Stem cells and cancer are inextricably linked and many tumours, including colorectal cancers, contain a small population of self-renewing cells, referred to as cancer stem cells (CSCs), able to give rise to proliferating but progressively differentiating cells that contribute to the cellular heterogeneity typical of solid tumours. Thus, the identification of CSCs and the factors that regulate their behaviour should have a profound impact on cancer treatment. Notch signalling controls the maintenance and differentiation of stem cells in several tissues, including the intestine, where it is essential for stem cells maintenance. Based on these premises, my work was aimed at identifying and characterising the cells that express the Notch1 receptor in intestinal tumours in vivo, with the objective of getting insights into the cellular hierarchy of colon cancer cells. We found that the Notch1 receptor is expressed in rare undifferentiated tumour cells that present self-renewal and multipotency in vivo, as they indefinitely give rise to marked differentiated tumour cells and fuel tumour growth. Our analysis on the transcriptomic profile of these cells confirmed our in vivo observations that Notch1+ tumour cells represent a specific population of highly proliferative tumour cells, expressing several, but not all, known markers of normal intestinal stem cells (ISCs). Indeed, their transcriptional signature highly correlates with normal ISCs. Given that the tumour cells we characterised appear not to carry Apc mutations, we hypothesise that during the earlies steps of tumourigenesis, normal Notch1+ ISCs are engulfed within the nascent tumour (in aberrant hyperproliferative crypts) and are able to grow and expand within this new ecosystem, as they are supported by extrinsic secreted growth factors from the neighbouring mutant cells. The concept that normal ISCs might contribute to tumour expansion highlights the complications that patients can encounter during treatment, since these cells share many features with their wild-type counterparts, making therapy deleterious to normal ISCs. / Les cellules souches et le cancer sont inextricablement liés et de nombreuses tumeurs, y compris les cancers colorectaux, contiennent une petite population de cellules auto-renouvelables, appelées cellules souches cancéreuses (CSCs), capables de donner naissance à des cellules proliférantes mais progressivement différenciatrices qui contribuent à l'hétérogénéité cellulaire typique des tumeurs solides. Ainsi, l'identification des CSC et des facteurs qui régissent leur comportement devrait avoir un impact profond sur le traitement du cancer. Notch signale le contrôle le maintien et la différenciation des cellules souches dans plusieurs tissus, y compris l'intestin, où elles sont essentielles au maintien des cellules souches. Sur la base de ces prémisses, mes travaux visaient à identifier et caractériser les cellules qui expriment le récepteur Notch1 dans les tumeurs intestinales in vivo, dans le but de mieux comprendre la hiérarchie cellulaire des cellules cancéreuses du colon. Nous avons constaté que le récepteur Notch1 s'exprime dans de rares cellules tumorales indifférenciées qui se renouvellent et se multiplient in vivo, car elles donnent lieu indéfiniment à une différenciation marquée des cellules tumorales et à une croissance tumorale. Notre analyse du profil transcriptomique de ces cellules a confirmé nos observations in vivo selon lesquelles les cellules tumorales Notch1+ représentent une population spécifique de cellules tumorales hautement prolifératives, exprimant plusieurs marqueurs connus, mais pas tous, des cellules souches intestinales normales (CSI). En effet, leur signature transcriptionnelle est fortement corrélée avec les CSI normaux. Étant donné que les cellules tumorales que nous avons caractérisées ne semblent pas être porteuses de mutations Apc, nous supposons que durant les premières étapes de la tumorigénèse, les CSI normales Notch1+ sont englouties dans la tumeur naissante (dans des cryptes hyperprolifératives aberrantes) et sont capables de croître et de s'étendre dans ce nouvel écosystème, car elles sont soutenues par les facteurs de croissance extrinsèques des cellules mutantes voisines. Le concept selon lequel les CSI normaux pourraient contribuer à l'expansion tumorale met en évidence les complications que les patients peuvent rencontrer pendant le traitement, puisque ces cellules partagent de nombreuses caractéristiques avec leurs homologues de type sauvage, ce qui rend le traitement délétère pour les CSI normaux.