Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Alexandre Secorun Borges / Banca: Alice Fernandes Alfieri / Banca: Hélio Jose Montassier / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A quantificação de anticorpos é muito importante para monitoramento sorológico em granjas e associação com proteção contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Dessa forma este trabalho teve como objetivo padronizar e aplicar ELISA indireto com anticorpo de captura e utilizá-lo na quantificação de anticorpos contra o PCV2 em soros de suínos. Na padronização, os soros teste e os imunoreagentes básicos, incluindo, anticorpo de coelho anti-PCV2 purificado utilizado como captura e suspensão viral tiveram suas concentrações de uso ótimas determinadas. Aplicou-se o índice ELISA (IE) nos resultados dos soros de suínos para correção de variações entre testes. O teste mostrou-se específico do ponto de vista analítico e com alta reprodutibilidade podendo adequadamente ser utilizado na quantificação de anticorpos em soros de suínos contra o PCV2. Na aplicação, um total de 138 amostras de soros foi testado sendo cinco de porcas na gestação e 133 de leitões nascidos dessas porcas, acompanhados nas fases de maternidade ao crescimento em uma granja comercial com SMDS. Na avaliação da resposta de anticorpos contra o vírus, houve uma diminuição dos anticorpos da maternidade para a creche, coincidindo com o declínio dos anticorpos de origem materna e com a ocorrência da soroconversão simultaneamente com a detecção de PCV no sangue total pela PCR quantitativa. Em dois leitões com alta carga relativa de DNA viral e sinais clínicos sugestivos de SMDS, a quantidade de anticorpos detectada foi extremamente baixa / Abstract: Antibody quantification is important for serological monitoring in swine herds and association with protection against porcine circovirus type 2 (PCV2). The aim of this work was to standardize and apply indirect trapping ELISA and use it in the quantification of antibodies against PCV2 in sera from pigs. The immunoreagents, including rabbit antibody anti-purified PCV2 used as trapping antibody and viral suspension had their optimum use dilution previously determined. The absorbance index (ELISA Index, EI), was used to determine the antibody concentration in pig serum directed against PCV2. The test showed high analytical specificity and reproducibility. A total of 138 serum samples was tested including five sows in gestation and 133 piglets accompanied by phases from lactation to growth in a commercial swine herd where PCV2 was previously detected. In anti PCV2 antibody response it was observed a decreasing in the phases of lactation to nursery due to decline of maternal antibodies. The seroconversion was concurrent with PCV DNA detection by quantitative PCR in total blood. In two piglets with high relative DNA viral load and compatible clinical signs of PMWS, the anti PCV2 antibody concentration was very low / Doutor

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Lúcia Helena O'Dwyer de Oliveira / Banca: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Banca: José Eduardo Tolezano / Banca: Tricia Maria Ferreira de Sousa Oliveira / Resumo: Animais silvestres são importantes fontes de infecção de leishmanioses e doença de Chagas, para espécies domésticas e o homem. A PCR com emprego de iniciadores da região ITS1 associando-se clonagem e seqüenciamento de DNA alvo permite caracterizar espécies parasitas. Pelo uso de imunorreagentes específicos também possibilitam a investigação da infecção natural entre diferentes espécies de animais silvestres para ambas enfermidades. Foram avaliados isolados flagelares em meio LIT (hemocultura) de 103 animais procedentes do Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira/SP e 118 amostras de soros. Em ensaios imunoenzimáticos utilizaram-se as proteínas recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi e rK39 de Leishmania infantum. Conjugados espécie-específicos foram produzidos para diferentes espécies e empregados no teste de ELISA indireto e a proteína A conjugada foi avaliada para testes sorológicos com emprego da rK39. Soros de cães reagentes para leishmaniose visceral e de humanos para doença de Chagas foram testados para verificar a reatividade contra estas proteínas. Observou-se na