Depuis la découverte fondatrice de la présence de cellules souches neurales (NSCs) multipotentes dans le cerveau des mammifères adultes, plusieurs études ont révélé l'importance de ces cellules pour le maintien de l'homéostasie du cerveau. Notamment, des perturbations dans l'équilibre des NSCs ont été associées au vieillissement et à diverses pathologies neurologiques, ce qui suscite un intérêt croissant pour ces cellules. Les NSCs résident dans des zones germinatives restreintes; dans le rongeur adulte les NSCs sont localisées principalement dans deux niches neurogéniques bien établies dans le télencéphale, ce qui contraste avec la situation chez le poisson zèbre adulte où des niches de NSCs actives ont été identifiées dans tout le cerveau, y compris dans le télencéphale dorsal (pallium). Aussi bien chez les rongeurs que le poisson zèbre, les NSCs adultes présentent les deux propriétés fondamentales des cellules souches: elles sont multipotentes, c’est-à-dire capables de générer de nouveaux neurones et cellules gliales, et ont la capacité d'auto-renouvellement à long terme, permettant leur maintien au long de la vie adulte. A la différence des progéniteurs neuronaux embryonnaires (NPCs), une caractéristique de ces NSCs adultes est qu’elles résident la plupart du temps dans un état d’arrêt réversible du cycle cellulaire appelé quiescence. Cet état, activement maintenu, est censé protéger la réserve de NSCs d’un épuisement prématuré, d’où l'importance de déchiffrer les mécanismes moléculaires de régulation de l’équilibre entre la quiescence et l’activation de ces cellules vers la neurogenèse.Les microARNs constituent une classe de petits ARN régulateurs, qui jouent un rôle crucial dans le contrôle d’états cellulaires et des transitions entre ces états. Ils sont capables de réagir rapidement à des signaux à la fois intra- et extracellulaires, qui peuvent moduler aussi bien leur niveau d’expression que leur impact fonctionnel, leur donnant ainsi la capacité de coordonner diverses signaux pour induire des transitions d'état cellulaire. Un microARN en particulier, miR-9, a été montré comme jouant un rôle clé et conservé au cours de la neurogenèse embryonnaire. L'objectif principal de cette étude était d'étudier, pour la première fois, un rôle potentiel de miR-9 dans le contrôle des NSCs, dans un contexte physiologique dans lequel la majorité des NSCs sont quiescentes - le pallium adulte du poisson zèbre. Nous avons constaté que miR-9 est exclusivement exprimé dans une sous-partie des NSCs, met vraisemblablement en évidence un « sous-état » de quiescence. De plus, nous avons pu montrer que miR-9 ancre les NSCs dans un état de quiescence, en partie via le maintien d’un niveau élevé d’activation de la voie de signalisation Notch. De façon surprenante, nous avons également identifié une modification de la localisation subcellulaire de miR-9 au cours du temps: alors que miR-9 est localisé dans le cytoplasme de tous les NPCs chez l’embryon ou le juvenile, chez le poisson adulte miR-9 est localisé dans le noyau des NSCs en quiescence. En outre, la localisation nucléaire de miR-9 dans ces NSCs quiescentes est fortement corrélée avec la localisation nucléaire des protéines effectrices des microARNs, les protéines Argonaute (Agos), ce qui suggère un rôle fonctionnel de miR-9 dans le noyau. De fait, l'élucidation du mécanisme de transport nucléo-cytoplasmique de miR-9/Agos nous a permis de manipuler leur localisation, et d’observer un impact de cette localisation sur l’état de quiescence vs activation des NSCs. L’ensemble des résultats de cette étude identifient ainsi miR-9 comme un régulateur essentiel de la quiescence des NSCs, fournissent pour la première fois un marqueur moléculaire d’un sous-état de quiescence spécifique du cerveau adulte et suggèrent l'implication d'un mécanisme inédit de régulation par les microARNs dans le maintien de l'homéostasie des réserves de NSCs. / Since the seminal discovery of multipotent neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian brain, multiple studies have unravelled the importance of these cells for maintaining brain homeostasis. Notably, disturbances in NSC equilibrium have been linked to physiological aging and various neurological pathologies thus sparkling interest in harnessing them for use in regenerative medicine. NSCs reside in distinct germinal zones; in the adult rodent brain NSCs are found mainly in two well-established neurogenic niches in the telencephalon which contrasts with the situation in the adult zebrafish where NSC niches are widespread throughout the brain, including in the dorsal telencephalon or pallium. In both the rodent and zebrafish brains, adult NSCs display fundamental stem cell properties: they are multipotent, e.g. capable of generating new neurons and glia throughout adult life, and have the capacity for long-term self-renewal. Similar to stem cells in other adult tissues, and in contrast to embryonic neural