Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVRS.pdf: 5281242 bytes, checksum: 8ae3e0f5731bedd5705926ff0020de41 (MD5) Previous issue date: 2007-08-16 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an important enzyme for industry, used to produce aminopenicillanic acid, a key intermediate in the synthesis of ampicillin, among other betalatam antibiotics. The production of this enzyme by Bacillus megaterium has been studied by the research group for several years. This work advances this research, aiming not only at the enhancement of the enzyme production, but also at a better understanding of B. megaterium regulatory expression mechanisms for PGA. A systematic study of the inoculum, including conservation strategies for the microorganism, was performed. Different cultivation media and operational conditions for the production of PGA were investigated, especially temperature and dissolved oxygen concentration. Enzyme recovery was also studied, including methodologies for minimizing protein contents in whey. Cheese whey is an important nutrient for enzyme production, but its use implies the presence of contaminant proteins in the culture broth. Finally, the enzyme was kinetically characterized. During the inoculum study, PGA yields of microorganisms conserved using different techniques were compared: endospores in 20%-glycerol, -50oC (cryotubes), endospores in solid medium, in refrigerator ( slants ) and vegetative cells in 5%-glycerol, -50oC ( eppendorffs ). It was observed that cryotubes (frozen spores) preserve the enzyme production levels for 12 months, 521 IU/L ±20 IU/L with great reproducibility. Conservation in slants shows a marked fall of production after one month, with a low reproducibility along months. Freezing vegetative cells leads to the highest patterns of enzyme production, up to 900 IU/L, but preservation is sustained for only five months. Maximum specific growth rates changed according to the conservation method, with µmax eppendofor > cryotube > slant . A study of the effect of the inoculum growth period on enzyme yield has shown that, for the three conservation methods, harvesting between 8 and 12 h leaded to similar cell mass and enzyme concentrations after 24 h of cultivation. The procedure of harvesting the inoculum after 12 h, with 10%-bioreactor inoculum volume, showed to be a good method for inoculum standardization. The effect of temperature on the cultivation of B. megaterium for production of PGA was assessed in the range 24-40oC. Maximum cell concentration and maximum enzyme yield were achieved at 30oC. The effect of the concentration of dissolved oxygen on the production of PGA was studied, using air to feed the bioreactor (culture medium volume: 1.2-2.0 L). A second B. megaterium strain showed a lower growth rate than the original one, demanding 24 h for germination/propagation, while the original one requires 12 h. Thus, different oxygen (air) feeding strategies were tested for both strains. Along the years, enzyme yields in agitated flasks have been higher than in bioreactor, for almost all assays. For the second strain, sustaining the dissolved oxygen at 10% of saturation leaded to the highest enzyme productivity among all tested conditions, with a bioreactor productivity similar to the agitated flasks. For the original strain a similar production was only achieved with an increasing stirring profile, implying a very low dissolved oxygen concentration, equal to zero during long periods of the cultivation. The two strains presented different dissolved oxygen requirements. Changes in the cultivation medium also implied different dissolved oxygen requirements for a maximum enzyme yield. Cheese whey has a still no-identified substance that is an essential nutrient for enzyme production. The use of enzymatically hydrolyzed cheese whey improves the downstream process. Assays in agitated flasks, with the original strain, using hydrolyzed whey, leaded to PGA levels similar to the ones obtained using integral whey. However, in bioreactor the yield of enzyme was always lower than in agitated flasks, no matter the aeration strategy that was used. Three possible explanations for this fact were investigated: 1) microorganism preservation method; 2) changes in the time necessary for attaining and sustaining the metabolic state where enzyme expression occurs, what could be related to the ratio between vegetative cells and spores along time, in flasks and in the bioreactor; 3) increase in the production of proteases in the bioreactor, compared to the flasks. The lower yield using hydrolyzed whey does not seem to be related to none of these hypotheses, and up to now it was not possible to generalize the study of the effect of this variable on the PGA production by B. megaterium. Enzyme purification and concentration, via ultra-diafiltration, in the presence of integral and hydrolyzed whey was another subject for research. The effect of pH and of the number of washing cycles on enzyme recovery was assessed. Results showed that this technique is efficient, provided it is run at low temperatures. Hydrolyzed whey indeed eases the purification of the enzyme using membranes, and great part of the contaminant whey proteins can be removed. However, an expressive loss of PGA occurs during the diafiltration stages, which must be minimized. pH did not influence enzyme recovery. The kinetic characterization of the produced enzyme, using the hydrolysis of penicillin G as standard reaction, has showed that maximum PGA activity is at pH 8 and 37oC. Estimated Michelis-Menten parameters were Vmax= 0.0344 mMPenG/min and Km=1.83 mM, with activation energy equal to 27.12 KJ/mol. / Penicilina G acilase (PGA) é uma importante enzima industrial usada para produção do ácido 6-aminopenicilânico, intermediário chave na produção de ampicilina e outros antibióticos β- lactâmicos semi-sintéticos. A produção dessa enzima por Bacillus megaterium vem sendo estudada no grupo há muitos anos. Esta tese dá