hemocultura, flagelados para as seguintes espécies de vida livre: cotia, gambá e tatu-galinha; espécie em cativeiro: bugio-preto. Produtos foram amplificados pela PCR (585 pb) a partir de hemocultura em animais de vida livre e de um animal em cativeiro (650 pb) em amostra de sangue total. Os amplificados foram inseridos em vetor de clonagem e sequenciados resultando-se em 97% de similaridade com T. cruzi para gambá e cotia (acesso nº: AF362825.1) e tatu-galinha (acesso nº: GQ258720.1) com 98%. No isolado de bugio-preto houve 90% de similaridade com T. minasense (acesso nº: AB362411.1). Estes resultados apresentam o primeiro relato destas espécies parasitárias de importância epidemiológica na área de estudo e demonstraram vantagem ao associar-se a hemocultura às técnicas moleculares para caracterização de... / Abstract: Wild animals are important sources of infection of leishmaniasis and Chagas disease to domestic animals and humans. The employment of PCR with ITS1 primers plus cloning and sequencing target DNA allows to characterize parasitic species. By using specific immunoreagents also enable investigation of natural infection between different species of wild animals for both diseases. Flagellate isolates in LIT medium (blood culture) were assessed of 103 animals coming from the Wildlife Conservation Center of Ilha Solteira -SP and 118 serum samples. In immunoassays, recombinant proteins CRA and FRA fromTrypanosoma cruzi and rK39 from Leishmania infantum were used. Species -specific conjugates were produced for different animal species and used in indirect ELISA and the protein A conjugate was evaluated for serological tests with use of rK39. Sera from dogs reagents for visceral leishmaniasis and for humans reagents for Chagas disease were tested for reactivity against these proteins. Flagellate protozoa were observed in LIT culture medium, at the following free-living species: common agouti (D. agouti), white-eared opossum (D. albiventris) and nine-banded armadillo (D. novemcinctus); and from a captive black howler monkey (A. caraya). Products were amplified by PCR (585bp) from blood culture in wild animals and from an animal in captivity (650bp) in whole blood sample. The amplified products were inserted into cloning vector and sequenced resulting in 97% similarity with T. cruzi to white-eared opossum an common agouti (acess number: AF 362825.1) and 98% to nine-banded armadillo (acess number: GQ 258720.1). The isolated from black howler monkey was 90% similar to T. minasense (acess number: AB 362411.1). The results present the first report of these parasitic species of epidemiological importance in the studied area and demonstrated advantage in the association of blood culture to molecular techniques to characterize flagellates. For ... / Doutor

Orientador: Luis Antonio Mathias / Coorientador: Raphaella Barbosa Meirelles Bartoli / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Anna Monteiro Correia Lima Ribeiro / Resumo: O trabalho teve como objetivo analisar a resposta sorológica induzida pela vacinação com a dose padrão de 60-120x109 organismos da amostra B19 de Brucella abortus em bezerras da raça Tabapuã, com idade entre 3 e 8 meses, pelos testes sorológicos preconizados pelo Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) para diagnóstico da brucelose bovina. Foram examinadas amostras de soro sanguíneo de 72 animais em quatro provas sorológicas: antígeno acidificado tamponado (AAT), teste de soroaglutinação lenta juntamente com o teste de 2-mercaptoetanoll (2-ME), reação de fixação de complemento (RFC) e teste de polarização fluorescente (TPF), o qual foi interpretado de duas formas: ponto de corte variável e ponto de corte fixo. As amostras de soro sanguíneo foram colhidas imediatamente antes da vacinação, e após 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 e 360 dias. Foi calculada a especificidade dos testes, e os resultados foram comparados pelo indicador kappa e pelo teste ² de McNemar. O TPF apresentou especificidade mais elevada do que os outros testes nas amostras colhidas dos 30 aos 90 dias após a vacinação, mas com o passar do tempo a diferença entre a especificidade do TPF e a dos outros testes diminuiu. Aos 270 dias de vacinação, observou-se especificidade de 93,74% no AAT, no 2-ME e na RFC. No TPF com ponto de corte