progenitors, a hallmark of these adult NSCs is their relative proliferative quiescence. Quiescence is an actively maintained, reversible state of cell-cycle arrest and generally thought to protect against exhaustion of the stem cell pool. In line with this, disrupting the balance between quiescent and activated NSCs leads to a premature depletion or permanent cell-cycle exit of these cells highlighting the importance of fully deciphering the mechanisms regulating this equilibrium. microRNAs, a major class of small pleiotropic regulatory RNAs, play crucial roles in reinforcing developmental and transitional states. They are capable of reacting to environmental cues, both cell-intrinsic and -extrinsic, with varying outputs such as changing their regulatory functions and expression levels, thus enabling them to coordinating diverse cues to induce cell-state transitions. One microRNA in particular, miR-9, is a highly conserved master regulator of embryonic neurogenesis and in the embryonic zebrafish brain, it establishes a primed neural progenitor state enabling them to quickly respond to cues to differentiate or proliferate. The primary goal of this study was to investigate, for the first time, a potential role for miR-9 in influencing NSC state in a physiological context in which the majority of NSCs are quiescent – the adult zebrafish pallium. We found that miR-9 is exclusively expressed in quiescent NSCs and highlights a “sub-state” within quiescence. In part by maintaining high levels of Notch signalling, a known quiescence promoting pathway, miR-9 anchors NSCs in the quiescent state. Strikingly, we identified a conserved age-associated change in the subcellular localization of the mature miR-9 from the cytoplasm of all embryonic/juvenile neural progenitors to the nucleus of a subset of quiescent NSCs in the adult brain. Moreover, the nuclear expression of miR-9 in these quiescent NSCs is highly correlated with nuclear localization of the microRNAs effector proteins Argonaute (Agos), suggestive of a functional role for nuclear miR-9. Indeed, the elucidation of the nuclear-cytoplasmic transport mechanism of miR-9/Agos enabled us to manipulate their nuclear to cytoplasmic ratios which directly impacted NSC state. Altogether, these results identify miR-9 as a crucial regulator of NSC quiescence, provide for the first time a molecular marker for an age-associated sub-state of quiescence and suggest the involvement of a novel and unconventional microRNA-mediated mechanism to maintain homeostasis of NSC pools.

La conception de souches efficacespour la production de composés d’intérêt offredes potentiels immenses qui restent trop peu exploitéspar manque de lien entre les étapes d’optimisationde la conception de souche et celle dela conduite du bioprocédé.Pour combler ce manque, cette thèse proposeune description des bioprocédés intégrant pleinementle fonctionnement interne des microorganismesimpliqués dans la production decomposés d’intérêt. Cette description permetd’optimiser simultanément la souche et le procédépour maximiser la production d’un composéd’intérêt en respectant les contraintes attachéesà ces deux étapes.Dans un premier temps, une nouvelle classe demodélisation de bioprocédés est développée, àl’interface entre les modèles intracellulaires degestion de ressources et les modèles macroscopiquesusuellement utilisés dans la commandede bioprocédés en bioréacteurs. Dans un secondtemps, des contraintes liées à l’implémentationbiologique de la stratégie de contrôle sont intégréesau problème. Ceci permet d’obtenir uneconception plus réaliste du point de vue de l’ingénieriedes génomes. Enfin, la dernière partiede la thèse montre que la méthodologie présentéejusqu’alors sur un modèle agrégé peut êtreétendue à des représentations détaillées du comportementdes micro-organismes. / The design of efficient strains forthe production of compounds of interest offerstremendous potentials that remain insufficientlyexploited due to the lack of link between theoptimization stages of strain design and that ofbioprocess control.This thesis proposes a description of bioprocessesthat fully integrates the internal functioningof micro-organisms involved in the productionof compounds of interest. This descriptionallows the strain and process to be optimizedsimultaneously to maximize the productionof a compound of interest while respecting theconstraints attached to these two stages.First, a new bioprocess modelling class is developedat the interface between intracellular resourceallocation models and macroscopic modelscommonly used in bioprocess control. In asecond stage, constraints linked to the biologicalimplementation of the control strategy are integratedinto the problem. This provides a morerealistic genome engineering design. Finally, thelast part of the thesis shows that the methodologypresented so far on an aggregate model canbe extended to detailed representations of thebehaviour of micro-organisms.

