La reproduction chez la reine de l’abeille domestique (Apis mellifera L.) se fait par copulation avec plusieurs faux-bourdons (polyandrique) lors d’un vol nuptial à l’extérieur de la colonie. Des problèmes de fertilité des reines abeilles sont rapportés et une défaillance de la production et la qualité du sperme des faux-bourdons est mise en cause. Ce projet vise à évaluer l’influence de la lignée génétique, de l’âge du faux-bourdon ainsi que du moment dans la saison sur la production et la qualité du sperme des faux-bourdons dans les colonies d’abeilles du Québec. Les résultats montrent que l’âge et le moment dans la saison influencent la maturité et la production de sperme. Une meilleure compréhension des facteurs influençant l’élevage des faux-bourdons au sein de la colonie d’abeille permettra d’optimiser la fécondation des reines en maximisant la qualité des mâles produits. / Honeybee (Apis mellifera L.) reproduction is polyandrous: the queen obtains millions of sperm by mating with several drones outside the colony. Since queen fertility problems have been reported, it is important to investigate the variations that exist in drone semen production and quality. The main objective of this project was to assess the influence of breeding line, drone age and breeding timing in the season on semen production and quality. Results showed that drone age and breeding timing are the most influential factors. A better understanding of factors influencing drone rearing within a honeybee colony will ensure optimum honeybee queen mating by maximising the quality of males.

Les techniques d'assistance médicale à la procréation particulièrement l'induction de l'ovulation, la maturation in vitro des ovocytes et la culture embryonnaire prolongée impliquent la manipulation des gamètes ainsi que les embryons à des moments critiques de leur maturation et développement qui sont également des étapes clé du remodelage épigénétique. Par conséquent, elles pourraient interférer avec la reprogrammation épigénétique, en particulier la mise en place de la méthylation des gènes soumis a empreinte au cours de l'ovogenèse, ou son maintien au cours du développement préimplantatoire. Afin d'évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l'expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l'ovocyte du stade VG au stade MII, in vivo et in vitro et que l'induction ovarienne des patientes génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l'étude de la méthylation de H19 DMR qui régule l'expression d'Igf2 et H19 dans des embryons d'ICSI, atypiques bloqués en culture prolongée et dans les spermes correspondants met en évidence une hypométhylation de l'allèle paternel et une méthylation de l'allèle maternel dans certains embryons, sans que l'on puisse établir de lien entre les dérégulations de l'empreinte et l'arrêt du développement au stade blastocyste.

Au cours des dernières décennies, un contexte alarmant de déclin des paramètres du sperme etd’accroissement constant des pathologies génitales masculines a été décrit dans de nombreuxpays industrialisés.Notre travail évalue dans un premier temps l’évolution des paramètres spermatiques chez11 330 hommes ayant consulté pour infertilité conjugale au Centre de ProcréationMédicalement Assistée du CHU de Marseille entre 1988 et 2007. Les données ont étérecueillies de manière rétrospective et analysées par régression linéaire multi-variée afin detenir compte de l’effet lié à l’âge. Nous montrons une diminution significative des principauxparamètres du sperme: concentration en spermatozoïdes (-1.4% par an), numération totale enspermatozoïdes (-1.5% par an), mobilité progressive rapide (-5.6% par an) et morphologienormale (-1.9% par an). Les possibles biais de selection ont été discutés. L’effet del’environnement sur notre fonction de reproduction est l’une des hypothèses principalesévoquées pour expliquer ce phénomène.Nous montrons ensuite comment un modèle de culture de tubes séminifères de rat en chambrebicamérale, couplé à des techniques d’étude de la méiose en immunocytochimie peut êtreutilisé comme nouvel outil de reprotoxicologie. Nous décrivons tout d’abord avec l’anticorpsanti-SCP3 la prophase de première division méiotique chez le rat in-vivo et nous validons lemodèle de culture par comparaison entre les résultats des cellules obtenues in vivo et ceux descellules obtenues ex-vivo. Nous montrons ensuite grâce à ce système l’impact du ChromeHexavalent et du Cadmium sur la méiose du rat. Ces 2 métaux lourds, largement présent dansnotre environnement, peuvent être responsables d’atteintes importantes des cellulesméiotiques, y compris à de faibles doses pouvant correspondre à celles retrouvées chez