continuidade a esse estudo visando não só aumento da produção da enzima, mas também um melhor entendimento dos mecanismos regulatórios da expressão de PGA por B. megaterium. Neste trabalho foi realizado um estudo sistemático do inóculo, incluindo estratégias para conservação do microrganismo. Foram investigados diferentes meios de cultura e condições operacionais de cultivo na produção de PGA, em especial temperatura e concentração de oxigênio dissolvido. A recuperação da enzima foi também estudada, incluindo metodologias para minimização do conteúdo de proteínas presentes no soro de queijo, um nutriente importante na produção da enzima, mas cujo uso implica também a presença de proteínas contaminantes no meio de cultivo. Finalmente, a enzima foi caracterizada cineticamente. No estudo do inóculo foram comparados, ao longo do tempo, os desempenhos na produção de PGA de microrganismos conservados como endósporos em glicerol 20% v/v, a -70°C (criotubos), como endósporos conservados em meio sólido a 4ºC ( slants ) e como células vegetativas em glicerol 8% v/v, a -70°C ( eppendorfs ). Verificou-se que sob a forma de esporos congelados (criotubos) há preservação dos níveis de produção da enzima até 12 meses, 521 UI/L ± 20 UI/L, com grande reprodutibilidade. Conservação como slants além de mostrar variabilidade ao longo dos meses, apresenta queda acentuada desde o primeiro mês de conservação. Congelamento de células vegetativas conduz a níveis mais altos de produção da enzima, 900 UI/L, mas preserva atividade apenas durante cinco meses. Velocidades específicas máximas de crescimento dos microrganismos variaram com a forma de conservação, com µmáx eppendorf > criotubo > slant . Estudo do efeito do tempo de crescimento do inóculo na produção da enzima mostrou que, para as três formas de conservação estudada, a colheita do microrganismo entre 8 e 12 horas de cultivo conduzia a produções de enzima e concentração do microrganismo similares após 24 horas de produção. O procedimento de colheita após 12 horas de cultivo, com inoculação de 10% do volume de biorreator, mostrou-se, assim, um bom critério para padronização do inóculo. Foi estudada a influência da temperatura no cultivo de B. megaterium para produção de PGA na faixa entre 25-40°C. Os resultados mostraram que a máxima concentração celular e a máxima produção da enzima ocorrem no cultivo a 30°C. O efeito da concentração de oxigênio dissolvido na produção de PGA foi extensamente estudado, sendo o biorreator (volume de meio: 1,2-2,0 L) alimentado com ar. Uma segunda linhagem de B. megaterium mostrou crescimento mais lento que a original, requerendo 24 horas para a fase de germinação/propagação, enquanto que a original requer 12 horas. Foi, assim, efetuado estudo em biorreator com diferentes estratégias de fornecimento de oxigênio (ar) para as duas linhagens. Ao longo dos anos, a produção de enzima em frascos agitados vem se mostrando maior que a obtida em biorreator em quase todos os ensaios realizados. A segunda linhagem mostrou de forma clara que a manutenção da concentração de oxigênio dissolvido em 10% da saturação conduzia à maior produção da enzima dentre todas as condições testadas, com produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 450 UI/L. Entretanto, produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 550-600UI/L, só foi obtida com a linhagem original usando-se um perfil crescente de agitação, que implicava concentração de oxigênio dissolvido muito baixa, permanecendo em zero por vários períodos ao longo do cultivo. As duas linhagens apresentaram, portanto, requerimentos diferenciados para o oxigênio dissolvido. Alterações no meio de cultivo também alteram o requerimento de oxigênio dissolvido para obtenção da máxima produção da enzima. Soro de queijo possui um fator que ainda não foi possível identificar que é nutriente essencial para a produção da enzima. O uso de soro hidrolisado permite melhor recuperação da enzima. Ensaios em frascos agitados, com a linhagem original, na presença de soro hidrolisado, conduziram a níveis de PGA similares aos obtidos com soro integral. Contudo, em biorreator, para todas as condições de oxigênio dissolvido testadas a produção da enzima era inferior à obtida em frascos agitados, qualquer que fosse a estratégia de aeração usada. Foram investigadas três possíveis explicações para esse fato: 1) forma de preservação do microrganismo; 2) alteração no tempo para se atingir e/ou manter o estágio metabólico onde ocorre expressão da enzima, o que poderia estar relacionado com a proporção entre células vegetativas/esporos ao longo do tempo em frascos agitados e biorreator; 3) aumento na produção de proteases no ensaio em biorreator em relação ao ensaio em frasco agitado. A menor produção com soro hidrolisado não parece estar relacionada com nenhuma dessas hipóteses, não tendo sido possível, portanto, até o momento, generalizar o estudo do efeito dessa variável na produção de PGA por B. megaterium. Foi efetuado estudo da concentração e purificação da enzima produzida na presença de soro integral e hidrolisado, através de ultra-diafiltração. Foi estudado o efeito do pH e do número de lavagens na recuperação da enzima. Resultados obtidos mostraram eficiência da técnica para concentração da enzima, se realizada a baixa temperatura. Mostraram também que soro hidrolisado realmente facilita a purificação da enzima através da filtração em membrana, permitindo remoção de grande parte das proteínas contaminantes introduzidas no meio com o soro de queijo. Contudo, ocorre expressiva perda de PGA durante as etapas de diafiltração, que devem ser minimizadas. O pH não influenciou na recuperação da enzima. Caracterização cinética da enzima produzida para a hidrólise de penicilina G mostrou que a máxima atividade de PGA ocorre a pH 8 e temperatura de 37°C. Os valores estimados para os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten foram de Vmáx e Km de 0,0344 mMPenG/min e 1,83 mM, respectivamente, com energia de ativação de 27,12 KJ/mol.