variável a especificidade foi 87,5%, e com ponto de corte fixo foi 100,0%. Foi possível concluir que o TPF apresentou maior capacidade de discriminação dos títulos de anticorpos vacinais logo após a vacinação, quando comparado com os outros testes preconizados pelo PNCEBT, apresentando-se, portanto, como uma ferramenta útil para o diagnóstico da brucelose bovina, além de ser de execução fácil e rápida / Abstract: The study aimed to analyze the antibody response induced by vaccination with the standard dose of 60-120x109 organisms of Brucella abortus strain 19 in Tabapuã heifers, aged between 3 and 8 months, by serological tests recommended by the National Program for Brucellosis and Tuberculosis Control and Eradication (PNCEBT) for the diagnosis of bovine brucellosis. Serum samples of 72 animals were examined by four serological tests: rose Bengal test (RBT), standard agglutination test with the 2-mercaptoetanol (2-ME) test, complement fixation test (CFT) and fluorescence polarization assay (FPA), which was interpreted in two ways: variable cutoff and fixed cutoff. Heifers were bled immediately prior to vaccination, and after 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 and 360 days. Specificity of the tests were calculated, and the results were compared using the kappa statistic and the McNemar's ² test. The FPA had a higher specificity than the other tests on the samples collected from 30 to 90 days after vaccination, but over time this difference decreased. At 270 days of vaccination, the specificity of RBT, 2-ME and RFC was 93.74%. The specificity of the FPA with variable cutoff was 87.5%, and with fixed cutoff was 100.0%. It was concluded that FPA had a higher discrimination ability for vaccination antibody titers shortly after vaccination, when compared with other tests recommended by the PNCEBT, and is a useful tool for the diagnosis of bovine brucellosis, besides being easy and quick to perform / Mestre

Orientador: Gilson Pereira de Oliveira / Coorientador: Gisele Braziliano de Andrade / Coorientador: Alvimar Jose da Costa / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca: Heitor Miraglia Herrera / Resumo: Dentre as doenças emergentes causadas por artrópodes em cães destacam-se as infecções por agentes das espécies Leishmania chagasi, transmitida por flebotomíneos, Ehrlichia canis e Babesia canis transmitidas por carrapatos da espécie Rhipicephalus sanguineus. O presente estudo teve como objetivo realizar o diagnóstico sorológico e molecular de parasitos das espécies Leishmania chagasi, Ehrlichia canis e Babesia canis em amostras de soro e de baço, respectivamente. Foram utilizados 60 cães naturalmente infectados, eutanasiados no Centro de Controle de Zoonoses do Município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul. Pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), 60 (100%), 39 (65%) e 49 (81%) dos 60 animais amostrados foram sororeagentes frente aos antígenos de L.chagasi, E.canis e B.canis respectivamente. Também foi realizado o ensaio Imunoenzimático Indireto (ELISA-teste) para detecção de anticorpos da classe IgG anti-L. chagasi, onde sessenta cães (100%) mostraram-se soropositividade. Cinquenta e quatro cães (90%) mostraram-se positivos na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para o gênero Leishmania sp e destes cinquenta e três animais, 53 (88%) foram positivos para o complexo L.Donovani. Vinte e sete animais (45%) foram positivos para Ehrlichia e destes animais todos foram positivos para E.canis pelo nested PCR e 2 (3,33%) cães foram PCR positivos para Babesia sp. Os amplicons foram confirmados por seqüenciamento e os DNAs mostraram 99% de similaridade genética para L.chagasi, E.canis e B.canis. Este estudo mostrou que os cães residentes em Campo Grande/MS, podem albergar mais de um hemoparasita, As co-infecções por agentes patogênicos intracelulares de células do sistema monocítico fagocitário, como é o caso da Ehrlichia e Leishmania, associadas ou não a Babesia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Among emerging diseases caused by arthropods in dogs stand out infections by agents of the species Leishmania chagasi, transmitted by sandflies, Ehrlichia canis and Babesia canis transmitted by ticks of the species Rhipicephalus sanguineus. The present study aims to perform serological