desindividus exposés dans leur vie quotidienne et/ou professionnelle. / In recent decades, an alarming decline of sperm parameters and a constant increase in malegenital diseases has been described in many industrialized countries.In a first time, our study evaluates the evolution of sperm parameters in 11 330 menconsulting for infertility of their couple in the Reproduction Biology Laboratory of anUniversity Hospital in Marseilles between 1988 and 2007. Data were collected retrospectivelyand analyzed by multivariate linear regression to take into account the effect related to age.We show a significant decrease of the main sperm parameters: sperm concentration (-1.4%per year), total sperm count (-1.5% per year), rapid progressive motility (-5.6% per year) andnormal morphology (-1.9 % per year). Possible selection bias were discussed. The effect ofenvironment on our reproductive function is one of the main hypothesis to explain thisphenomenon.Secondly, we show how a rat seminiferous tubule culture in a bicameral chamber system,coupled with study of meiosis by immunocytochemistry can be used as a new tool ofreprotoxicology. We first describe with an anti-SCP3 antibody the first prophase of ratmeiosis and we validate the model of culture by comparing the results obtained on cellsobtained after in vivo spermatogenesis and those of cells obtained ex-vivo. Then, we showusing this system, the impact of hexavalent chromium and cadmium on rat meiosis. These twoheavy metals, widely present in our environment, may cause substantial impairment ofmeiotic cells, including low doses which can fit with those found in individuals exposed intheir personnal life and / or occupational training.

Cette thèse présente une étude du métabolisme énergétique du spermatozoïde d’huître creuse, Crassostrea gigas. Les principaux objectifs sont (1) d’établir la dynamique des caractéristiques cellulaires et biochimiques du spermatozoïde de cette espèce durant la phase de mouvement, (2) d’identifier les voies de synthèse d’ATP et leurs substrats et (3) de déterminer l’implication du métabolisme énergétique dans le succès à la fécondation du spermatozoïde de cette espèce. Les résultats de ce travail montrent la longue durée du mouvement (de 24 à 72h) du spermatozoïde d’huître creuse et le maintien d’une concentration élevée en ATP intracellulaire, jusqu'à la fin du mouvement. Le rôle de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) dans la synthèse d’ATP a été mis en évidence. Le spermatozoïde d’huître creuse montre une grande plasticité dans l’utilisation de ses voies de production d’énergie, assurant la synthèse d’ATP par d’autres voies qu’OXPHOS lorsque la mitochondrie est inhibée. L’accumulation de phosphoarginine en fin de mouvement montre une capacité de stockage de l’ATP synthétisé. La nature des substrats endogènes utilisés pour la synthèse d’ATP reste cependant à déterminer. La forte capacité de régulation du métabolisme énergétique du spermatozoïde d’huître creuse, associée à la possibilité de synthétiser de l’énergie au cours de sa longue phase de nage, contribuent probablement au succès du peuplement observé chez cette espèce. Ce travail apporte une première description du métabolisme énergétique du spermatozoïde d’huître creuse, améliorant la connaissance fine de cette cellule. / The present study aims at describing the energy metabolism of Pacific oyster, Crassostrea gigas, spermatozoon. The main objectives are: (1) describing the kinetic of cellular and biochemical characteristics of Pacific oyster spermatozoon during its movement phase, (2) identifying the metabolic pathways to produce energy and their substrates, (3) determining the involvement of energy metabolism in fertilization success. The results showed the long duration (ranging 24 to 72h) of the movement of Pacific oyster spermatozoon and the maintenance of a high intracellular ATP content until the end of the movement phase. The role of oxidative phosphorylation (OXPHOS) in ATP production was highlighted. Alternative ATP producing pathways might contribute to sustain energy production when OXPHOS is impaired, showing the high adaptation capacity of Pacific oyster spermatozoa. An increase of phosphoarginine content observed at the end of the movement phase suggests energy storage capacity. Endogenous substrates involved in ATP synthesis must be determined. Both the high regulation capacity of the energy metabolism of Pacific oyster spermatozoa and their ability to restore energy stores catabolized during movement likely contribute to the successful settlement observed in the wild. In conclusion, this work provided a fine description of energetic metabolism of Pacific oyster spermatozoon.