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1651.pdf: 3101567 bytes, checksum: 399a65fa1b493a7477de38b37956b87e (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / Enzymatic hydrolyzed proteins present some advantages over the pool of amino acids obtained after a chemical hydrolysis: lower osmolality (easier absorption by the organism) and better sensorial characteristics. The removal of phenylalanine (Phe) from these hydrolysates allows their use in the diet of phenylktonuria (PKU) patients. This Thesis studies the sequential hydrolysis of cheese whey proteins. This process aims at producing a protein hydrolysate with low contents of Phe, after two reaction stages: in the first one, concentrated cheese whey proteins are hydrolyzed by the endoprotease chymotrypsin, immobilized on agarose gel. The substrate of the second stage is the product of the first one. This reaction is the central focus of this Thesis, and consists in a hydrolysis using the exoprotease carboxipeptidase A (CPA), immobilized on the same matrix. Since the scope of this work was a process for obtaining a protein hydrolysate with low contents of Phe for phenylketonurics, another stage had to be incorporated: ultrafiltration, to separate the amino acids released by the action of CPA, mainly Phe (and other amino acids that inhibit the reaction). With this purpose, an enzymatic membrane reactor (EMR) is proposed. It should be noticed that, to the best of our knowledge, the reactor design presented here has not been published yet. The EMR had spherical agarose particles within the reaction space, retained by a stainless steel mesh (400 Tyler). Hence, the ultrafiltration membrane was in charge only of the separation of the amino acids in the hydrolysate, which was continuously recycled to the flask containing the immobilized enzyme. Assays to characterize the membranes were performed. These membranes were then used in the integrated process (reaction with immobilized enzyme coupled to the ultrafiltration), for different experimental conditions. The substrates where Prato and Minas Frescal cheese whey. Two set-ups of the ultrafiltration unit were tested: flat plate and hollow fiber, both with 1 kDa cut-off. The reactor volume/membrane area ratios were 7.5×10-2 cm and 76.9×10-2 cm, respectively. Finally, the performance of three systems was compared: EMR with flat plane and hollow fiber and a batch reactor, followed by diafiltration. The hollow fiber EMR showed the best performance (85% conversion, productivity of 275.2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-PHE/h and only 1% retention of Phe in the membrane, after assays of 10 h). The resulting product was appropriate for phenylketonurics, with high protein contents (53.4 g/L), mainly constituted by small peptides (≤ 5.8 kDa) and with 19.9 mgPhe/gProteína, within the admissible range for PKU / Os hidrolisados protéicos via enzimática apresentam algumas vantagens, em relação à mistura de aminoácidos livres obtida pela hidrólise química: menor osmolalidade (e, portanto, maior facilidade de absorção pelo organismo) e características sensoriais mais agradáveis. Por sua vez, a remoção da fenilalanina (Phe) desses hidrolisados permite a utilização dos hidrolisados na dieta de fenilcetonúricos. Nesta Tese foi estudada a hidrólise enzimática seqüencial de proteínas de soro de queijo, processo proposto para obtenção de um hidrolisado protéico, com reduzido teor de Phe, e constituído de duas etapas reacionais: na primeira, as proteínas do soro de queijo concentrado são hidrolisadas pela endoprotease quimotripsina, imobilizada em gel de agarose. A segunda etapa, cujo substrato é o produto da primeira proteólise, é o foco central desta Tese, e consiste na hidrólise do substrato prehidrolisado utilizando-se a exoprotease carboxipeptidase A (CPA), imobilizada na mesma matriz. Como o escopo do trabalho era o processo para obtenção de um hidrolisado protéico com baixo teor de Phe para pacientes fenilcetonúricos foi necessário incorporar outra etapa: ultrafiltração, para separar os aminoácidos liberados por ação da CPA, principalmente Phe (além de outros aminoácidos inibidores da reação). Para isso, propõe-se trabalhar com reator enzimático de membrana (REM). Destaque-se que a concepção de reator aqui apresentada é, até onde vai nosso conhecimento, inédita. Estudou-se um reator de membrana com a enzima imobilizada em partículas esféricas de gel de agarose, retidas no volume reacional propriamente dito por meio de um filtro de aço (400 Tyler). Assim, a membrana de ultrafiltração ficou a cargo apenas da separação dos aminoácidos presentes no hidrolisado, que era reciclado continuamente para o frasco contendo a enzima imobilizada. Foram realizados ensaios para caracterização das membranas utilizadas, para posteriormente serem realizados ensaios em diferentes condições experimentais no processo integrado (reação com enzima imobilizada acoplada à ultrafiltração), utilizando como substratos soro de queijo tipo Prato e Minas Frescal. Foram testadas duas configurações de unidades de ultrafiltração: placa plana e fibra oca, ambas com corte de 1 kDa As razões volume de reator/área de membrana testadas foram de 7,5×10-2 e 76,9×10-2 cm, rescpectivamente. Foi desenvolvido um modelo matemático do REM, e suas predições foram comparados com dados experimentais de hidrólise com CPA para ambos os sistemas. Finalmente, foi comparado o desempenho de três sistemas: reator com membrana de placa plana, reator com membrana de fibra oca e reator em batelada, seguido por diafiltração com membrana de fibra oca. O REM tipo fibra oca apresentou o melhor desempenho (85% de conversão, uma produtividade de 275,2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-Phe/h e apenas 1% de retenção de Phe na membrana, em ensaios de 10 h. O produto resultante desse sistema apresentou características próprias para ser utilizado como complemento protéico para pacientes fenilcetonúricos, com um alto conteúdo protéico (53,4 g/L) constituído majoritariamente por pequenos peptídeos (≤ 5,8 kDa) e com 19,9 mgPhe/gProteína valor que se encontra dentro da faixa tolerada para pacientes de fenilcetonúria

