse gestation showed the protein is present in all gestational phases and compartments analysed and it is expressed by several cell types in the placenta. In trophoblast functional assays, SDF2 showed opposite expression patterns in human and mouse differentiation processes. In humans, where the process is dependent of caspase-8 activation, the protein is upregulated. Im mouse, the process is dependent of endoreduplication, the protein is downregulated. The participation of SDF2 in Endoplasmic Reticulum (ER) stress in trophoblastic cells was also evaluated. Adverse environmental conditions may lead to disruption of ER homeostasis causing accumulation of unfolded/misfolded proteins in ER, a phenomenon known as ER stress. ER stress activates the Unfolded Protein Response (UPR) that acts in several signaling cascades to improve chaperone production, misfolded protein degradation and to downregulate new protein production. These responses increase the capacity of cells to maintain alive even in stress conditions. Whether cells fail on restore homeostasis, the UPR activates apoptosis. We were able to observed that when gene silencing assays was used for SDF2, modifications in UPR cell survival/apoptosis markers were observed. In conclusion, we propose that SDF2 is playing a role in ER stress cell survival/apoptosis control in trophoblast cells.

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-15Bitstream added on 2014-08-27T15:57:17Z : No. of bitstreams: 1 000779820.pdf: 7636663 bytes, checksum: 221e2960f370d289d0928952e2d4eb9c (MD5) / É sabido que alguns patógenos podem desencadear o processo de apoptose em determinadas células do organismo, entretanto, o BHV-5 inibe a apoptose em embriões bovinos com sete dias de desenvolvimento. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação vírus-embrião no mecanismo de morte celular programada. Oócitos bovinos foram divididos em dois grupos, sendo: I (controle) e II (exposto ao BHV-5). Após 24 horas de maturação in vitro, 100 oócitos de cada grupo foram desnudados e observados em microscópio invertido para verificação da extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo o restante dos oócitos incubados com espermatozoides, por 18 a 20 horas, para que ocorresse o processo de fertilização in vitro. Transcorrido este período, os prováveis zigotos foram desnudados e transferidos para gotas contendo meio de cultivo (mSOF), até o dia sete pós-inseminação. Os embriões produzidos in vitro foram submetidos à técnica de PCR em tempo real para pesquisa do BHV-5 e análise da transcrição dos genes Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 e Apaf-1 relacionados à apoptose, além do teste de MTT ((3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), para avaliação da atividade mitocondrial. A análise estatística para a taxa de maturação nuclear dos oócitos foi feita pelo teste de x2. A produção in vitro de embriões, MTT e transcrição gênica foi avaliada pelo teste t não pareado. Observou-se que o BHV-5 não interferiu na taxa de maturação nuclear dos oócitos e no desenvolvimento embrionário, entretanto os embriões do grupo I apresentaram maior viabilidade mitocondrial e os embriões do grupo II tiveram a expressão dos genes Bax e caspase-2 diminuídos, comprovando que o vírus inibiu o processo de morte celular programada nos embriões bovinos sete dias pósinseminação, a fim de favorecer a disseminação viral / It is known that some pathogens can initiate apoptosis in certain cells of the organism, however, BHV-5 inhibits apoptosis in bovine embryos after seven days of development. Therefore, the aim was to investigate the interaction virus-embryo in the mechanism of programmed cell death. Bovine oocytes were divided into two groups: I (control) and II (exposed to BHV-5). After 24 hours of in vitro maturation, 100 oocytes of each group were denuded and observed under inverted microscope to check the extrusion of the first polar body, and the other oocytes were incubated with spermatozoa for 18 to 20 hours, for in vitro fertilization. After this period, presumptive zygotes were denuded and transferred to drops containing culture medium (mSOF), until day seven postfertilization. In vitro produced embryos were submitted to real time PCR to evaluated the presence of BHV-5 and expression of Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 and Apaf-1 related to apoptosis, also the MTT assay ((3 - [4,5-dimethylthiazol 2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)) was performed for the evaluation of mitochondrial activity. Statistical analysis for nuclear maturation of oocytes was performed by x2 test. In vitro embryo production, MTT and gene expression were analyzed by unpaired t test. It was observed that BHV-5 did not influence nuclear maturation rate of oocytes or embryonic development, however embryos of group I showed greater mitochondrial viability, and embryos of group II had a decrease in genes expression of Bax and caspase-2, suggesting that the virus inhibited the process of programmed cell death in bovine embryos seven days post-fertilization, in order to promote viral spread