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez les cellules eucaryotes, la transcription est réalisée par les ARN polymérases I, II et III. L’ARN polymérase III (Pol III) transcrit des petits ARNs non codants tels que les ARNt, l’ARN U6, l’ARNr 5S et certains microARN. Il a été montré précédemment que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de la Pol III était associée à la transformation tumorale. Au sein du laboratoire, nous avons décrit une nouvelle sous–unité de la Pol III, RPC32α, qui met en évidence l’existence de deux isoformes de la Pol III humaine : la Pol IIIα et la Pol IIIβ. La sous-unité RPC32β, présente dans la Pol III, est exprimée de façon ubiquitaire et parait comme essentielle pour la croissance cellulaire. La sous-unité RPC32α n’est pas essentielle pour la survie cellulaire et son expression est limitée aux cellules souches non différenciées et aux cellules tumorales. De plus, l’expression ectopique de RPC32α induit la transformation tumorale des cellules fibroblastes IMR90 et change totalement l’expression de nombreux transcrits Pol III mais aussi d’autres ARNm impliqués dans la tumorogenèse (Haurie et al., 2010). Les travaux décrits dans ce manuscrit ont eu pour but de mieux caractériser et comprendre les deux isoformes de la Pol III humaine. Nous avons purifié les Pol IIIα et Pol IIIβ afin d’identifier tous les composants protéiques des deux isoformes du complexe. Au cours de cette étude nous avons observé que des modifications post-traductionnelles de RPC32α semblaient jouer un rôle déterminant dans la capacité oncogénique de la Pol IIIα. Pour comprendre par quel mécanisme moléculaire les Pol IIIα et Pol III pouvaient influencer l’expression de transcrits Pol II, notamment lors de la transformation cellulaire induite par l’expression de RPC32α, nous avons étudié cette régulation lors de la surexpression des deux sous unités paralogues. Ainsi, nous avons mené des analyses ciblées révélant la régulation de certains gènes impliqués dans le développement, la différenciation et la tumorogenèse. Nous avons également essayé de décrire les changements d'expression des gènes au niveau globale en utilisant la technologie des puces à ADN. Cette approche innovante et puissante nous a permis d’obtenir une vision d’ensemble des transcrits Pol II différentiellement régulés lors de la surexpression de RPC32α et RPC32β Nous avons pu apprécier l’impact de la Pol III pour le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire, la survie de la cellule, la prolifération tumorale ou encore à la réponse immunitaire innée. Les résultats de cette étude qui demandent à être confirmés ouvrent des voies de recherches particulièrement intéressantes qui mériteront d’être approfondies dans le futur / Transcription in eukaryotic nuclei is carried out by DNA-dependent RNA polymerases I, II, and III. Human RNA polymerase III (Pol III) transcribes small untranslated RNAs that include tRNAs, 5S RNA, U6 RNA, and some microRNAs. Increased Pol III transcription has been reported to accompany or cause cell transformation. In the laboratory, we described a Pol III subunit (RPC32β) that led to the demonstration of two human Pol III isoforms (Pol IIIα and Pol IIIβ). RPC32β-containing Pol IIIβ is ubiquitously expressed and essential for growth of human cells. RPC32α-containing Pol IIIα is dispensable for cell survival, with expression being restricted to undifferentiated ES cells and to tumor cells. In this regard, and most importantly, ectopic expression of RPC32α in fibroblast IMR90 enhances cell transformation and dramatically changes the expression of several tumor-related mRNAs and that of a subset of Pol III RNAs. These results identify a human Pol III isoform and isoform-specific functions in the regulation of cell growth, the differentiation and transformation. (Haurie et al., 2010).The work described in this manuscript enables identification and understanding the function of the two human Pol III isoforms. Pol IIIα and Pol IIIβ are purified in order to describe all the protein components of the two Pol III complex. During this study, we observed that post-translated modifications of RPC32α seem to have a crucial function in oncogenic capacity of Pol IIIα. To understand how Pol IIIα and Pol IIIβ can affect Pol II RNA expression, in particular during cell transformation induced by RPC32α, we studied this regulation during the overexpression of the two paralogue subunits. We performed focused analysis, this study revealed the regulation of certain genes involved in the development, the differentiation and the tumorigenesis. We also tried to describe global gene expression modification using microarray technology. This new and powerful approach enables to obtain a global view on mRNA regulation by overexpression of RPC32α and RPC32β. We observed the effect of Pol III on embryo development, cell differentiation, cell survival, tumor proliferation and on innate immune response. The results of this study need further confirmation pave the way for interesting projects which are worth going into detail for the future.