Aujourd’hui, plus de 80% des nouvelles infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) se produisent au cours d’un rapport sexuel, avec une transmission du virus par voie muqueuse. Le sperme constitue donc une source majeure de virus à l’échelle mondiale. Le sperme d’hommes infectés par le VIH contient le virus sous deux formes : des particules virales libres et des cellules infectées, principalement des leucocytes.Plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’expliquer le passage du virus à travers la barrière muqueuse, qu’il s’agisse d’une muqueuse génitale (cervico-vaginale, pénienne ou urétrale) ou intestinale (muqueuse anale ou rectale). Toutefois, une grande majorité des études qui ont été menées jusqu’à présent se sont concentrées sur le rôle des particules virales libres, et celui des cellules infectées demeure mal compris. Une étude menée dans notre laboratoire a montré que des leucocytes infectés par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS) sont capables de transmettre l’infection après inoculation vaginale.Le projet de cette thèse est d’étudier le rôle des leucocytes infectés présents dans le sperme de macaque dans la transmission muqueuse du VIS/VIH. Ainsi, trois axes d’étude principaux ont été définis: 1) l’étude des leucocytes présents dans le sperme de macaque cynomolgus, et de l’influence que peut avoir l’infection par le VIS sur eux ; 2) l’identification des cellules immunitaires infectées présentes dans le sperme de macaque, et l’étude de leur dynamique au cours de l’infection par le VIS. ; 3) l’étude du pouvoir infectieux des deux principales cellules cibles pour le VIS/VIH : les lymphocytes CD4+ (LT CD4+) et les macrophages, in vitro et in vivo, après inoculation rectale et vaginale à des macaques cynomolgus.Le sperme de macaque contient toutes les cellules cibles du VIS/VIH : des lymphocytes T CD4+ (LTCD4+), des macrophages et des cellules dendritiques dans une moindre proportion). Les LTCD4+ et les macrophages du sperme présentent un phénotype d’activation, de différenciation et d’expression de marqueurs de migration typique des leucocytes résidant dans les tissus muqueux. L’infection par le VIS induit des changements significatifs dans leur phénotype et leur dynamique. Ces deux types cellulaires peuvent être infectés de façon productive et sont présents dans le sperme à tous les stades de l’infection. Ces données suggèrent que les LTCD4+ et les macrophages du sperme seraient capables de transmettre l’infection par voie muqueuse.Si le rôle des leucocytes infectés du sperme est confirmé in vivo, il sera important à l’avenir de prendre en compte ce mécanisme de transmission dans le développement de nouvelles stratégies préventives de l’infection par le VIH, notamment les microbicides. / Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection mostly spreads by the mucosal route: sexual transmission is the dominant mode of transmission, responsible for between 85% and 90% of cases of infection worldwide. These epidemiological data indicate that semen is one of the major sources of HIV-1 transmission. Semen, like other bodily secretions involved in HIV sexual transmission, contains the virus as two forms: cell-free viral particles and cell-associated virus, mostly in infected leukocytes. Although cell-to-cell HIV transmission has been extensively described as more efficient, rapid and resistant to host immune responses, very few studies have investigated the role in vivo of infected leukocytes in virus mucosal transmission. One such study has been recently conducted in our lab, and demonstrated that SIV-infected splenocytes are able to transmit infection to female macaques after vaginal exposure. However, all these studies used immune cells from peripheral blood or lymphoid tissues, such as spleen, and none have investigated the capacity of infected leukocytes in semen to transmit the infection in vivo. Indeed, nature, phenotype and infectivity of HIV associated with semen leukocytes may be different from that of HIV from other sources.Therefore, the objectives of this work are, first, to study of semen leukocytes and their dynamics during SIVmac251 infection in detail, then to investigate seminal factors that may influence semen infectiousness, and finally to test semen leukocyte infectivity in vitro and in vivo, using a model of mucosal exposure in cynomolgus macaques.Macaque semen contains all the target cells for HIV/SIV: CD4+ T cells, macrophages and dendritic cells in lower proportions. Semen CD4+ T cells and macrophages display an activation, differenciation and expression of migration markers profile which is typical of mucosal leucocytes. SIV infection induces significant changes in their phenotype and dynamics. Both cell types can be productively infected and are found in the semen at all stages of infection. These observations suggest that semen CD4+ T cells and macrophages may be able to transmit infection after mucosal exposure.If the role of semen infected leukocytes in HIV/SIV mucosal transmission is confirmed in vivo, this mechanism will be important to consider for further preventive strategies design, like microbicides.