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2138.pdf: 4301493 bytes, checksum: b5c60c6030083935e6ef824229ef53ac (MD5) Previous issue date: 2008-10-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The continuous advances in process computing have provided in recent years several sophisticated tools for process analysis and simulation. The effective use of these tools demands the capability to interface with a pre-existent process system hierarchy. Within this perspective, an important issue is to provide meaningful and useful simulation and optimization applications for complex systems that require integration with data-intensive experimentation. This study proposes an integrated environment, using Internet as development platform, for simulation, monitoring, control and optimization of a cheese whey refinery, employing immobilized and stabilized enzymes as catalysts. The multipurpose process described here, the cheese whey biorefinery, provides, besides lactose, whey protein concentrates and hydrolysates that can be applied in food and pharmaceutical formulae. In these circumstances, it is possible to add value to this significant by-product of the dairy industry, avoiding its disposal in natura (what is mostly done by small cheese manufacturers). In parallel, relevant aspects of the enzymatic reactions within the cheese whey biorefinery were investigated. The lumping of substrate molecules in pseudo-components, using a hybrid phenomenological-neural approach for description of the enzymatic depolymerization kinetics, is the suggestion to follow the complex reaction dynamics in biorefinery. During the estimative of model parameters, global search algorithms and different post-fitting statistical strategies were implemented and evaluated. The work, thus, is concerned with two of the main dilemmas/challenges of the present millennium: reduction of environmental problems related to the disposal of agro-industrial residues (i.e., cheese whey) and development of processes for food production from alternative sources (whey refinery). The integrated web application here presented may allow small companies to access a remote engineering centre , with know-how on plant design, economic evaluation and advanced control/optimization techniques. The idea can also be extended to large dairy companies, providing the remote control of sites of production geographically sparse. All implemented algorithms for remote process monitoring and control were validated with data from laboratory-scale assays. The validation of the hydrolytic kinetic models followed the same procedure. According to the achieved results, is possible to conclude that the robustness of the integrated computational environment was demonstrated. The prediction capability of the approaches employed for description of the proteolytic enzymatic reactions was verified, as well. / O contínuo avanço no processamento computacional vem proporcionando nos últimos anos o desenvolvimento e aplicação de ferramentas cada vez mais elaboradas de análise e simulação de processos. O uso consistente dessas ferramentas demanda, entre outras competências, a capacidade de interação com uma hierarquia de sistemas pré-definida pela engenharia de processos. Por outro lado, é imprescindível, nesse contexto, validar os cálculos matemáticos com dados reais de processo. Esta tese propõe um ambiente integrado, utilizando a Internet como plataforma de desenvolvimento, para simulação, monitoramento, controle e otimização do processo de refino do soro de queijo, utilizando enzimas imobilizadas em suporte inerte como catalisadores. O processo de refino aqui apresentado, dentro do escopo de uma planta multipropósito denominada biorefinaria de soro de queijo, disponibiliza como produtos, além da lactose, concentrados e hidrolisados protéicos com aplicação vasta em formulações alimentícias e farmacêuticas. Assim, agrega-se valor a um importante resíduo da indústria queijeira, altamente poluente se descartado in natura no meio ambiente. Paralelamente, aspectos relevantes das reações enzimáticas envolvidas na biorefinaria do soro de queijo foram aprofundados. O agrupamento de moléculas de substrato em pseudocomponentes, utilizando-se um enfoque híbrido fenomenológico-neuronal para descrição da complexa cinética de despolimerização enzimática, é a proposta para o acompanhamento dinâmico dos processos ocorrendo na biorefinaria. Durante o procedimento de estimativa paramétrica desses modelos cinéticos, algoritmos globais de busca e diferentes ferramentas de análise estatística pós-ajuste foram implementadas e avaliadas. O trabalho, assim, se insere em dois dos principais dilemas/desafios do presente milênio: redução do impacto ambiental provocado por resíduos agroindustriais (soro de queijo) e desenvolvimento de processos para produção de alimentos a partir de fontes alternativas (refino do soro). Nesse contexto, com o aplicativo aqui desenvolvido, pequenas e médias empresas interessadas em implementar o processo de beneficiamento do soro de queijo têm acesso a dados para dimensionamento dos equipamentos, estimativa do custo de produção e do retorno de investimento, com base em atualizações em tempo real de preços, custos e taxas de juros pela própria Internet. Com rotinas avançadas de monitoramento e controle agregadas, o ambiente integrado também pode se tornar atrativo para grandes indústrias de laticínios que tenham várias unidades fisicamente descentralizadas. Nesse caso, cada unidade poderia ser monitorada à distância, por exemplo, por um núcleo central de engenharia (conceito este que pode ser ampliado até níveis globais, com plantas de produção em diferentes países). Todos os algoritmos de monitoração e controle remotos implementados nesta tese foram validados em ensaios experimentais em escala de laboratório. Da mesma forma, os modelos cinéticos das reações enzimáticas também foram testados, em ensaios independentes de validação. Com base no conjunto de resultados apresentados, pode-se afirmar que ficou demonstrada tanto a robustez do ambiente computacional integrado, como a propriedade dos enfoques utilizados para descrição das reações de proteólise enzimática.