Une des causes d’échec les plus importantes dans la prise en charge des cancers est la rechute, reflet de la persistance de cellules souches cancéreuses. Les leucémies aiguës myéloïdes représentent la forme principale de leucémie aiguë chez l’adulte et sont caractérisées par une prolifération excessive de cellules immatures et un défaut d’apoptose. En haut de la hiérarchie clonale, les cellules souches leucémiques (CSL) au travers de leurs capacités fonctionnelles participent à l’initiation et la maintenance de la maladie. Ces cellules sont régulées à la fois de façon extrinsèque au travers du microenvironnement et de façon intrinsèque notamment les facteurs de transcription.Notre équipe travaille sur le récepteur à la vitamine D (VDR) et son ligand la vitamine D (VD) et a mis en évidence une synergie d’action entre chélation martiale et VD afin de lever le blocage de différenciation des LAM avec une toxicité réduite (Callens et al, JEM 2010). Une étude clinique rétrospective a été conduite mettant en évidence qu’un taux de vitamine D élevé chez les patients atteints de LAM avant tout traitement leur confère un meilleur pronostic (Paubelle, Zylbersztejn et al, Plos One 2013) . Nous poursuivons donc ce projet sur l’étude la voie VD/VDR dans la maintenance des cellules souches hématopoïétiques et sa dérégulation dans la LAM. Mon projet doctoral a pour objectif de déterminer l’implication du microenvironnement tumoral (voie des BMP et du VDR) dans le maintien des cellules souches leucémiques de LAM. Notre hypothèse de travail est que le récepteur à la vitamine D en plus de son rôle différenciant connu, aurait un impact sur le maintien des cellules souches hématopoïétiques normales et de LAM et que son mécanisme d’action passerait par la voie des Bone Morphogenetic Protein. Nous avons dans un premier temps démontré l’importance du VDR dans la régulation des CSH et pu tester l’intérêt de l’emploi de son ligand afin de cibler spécifiquement les cellules souches leucémiques dans des modèles pré-cliniques. Enfin nous avons pu confirmer la dérégulation de cette voie dans des cellules primaires de LAM et la régulation de ce récepteur par la voie des Bone Morphogenetic Protein. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension dans la biologie des CSH et de leur dérégulation dans la LAM / One of the most important causes of failure in the management of cancer is relapse, due to cancer stem cells persistence. Acute Myeloid Leukemias (AML) are the major form of acute leukemia in adults and are characterized by excessive proliferation of immature cells and apoptosis defect. At the top of the clonal hierarchy, leukemic stem cells (LSC) through their functional abilities participate in the initiation and maintenance of the disease. These cells are regulated both extrinsically mechanisms through the microenvironment and intrinsically by transcription factors.Our team is working on the Vitamin D Receptor (VDR) and its ligand Vitamin D (VD) and has demonstrated a synergistic action between iron chelation and VD in order to lift the differentiation blocking of AML with reduced toxicity (Callens et al, JEM 2010). A retrospective clinical study was conducted showing that a high vitamin D level in patients with AML before any treatment gives them a better prognosis (Paubelle, Zylbersztejn et al, Plos One 2013). We are continuing this project on the study of the VD/VDR pathway in the maintenance of hematopoietic stem cells (HSC) and its deregulation in AML. My project aims to determine the involvement of the tumor microenvironment (BMP and VDR pathway) in the maintenance of AML-LSC. Our working hypothesis is that the vitamin D receptor, in addition to its known differentiating role, would have an impact on the maintenance of normal HSC and AML and that its mechanism of action would be through the Bone Morphogenetic Protein pathway. We first demonstrated the importance of VDR in the regulation of HSCs and tested the interest of the use of its ligand to specifically target LSC in pre-clinical models. Finally we were able to confirm the deregulation of this pathway in primary AML cells and the regulation of this receptor by the Bone Morphogenetic Protein pathway. These works open up new perspectives in the understanding in CSH biology and their deregulation in AML.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement de l’épithélium mammaire dépend des cellules souches qui, en proliférant et se différenciant, donnent naissance aux cellules du lignage épithélial. Les cellules souches sont ensuite sollicitées à chaque gestation pour régénérer une partie de l’épithélium. L’objectif de cette thèse est d’identifier et de caractériser en profondeur les différents types de cellules du lignage épithélial mammaire bovin par des approches de cytométrie en flux et de tri cellulaire. Nous avons défini et étudié des (sous)populations épithéliales engagées dans le développement mammaire à la puberté. A ce stade, l’épithélium mammaire contient de rares cellules souches mammaires, des cellules progénitrices à typage mixte luminal/basal et des cellules luminales et basales. Ces (sous)populations diffèrent soit en proportion soit en caractéristiques, voire les deux, aux stades physiologiques majeurssuivants (lactation et tarissement). Les cellules basales diminuent en lactation et au tarissement. Elles possèdent une signature moléculaire propre à chaque stade. La population luminale, composée de plusieurs sous-populations, est la plus variable. Elle arbore une réceptivité hormonale différente à chaque stade. Des (sous)populations épithéliales n’apparaissent qu’à un stade précis (puberté ou lactation) et disparaissent aux autres, comme certaines cellules prolifératives définies comme cellules progénitrices. Enfin, la fraction de rares cellules souches putatives diminue graduellement, de la puberté aux stades suivants, tout en conservant des caractéristiques moléculaires similaires. Ces / The development of the mammary epithelium relies on the mammary stem cells which, by proliferating and differentiating, give rise to the luminal, basal and progenitor cells of the epithelial lineage. The stem cells are then solicited at each gestation to regenerate a part of the epithelium. In this thesis work, we aim at identifying and characterizing in depth the different types of cell constitutive of the bovine mammary epithelial cell lineage by flow cytometry and cell sorting approaches. We defined and studied epithelial (sub)populations committed to mammary development at puberty. At this stage, the mammary epithelium contains rare mammary stem cells, mixed luminal/ basal progenitors, as well as luminal and basal cells.These (sub)populations were found to differ in proportion and/or characteristics at thesubsequent major physiological stages (lactation and dry periods). Basal cells decrease at lactation and dry off. They harbor a specific molecular signature at each stage. The luminal population, composed of several subpopulations, is the most variable. The hormonal receptivity of these cells changes at each physiological stage. Interestingly, some epithelial populations only appear at specific stages (puberty or lactation) and disappear at others, as one subpopulation of proliferative cells that we defined as progenitor cells. At last, the pool of rare putative stem cells gradually decreases from puberty to the next stages while maintaining a similar molecular signature. These are novel insights that show that the epithelial lineage evolves substantially through the

A l’état basal, les cellules souches musculaires sont quiescentes. Après blessure, ces cellules s’activent, s’amplifient et se différencient afin de réparer les myofibres lésées. Cependant, une petite population de ces cellules myogéniques activées ne va pas entrer dans la voie de la myogenèse, mais va retourner en quiescence par un phénomène appelé auto-renouvellement. Cette étape est cruciale afin de maintenir une réserve de cellules souches musculaires tout au long de la vie. Mais, les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant ce phénomène sont peu décrits dans la littérature. La régénération musculaire est composée d’une série d’évènements complexes et bien orchestrés selon une cinétique précise. Le challenge de son étude est donc de pouvoir distinguer les évènements les uns des autres, tout en sachant qu’ils sont interconnectés. Bien que les cellules souches musculaires aient un fort potentiel de régénération, elles ont besoin d’interagir avec d’autres cellules au cours de la régénération, notamment avec les macrophages qui ont un rôle prépondérant dans ce processus. Après une blessure, les monocytes circulants sont recrutés sur le site de lésion et se différencient en macrophages inflammatoires. Ensuite, ces macrophages changent leur statut inflammatoire et acquièrent un profil anti-inflammatoire. Plusieurs études in vitro ont suggéré un rôle pour le métabolisme et son régulateur principal, la kinase activée par l’AMP (AMPK), dans la résolution de l’inflammation et dans le devenir des cellules souches adultes. Ainsi, j’ai étudié l’influence extrinsèque (via les macrophages) et intrinsèque du métabolisme sur le devenir des cellules souches musculaires au cours de la régénération. Pour cela, j’ai utilisé divers modèles déficients pour l’AMPK1 dans le macrophage, dans la cellule souche musculaire et dans la myofibre qui m’ont permis d’établir des cultures primaires de macrophages et de cellules musculaires. Dans un premier temps, grâce à ces outils, nous avons pu démontrer le rôle primordial de l’AMPK dans la résolution de l’inflammation au cours de la régénération musculaire et dans l’acquisition des fonctions anti-inflammatoires des macrophages. Dans ce contexte, l’activation de l’AMPK est dépendante de la kinase CAMKK et régule la phagocytose, principal phénomène cellulaire permettant le changement de statut inflammatoire des macrophages. Ce travail a été publié en 2013 dans le journal Cell Metabolism. Ensuite, j’ai mis en évidence un lien entre le métabolisme et le devenir des cellules souches musculaires. La suppression de l’AMPK dans les cellules souches musculaires augmente leur auto-renouvellement. Cette modification du devenir des cellules souches est due à un changement de métabolisme similaire à l’effet Warburg observé dans les cellules souches cancéreuses, qui s’effectue via la modulation de l’activité de l’enzyme Lactate Déshydrogénase, enzyme clé de la glycolyse. En conclusion, j’ai pu mettre