and molecular diagnosis of parasites of the species Leishmania chagasi, Ehrlichia canis and Babesia canis in samples of sera and spleen, respectively. A total of 60 naturally infected dogs were euthanized at the Zoonosis Control Center of the city of Campo Grande, Mato Grosso do Sul Through Immunofluorescence Assay (IFA), sixty (100%), 39 (65%) and 49 (81%) of the 60 animals sampled were reactive serum against the antigens L.chagasi, E.canis and B. canis, respectively. We also performed indirect immunosorbent assay (ELISA test) for detection of IgG antibodies anti-L. chagasi, where sixty dogs (100%) were seropositive. Fifty-four dogs (90%) were positive by PCR for the genus Leishmania, and of these fifty and three animals, 53 (88%) were positive for the complex L.Donovani. Twenty-seven dogs (45%) were positive for Ehrlichia sp and these animals were all positive for E.canis by nested PCR and two dogs (3%) were PCR positive for Babesia sp. The amplicons were confirmed by DNA sequencing and showed 99% genetic similarity to L.chagasi, E.canis and B. canis. This study showed that dogs living in Campo Grande / MS, can accommodate more than one haemoparasite. The co-infections by intracellular pathogens monocytic phagocyte system cells, as is the case with Ehrlichia and Leishmania, associated or not with Babesia (which multiplies in red blood cells), causing serious damage to the health of animals. The decline in physical condition and immune co-infections resulting from increases parasitemia, which in the case of agents transmitted by... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Aureo Evangelista Santana / Coorientador: Karina Paes Bürguer / Banca: Annelise Carla Camplesi dos Santos / Banca: Ana Maria Centola Vidal / Banca: José Ribamar Privado Filho / Banca: Maria Angélica Dias / Resumo: A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) preocupa as autoridades sanitárias devido ao aumento de sua incidência nos últimos anos, aliado ao fato da situação epidemiológica da enfermidade ser desconhecida na maioria das regiões. Desta forma, o presente estudo objetou realizar o diagnóstico de situação epidemiológica da leishmaniose visceral canina (LVC) no Município de Rio Verde/GO. Para tanto, a pesquisa foi desenvolvida em bairros pré-definidos da região norte do município com a avaliação das condições das três esferas da saúde (animal, humana e ambiental) relacionadas à LVC, por meio de questionários semiestruturados com a participação dos tutores dos animais; a avaliação clínica dos cães e classificação segundo a sintomatologia; a realização do diagnóstico sorológico (ELISA, RIFI e TR DPP) e o geoprocessamento da localidade dos cães reagentes. Na avaliação das condições da saúde animal, os resultados evidenciaram superpopulação canina, especialmente aqueles animais considerados sem controle de mobilidade e sem supervisão, com trânsito livre, sem assistência médicoveterinária. Com relação à saúde humana, destacou-se o convívio íntimo entre o ser humano e o seu animal de estimação, além do agravante do desconhecimento da enfermidade pela população, de seus mecanismos de transmissão, de controle e de prevenção. Sob o olhar ambiental, observou-se problemas de infraestrutura, sendo a falta de saneamento básico a principal delas, além da presença de árvores frutíferas e animais de produção favorecendo o acúmulo de matéria orgânica, facilitando e promovendo o desenvolvimento do vetor. A classificação segundo a avaliação clínica dos cães reagentes (ELISA e RIFI) foi de 65% (13/20) assintomáticos e 35% (7/20) oligossintomáticos. Na avaliação sorológica, 10,38% (55/530) foram reagentes no ELISA, desses 36,37% (20/55) foram... / Abstract: Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a concern to sanitary authorities due increase on incidence observed recently and lack of knowledge about the disease epidemiological situation in most regions. So, this study focused on to perform epidemiological diagnosis of canine visceral leishmaniasis situation in Rio Verde Municipality, state of Goiás, Brazil. For this purpose, the research was performed in pre-selected neighborhoods in the north region of the municipality embracing all three areas in health (animals, human beings and environment) related to CVL using semi-structured questionnaires to animals' owners, clinical