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissDF.pdf: 699670 bytes, checksum: 3b6ce911fe1da5141ad8e34545247e79 (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / In the last two decades mammalian cell cultures have been broadly used for the industrial production of pharmaceutical, proteins, in particular the monoclonal antibodies by cultures of murine hybrid cells (hybridoma). The development of bioprocess for industrial scale of monoclonal antibodys (MAbs) depends on the determination and optimization of several physiological and metabolic parameters. In this work are shown preliminary development results of the bioprocess for production of three MAbs for blood typing through the ABO system, with is of great interest for Brazilian public health. Experiments with three lineages of murine hybridomas which were able to secret three different immunoglobulins with specificity to ABO human blood antigens were accomplished in Spinner flasks using RPMI 1640 medium and fetal bovine serum (FBS) in concentrations of 20 and 10 % vv, temperature of 37 ºC and pH 6.8 7.4 .The three hybridomas showed very different growth patterns in these culture medium The cultivation with 20 % v/v of FBS as much as the cultivation with cells adapted to 10 % v/v FBS showed the necessity of a better balance of the amino acids formulation in the culture medium in order to improve the specific maximum grow rate (µmáx) and maximum cells density (CXmáx). / Nas últimas duas décadas o cultivo de células animais tem sido amplamente utilizado para a produção industrial de proteínas de interesse farmacêutico em particular de anticorpos monoclonais, através do cultivo de células híbridas murinas (hibridomas). O desenvolvimento de bioprocessos de alta produtividade em larga escala de produção de anticorpos monoclonais (MAbs monoclonal antibodys) depende da determinação e otimização de vários parâmetros fisiológicos e metabólicos dos hibridomas. Neste trabalho são apresentados dados preliminares para o desenvolvimento de um bioprocesso de produção de três MAbs para tipagem sanguínea pelo sistema ABO, de grande interesse para a saúde pública Brasileira. Experimentos com três linhagens de hibridomas murinos capazes de secretar imunoglobulinas com especificidade a antígenos eritrocitários do sistema sanguíneo ABO humano foram realizados em frascos Spinner usando meio RPMI 1640 e soro fetal bovino (SFB) em concentrações de 20 e 10 % v/v, temperatura de 37 ºC e pH 6,8 7,4. Os três hibridomas mostraram características de crescimento celular bem diferenciadas nesse meio de cultura. Tanto os cultivos com 20 % v/v de SFB como os cultivos com células adaptadas a 10 % v/v SFB revelaram a necessidade de balanceamento de aminoácidos no meio para melhorar a velocidade específica máxima de crescimento celular (µmáx) e densidade máxima de células (CXmáx).

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-04T13:20:40Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1164967 bytes, checksum: 332512ca6a2aeedf157cf9480454d7f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T13:20:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1164967 bytes, checksum: 332512ca6a2aeedf157cf9480454d7f8 (MD5) Previous issue date: 2017-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Colostrum from the first secretions of the mammary glands is considered an essential food for the development of newborns due to its high content of proteins, antimicrobial peptides, macro and micronutrients. The serum is considered na important coproduct for the dairy industry, configuring about 85-90% of the total milk volume, its proteins are recognized by their biological properties, since they have an excellent composition and bioavailability of essential amino acids. The present study had as objective to characterize the serum protein profile of goat colostrum produced by goats Created in Paraíba and to evaluate possible biological activities. The serum (SR) was obtained by acid precipitation in pH 4.1 and fractionated by ammonium sulfate precipitation to obtain the fractions 0-30% (SF1), 30- 60% (SF2) and 60-90% (SF3). The analysis of the protein profile was verified by SDS-PAGE and total amino acids. The biological properties of the samples were verified with the analysis of antioxidant, DNA protection and antibacterial activities. It was verified that colostrum serum presents proteins with molecular masses between 12-160kDa and an excellent profile of amino acids. From the obtained results it is possible to affirm that all the fractions were able to sequester the radicals ABTS and DPPH. For the DNA protection test, the concentracion of 10μg of SF3 conferred a greater integrity to the molecule. The samples presented inhibitory activity for both gram-negative and gram-positive bacteria. Colostrum serum proteins have biological properties with potential biotechnological application and pharmaceutical interest / O colostro oriundo das primeiras secreções das glândulas mamárias é considerado um alimento essencial para o desenvolvimento dos recém-nascidos, devido seu elevado teor de proteínas, peptídeos antimicrobianos, macro e micronutrientes. O soro é considerado um coproduto importante para a indústria leiteira, configurando cerca de 85–90% do volume total do leite. Suas proteínas são reconhecidas pelas propriedades biológicas, uma vez que possuem uma excelente composição e biodisponibilidade de aminoácidos essenciais. O presente estudo teve como objetivo caracterizar o perfil proteico do soro de colostro caprino produzido por cabras criadas na Paraíba e avaliar possíveis atividades