en évidence deux nouveaux rôles de l’AMPK dans le devenir des cellules souches musculaires, établissant un lien de causalité entre métabolisme, inflammation et devenir des cellules souches. / During skeletal muscle regeneration, muscle stem cells activate and recapitulate the myogenic program to repair the damaged myofibers. A subset of these cells does not enter into the myogenesis program but self-renews to return into quiescence for further needs. Control of muscle stem cell fate choice is crucial to maintain homeostasis but molecular and cellular mechanisms controlling this step are poorly understood. A difficulty of understanding muscle stem cell self-renewal is that skeletal muscle regeneration is a coordinated and non-synchronized process. Various and dissociated molecular and cellular mechanisms regulate muscle stem cell fate. Indeed, skeletal muscle regeneration requires the interaction between myogenic cells and other cell types, among which the macrophages. Macrophages infiltrate the muscle and adopt distinct and sequential phenotypes. They act on the sequential phases of muscle regeneration and resolving the inflammation by skewing their inflammatory profile to an anti-inflammatory state. Some in vitro studies suggested a role for the metabolism and the AMP-activated protein Kinase (AMPK), the master metabolic regulator of cells, in both inflammation and stem cell fate. Thus, I investigated the role of metabolism on muscle stem cell fate within the muscle stem cells (cell autonomous regulations) and through the action of macrophages (non-cell autonomous regulations) during skeletal muscle regeneration. To analyze muscle stem cell fate, I used in vitro (macrophages and muscle stem cell primary cultures), ex vivo (isolated myofibers) and in vivo (using specific mice model deleted specifically for AMPK1 in the myeloid lineage, in muscle stem cells or in myofibers) experiments. First, I highlighted that macrophagic AMPK1is required for the resolution of inflammation during skeletal muscle regeneration and for the trophic functions of macrophages on muscle stem cell fate. Moreover, CAMKK-AMPK1 activation regulates phagocytosis, which is the main cellular mechanism inducing macrophage skewing. This work was published in 2013 in Cell Metabolism. Second, I demonstrated that depletion of myogenic AMPK1 tailors muscle stem cell metabolism in a LKB1 independent manner, orients their fate to the self-renewal by promoting metabolic switch from an oxidative to a glycolytic metabolism pathway, through the over activation of a new molecular target, which is a key enzyme for glycolysis: the Lactate Dehydrogenase. To conclude, during my thesis, I established two new crucial roles of AMPK1 in muscle stem cell fate choice, linking for the first time metabolism, inflammation and fate choice.

Le cancer épithélial de l’ovaire (EOC) a la particularité d’être diagnostiqué à un stade avancé chez 75% des patientes et de récidiver dans un grand nombre de cas malgré une bonne réponse initiale à la chimiothérapie, expliquant ainsi son pronostic sombre. Le rôle du microenvironnement tumoral semble être de premier plan dans le développement et la survie des cellules cancéreuses mais il existe encore peu de données concernant les cellules mésenchymateuses souches (MSC). Dans ce travail nous avons donc cherché à déterminer les mécanismes moléculaires entre les MSC et les cellules tumorales ovariennes. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence l’émergence d’un profile pro-métastatique des cellules tumorales ovariennes après contact avec les MSC. Nous avons ensuite développé un modèle d’infiltration tumorale 3D révélant que les MSC augmentaient la dissémination tumorale ovarienne par la sécrétion d’IL6. Enfin nous avons démontré que les MSC étaient capables d’induire chez les cellules tumorales ovariennes un phénotype thermotolérant lié à la sécrétion CXCL12. Ces données vont donc toutes dans le même sens en démontrant les propriétés pro-tumorales des MSC et ouvrent de nouvelles perspectives de thérapies ciblant les interactions entre le stroma et la tumeur. / Patients with epithelial ovarian cancer (EOC) are diagnosed with advanced stage in 75% of cases and most of them will relapse despite a good primary response to chemotherapy, thus explaining the bad prognosis of EOC. While tumor microenvironment seems to play an important role for the development and survival of cancer cells, there is only few data regarding the mesenchymal stem cells (MSC) in EOC. In this work we therefore aimed at identifying the molecular determinant between MSC and ovarian cancer cells. In the first part of this work, we demonstrated that ovarian cancer cells acquired pro-metastatic profile upon contact with MSC. We then showed that MSC could enhance ovarian cancer cells infiltration through IL6 secretion in an amniochorionic membrane based 3D model. Finally we showed that MSC could protect ovarian cancer cells from hyperthermia through CXCL12 secretion. Taken together, our data are concordant to reveal the pro-tumoral properties of MSC. Cytokine inhibitors interrupting the cross-talk between OCC and MSC should now be tested as new therapies for EOC.

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