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement couramment utilisé pour traiter plusieurs types de maladies hématologiques telles que les leucémies. Par contre, une limite importante de ce type de traitement est la quantité restreinte de CSH disponibles pour la transplantation. Il importe donc de trouver des moyens pour expandre efficacement ces cellules ex vivo tout en préservant leurs propriétés. Le gène HOXB4 est présentement un candidat très prometteur pour atteindre cet objectif. Il a en effet été montré que HOXB4 est capable d’expandre les CSH in vivo et in vitro sans mener au développement de leucémie. Le gène HOXC4, qui appartient au même paralogue est aussi en mesure d’expandre les cellules hématopoïétiques primitives suggérant un rôle commun pour les gènes HOX du paralogue 4 dans l’autorenouvellement des CSH. Le gène HOXA4 est dix fois plus exprimé que le gène HOXB4 dans des CSH du foie fœtal au moment de leur principale expansion. De plus, les CSH mutantes pour Hoxa4, contrairement aux CSH mutantes pour Hoxb4, sont incapables de reconstituer un receveur irradié lorsqu’elles sont transplantées en condition de compétition. HOXA4 pourrait donc jouer un rôle plus important que les autres gènes du paralogue 4 pour l’expansion des CSH au niveau physiologique. Nous avons donc posé l’hypothèse que HOXA4 est capable d’expandre des CSH de façon plus importante que HOXB4. Les résultats obtenues dans le cadre de ce projet de recherche ont montré que la surexpression de HOXA4 était capable d’expandre les CSH et les progéniteurs hématopoïétiques primitifs dans le même ordre que ce qui est connu pour HOXB4. Des cultures et des essais de transplantation en situation de compétition ont confirmé la capacité égale des CSH surexprimant HOXA4 et HOXB4 de proliférer et de reconstituer les receveurs irradiés à long terme. Par contre, nous avons observé une meilleure reconstitution périphérique à court terme par les CSH HOXA4+ par rapport aux CSH HOXB4+, associée à une meilleure reconstitution lymphoïde. Nous avons aussi comparé les niveaux d’expression de gènes cibles potentiels dans des CSH surexprimant HOXA4 ou HOXB4 et observer que plusieurs gènes importants pour la fonction des CSH était régulé positivement suite à leur surexpression, notamment plusieurs gènes impliqués dans les voies de signalisation Notch et Wnt, tels que des récepteurs et ligands. Les gènes HOX du paralogue 4 pourraient donc réguler la communication entre les CSH et leur microenvironnement via ces voies de signalisation majeures et ainsi réguler leur autorenouvellement. La modulation de différents gènes codant pour des facteurs de transcription et des molécules impliquées dans la pluripotence suggère également que HOXA4 et HOXB4 utilisent des mécanismes intrinsèques et extrinsèques pour réguler leur potentiel d’autorenouvellement. Ces connaissances pourront ainsi être utilisées pour optimiser les protocoles d’expansion ex vivo des CSH dans un but thérapeutique. / Transplantation of hematopoietic stem cells (HSC) is a treatment commonly used to treat several types of hematological diseases such as leukemia. However, a major limitation of this type of treatment is the limited number of HSC available for transplantation. It is therefore important to develop ways to expand these cells ex vivo. The HOXB4 gene is a promising candidate for achieving this goal. It has indeed been shown that HOXB4 is able to expand HSC in vivo and in vitro without inducing leukemia. HOXC4, which belongs to the same paralog group, is also able to expand primitive hematopoietic cell suggesting a common role for paralog 4 HOX genes in the self-renewal of HSC. HOXA4 is ten times more expressed in fetal liver HSC during their primary expansion. Furthermore, Hoxa4 mutant HSC, unlike Hoxb4 mutant HSC, are unable to reconstitute an irradiated recipient when transplanted in competition. Therefore, HOXA4 could play a more important role than other paralog 4 genes for HSC expansion at the physiological level and we hypothesized that HOXA4 can expand HSC more efficiently than HOXB4. The results obtained during this research project showed that the overexpression of HOXA4 expand HSC and primitive hematopoietic progenitors in the same order as HOXB4. Direct competitive culture and transplantation assays confirmed the equal capacity of HSC overexpressing HOXA4 and HOXB4 to proliferate and engraft at long-term. However, we observed a better short-term peripheral reconstitution by HOXA4+ HSC compared to HOXB4+ HSC, which was associated with a better lymphoid reconstitution. We also compared the expression levels of potential target genes in HSC overexpressing HOXA4 or HOXB4 and observed that many genes important for HSC function were upregulated following their overexpression, including several genes involved in the Notch and Wnt signaling pathway. These included both receptors as well as ligands, indicating that HOX4 genes might regulate the communication of primitive HSCs with their environment through these major signaling pathways and promote self-renewal. In addition, modulation of genes coding for transcription factors and molecules known for their function in pluripotency suggest that HOXA4 and HOXB4 have both intrinsic and extrinsic potential to control self renewal potential. This knowledge can then be further explored and used to optimize ex vivo HSC expansion protocols for clinical purposes.