biológicas. O soro (SR) foi obtido por precipitação ácida em pH 4,1 e fracionado por precipitação com sulfato de amônio para obtenção das frações 0-30% (SF1), 30-60% (SF2) e 60-90% (SF3). A análise do perfil proteico foi verificado por SDS-PAGE e aminoácidos totais. As propriedades biológicas das amostras foram verificadas com as análises das atividades antioxidante, proteção ao DNA e antibacteriana. Verificou-se que o soro do colostro apresenta proteínas com massas moleculares entre 12-160kDa e um excelente perfil de aminoácidos. A partir dos resultados obtidos é possível afirmar que todas as frações foram capazes de sequestrar os radicais ABTS e DPPH. Para o teste de proteção ao DNA, a concentração de 10μg de SF3 conferiu uma maior integridade à molécula. As amostras apresentaram atividade inibitória tanto para as bactérias gramnegativas quanto para gram-positivas. As proteínas do soro do colostro apresentam propriedades biológicas com potencial aplicação biotecnológica e de interesse farmacêutico.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 822133 bytes, checksum: e079e0bf0b7042a8b0741f41174d4120 (MD5) Previous issue date: 2006-05-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The physiological and technological parameters important to the development of Direct Vat Set culture of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 cultivated in Minas Frescal cheese whey were studied. Greater fermentative activity on cheese whey was observed at 40ºC and therefore all bacterial growth experiments were performed at this temperature. Heat shock, 50ºC for 30 minutes, or acid stress, cheese whey with pH 3.5 for 30 minutes, did not affect growth of L. delbrueckii UFV H2b20 on cheese whey. The survival of heat or acid pre-treated cells was assessed after dehydration by lyophilization and spray-drying. Cell survival to either dehydration processes was not affected by acid pre-treatment, whereas heat shock had a deleterious effect on survival. The addition of protective substances (6% mannitol, 1,25% sorbitol, 1,25% monosodium glutamate and mixture of 6% sucrose and 4% trehalose) to cheese whey in which the cells were submitted to lyophilization did not improve cell survival to dehydratation and storage at -80ºC for two months. Cell survival was greater when lyophilization was performed on cheese whey alone. Acid pre-treated cells on cheese whey, pH 3.5 adjusted with HCl, without any further addition, retained higher viable counts after lyophilization and subsequent -80ºC storage. Cell activity recovery in 10% reconstituted skimmed milk was not affected by either heat shock or acid pre-treatment when cells were lyophilized in cheese whey with no additional substances. Spray-dried cultures submitted to acid stress demonstrate recovery comparable to active cells which were not subjected to any condition that could result in cell injury. Those cultures exhibit a high activity even after two months storage at - 20ºC. The hereby presented results demonstrate that the probiotic culture produced in stabilized Minas Frescal cheese whey, pre-treated at pH 3.5, and spray-dried have desirable viability and activity characteristics, and its use can be recommended for the elaboration of milk fermented products containing L. delbrueckii UFV H2b20 cells. / Os parâmetros fisiológicos e tecnológicos de importância para o desenvolvimento de sistema DVS para Lactobacillus delbrueckii UFVH2b20 em soro de queijo Minas Frescal estabilizado foram estudados. A maior atividade fermentativa das células do L. delbrueckii UFV H2b20 em soro de queijo ocorreu a 40ºC. Por essa razão, essa temperatura de incubação foi adotada para a condução dos experimentos. Foi observado que a aplicação de choque térmico, 50ºC por 30 minutos, ou choque ácido, pH 3,5 por 30 minutos, a 40ºC, às células de L. delbrueckii UFV H2b20 não afetaram seu crescimento. Foi avaliado ainda se a aplicação de tais pré-tratamentos afetava a sobrevivência aos processos de desidratação das células por liofilização e spray-drying. Foi observado que o choque ácido não afetou a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 aos dois processos de desidratação avaliados. Por outro lado, o choque térmico teve efeito deletério sobre a sobrevivência das células submetidas aos mesmos processos de desidratação. Para as culturas liofilizadas, foi avaliado se a adição de diferentes soluções protetoras (manitol 6%, sorbitol 1,25%, glutamato monossódico 1,25% e mistura das soluções de sacarose 6% e trealose 4%) exercia efeito sobre a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 à liofilização, bem como durante o período de estocagem das células desidratadas a -80ºC por 2 meses. A sobrevivência das células ao processo de liofilização foi maior quando não se adicionaram substâncias crioprotetoras ao soro de queijo. Maior viabilidade durante o armazenamento a -80ºC foi observada quando as células foram pré-tratadas em soro de queijo pH 3,5, ajustado com HCl e sem a adição de outras substâncias antes da liofilização. Observou-se que os choques térmico ou ácido não afetaram a recuperação imediata em leite desnatado reconstituído a 10% das culturas liofilizadas que não sofreram adição de substâncias protetoras. Nas culturas desidratadas por spray-drying, observou-se que as células de L. delbrueckii UFV H2b20, previamente submetidas ao choque ácido, lograram crescimento comparável ao obtido pelas células ativas que não foram submetidas a qualquer condição que possa causar injúria. Essas culturas permaneceram com elevado número de células, mesmo após 2 meses de estocagem a -20°C. Os resultados obtidos levam à conclusão de que a cultura starter probiótica produzida em soro de queijo Minas Frescal estabilizado, desidratada por spray-drying e previamente submetida ao choque ácido, demonstrou características de viabilidade e atividade mais promissoras, e seu uso pode ser recomendado para a elaboração de produtos lácteos fermentados contendo células do L. delbrueckii UFV H2b20.