evaluation of animals and classification according to clinical signs, serological diagnosis (ELISA, RIFI and TR DPP) and geospatial analyses of positive dogs. ). A canine overpopulation, especially on those animals that lives free in streets, without supervision of owners and veterinaries were highlighted. In relation to human health, the close contact among humans and animals and the ignorance about this disease epidemiology, prevention and control by the population were shown. About the environmental situation, infrastructural problems, as the needs of basic sanitation, were observed. Also, fruit trees and production animals' presence were observed, which favors organic matter accumulation and allows the vector's development. The clinical classification of the reagents animals (ELISA and RIFI) was 65% (13/20) asymptomatic and 35% (7/20) oligosymptomatic during evaluation on CI. On serological evaluation, 10.38% (55/530) were positive on ELISA and from these animals, 36.37% (20/55) were also positive on RIFI. None of the samples were considered as positive on TR DPP®. The animals considered as positives in ELISA and RIFI were located in nearby houses agreeing with the results of serological tests. The human beings and canine populations in the studied areas have ... / Doutor

Ehrlichia canis e Anaplasma platys são parasitas de células sanguíneas transmitidos por carrapatos de larga distribuição mundial. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de E. canis e A. platys em cães naturalmente infectados no município de Porto Alegre, RS, Brasil, através de técnicas sorológicas e moleculares; realizar análise molecular dos agentes através do sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA e compará-lo com sequências disponíveis no Genbank. Adicionalmente, avaliamos os parâmetros hematológicos e possíveis fatores de risco associados à infecção. Amostras de sangue foram coletadas de 146 cães residentes no Bairro Arquipélago, região suburbana de Porto Alegre e 53 cães mantidos no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ). Dentre os animais analisados, 27 (13,56%) apresentaram resultado positivo na nPCR e 20 (10,2%) apresentaram sorologia positiva para A. platys. Através da ferramenta BLASTn, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas e mostraram similaridade de 99,75% a 100% em relação a outras sequências de A. platys disponíveis no Genbank. Neste estudo não foi observada a presença de E. canis. DNA do agente não foi amplificado em nenhuma das amostras analisadas através de técnicas moleculares, e tampouco foram detectados cães sororreagentes, indicando a baixa prevalência do agente no município. Ao comparar a prevalência de infecção/exposição entre as populações estudadas, não observamos diferença significativa entre elas. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros hematológicos e fatores de risco analisados nos animais infectados ou expostos, exceto a contagem de basófilos, que foi associada positivamente com infecção por A. platys. / Erlichia canis and Anaplasma platys are tick borne disease which has a worldwide geographic distribution. The aim of this study was to detect the presence of E. canis and A. platys in naturally infected dogs in Porto Alegre/RS – Brazil by serological and molecular techniques, performing molecular analysis of the agents by sequencing of a fragment of the 16S rRNA and comparing it with sequences available in Genbank. Additionally, we evaluated the hematological parameters and potential risk factors associated with infection. Blood samples were collected from 146 dogs living in the Arquipelago neighborhood, a suburban area of Porto Alegre and 53 dogs from Control Centrer of Zoonosis (CCZ). Among the examined animals, 27 (13.56%) were positive by nPCR and 20 (10.2%) were seropositive for A. platys. Through the BLASTn, the sequences obtained in this study were compared and showed similarity of 99.75% to 100% as compared to other sequences of A. platys available in Genbank. None of the dogs showed antibodies or E. canis DNA, indicating the low occurrence of the agent in Porto Alegre. There were no significant differences between positive groups and hematological parameters, or among the risk factors evaluated, except basophils count was associated with A. platys infection.