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La morphogenèse de la glande mammaire résulte de la coordination de différentes voies, incluant l'apoptose, la prolifération, la différenciation et la dynamique des cellules souches/progénitrices. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) semble être impliquée dans ces voies de signalisation. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur le facteur de transcription Slug, un gène clé régulant l'EMT, et son implication dans la morphogenèse de la glande mammaire. Dans un premier temps, en utilisant un modèle de souris transgéniques Slug-Lacz, nous avons localisé Slug dans une sous-population couvrant 10 à 20% des cellules basales du tubule et des cap cells du bourgeons terminal, coexprimant les marqueurs P-cadhérine, CK5, CD49f. Ensuite, nous avons montré par des expériences in vitro de perte et de gain de fonction, que Slug régulait la différenciation et la prolifération des cellules épithéliales mammaires. De plus, nous avons trouvé que Slug inhibait l'apoptose, promouvait la motilité cellulaire, et permettait l'émergence et la croissance de mammosphères clonales. Ce dernier point montre l'implication de Slug dans les cellules souches, qui est renforcé par le fait que des cellules primaires déficientes pour Slug étaient incapables de donner des mammosphères secondaires. Par ailleurs, nous avons pu observer in vivo que les souris déficientes pour Slug présentaient un retard de développement de la glande mammaire, possédant moins de cellules en prolifération, et une surexpression des marqueurs des cellules luminale CK8/18, GATA3 et ER. D'autres gènes régulant l'EMT sont retrouvés surexprimés, suggérant un mécanisme de compensation, qui peut expliquer le fait que le retard de développement de la glande mammaire est rattrapé à l'âge adulte. Les glandes mammaires Slug-knockout présentaient également des branchements excessifs, évoquant une différenciation précoce, similaire aux glandes mammaires de souris déficientes pour la P-cadhérine, exprimée dans les cellules basales. Sachant cela, nous avons constaté que la P-cadhérine était diminuée dans les glandes mammaires Slug-knockout, et dans les cellules CommaDβ traitées par siRNA ciblant Slug. Nous avons alors trouvé que Slug se liait directement au promoteur de la P-cadhérine et l'activait, et que cette dernière intervenait dans certains effets fonctionnels de Slug, tels que la croissance de mammosphères, la différenciation et la migration cellulaire. Ainsi, nous avons montré l'importance d'une nouvelle voie de signalisation Slug/P-cadhérine dans les capacités souches/progénitrices des cellules épithéliales mammaires, intégrant la différenciation et la motilité cellulaire, et nous avons maintenant une meilleure compréhension de son rôle dans l'agressivité de certains cancers du sein. / Mammary gland morphogenesis results from the coordination of different pathways, including apoptosis, proliferation, differentiation, and stem/progenitor cell dynamics. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) appears to be involved in these signalling pathways. Thus, we focused on transcription factor Slug, a key gene regulating EMT, and its involvement in mammary gland morphogenesis. First, using a Slug–LacZ transgenic mice model, we located Slug in a subpopulation covering about 10–20% basal duct cells and cap cells of terminal end bud, coexpressed with basal markers P-cadherin, CK5 and CD49f. Then, we have shown by in vitro experiments of loss and gain of function that Slug regulated the differentiation and proliferation of mammary epithelial cells. Moreover, we found that Slug inhibited apoptosis, promoted cell motility, and allowed the emergence and growth of clonal mammospheres. This last point shows the involvement of Slug in stem cells, which is reinforced by the fact that primary cells deficient for Slug were unable to give secondary mammospheres. Furthermore, we observed in vivo that mice deficient for Slug showed delayed development of the mammary gland, with less proliferating cells, and overexpression of markers of luminal cells CK8/18, GATA3 and ER. Other genes regulating EMT are found overexpressed, suggesting a compensatory mechanism, which can explain the fact that the delayed development of the mammary gland is caught up in adulthood. The Slug-knockout mammary glands also showed overbranching, evoking an early differentiation, similar to the mammary glands of mice deficient in P-cadherin, expressed in the basal cells. Knowing this, we found that P-cadherin was decreased in Slug-knockout mammary glands, and in CommaDβ cells treated with siRNA targeting Slug. We then found that Slug binds directly to the promoter of the P-cadherin and activated it, and that P-cadherin was involved in some functional effects of Slug, such as mammospheres growth, differentiation and cell migration. Thus, we have shown the importance of a new signalling pathway Slug/P-cadherin in the capacity of mammary epithelial stem/progenitor cells, integrating differentiation and cell motility, and we now have a better understanding of its role in the aggressiveness of some breast cancers.