Submitted by CINTIA RAMOS CAMARGO null (cintiaramoscamargo@gmail.com) on 2017-10-26T19:26:25Z No. of bitstreams: 1 Tese _Cintia Ramos Camargo_.pdf: 5811868 bytes, checksum: a56e37c6cc9f843250f31549c5aa7e98 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-10-31T18:52:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 camargo_cr_dr_sjrp.pdf: 5811868 bytes, checksum: a56e37c6cc9f843250f31549c5aa7e98 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-31T18:52:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camargo_cr_dr_sjrp.pdf: 5811868 bytes, checksum: a56e37c6cc9f843250f31549c5aa7e98 (MD5) Previous issue date: 2017-09-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A folha de louro verde brasileira, uma especiaria muito apreciada na cozinha local (Aniba riparia, Lauraceae), contém compostos químicos que apresentam derivados de benzoíla chamados riparinas, que possuem propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas e ansiolíticas. No entanto, não está claro qual o tipo de interação que as riparins desempenham com qualquer alvo molecular. Como um alvo rentável, a albumina de soro humano (HSA) é uma das principais proteínas extracelulares, com uma capacidade excepcional para interagir com várias moléculas, e também desempenha um papel crucial no transporte, distribuição e metabolismo de uma grande variedade de ligantes endógenos e exógenos. Para delinear o mecanismo de interação HSA-riparina, a espectroscopia e os métodos computacionais foram aplicados de forma sinérgica. Uma avaliação através de espectroscopia de fluorescência mostrou que a emissão, atribuída ao Trp 214, a 346 nm, diminuiu com as titulações das riparinas. Observou-se um mecanismo de supressão estática na ligação das riparinas à HSA. Os experimentos de fluorescência realizados em 298, 308 e 318 K possibilitaram a realização de análises termodinâmicas que indicassem uma reação espontânea na formação do complexo (ΔG <0). O experimento do balanço entálpico-entrópico e com um cálculo de modelagem molecular revelou que interações hidrofóbicas, ligação de hidrogênio e interações não específicas estão presentes para as riparinas I - III com a HSA. O conjunto de resultados das mudanças da fração de fluorescência obtidos através de Schatchard não foi conclusivo ao estabelecer que tipo de cooperatividade esteja presente na interação. Para esclarecer o complexo HSA-riparinas, a abordagem de Hill foi utilizada para distinguir o índice de afinidade e a constante de ligação. Observou-se uma correspondência entre as estruturas moleculares das riparinas, devido à presença do grupo hidroxila no anel B, com parâmetros termodinâmicos e índice de afinidade. Riparin III realiza uma ligação de hidrogênio intramolecular, que afeta o coeficiente de Hill e a constante de ligação. Portanto, a presença de grupos hidroxila é capaz de modular a interação entre riparinas e HSA. Os experimentos de competição de sítio indicaram o sítio I como sendo o mais acessado, e as ferramentas de modelagem molecular reforçavam os resultados experimentais detalhando a participação de resíduos. / The green Brazilian bay leaf, a spice much prized in local cuisine (Aniba riparia, Lauraceae), contains chemical compounds presenting benzoyl-derivatives named riparins, which have anti-inflammatory, antimicrobial and anxiolytic properties However, it is unclear what kind of interaction riparins perform with any molecular target. As a profitable target, human serum albumin (HSA) is one of the principal extracellular proteins, with an exceptional capacity to interact with several molecules, and it also plays a crucial role in the transport, distribution, and metabolism of a wide variety of endogenous and exogenous ligands. To outline the HSA– riparin interaction mechanism, spectroscopy and computational methods were synergistically applied. An evaluation through fluorescence spectroscopy showed that the emission, attributed to Trp 214, at 346 nm decreased with titrations of riparins. A static quenching mechanism was observed in the binding of riparins to HSA. Fluorescence experiments performed at 298, 308 and 318 K made it possible to conduct thermodynamic analysis indicating a spontaneous reaction in the complex formation (ΔG<0). The enthalpy-entropy balance experiment with a molecular modeling calculation revealed that hydrophobic, hydrogen bond and non-specific interactions are present for riparin I - III with HSA. The set of results from fractional fluorescence changes obtained through Schatchard was inconclusive in establishing what kind of cooperativity is present in the interaction. To shed light upon the HSA-riparins complex, Hill’s approach was utilized to distinguish the index of affinity and the binding constant. A correspondence between the molecular structures of riparins, due to the presence of the hydroxyl group in the B-ring, with thermodynamic parameters and index of affinity were observed. Riparin III performs an intramolecular hydrogen bond, which affects the Hill coefficient and the binding constant. Therefore, the presence of hydroxyl groups is capable of modulating the interaction between riparins and HSA. Site marker competitive experiments indicated Site I as being the most suitable, and the molecular modeling tools reinforced the experimental results detailing the participation of residues.