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-01Bitstream added on 2014-06-13T18:19:48Z : No. of bitstreams: 1 pereira_ccs_me_araca.pdf: 1524857 bytes, checksum: 29dbf40d228058d4769e3d3ef3821153 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O propósito desse trabalho foi avaliar o efeito da osteotomia para implantes sobre a viabilidade celular óssea imediata, comparando a utilização de fresas do sistema convencional com a piezocirurgia em tíbias de coelhos. Foram utilizados 6 coelhos machos, divididos em 2 etapas: (1) Fresas – 5 grupos (G1 a G5) correspondentes às osteotomias 10, 20, 30, 40 e 50 vezes, respectivamente. Cada leito ósseo recebeu a sequência de fresas: lança e helicoidais de 2,0 mm, 2,8 mm, 3,0 mm e 3,15 mm; (2) Piezocirurgia – 5 grupos (P1 a P5) correspondentes às osteotomias 10, 20, 30, 40 e 50 vezes, respectivamente, efetuadas pela sequência de pontas de 2,0 e 3,0 mm, mediante vibração ultrassônica piezoelétrica. As áreas osteotomizadas foram coletadas e processadas laboratorialmente. A análise imunoistoquímica demonstrou equilíbrio das expressões de OPG e RANKL, ou seja, formação e reabsorção óssea, tanto nas osteotomias com fresas, quanto na piezocirurgia, embora mais intensas nesta última. A expressão de OC apresentou-se bastante intensa nos grupos de piezocirurgia, mas com redução da imunomarcação a partir da 30ª osteotomia, enquanto manteve-se constante nos grupos fresados. A CAS3 evidenciou a viabilidade osteoblástica a partir da 20ª osteotomia com piezocirurgia e manteve-se constante até a 50ª. No grupo de fresas, notou-se aumento gradativo da expressão dessa proteína, conforme o aumento do número de osteotomias. De acordo com a metodologia aplicada, foi possível concluir que a piezocirurgia propicia maior viabilidade celular osteoblástica do que o sistema de fresas convencional / The purpose of this study was to evaluate the effect of the osteotomy implant on bone cell viability immediately, comparing the use of conventional drilling system with piezosurgery® in tibiae of rabbits. We used 6 male rabbits were divided into 2 stages: (1) Drilling - 5 groups (G1 to G5) corresponding to the 10 osteotomies, 20, 30, 40 and 50 times respectively. Each received a bone bed following drills: Spear drill and 2.0 mm, 2.8 mm, 3.0 mm and 3.15 mm helicoidal drills, (2) Piezosurgery® - 5 groups (P1 to P5) corresponding to the 10 osteotomies, 20, 30, 40 and 50 times, respectively, analyzed by the sequence of inserts 2 and 3 mm by piezoelectric ultrasonic vibration. The receptor-beds were collected and processed in a laboratory. The immunohistochemical analysis showed balance expressions of OPG and RANKL, ie bone formation and resorption in both the osteotomies with drills and piezosurgery®, although more intense in the latter. The expression of OC had become quite intense in piezosurgery® groups, but with reduced immunostaining from the 30th osteotomy, while remained unchanged in groups drilled. The CAS3 showed the viability of the osteoblast from the 20th osteotomy with piezosurgery® and remained constant until the 50th. In the group of drills noticed a gradual increase in the expression of this protein, as the increase in the number of osteotomies. According to the methodology, it was concluded that the piezosurgery® provides greater osteoblastic cell viability than the system of conventional drilling

Orientador: Cleverton Roberto de Andrade / Resumo: O óleo essencial de Melaleuca alternifolia (tea tree oil - TTO) é composto por aproximadamente 100 componentes, sendo que os de maior concentração são o terpinen-4-ol e gama-terpineno. Os estudos da sua capacidade citotóxica têm demonstrado efeito sobre linhagens neoplásicas malignas. O objetivo do trabalho foi avaliar a capacidade citotóxica e mutagênica do TTO e seus componentes, terpinen-4-ol e gama terpineno em culturas celulares. Duas linhagens de carcinomas espinocelulares orais e uma linhagem de ceratinócitos foram analisadas por: (1) Análise colorimétrica de Metiltetrazolium (MTT); (2) Teste do Micronúcleo. Os resultados foram expressos na forma de ensaios de susceptibilidade e grau de mutagenicidade. Posteriormente foram analisados por one-way Anova com pós-teste de Tukey. Os valores de IC50 obtidos nas análises de MTT das células expostas ao TTO foram de 0,2% para a HaCaT, 0,14% para a HSC-3 e 0,17% para a SCC-25. Para a exposição ao terpinen-4ol, os valores de IC50, foram 0,5%, 0,3% e 0,45% para as linhagens HaCaT, HSC-3 e SCC-25, respectivamente. O gama-terpineno, não demonstrou atividade citotóxica expressiva, não sendo possível calcular o IC50. O TTO não demonstrou mutagenicidade nas linhagens HaCaT e HSC-3. O terpinen-4-ol, não foi capaz de produzir mutagenicidade em nenhuma das linhagens em estudo. Conclui-se que tanto o TTO quanto o terpinen-4-ol apresentam capacidade citotóxica sobre as linhagens HaCaT, HSC-3 e SCC-25. O TTO não foi mutagênico nas linhagens... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil - TTO) consists of about 100 components, and the highest concentration are terpinen-4-ol and gammaterpinene. Studies of their cytotoxic capacity have shown effect on malignant neoplastic lineages. The aim of this study was to evaluate the cytotoxic and mutagenic capacity of TTO and main soluble components, terpinen-4-ol and gama-terpinene in cell cultures. Two lineages of oral squamous cell carcinoma and a keratinocyte cell were analyzed: (1) colorimetric analysis Metiltetrazolium (MTT); (2) Micronucleus assay. The results were expressed as susceptibility tests and degree of mutagenicity. The statistical test used in the analysis was one-way ANOVA (Tukey test). The IC50 values obtained from the MTT analysis of cells exposed to TTO were 0.2% for HaCaT, 0.14% for HSC-3, and 0.17% for SCC-25. For exposure to terpinen-4ol, IC50 values were 0.5%, 0.3% and 0.45% for HaCaT, HSC-3 and SCC-25, respectively. The gamma-terpinene didn't show significant cytotoxic activity, therefore it was impossible to calculate the IC50. The TTO was unable to produce mutagenicity in HSC-3 and HaCaT. The terpinen-4-ol was not mutagenic in any of the lineages tested. In conclusion, both the TTO and terpinen- 4-ol had cytotoxic capacity on HaCaT, HSC-3 and SCC-25. The TTO was unable to produce mutagenicity in HSC-3 and HaCaT. The terpinen-4-ol was not mutagenic in any of the lineages tested. / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Helena Lage Ferreira / Banca: Vera Claúdia Magalhães Curci / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Resumo: É sabido que alguns patógenos podem desencadear o processo de apoptose em determinadas células do organismo, entretanto, o BHV-5 inibe a apoptose em embriões bovinos com sete dias de desenvolvimento. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação vírus-embrião no mecanismo de morte celular programada. Oócitos bovinos foram divididos em dois grupos, sendo: I (controle) e II (exposto ao BHV-5). Após 24 horas de maturação in vitro, 100 oócitos de cada grupo foram desnudados e observados em microscópio invertido para verificação da extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo o restante dos oócitos incubados com espermatozoides, por 18 a 20 horas, para que ocorresse o processo de fertilização in vitro. Transcorrido este período, os prováveis zigotos foram desnudados e transferidos para gotas contendo meio de cultivo (mSOF), até o dia sete pós-inseminação. Os embriões produzidos in vitro foram submetidos à técnica de PCR em tempo real para pesquisa do BHV-5 e análise da transcrição dos genes Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 e Apaf-1 relacionados à apoptose, além do teste de MTT ((3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), para avaliação da atividade mitocondrial. A análise estatística para a taxa de maturação nuclear dos oócitos foi feita pelo teste de x2. A produção in vitro de embriões, MTT e transcrição gênica foi avaliada pelo teste t não pareado. Observou-se que o BHV-5 não interferiu na taxa de maturação nuclear dos oócitos e no desenvolvimento embrionário, entretanto os embriões do grupo I apresentaram maior viabilidade mitocondrial e os embriões do grupo II tiveram a expressão dos genes Bax e caspase-2 diminuídos, comprovando que o vírus inibiu o processo de morte celular programada nos embriões bovinos sete dias pósinseminação, a fim de favorecer a disseminação viral / Abstract: It is known that some pathogens can initiate apoptosis in certain cells of the organism, however, BHV-5 inhibits apoptosis in bovine embryos after seven days of development. Therefore, the aim was to investigate the interaction virus-embryo in the mechanism of programmed cell death. Bovine oocytes were divided into two groups: I (control) and II (exposed to BHV-5). After 24 hours of in vitro maturation, 100 oocytes of each group were denuded and observed under inverted microscope to check the extrusion of the first polar body, and the other oocytes were incubated with spermatozoa for 18 to 20 hours, for in vitro fertilization. After this period, presumptive zygotes were denuded and transferred to drops containing culture medium (mSOF), until day seven postfertilization. In vitro produced embryos were submitted to real time PCR to evaluated the presence of BHV-5 and expression of Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 and Apaf-1 related to apoptosis, also the MTT assay ((3 - [4,5-dimethylthiazol 2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)) was performed for the evaluation of mitochondrial activity. Statistical analysis for nuclear maturation of oocytes was performed by x2 test. In vitro embryo production, MTT and gene expression were analyzed by unpaired t test. It was observed that BHV-5 did not influence nuclear maturation rate of oocytes or embryonic development, however embryos of group I showed greater mitochondrial viability, and embryos of group II had a decrease in genes expression of Bax and caspase-2, suggesting that the virus inhibited the process of programmed cell death in bovine embryos seven days post-fertilization, in order to promote viral spread / Doutor