Chez les métazoaires, la différenciation terminale est généralement accompagnée par une sortie définitive du cycle cellulaire. Cependant, les macrophages et très peu d'autres types cellulaires rompent avec ce dogme. En effet, il est maintenant admis que les macrophages conservent la capacité de s'auto-renouveler indépendamment des cellules souches ou progénitrices. À cet égard, nous avons démontré que la double déficience en facteurs Maf dans les macrophages (Maf-DKO) leur confère la capacité de s'auto-renouveler indéfiniment en culture sans se dé-différencier ou devenir tumorigènes. Ce phénotype d'auto-renouvellement semble être médié par un réseau transcriptionnel de de gènes régissant l'auto-renouvellement qui sont également actifs dans les cellules souches embryonnaires, parmi lesquels Myc et Klf4. Ces deux facteurs sont activés et nécessaires pour l'auto-renouvellement des Maf-DKO. De façon intéressante, l'expression de Myc seul induit une prolifération illimitée des macrophages, mais provoque une transformation tumorale. Nous avons donc cherché à décrypter les mécanismes grâce auxquels Myc et Klf4 induisent l'auto-renouvellement des macrophages, en comparaison à la transformation cellulaire causée par l'expression de Myc uniquement. En outre, nous nous sommes concentrés sur l'identification de gènes candidats permettant un auto-renouvellement illimité des macrophages, tout en les protégeant de la transformation cancéreuse. Notre objectif est de contribuer à l'identification du programme transcriptionnel régulant l'auto-renouvellement non tumoral des macrophages. / In metazoan, terminal differentiation is generally accompanied by permanent exit from the cell cycle. Yet, macrophages and very few other examples break with this dogma. Indeed, it has become evident that macrophages retain the ability to self-renew independently of stem or progenitor cells. In this regard, we have previously shown that MafB/c-Maf double deficient (Maf-DKO) macrophages are able to self-renew indefinitely in vitro without dedifferentiating or becoming tumorigenic. This self-renewal phenotype appears to be mediated by a transcriptional network of self-renewal genes also active in embryonic stem cells, among which Myc and Klf4. Interestingly, these two factors are activated and required for Maf-DKO self-renewal. By contrast, Myc alone induces an unlimited proliferation of macrophages but causes malignant transformation. We aimed to decipher the mechanisms by which Myc and Klf4 induce stem cell-like self-renewal in macrophages, in comparison to cellular transformation caused by the expression of Myc alone. Additionally, we focused on identifying candidate genes allowing an unlimited self-renewal of macrophages while protecting them from tumorigenic transformation or aberrant proliferation. Our objective is to contribute to the identification of the transcriptional program regulating non-tumorigenic self-renewal in macrophages.

Le médulloblastome (MB) est la plus fréquente des tumeurs cérébrales malignes pédiatriques qui représentent la première cause de mortalité par cancer chez l’enfant. Malgré les avancées des nouveaux traitements, les risques de récidive, séquelles et décès après traitement restent importants. Le récepteur de neuropiline-1 (NRP-1) a été récemment impliqué dans la progression tumorale des MBs et semble jouer un rôle important dans le phénotype des cellules souches cancéreuses (CSCs). Le ciblage de cette molécule pourrait ainsi présenter un intérêt thérapeutique dans le traitement des MBs. Nous avons sélectionné des cellules souches de MB capables de former des médullosphères (MS) à partir de 3 lignées cellulaires (DAOY, D283-Med et D341-Med). Ces modèles ont été caractérisés par l’expression de neuropilines (NRP-1 and NRP-2) et de marqueurs phénotypiques (CD133，CD15 et NF-M). Les résultats ont montré une augmentation significative de l’expression de NRP-1 par les cellules cultivées en médullosphères confortant notre stratégie de ciblage. L’impact du traitement de ces cellules par un composé innovant ciblant spécifiquement NRP-1, le MR438, a été ensuite évalué in vitro seul et association avec la radiothérapie notamment sur l’étude de la capacité d’auto-renouvellement des CSCs de MBs. Nous avons mis en évidence une diminution de la capacité d’autorenouvellement des cellules souches de MBs après exposition au MR438 avec une radiosensibilité augmentée pour les 3 modèles cellulaires. In vivo, le composé MR438 a été evalué sur des modèles de xénogreffes hétérotopiques chez la souris nude et montre un effet radiopotentialisant significatif pour les tumeurs issues de la lignée Daoy avec une tendance à la diminution de la progression tumorale pour les 2 autres lignées. De façon intéressante, le composé MR438 induit une diminution significative du nombre de cellules souches pour l’ensemble de nos modèles. Par conséquent, le composé semblerait induire les cellules souches vers un phénotype différencié au moins pour la lignée DAOY, même si les mécanismes n’ont pas pu être clairement élucidé. En conclusion, l’inhibition de NRP-1 via MR438 semble stimuler la différenciation des cellules souches cancéreuses pouvant à terme réduire la progression du MB et apporter un bénéfice en association avec la radiothérapie. L’evaluation du composé sur des modèles orthotopiques de MB permettrait d’obtenir des informations quant à son efficacité sur des modèles plus