Orientador: Antonio Carlos Paes / Banca: Hélio Langoni / Banca: Kátia Denise Saraiva Bresciane / Resumo: A neosporose é uma doença parasitária causada pelo protozoário Neospora caninum sendo causadora de problemas reprodutivos e distúrbios neurológicos nos animais. Os canídeos selvagens e domésticos são hospedeiros definitivos, e os ovinos, entre os hospedeiros intermediários, se constituem uma das espécies susceptíveis. A presença de cães nas propriedades rurais é um fator de risco para a infecção nos ovinos, indicando associação entre a infecção em ambas as espécies. Este trabalho teve por objetivo verificar a soro-ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em ovinos e cães naturalmente infectados. Foram colhidas amostras de sangue de 1497 ovelhas e 42 cães que compartilhavam o mesmo ambiente, provenientes de 16 propriedades rurais localizadas na microrregião de Araraquara. Para a pesquisa de anticorpos anti- N. caninum utilizou-se a técnica de reação de imunofluorescência indireta (RIFI ≥ 25). Para o estudo epidemiológico foi aplicado um questionário aos proprietários ou responsáveis pelos animais, contendo informações ligadas a neosporose, tanto para ovinos quanto para os cães. Dos 1497 soros ovinos testados obteve-se uma ocorrência de 8,0% (LI 95%= 6,7%; LS 95%= 9,2%) e dos 42 cães 4,8% (LI 95%= 0%; LS 95%= 7,2%). Foram observadas diferenças estatísticas significativas na associação entre o resultado da sorologia dos ovinos para N. caninum e as variáveis: abastecimento de água (P=0,0004; OR=2,15), presença de outros canídeos selvagens ou domésticos (P=0,0013; OR=2,38) e presença ou ausência de problemas reprodutivos (P=0,0031; OR=1,75). A ingestão de água de represa, a presença de canídeos selvagens ou de propriedades vizinhas e presença de problemas reprodutivos apresentaram associação positiva com a ocorrência de neosporose em ovinos / Abstract: The neosporosis is a parasitic disease caused by protozoan Neospora caninum that is considered a cause of reproductive problems and neurological disorders in animals. Domestic and wild canids are definitive hosts, and sheep, among the intermediate hosts, constitute one of the susceptible species may occur reproductive problems. The presence of dogs in the farms is a risk factor for infection in sheep, indicating an association between infection in both species. This study aimed to verify the serum-occurrence of antibodies in sheep and dogs naturally infected by N. caninum. We collected 1497 blood samples from sheep and 42 samples from dogs that lived with the sheep from 16 farms located in the microregion of Araraquara. For the detection of N. caninum antibodies was performed the technique of reaction of indirection immunofluorescence (IFAT ≥ 25). Epidemiological study was applied as a questionnaire for sheep and dogs with information related to neosporosis. Of 1497 sheep sera tested, the occurrence obtained was 8.0% (LL 95% = 6.7%; UL 95% = 9.2%) and of 42 dogs, 4.8% (LL 95% = 0%; UL 95% = 7.2%). Were statistically significant differences in the association between seropositivity for N. caninum in sheep and the variables: water supply (P=0.0004; OR=2.15), presence of other wild or domestic canids (P=0.0013; OR=2.38) and presence or absence of reproductive problems (P=0.0031; OR=1.75). Ingestion of water from dams, the presence of wild dogs or wild canids of neighboring properties and the presence of reproductive problems were positively associated with the occurrence of neosporosis in sheep / Mestre

The aimed of this study was to determine and compare seroprevalence of Bovine Leukosis between beef and dare cattle in the city of Catalão, Goiás and identify epidemiological factors that influence the disease. Twenty properties were chosen ten with dare ability and ten cut ability, comprising 120 animals of each one. The epidemiological variables considered were: ability (beef or dare), gender, age, replacement of animals on the property, needle exchange among animals, intense presence of vectors practice of milking, fomites sharing, veterinary care and supply of silage. Serum samples were examined by AGID - LEB and produced by TECPAR. In beef properties, 20 calves were positive (16.67%), whereas in dairy herd cattle 49 (40.83%) were positive for leukemia. In simple regression, there was an increase of probability of 3,45 times of the animal is seropositive for leukemia in dare ability. The age group with the highest percentage of positive was that of over 36 months. A higher positivity rate (34.57%) on the properties who do needle exchange than no standard exchange. When analyzed individually, needle exchange did not influence the frequency of the disease. In the multivariate analysis, needle exchange influenced the leukemia frequency, being higher in properties that practiced exchange. Vectors presence on the property and providing silage influence the greatest number of positive animals. Females had a higher percentage of positive animals for leukemia than males. Properties that practiced replecement of animals from other areas had lowest percentage of positivity. In properties where cows were milked, denotes to increase 1,28 times of chance of the animal been positive for leukemia. Fomites sharing practice influenced the higher positivity of the herd in the properties that used this practice. Failure of veterinary treatment was responsible for over 50% of cases of animals with leukemia. Of the ten risk factors, five were significant (ability, age, needle exchange, presence of vectors and supply of silage) when evaluated together for the presence of the disease and five as unrepresentative (sex, replacement of animals, milking, sharing fomites and veterinary care). In dairy cattle observed increase in the probability of being positive for leucosis more than 5,21 times. For each age group that evolves, is increased by 0,16times of the chance of finding disease. Already needle exchange represented an increase of 2,83 times of probability of having leukemia. Intense presence of vectors increased 7,14 times of chance to present leukemia. Providing silage represents an increase of 5,2 times of probability of bovine be positive. In multivariate regression, gender, replacement of animals, milking, sharing fomites and veterinary care together not correlate with seropositivity for enzootic bovine leukemia. 8.34% (20/240) of positive population belongs to beef cattle and 20.42% (49/240) belongs to dairy cattle. In conclusion, Enzootic Bovine Leukosis occurs most frequently in dairy cattle in the court, in the Catalan / GO region. The risk factors that together account for significant prevalence of the disease are: animals over 36 months, needle exchange, intense presence of vectors and supply of silage. / Objetivou-se determinar e comparar soroprevalência da Leucose Enzoótica Bovina entre bovinos de corte e leite no município de Catalão, Goiás e identificar fatores de risco que influenciam na doença. Foram escolhidas vinte propriedades, sendo dez com aptidão leite e dez com aptidão corte, contendo 120 animais de cada aptidão. As variáveis epidemiológicas consideradas foram: aptidão (leite ou corte), sexo, faixa etária, reposição de animais na propriedade, troca de agulhas entre animais, presença de vetores, prática de ordenha, compartilhamento de fômites, assistência veterinária e fornecimento de silagem. Amostras séricas foram examinadas pelo IDGA. Nas propriedades de corte, 20 bovinos foram positivos (16,67%), enquanto no rebanho leiteiro 49 bovinos (40,83%) foram positivos para leucose. Na regressão simples, observou-se aumento de probabilidade de 3,45 vezes de o animal ser soropositivo para leucose na aptidão leite. A faixa etária com maior porcentagem de positivos foi a de acima de 36 meses. Observou-se maior índice de positividade (34,57%) nas propriedades que praticam troca de agulhas do que não procedem a troca. Quando analisada individualmente, troca de agulha não influenciou na frequência da doença. Na análise multivariada troca de agulhas influenciou na frequência de leucose, sendo maior nas propriedades que praticavam troca. Presença de vetores na propriedade e fornecimento de silagem influenciaram no maior número de animais positivos. Fêmeas apresentaram maior percentual de animais positivos para leucose que machos. Propriedades que praticavam compra de animais de outros locais apresentaram menor percentual de reagentes. Nas propriedades onde vacas eram ordenhadas, denota-se incremento de 1,28 vezes na chance de o animal ser positivo para leucose. Prática de compartilhamento de fômites influenciou na maior positividade do rebanho nas propriedades que utilizavam tal prática. Falta de assistência veterinária foi responsável por mais de 50% dos casos de animais com leucose. Dos dez fatores de risco, cinco foram significantes (aptidão, faixa etária, troca de agulhas, presença de vetores e fornecimento de silagem) quando em conjunto, para a presença da doença e cinco como não representativos (sexo, reposição de animais, ordenha, compartilhamento de fômites e assistência veterinária). No gado de leite observou-se aumento na probabilidade de ser positivo para leucose de 5,21 vezes. Para cada faixa etária que se evolui, aumenta-se 0,16 vezes a chance de se encontrar doença. Já troca de agulha representou aumento de 2,83 vezes de probabilidade de ter leucose. Presença de vetores aumentou em 7,14 vezes a chance de apresentar leucose. Fornecimento de silagem representou aumento de 5,2 vezes na probabilidade do bovino ser positivo. Na regressão multivariada, variáveis sexo, reposição de animais, ordenha, compartilhamento de fômites e assistência veterinária, em conjunto, não apresentam correlação com soropositividade para leucose enzoótica bovina. 8,34% (20/240) da população positiva pertence ao gado de corte e 20,42% (49/240) pertence ao gado de leite. Conclui-se que Leucose Enzoótica Bovina ocorre com maior frequência no gado leiteiro que no de corte, na região de Catalão/GO. Fatores de risco que representam em conjunto significância para prevalência da doença são: animais acima de 36 meses, troca de agulha, presença de vetores e fornecimento de silagem. / Mestre em Ciências Veterinárias

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-24Bitstream added on 2014-06-13T18:06:52Z : No. of bitstreams: 1 nakaghi_ach_dr_jabo.pdf: 627442 bytes, checksum: 53f339a01b25f98c06e48eed8f59cc13 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente estudo objetivou clonar e analisar a expressão do gene p28 da amostra Jaboticabal de Ehrlichia canis e avaliar sua utilização no diagnóstico molecular e sorológico da erliquiose canina. A PCR, baseada no gene p28 de E. canis, foi capaz de detectar o DNA de um único parasita entre um bilhão de células. Amostras sangüíneas de cães com suspeita clínica de erliquiose foram testadas pela PCR, baseada no gene p28 e pela nested PCR para detecção do gene 16S rRNA. O fragmento amplificado do gene p28 foi observado em 51,25% (n=41) das 80 amostras examinadas, e todas elas foram positivas para o gene 16S rRNA de E. canis, entretanto, em outros 21,25% (n=17) das amostras apenas o gene 16S rRNA foi detectado. A caracterização molecular do gene p28 mostrou similaridade com outras amostras de E. canis. Para a expressão da proteína recombinante P28, foram testados dois sistemas diferentes com linhagens de Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS e BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. A análise pelo Western-blotting revelou reatividade de várias frações protéicas com anticorpo policlonal anti-E. canis. Porém, quando a membrana foi incubada com anticorpo monoclonal para detecção de moléculas de histidina, não houve reatividade, mostrando a ausência de expressão da proteína P28. / The aim of this study was to clone and express the p28 gene of Ehrlichia canis Jaboticabal strain and evaluate its application in molecular and serological diagnosis of canine ehrlichiosis. The p28-based PCR was able to detect E. canis DNA of one parasite among one billion cells. Blood samples from dogs for which a diagnosis of canine ehrlichiosis was suspected were tested by p28-based PCR and by 16S rRNA-based nested PCR. Amplified fragment from p28 gene were observed in 51.25% (n=41) among 80 assayed samples and all of this positive samples were also positives for 16S rRNA gene of E. canis, however in 21.25% (n=17) only 16S rRNA gene was detected. The molecular characterization of p28 gene showed similarity with others strains of E. canis. Expression of P28 recombinant protein was tested with two different systems and in Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS and BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strains. After expression induction, Westernblotting showed reactivity of some protein fractions against anti-E. canis antibodies. However, when samples were incubated with anti-histidine monoclonal antibodies, they did not react, demonstrating non-expression of P28 protein.