Le présent travail avait pour but principal de déterminer si l'enrichissement de la l'alimentation avec des acides gras oméga-3 (AGPI n-3), présents en quantités importantes dans les huiles de poisson, modifie le profil lipidique du sang et des spermatozoïdes tout en améliorant les performances de production des verrats, la qualité du sperme et ses propriétés de conservation; ces effets dépendraient aussi du statut en biotine, une vitamine impliquée dans l'élongation des acides gras. Un autre aspect de ce travail a été d'établir si un apport important d'acides gras n-3 pendant une longue période pouvait modifier le métabolisme post-prandial de l'insuline. Au cours d'une première expérience, 64 verrats ont reçu pendant 28 semaines une alimentation de base supplémentée avec l'un des 4 traitements suivants: 1) 62 g de gras animal hydrogéné (AF); 2) 60 g d'huile de menhaden (MO); 3) 60 g d'huile de thon (TO); 4) 60 g d'huile de menhaden et 2 ppm de biotine (MO+B). Outre les données quantitatives et qualitatives, des échantillons de sang et de semence ont été récoltés afin d'évaluer la composition en acides gras et en certaines vitamines. Une seconde expérience visait à évaluer, dans des conditions dites « commerciales », les performances de production de 222 verrats recevant pendant six mois l'un des traitements alimentaires suivants : AF, MO ou TO. À l'issue de ces expériences, une évaluation de la qualité de la semence, après conservation à 17°C pendant plusieurs jours et congélation en paillettes de 0,5 ml, a été effectuée, ainsi qu'un test oral de tolérance au glucose. L'ajout d'huiles de poisson à la ration alimentaire des animaux a modifié efficacement la composition en acides gras du plasma sanguin et des spermatozoïdes, ceci indépendamment du type d'huile de poisson utilisée (MO ou TO) ou du statut en biotine. En revanche, cet apport alimentaire en AGPI n-3 n'a donné aucun effet sur la libido, les caractéristiques quantitatives ou qualitatives de l'éjaculat, la résistance des spermatozoïdes à la conservation ou le métabolisme de l'insuline. / The aim of the present work was to determine if a dietary supplementation of fish oils (rich in long chain omega-3 fatty acids, n-3 PUFA) alters the profile of fatty acids in blood plasma and spermatozoa and improves reproductive performances of boar, semen quality and its properties for conservation. Those effects are dependent upon biotin status, this vitamin being a critical factor in the elongation of long-chain fatty acids. Another aspect of this study was to evaluate the influence of n-3 PUFA on post-prandial insulin metabolism. For Experiment 1, 64 boars were fed a basal diet at 2.5 kg/day top dressed with 0.3 kg/day of one of the following treatment mixtures: 1) 62 g of hydrogenated animal fat (AF); 2) 60 g of menhaden oil (MO); 60 g of tuna oil (TO); 4) 60 g of menhaden oil and with 2 ppm of biotin (MO+B). All diets were isoenergetics. For this experiment, semen production and quality were measured. Blood and spermatozoa samples were also collected to measure composition of fatty acid and of some vitamins. In Experiment 2, 222 animals raised in "commercial conditions" were fed one of the 3 treatments (AF, MO or TO) during six months. Furthermore, an evaluation of sperm quality during storage at 17°C and cryopreservation was also performed. The addition of fish oils to boar diet had an effect on the composition of fatty acid in blood plasma and sperm. This effect was affected by the fish oil type (MO or TO) and the biotin status (MO or MO+B). Dietary supplementation with n-3 PUFA did not have any effect on sexual behaviour, quantitative and qualitative characteristics of the boar semen, and sperm capacity to conservation as well as insulin secretion/sensitivity.

Les rapports sexuels non protégés (RSNP) sont un facteur de risque prédominant pour l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et doivent donc être évalués de la façon la plus valide possible dans le cadre des études de prévention du VIH. À ce jour, le questionnaire demeure l’outil le plus utilisé pour documenter les comportements sexuels. Or, l’auto-rapportage des comportements sexuels est sujet à des biais de rappel et de désirabilité sociale. L’usage de biomarqueurs de l’exposition au sperme pourrait aider à pallier ces biais. L’antigène prostatique spécifique (PSA) et l’ADN chromosomique Y (ADNch-Y) sont les deux biomarqueurs de l’exposition au sperme les mieux caractérisés à ce jour. La PSA et l’ADNch-Y sont détectables jusqu’à respectivement deux et 14 jours suivant un RSNP. Dans le cadre d’une étude prospective de démonstration visant à vérifier la faisabilité d’implanter le traitement précoce comme prévention (early antiretroviral therapy : E-ART) et la prophylaxie pré-exposition (pre-exposure prophylaxis : PrEP) chez les travailleuses du sexe (TS) professionnelles de Cotonou au Bénin, le sous-rapportage des RSNP était anticipé de la part des participantes, de même qu’un potentiel changement dans les RSNP en cours de suivi dans le groupe PrEP. Nos objectifs étaient donc de valider l’autorapportage des RSNP à l’aide de la PSA et de l’ADNch-Y; de comparer le sous-rapportage des RSNP sur les périodes de rappel de deux et 14 jours; et d’évaluer les tendances de RSNP dans le groupe PrEP. Nous avions aussi pour objectif de comparer la capacité de détection des RSNP d’un nouveau test de détection, soit une PCR nichée ciblant la famille de gènes homologues testis-specific protein Y-encoded (n-TSPY), à celle de six autres méthodes couramment utilisées à des fins de détection de l’exposition récente au sperme. Au recrutement de l’étude E-ART/PrEP et sur une période de 24 mois de suivi, les RSNP survenus dans les deux et 14 derniers jours ont été évalués à chaque six mois par questionnaire et par détection de la PSA et de l’ADNch-Y. Lorsqu’une participante ne rapportait pas de RSNP dans les deux (ou 14) derniers jours, mais qu’elle était testée positive pour la PSA (ou l’ADNch-Y), elle était considérée comme ayant sous-rapporté les RSNP des deux (ou 14) derniers jours. Une régression de Poisson robuste a été utilisée pour comparer le sous-rapportage sur les deux périodes de rappel. Les tendances de RSNP en fonction des différentes mesures de RSNP ont été évaluées à l’aide d’une régression log-binomiale. Des équations d’estimation généralisée (Generalized estimating equation : GEE) ont été appliquées pour tenir compte de la dépendance des observations. Au recrutement, nous avons observé une prévalence d’environ 20% de sous-rapportage des RSNP chez les TS de Cotonou, mais aucune différence statistiquement significative du sous-rapportage des RSNP entre les deux périodes de rappel. Certains de nos résultats suggèrent que les performances relatives de chacun des biomarqueurs pour détecter les RSNP sur sa période de rappel respective ne sont pas équivalentes, ce qui pourrait avoir compromis notre capacité à détecter une différence de sous-rapportage entre les deux périodes de rappel. Aucun changement statistiquement significatif n’a été observé dans les RSNP en cours de suivi dans le groupe PrEP. Enfin, en comparaison avec la PCR n-TSPY développée pour l’étude E-ART/PrEP, chacune des six méthodes courantes de détection de l’exposition récente au sperme manquait de sensibilité pour détecter les RSNP. En conclusion, les données auto-rapportées sur les RSNP sont biaisées et devraient donc être interprétées avec précaution. Une meilleure caractérisation de la cinétique de clairance de la PSA et de l’ADNch-Y est requise afin de mieux évaluer l’effet de la durée de la période de rappel sur le sous-rapportage des RSNP. L’absence de changement dans les RSNP en cours de suivi suggère que la PrEP pourrait potentiellement être utilisée comme méthode de prévention du VIH chez des TS sans craindre une compensation de risque par diminution de l’utilisation du condom. Nos analyses de tendances de RSNP suggèrent aussi la nécessité d’évaluer objectivement les RSNP par l’utilisation de biomarqueurs et de corriger pour les biais de sélection potentiels lors de l’évaluation des tendances de RSNP dans une étude longitudinale avec forte attrition. Enfin la PCR n-TSPY pourrait être d’une grande utilité pour détecter les RSNP dans des études observationnelles où plusieurs facteurs peuvent accélérer la clairance des biomarqueurs. / Unprotected sex (UPS) is a major risk factor for human immunodeficiency virus (HIV) infection and must be measured as validly as possible in HIV prevention studies. To date, the questionnaire is the most commonly used tool to assess sexual behaviours. However, self-report of sexual behaviours is subject to recall and desirability biases. The use of biomarkers of recent semen exposure might help to overcome these biases. Prostatespecific antigen (PSA) and Y chromosomal DNA (Yc-DNA) are the most characterized biomarkers of semen exposure. PSA and Yc-DNA can be detected up to two and 14 days following UPS. Over the course of an early antiretroviral therapy (E-ART) and pre-exposure prophylaxis (PrEP) demonstration study that was conducted among professional female sex workers (FSW) in Cotonou, Benin, under-reporting of UPS was expected, as well as a change in UPS in the PrEP group. Our objectives were thus to validate self-report of UPS by the means of PSA and Yc-DNA detection; to compare under-reporting of UPS over the last two and 14 days; and to assess trends in UPS in the PrEP group. We also aimed to compare the UPS detection capability of a novel screening test of Yc-DNA, a nested polymerase chain reaction targeting the testis-specific protein Y-encoded family of homologous genes (n-TSPY), to six other commonly used methods to detect recent semen exposure. At baseline of the E-ART/PrEP study and over a 24 months period of follow-up, UPS from the last two and 14 days were assessed every six months by questionnaire and by PSA and Yc-DNA screening. Under-reporting of UPS in the last two or 14 days was defined as reporting no UPS in the last two or 14 days while testing positive for PSA or Yc-DNA, respectively. A robust Poisson regression was used to compare under-reporting over the last two and 14 days. Trends in UPS as measured with the different tools were assessed by the means of a log-binomial regression. Generalized estimating equations (GEE) were used to account for dependence between observations. At baseline, we observed about 20% of under-reporting of UPS among FSW from Cotonou. However, we observed no statistically significant difference between under-reporting in the last two days and under-reporting in the last 14 days. Some of our results suggest that the relative performances of each biomarker to detect UPS over its corresponding recall period are not equal, which might have prevented us to detect a difference in under-reporting over the two recall periods. No trend in UPS was observed in the PrEP group. Finally, using n-TSPY as a reference test, each of six commonly used methods to detect recent semen exposure lacked sensitivity in the detection of RSNP. In conclusion, self-report of UPS is biased and must be cautiously interpreted. A better characterization of the clearance of PSA and Yc-DNA is required in order to better evaluate the potential effect of the recall period length on under-reporting of UPS. The absence of any evidence of a trend in UPS in the PrEP group might suggests that there was no risk compensation over the PrEP demonstration study and that PrEP might be a suitable HIV prevention method to use among FSW. Our trends in UPS analyses also pointed out the necessity to objectively assess UPS by the means of biomarkers and to correct for the potential selection bias when assessing trends in UPS over the course of a longitudinal study with high attrition. Finally, the n-TSPY might be of great utility to detect UPS in observational studies where many factors might accelerate the clearance of the biomarkers.

Les techniques d’assistance médicale à la procréation particulièrement l’induction de l’ovulation, la maturation in vitro des ovocytes et la culture embryonnaire prolongée impliquent la manipulation des gamètes ainsi que les embryons à des moments critiques de leur maturation et développement qui sont également des étapes clé du remodelage épigénétique. Par conséquent, elles pourraient interférer avec la reprogrammation épigénétique, en particulier la mise en place de la méthylation des gènes soumis a empreinte au cours de l'ovogenèse, ou son maintien au cours du développement préimplantatoire. Afin d’évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l’expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l’ovocyte du stade VG au stade MII, in vivo et in vitro et que l’induction ovarienne des patientes génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l’étude de la méthylation de H19 DMR qui régule l’expression d’Igf2 et H19 dans des embryons d’ICSI, atypiques bloqués en culture prolongée et dans les spermes correspondants met en évidence une hypométhylation de l'allèle paternel et une méthylation de l'allèle maternel dans certains embryons, sans que l'on puisse établir de lien entre les dérégulations de l’empreinte et l’arrêt du développement au stade blastocyste. / Assisted reproductive technologies particularly the induction of ovulation, oocytes in vitro maturation, and prolonged embryo culture require in vitro manipulation of gamete and embryos at critical times of their maturation and development. In consequence, they may interfere with epigenetic reprogramming and affect particularly demethylation and remethylation of imprinted genes. To evaluate such a risk, we have determined the methylation profile of KvDMR1, the region that regulates KCNQ1OT1 imprinted gene, in human oocytes retrieved from stimulated or unstimulated cycles, at different phases of their maturation in vivo or in vitro. Our results show that the timing of establishment of the methylation profile of KvDMR1 covers the maturation phase of oocyte growth, in vivo and in vitro, and that hyperstimulation likely recruits young follicles epigenetically immature. Analysis of the methylation profile of H19DMR (DMR of IGF2/H19) in atypical ICSI embryos and corresponding sperm suggests that imprinting disorders are not responsible of embryo developmental failure prior the blastocyst stage.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre du projet CRB-Anim (Centre de Ressources Biologiques d’Animaux Domestiques) dont le but est de constituer une cryobanque nationale et d’améliorer les techniques de cryoconservation. Aujourd’hui, les ressources biologiques de type reproductif (embryons, sperme, ovocytes) et de type somatique (fibroblastes et cellules souches pluripotentes) sont conservées dans des milieux contenant des produits d’origine animale (POA). L’utilisation actuelle des POA (sérums, lait, jaune d’œuf) pose des problématiques sanitaires (risque de contamination) et scientifiques (manque de reproductibilité liée à la variabilité de composition des POA). Cette étude a pour objectif d’évaluer l’effet d’un milieu de préservation synthétique, chimiquement défini, breveté pour la congélation de cellules de sang de cordon (STEMALPHA.CRYO3) sur la cryoconservation de sperme ovin et bovin, et de cellules souches pluripotentes de lapin. Pour cela, une approche biologique (étude in vitro et in vivo sur le terrain), alliée à une approche physique (étude des cinétiques de refroidissement et caractérisation des propriétés thermodynamiques des milieux de congélation) ont été mis en place.Nos résultats montrent l’intérêt de l’utilisation du STEMALPHA.CRYO3, en tant que substituant aux sérums, dans les solutions de cryoconservation des cellules souches pluripotentes. Néanmoins, notre étude indique que ce produit n’est pas efficace pour protéger le sperme lors de la congélation. Cette thèse confirme l’intérêt de standardiser les procédures de cryoconservation afin d’assurer la qualité des ressources biologiques pour les cryobanques et les échanges internationaux / Nowadays, reproductive (embryos, sperm, oocytes) and somatic (fibroblasts and pluripotent stem cells) resources are cryopreserved in media containing animal-derived products (serum, egg yolk, milk). Using these products raises sanitary (risk of contamination) as well as scientific concerns (reproducibility limits due to the variability of their composition). This study aims to replace animal derived-product in assessing the effect of a synthetic and chemically defined medium, STEMALPHA.CRY03® (Stem Alpha, France), on the cryopreservation of ovine and bovine sperm, and on rabbit pluripotent stem cells. First, a physical approach permitted to study the cooling rates and the characterization of thermodynamic properties of the freezing media. The differential scanning calorimetry allowed us to define their phase transition temperatures (crystallization temperature, melting temperature and enthalpy variation of crystallization, proportional to the amount of crystallized ice). Second, a biological approach was used for the cryopreservation of bovine and ovine sperm, as well as rabbit pluripotent stem cells. Flow cytometry and computer- assisted sperm analyses showed that STEMALPHA.CRY03® impaired bovine sperm, compared to a medium containing animal derived-product. These last results were confirmed in ovine species. Nevertheless, artificial insemination by laparoscopy (n = 270 ewes) counteracts this impairment and allowed an average pregnancy rate of 70 %. Moreover, without any additive in the freezing medium, a similar pregnancy rate was obtained. The study of pluripotent gene expression profile, and analyses of viability and growth rates for the cryopreservation of rabbit pluripotent stem cells confirmed that synthetic media, STEMALPHA.CRY03® (with 4, 5 or 10 % of cryoprotectant) and CryoStor® CS10 (containing 10 % of cryoprotectant) were more efficient than serum-based media. We demonstrate that it is possible to cryopreserve sperm cells and pluripotent stem cells in synthetic and chemically defined media. 0ur results confirmed the interest of a standardized approach for cryopreservation procedures of genetic resources in mammals. This work meets the needs of cryobanking activities (quality policy) and of the regulation development within the framework of international trade