proche de la physiopathologie tenant compte de sa distribution au niveau cérébral / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant pediatric brain tumors which is the leading cause of cancer death in children. Despite the progress of new treatments, the risk of recurrence, morbidity, and death after treatment remain important. The neuropilin-1 receptor (NRP-1) has recently been implicated in tumor progression of MBs, which seems to play an important role in the phenotype of cancer stem cells (CSCs). Targeting this molecule could thus present an interesting therapeutic value in the treatment of MB. We have selected cancer stem like cells of MBs in the form of medullospheres (MSs) from 3 cell lines (DAOY, D283-Med and Med-D341). These models were characterized by expression of neuropilins (NRP-1 and NRP-2) and phenotypic markers (CD133, CD15 and NF-M). Results showed a significant increase of the expression of NRP-1 by our CSCs models cultured in MSs that confirms our targeting strategy. The impact of the treatment of these cells with an innovative compound specifically targeting NRP-1, MR438, was then evaluated in vitro alone and in association with radiotherapy, especially on the study of the capacity for self-renewal. A decrease of self-renewal capacity for MB stem cells after exposition of MR438 with an increase of radiosensitivity for the 3 cell models in vitro was demonstrated. In vivo, MR438 was evaluated on heterotopic xenograft models in nude mice and showed a significant augmentation of radiosensitivity for DAOY tumors with a tendency to decrease tumor progression for the other 2 cell lines. Interestingly, the compound MR438 induced a significant decrease in the number of stem cells for all of our models. The compound appeared to induce CSCs to a differentiated phenotype at least for the DAOY cells, although mechanisms could not be clearly elucidated. In conclusion, inhibition of NRP-1 via MR438 seems to stimulate the differentiation of CSCs that may eventually reduce the progression of MB and bring a benefit in association with radiotherapy. Evaluation of this compound on orthotopic models of MB would provide information on its effectiveness on models closer to the physiopathology taking into account its distribution at the cerebral level

De par leur incidence et un diagnostic tardif, les cancers du sein et du colon restent parmi les plus meurtriers en France. L’identification de marqueur précoce semble primordiale pour détecter rapidement ces maladies et ainsi améliorer la survie des patients. Le protéome de chaque stade du cancer du côlon a été identifié et quantifié par spectrométrie de masse. L’Olfactomedine-4 (OLFM4) a été définie comme un biomarqueur potentiel par sa présence dans le sérum et ses variations d’expression. Alors que cette protéine est surexprimée, au niveau du site tumoral primaire,uniquement dans les stades précoces du cancer colorectal, sa surexpression est maintenue dans le sang des patients tous stades confondus. Cette variabilité d’expression est également retrouvée dans le cancer du sein. L’OLFM4 est décrite comme un marqueur des cellules souches colorectales mais ses fonctions restent contradictoires. Selon le contexte cellulaire, nos travaux associent cette protéine sécrétée à l’établissement de propriétés de cellule souche cancéreuse comme la prolifération en faible adhésion et la formation de mammosphères. Elle facilite également le processus migratoire et la résistance à la chimiothérapie. De plus, des expériences in vivo ont confirmé le caractère protumoral de cette protéine. Nous avons également mis en évidence son implication dans la régulation de l’expression du facteur de transcription GLI1 de la voie Sonic Hedgehog et de protéines d’adhésion telle que l’E-Cadherine. Cette étude décrit le lien étroit entre l’induction d’un phénotype agressif et l’OLFM4 dont le dosage sérique permettrait une détection précoce de ces maladies. / Through their high frequencies and the lack of early diagnosis, breast and colorectal cancer remain poor prognosis’ diseases. Therefor, the identification of early markers appears as crucial. The proteomic approach isone of the potential tools to identify these biomarkers as it enables the study of tumour cell lines or tissues amples. Indeed, proteins enriched from a shotgun proteomic approach can be identified and quantified by mass spectrometry. In a previous study, we have analysed the proteome of colorectal tumour at different stages and defined Olfactomedine-4 (OLFM4) as a potential biomarker. While OLFM4 expression is increased at primary tumoral site only in non-invasive stages, we have observed that OLFM4 isover expressed in the blood of patients regardless of the cancer stage. The same analysis was made on breast cancer patients. Although OLFM4 has been described as a stem cell marker, its functions remain unclear. In this study, we found that OLFM4 confers cancer stem cell properties. It acts as a regulator of proliferation in low adhesion conditions, migration, mammosphere formation and tumor growth. These abilities could be dependent of Sonic Hedgehog signalling pathway, especially of transcriptional factor GLI1, and regulation of adhesion proteins like E-cadherin. According to the cellular background, all these features highlight a close relationship between a potential biomarker and its involvement in the acquisition of an aggressive phenotype.

Les cellules souches de l’épiderme interfolliculaire humain, appelées cellules souches kératinocytaires (CSK), assurent l’homéostasie et le renouvellement du tissu durant toute la vie d’un individu grâce à leur importante capacité d’autorenouvellement. Ma thèse de doctorat a porté sur l’étude des effecteurs moléculaires impliqués dans la balance entre prolifération et quiescence dans un modèle in vitro de CSK, isolées de manière clonale et définies par le terme holoclone. Je me suis tout d’abord intéressée à la réponse des holoclones à l’effet d’un régulateur important de la prolifération et de la quiescence des cellules souches adultes : le facteur de croissance TGF β1. Mon travail s’est ensuite focalisé sur l’étude d’un gène agissant en aval de la voie de signalisation TGF β, le facteur de transcription Klf4, et dont le rôle dans la biologie des cellules souches adultes reste largement méconnu. Klf4 est en effet surtout décrit pour son rôle dans la reprogrammation des cellules somatiques en cellules iPS. Le maintien de la sensibilité des holoclones aux signaux inhibiteurs de la croissance constitue un gage de la normalité des CSK. Notre étude de la réponse des holoclones à l’effet antiprolifératif du TGF β1 montre que les holoclones, dotés d’un fort potentiel de croissance, caractéristique des CSK, conservent leur sensibilité à l’effet du TGF β1. Ces résultats nous ont permis de valider les holoclones comme constituant un modèle pertinent pour caractériser la biologie normale des CSK et décrypter les contrôles moléculaires de l’état souche. Le modèle des holoclones a été exploité dans le cadre d’une approche de génomique fonctionnelle visant à déterminer le rôle du facteur de transcription Klf4 dans les CSK. L’utilisation de vecteurs lentiviraux exprimant un shARN dirigé contre l’ARNm de Klf4 nous a permis d’étudier l’impact d’une modulation fine du niveau d’expression de Klf4 sur les propriétés des holoclones. La répression transcriptionelle de Klf4, d’environ un facteur 2, favorise de manière significative l’expansion du compartiment clonogénique au sein des holoclones. Ce gain de fonction concerne à la fois les potentiels de croissance et de reconstruction épidermique des holoclones. Un aspect important de ce travail a concerné la recherche des réseaux moléculaires régulés par Klf4 dans les holoclones. Une analyse du transcriptome nous a permis de montrer que Klf4 participe au contrôle des mécanismes de cycle cellulaire et de différenciation. Klf4 interviendrait également dans la régulation des voies de signalisation TGF β/BMP et Wnt, connues pour exercer des rôles clés dans la biologie des cellules souches. Klf4 constituerait donc un censeur de l’activité du compartiment immature dans l’épiderme interfolliculaire. Il participerait aux mécanismes de régulation du cycle cellulaire et serait susceptible d’intervenir dans le contrôle de l’autorenouvellement du compartiment souche. / Stem cells present within the human interfollicular epidermis, which are defined as keratinocytes stem cells (KSC), ensure the homeostasis and renewal of the tissue throughout the whole individual life. These functions are related to their important self-renewal capacity. My PhD project was focused on the knowledge of the molecular effectors involved in the control of the balance between proliferation and quiescence in KSC. This scientific question was investigated in an in vitro model of KSC which were clonally derived and characterized as holoclones. Holoclones are controlled by mitogenic growth factors and also by antiproliferative signals. One of these regulators is the growth factor TGF β1 which plays an important role in the control of quiescence and cell proliferation within several adult stem cell systems. In the context of growth inhibition by TGF β1, I have studied the role of a downstream gene of the TGF β pathway, the transcription factor Klf4, whose role in adult stem cell biology remains unclear. In fact, Klf4 is mostly described for its involvement in the reprogramming process of somatic cells into iPS cells. The maintenance of holoclone sensitivity to cell growth inhibitors is a critical parameter of KSC normal physiology. Holoclones possess an extensive growth capacity, which is characteristic of KSC. Despite this high proliferation rate, holoclones are still responsive to the antiproliferative effect of TGF β1. These results allowed us to validate the use of holoclone as a relevant model of non-transformed KSC suitable for the characterization of the role of candidate stemness genes in KSC biology, such as Klf4. The holoclone model was exploited to perform a functional genomic approach to investigate the role of Klf4 in KSC. We have developed a shRNA-based gene knock-down method using lentiviral vectors to assess the impact of Klf4 down-modulation on holoclone functional properties. Our results show that Klf4 down modulation controls the expansion of the clonogenic compartment present within holoclone progeny. This gain-of-function, which is maintained at the long term level, leads to an increase in holoclone 3D epidermis reconstruction capacity. A major point of this project was to elucidate the molecular networks controlled by Klf4 in holoclones. Microarray data show that Klf4 regulates the expression of several genes related to pathways involved in the control of stem cell fate. In particular, we identified many transcripts related to TGF β/BMP and Wnt signallings. Interestingly, the majority of the modulated transcripts are involved in the regulation of cell cycle and in keratinocyte differentiation process. All together these results suggest a critical role Klf4 as a stemness censor of the most immature compartment activity. Klf4 is likely to be involved in cell cycle regulation of KSC compartment and in the control of KSC self-renewal process.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des maladies hématologiques hétérogènes caractérisées par une prolifération clonale des blastes myéloïdes qui s’infiltrent dans la moelle osseuse (MO), le sang et d’autres organes. Identifiée comme le type le plus courant de leucémie aiguë chez l’adulte avec 80% des cas, la LAM est synonyme de rechute et de mauvais pronostic, avec 70% des patients étant confrontés à une mortalité dans l’année suivant le diagnostic. La présence des cellules souches leucémiques (CSL) a été associée à une résistance à la chimiothérapie et à une rechute dans la LAM. Le microenvironnement tumoral a été décrit pour son rôle clé dans la régulation des CSL par l’interaction des voies de signalisation. La voie des Bone Morphogenetic Proteins (BMP) est fortement impliquée dans la régulation des cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais elle a également été reconnue pour réguler les CSL. Ici, nous avons identifié des concentrations élevées de BMP2 et BMP4 dans la MO des patients atteints de LAM au moment du diagnostic. De plus, nous avons identifié pour la première fois une nouvelle cascade de signalisation impliquant la liaison de BMP4 au récepteur BMPR1A, qui induit l’expression de ΔNp73 et NANOG. L’activation de cette signalisation favorise un phénotype proche des cellules souches dans les cellules leucémiques. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que cette voie est responsable de la capacité de résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie. En outre, nous avons identifié BMPR1A/ΔNp73/NANOG comme marqueurs potentiels du pronostic dans la LAM, en raison de leurs surexpressions au moment du diagnostic associé à une rechute dans les trois ans. Lorsque nous avons analysé des échantillons de LAM lors d’une rechute, nous avons constaté des taux plus élevés de l’isoforme ΔNp73 par rapport à ceux de patients au moment du diagnostic. D’autre part, nous avons identifié une forte expression du récepteur BMPR1A, ΔNp73, NANOG, SOX2 et ID1 dans les cellules leucémiques primaires résistantes à court terme. Ces résultats sont en corrélation avec ce que nous avons observé dans les cellules résistantes de LAM, où BMPR1A, ΔNp73, NANOG et ID1 semblent être impliqués dans la capacité de résistance des cellules de LAM face à la chimiothérapie. La modulation et le ciblage des éléments de la voie BMP et des gènes associés identifiés au travers de notre étude représentent donc une approche prometteuse pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes et plus efficaces contre les LAM / Acute myeloid leukemias (AML) are heterogeneous hematological malignancies characterized by a clonal proliferation of myeloid blasts which infiltrate the bone marrow, blood and other organs. Identified as the most common type of acute leukemia in adults with 80% of cases, AML is associated with high relapse and poor prognosis where 70% of patients face mortality within one year after diagnosis. Leukemic stem cell (LSCs) presence has been related to resistance to chemotherapeutic agents and relapse in AML. The tumor microenvironment has been described for its key role regulating LSCs through the crosstalk of signaling pathways. Bone Morphogenetic Proteins (BMP) pathway is highly involved in hematopoietic stem cell (HSC) regulation, but has also been recognized to regulate LSCs. Here, we have identified high concentrations of BMP2 and BMP4 in bone marrow (BM) AML samples at diagnosis. Furthermore, we have identified for the first time a new signaling cascade, involving the binding of BMP4 to BMPR1A receptor, which induces the expression of ΔNp73 and NANOG. Activation of this signaling promotes a stem-like phenotype in leukemic cells. Therefore, we hypothesized that this signaling is responsible for the resistant capacity of leukemic cells to chemotherapy. In addition, we have reported BMPR1A/ΔNp73/NANOG as potential AML prognosis markers, due to their overexpression at diagnosis associated to an increased rate of relapse of AML patients within three years. When we analyzed AML samples at relapse, higher levels of ΔNp73 isoform were found compared to patients at diagnosis. Moreover, we have identified high expression of the BMPR1A receptor, ΔNp73, NANOG, SOX2 and ID1 in short-term resistant primary leukemic cells. These results correlate with what we observed in AML resistant cells, where BMPR1A, ΔNp73, NANOG and ID1 seem to be implicated in driving the resistant capacity of AML cells to drug therapy. Therefore, modulation and targeting of the BMP pathway elements and related genes identified with our study, represent a promising approach towards the development of new and more effective therapeutic strategies against AML