Orientador: Luis Antonio Mathias / Coorientador: Raphaella Barbosa Meireles Bartoli / Banca: Anna Monteiro Correia Lima / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Resumo: A leptospirose é uma zoonose que causa grandes prejuízos para a saúde pública e para a saúde animal. O objetivo deste trabalho foi estudar a ocorrência de anticorpos contra 20 sorogrupos de Leptospira spp. em diferentes espécies de animais de vida livre do Pantanal do Mato Grosso do Sul. Foram utilizadas 224 amostras de soro de animais de vida livre das sub-regiões de Nhecolândia e Paiaguás, no Mato Grosso do Sul, provenientes de um banco de soros da Embrapa Pantanal. As amostras foram submetidas ao teste de soroaglutinação microscópica (SAM), utilizando diluição inicial de 1/50 para os animais selvagens e 1/100 para os suínos ferais. As frequências de reagentes de acordo com o sexo e de acordo com a faixa etária foram comparadas por meio do teste exato de Fisher e os cálculos foram realizados com o auxílio do programa R. Dos 35 cachorros-do-mato (Cerdocyon thous), 37,14% foram considerados reagentes e os sorogrupos mais frequentes foram Pomona, Pyrogenes, Grippotyphosa e Canicola. Entre os quatis (Nasua nasua), 22,22% apresentaram reação na SAM, e quanto aos sorogrupos, Pomona foi o mais frequente. Dos 95 veados-campeiros (Ozotoceros bezoarticus) avaliados, 31,58% foram reagentes, sendo os sorogrupos mais frequentes o Pomona e o Autumnalis. Para os suínos em estado feral (Sus scrofa), 36,84% foram sororreagentes e os sorogrupos mais encontrados foram Pomona e Icterohaemorrhagiae. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as frequências de reagen... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leptospirosis is a zoonotic disease that causes great damage to public health and animal health. The objective of this investigation was to study the occurrence of antibodies against 20 Leptospira spp. serogroups in different species of free-ranging animals of Pantanal, Mato Grosso do Sul, Brazil. Serum samples of 224 animals from the subregions of Nhecolândia and Paiaguás in Mato Grosso do Sul were collected and tested through the microscopic agglutination test (MAT), at an initial dilution of 1/50 for wild animals and 1/100 for feral swine. The frequencies of reagents according to sex and according to age group were compared using Fisher's exact test, and the calculations were performed with the software R. Of the 35 crabeating foxes, 37.14% reacted to Leptospira, and the most frequent serogroups were Pomona, Pyrogenes and Canicola. For coatis, of the 18 samples examined, only four 22.22% showed reaction in MAT, and Pomona was the most frequent serogroup. Of the 95 deer evaluated, 31.58% were reactors, and the most common serogroups were Pomona and Autumnalis. For feral pigs, of the 76 samples analyzed, 36.84% were reactors and the most frequent serogroups were Pomona and Icterohaemorrhagiae. There was no significative difference between the frequency of male and female reactors, and among the age groups in any of the animal species studied. This study found high frequencies of wild animals and feral swine reactors. For all species, the highest proportion of reactions was o... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Coorientador: Antonio José Goulart / Banca: Alice Yoshiko Tanaka / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Ana Lúcia Martiniano Nasser / Banca: José Paschoal Batistuti / Resumo: O soro proveniente da fabricação de queijo tem sido utilizado para fins diversos, sendo uma importante fonte proteica de baixo custo apresentando alta percentagem de aminoácidos essenciais. Nesse contexto, a hidrólise de suas proteínas melhora a biodisponibilidade e permite que peptídeos bioativos formados sejam absorvidos. O objetivo desse estudo foi verificar a biodisponibilidade in vitro das proteínas do soro de queijo e seus hidrolisados com diferentes teores de hidrólise e o efeito da suplementação da dieta de ratos wistar adultos com esses hidrolisados. As soroproteínas foram submetidas a tratamento com as proteases pepsina, quimotripsina, carboxipeptidase-A e tripsina em pH e temperatura específicos, produzindo suplementos com médio (MTH) e alto (ATH) teor de hidrólise. A biodisponibilidade dos hidrolisados foi analisada por meio da simulação da digestão gástrica e duodenal. Os peptídeos e aminoácidos foram analisados por CLAE e o perfil proteico por SDS-PAGE. O perfil sérico, cálcio ósseo e a proteína muscular dos animais foram avaliados após suplementação com proteínas integrais e hidrolisados de alto e médio teor por um período de 43 dias. A biodisponibilidade de aminoácidos foi maior nos hidrolisados MTH e ATH após a simulação da digestão gastrointestinal, indicando que a hidrólise das soroproteínas pode aumentar a absorção destes compostos. O perfil sérico dos ratos apresentou alterações significativas principalmente em relação à glicemia após suplementação da dieta, sendo que os animais que receberam o suplemento MTH apresentaram uma grande redução nesse parâmetro e também excelente resultado em relação ao HDL, cálcio sérico e massa muscular. Embora de forma menos expressiva, os animais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The whey from cheese production has been used for various purposes and it is an important low cost protein source with high proportion of essential amino acids. In this context, the hydrolysis of its proteins improves the bioavailability and allows the absorption of bioactive peptides formed. The aim of this research was to determine the in vitro bioavailability of whey proteins and their hydrolysates with different hydrolysis levels and the effect of supplementing the diet of adult Wistar rats with these hydrolysates. Whey proteins were subjected to treatment with proteases pepsin, trypsin, chymotrypsin, and carboxypeptidase A in specific pH and temperature, producing supplements with medium (MTH) and high (ATH) content of hydrolysis. The hydrolysates bioavailability was analyzed by simulating the gastric and duodenal digestion. Peptides and amino acids were analyzed by HPLC and protein profile by SDS-PAGE. The animals serum profile, bone calcium and muscle protein were evaluated after supplementation with integral proteins, high and medium hydrolyzed levels over a period of 43 days. The amino acid bioavailability was greater in hydrolysates MTH and ATH after simulating gastrointestinal digestion, indicating that the hydrolysis of whey proteins may increase the absorption of these compounds. The serum profile of the rats showed significant changes mainly related to glucose after dietary supplementation, and the animals that received the MTH supplement showed a large reduction in this parameter and also excellent results compared to HDL, serum calcium and muscle mass. The animals that received the ATH supplement showed satisfactory results for serum phosphorus and total protein. Thus, MTH supplement showed better results in terms of bioavailability and when used how supplement, and its excellent performance with respect... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor