The farm, where I have watched ethological behaviour, is next to CHKO Blanský les, near the small town Lhenice. The farm is engaged in breeding of horses. The basic herd is created with warm-blooded mares of Netolice´s breeding. The aim of ethological watching was to recognize basic symptoms of behaviour of horses in their natural conditions during pasture season. These symptoms were watched in the herd of 20 mares (barren, advanced stage of pregnancy and mares with foals) and in the one of 9 stallions and 2 geldings. Everything was conducted during four of 24-hours cycles during pasture season 2008 inside each of the herds. It was recognized, that horses most of their time were accepting their fodder. The time of feeding depended on quality of the pasture fodder and at the temperature of the air. Mares spent the longest time with feeding. It was 63.84 % of the day. The stallions spent with feeding 58.90 % of the day. At the end of their pasture season in September, but it is quite normal, because the quality of pasture is during the second part of pasture season much worse. The rest, as laying and standing depended on the time, that was needed for satisfying with pasture. The longest time for have a rest was watched during the month of Juni {--} 42.50 % of the day and 46.47 % of the day during August, when the parture was the richest and temperature the highest. Moving activity was much better inside the stallion´s herd. The conflict behaviour was the same inside the both of herds and aggressive behaviour was watched during the social fighting for relationships inside both of herds.

This thesis is dealing with evaluation of a Czech Warmblood mare performance test system. Mare performance tests have become an important measure in the Czech Warmblood breed and most newly registered mares undergo them. The mare performance test does not only indicate the mare{\crq}s own disposition but it is also a valuable source of information on the sires of the mares taking part. The main reason for mare performance testing is to obtain a performance record to use as a tool in making breeding decisions. Within the tests the best sire of the mares are evaluated. This thesis examines the system of mare performance tests and compares it with systems of organizing mare performance tests in other European countries. In the conclusion all the achieved results are assessed and discussed.

Dois experimentos foram conduzidos para verificar a viabilidade do uso do leite UHT como diluente para sêmen equino refrigerado. O objetivo principal deste estudo foi avaliar o uso de leite UHT nas apresentações desnatado, semidesnatado e integral como diluente de sêmen e posteriormente foi avaliada a viabilidade espermática com o uso de leite como diluente comparado a outros dois diluentes industrializados. No experimento I foram utilizados 31 ejaculados de 3 garanhões, as amostras de cada ejaculado foram diluídas em leite UHT nas apresentações integral, semidesnatado e desnatado, numa proporção de 3:1 (3 ml de diluente e 1ml de sêmen). Foram realizadas análises de viabilidade espermática com testes de motilidade espermática, vigor espermático, integridade de membrana (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana espermática (HOST) pós-diluição, os quais foram repetidos nas amostras refrigeradas a 4ºC após 24 e 48h. Neste experimento, não foram observadas diferenças significativas entre os 3 diluentes, quanto a motilidade espermática, vigor, CFDA/PI e HOST. No entanto, houve uma diminuição na qualidade do sêmen armazenado por 48h (P < 0,01), sendo mais acentuada entre 24 e 48h de refrigeração. No experimento II foram utilizados 30 ejaculados de 3 garanhões onde, logo após a coleta do sêmen, as amostras de cada ejaculado foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSP). As amostras foram examinadas a fresco, após a diluição (0h) e em resfriamento de 24h e 48h a 4°C. Foram realizados os mesmos testes de análise espermática do primeiro experimento para avaliação comparativa dos diluentes. As amostras de sêmen refrigeradas com BSP obtiveram maior porcentagem de motilidade total (51,1%) após 24h de refrigeração quando comparado aos outros dois diluentes testados, LD (45,8%) e BS (47,3%). Com base nos resultados obtidos nos dois experimentos, o leite UHT, independente da apresentação, pode ser utilizado como diluente de sêmen para as primeiras 24h de refrigeração, mantendo a viabilidade espermática adequada, sendo também de fácil acesso e manuseio. Se for necessário a manutenção do sêmen por mais de 24h, o BSP se mostrou superior em manter a qualidade do sêmen até 48h. / Two experiments were conducted to verify the feasibility of the use of UHT milk as an extender for chilled equine semen. The main objective of this study was to evaluate the use of UHT milk in skimmed, semi-skimmed and whole milk as extender for semen and subsequently assess sperm viability using milk as a diluent compared to two other industrial extenders. In the first experiment were used 31 ejaculates from 3 stallions of known fertility, samples of each ejaculate were diluted in the whole UHT milk, semi-skimmed milk and skim milk shows a ratio of 3:1 (3ml diluent and 1ml of semen). Sperm viability analyzes were performed, including sperm motility, sperm vigor, membrane integrity (CFDA/PI) functionality and sperm membrane (HOST) post-dilution tests which were repeated in the samples cooled to 4°C after 24 and 48h. In this experiment, no significant differences in sperm motility, vigor, CFDA/IP and HOST were observed among the 3 extenders. However, there was a decrease in the quality of semen stored for 48h (P < 0.01), being more pronounced between 24 and 48h of cooling. In the second experiment, 30 ejaculates from 3 stallions were used soon after collection of semen samples, each ejaculate was diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSP). The samples were analyzed fresh, immediately after the dilution (0h) and after cooling for 24h and 48h at 4°C. The same tests of sperm analysis used in the first experiment for comparative evaluation of extenders were performed. Semen samples cooled with BSP obtained the highest percentage of total motility (51.1%) after 24h of cooling when compared to the two other extenders tested, LD (45.8%) and BS (47.3%). Based on the results from the two experiments, UHT milk, regardless of the presentation, can be used as a diluent of semen during the first 24h of cooling maintaining adequate sperm viability and is easy to access and handle. If maintenance of semen for more than 24h is required, the BSP was superior in maintaining the quality of semen until 48h.

Dois experimentos foram conduzidos para verificar a viabilidade do uso do leite UHT como diluente para sêmen equino refrigerado. O objetivo principal deste estudo foi avaliar o uso de leite UHT nas apresentações desnatado, semidesnatado e integral como diluente de sêmen e posteriormente foi avaliada a viabilidade espermática com o uso de leite como diluente comparado a outros dois diluentes industrializados. No experimento I foram utilizados 31 ejaculados de 3 garanhões, as amostras de cada ejaculado foram diluídas em leite UHT nas apresentações integral, semidesnatado e desnatado, numa proporção de 3:1 (3 ml de diluente e 1ml de sêmen). Foram realizadas análises de viabilidade espermática com testes de motilidade espermática, vigor espermático, integridade de membrana (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana espermática (HOST) pós-diluição, os quais foram repetidos nas amostras refrigeradas a 4ºC após 24 e 48h. Neste experimento, não foram observadas diferenças significativas entre os 3 diluentes, quanto a motilidade espermática, vigor, CFDA/PI e HOST. No entanto, houve uma diminuição na qualidade do sêmen armazenado por 48h (P < 0,01), sendo mais acentuada entre 24 e 48h de refrigeração. No experimento II foram utilizados 30 ejaculados de 3 garanhões onde, logo após a coleta do sêmen, as amostras de cada ejaculado foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSP). As amostras foram examinadas a fresco, após a diluição (0h) e em resfriamento de 24h e 48h a 4°C. Foram realizados os mesmos testes de análise espermática do primeiro experimento para avaliação comparativa dos diluentes. As amostras de sêmen refrigeradas com BSP obtiveram maior porcentagem de motilidade total (51,1%) após 24h de refrigeração quando comparado aos outros dois diluentes testados, LD (45,8%) e BS (47,3%). Com base nos resultados obtidos nos dois experimentos, o leite UHT, independente da apresentação, pode ser utilizado como diluente de sêmen para as primeiras 24h de refrigeração, mantendo a viabilidade espermática adequada, sendo também de fácil acesso e manuseio. Se for necessário a manutenção do sêmen por mais de 24h, o BSP se mostrou superior em manter a qualidade do sêmen até 48h. / Two experiments were conducted to verify the feasibility of the use of UHT milk as an extender for chilled equine semen. The main objective of this study was to evaluate the use of UHT milk in skimmed, semi-skimmed and whole milk as extender for semen and subsequently assess sperm viability using milk as a diluent compared to two other industrial extenders. In the first experiment were used 31 ejaculates from 3 stallions of known fertility, samples of each ejaculate were diluted in the whole UHT milk, semi-skimmed milk and skim milk shows a ratio of 3:1 (3ml diluent and 1ml of semen). Sperm viability analyzes were performed, including sperm motility, sperm vigor, membrane integrity (CFDA/PI) functionality and sperm membrane (HOST) post-dilution tests which were repeated in the samples cooled to 4°C after 24 and 48h. In this experiment, no significant differences in sperm motility, vigor, CFDA/IP and HOST were observed among the 3 extenders. However, there was a decrease in the quality of semen stored for 48h (P < 0.01), being more pronounced between 24 and 48h of cooling. In the second experiment, 30 ejaculates from 3 stallions were used soon after collection of semen samples, each ejaculate was diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSP). The samples were analyzed fresh, immediately after the dilution (0h) and after cooling for 24h and 48h at 4°C. The same tests of sperm analysis used in the first experiment for comparative evaluation of extenders were performed. Semen samples cooled with BSP obtained the highest percentage of total motility (51.1%) after 24h of cooling when compared to the two other extenders tested, LD (45.8%) and BS (47.3%). Based on the results from the two experiments, UHT milk, regardless of the presentation, can be used as a diluent of semen during the first 24h of cooling maintaining adequate sperm viability and is easy to access and handle. If maintenance of semen for more than 24h is required, the BSP was superior in maintaining the quality of semen until 48h.

In dieser Studie wurde der Einfluss von anabol-androgenen Steroiden (AAS) wie Testosteron auf die Angiogenese im peripubertären Hengsthoden untersucht. Sieben von 14 Junghengsten erhielten Durateston® und wurden vier [n=3; Versuchsgruppe 1 (VG1)] bzw. zwölf [n=4; Versuchsgruppe 2 (VG2)] Wochen nach der letzten Applikation kastriert, während die übrigen sieben Tiere ohne eine Behandlung in dem gleichen Zeitraum kastriert wurden. Im Rahmen der morphometrischen Untersuchung konnte ein Anstieg der Volumendichte und der Numerischen Dichte bezüglich der Blutgefäße in der Versuchsgruppe festgestellt werden, während die Fläche der Blutgefäßanschnitte in den Kapillaren der Versuchsgruppe kleiner ist als bei den Tieren in der Kontrollgruppe. Die erhöhte Angiopietin2- und transforming growth factor alpha-Expression in der VG1 könnte möglicherweise für diese morphometrischen Be-funde verantwortlich sein. Die Blutgefäße der Versuchsgruppen zeigen, möglicherweise stimuliert durch Testoste-ron, eine höhere vascular endothelial growth factor-receptor2-Expression als die der Kontrollgruppe. Aufgrund der signifikanten Abnahme der morphometrischen Parameter von der VG1 zu der VG2 handelt es sich vermutlich um einen temporären Effekt.

Em equinos é descrita uma variabilidade na qualidade do sêmen congelado, relacionada principalmente a variações consideráveis na composição da membrana plasmática do espermatozoide. Neste contexto, estudos investigam alternativas para aumentar a fertilidade ao se usar sêmen congelado, e a adição de ácidos graxos polinsaturados ao diluente de congelamento é sugerida. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição de diferentes níveis de ácidos graxos poli-insaturados: ácido eicosanóico e ácido docosahexaenóico, em meio diluente específico para a espécie sobre as características do espermatozoide pós-descongelamento. Foi utilizado sêmen de quatro garanhões (quatro ejaculados por garanhão) da raça Crioula. O sêmen foi diluído em diluente de congelamento comercial a base de gema de ovo, glicerol e dimetilformamida (Botu-Crio©) ajustando a concentração para 200 x 10⁶ espermatozoides viáveis/mL (grupo controle) e, na sequência, os demais tratamentos: adição de ácido docosahexaenóico nas doses 25μm e 50μm /mL e ácido eicosanóico nas doses 25μm e 50μm /mL. Após o descongelamento foram realizadas análises de cinética espermática no sistema de Análise Computadorizada para Avaliação Espermática, das seguintes variáveis: motilidade total, motilidade progressiva, motilidade rápida, motilidade lenta, motilidade local, velocidade de trajeto, velocidade progressiva, velocidade curvilinear, amplitude do deslocamento lateral da cabeça, frequência de batimentos, retilinearidade e linearidade; e avaliação da integridade física através do uso de sondas fluorescentes, e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. Não ouve diferença nas variáveis avaliadas. Este é o primeiro estudo que descreve a adição de ácido eicosanóico ao sêmen equino. Concluí-se a adição de ácido docosahexaenóico e eicosanóico nas concentrações testadas não alterou as variáveis avaliadas no sêmen de garanhões da raça Crioula. / In equines, a variability in the quality of frozen semen is described, mainly related to the considerable variations in the composition of the sperm plasma membrane. In this context, studies investigate alternatives to increase fertility when using frozen semen, and the addition of polyunsaturated fatty acids to the freezing diluent is suggested. The objective of this study was to evaluate the effect of the addition of different levels of polyunsaturated fatty acids: eicosanoic acid and docosahexaenoic acid, in specific diluent medium for the species on the characteristics of the post-thawing spermatozoa. Semen was used of four stallions (four ejaculates per stallion) of the Crioula breed. The semen was diluted in commercial freezing diluent based on egg yolk, glycerol and dimethylformamide (Botu-Crio ©) by adjusting the concentration to 200 x 10 vi viable spermatozoa / mL (control group) and, in sequence, the other treatments: addition of docosahexaenoic acid at 25μm and 50μm / mL and eicosanoic acid at 25μm and 50μm / mL. After thawing, sperm kinetics analyzes were performed in the Computerized Analysis System for Sperm Evaluation, of the following variables: total motility, progressive motility, rapid motility, slow motility, local motility, path velocity, progressive velocity, curvilinear velocity, lateral head displacement amplitude, beating frequency, linearity and linearity; and evaluation of physical integrity through the use of fluorescent probes, and membrane functionality by the hyposmotic test. No difference in the variables evaluated. This is the first study to describe the addition of eicosanoic acid to equine semen. We concluded that with the addition of docosahexaenoic and eicosanoic acid at the concentrations tested did not alter the variables evaluated in the semen of Crioula stallions.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

Em equinos é descrita uma variabilidade na qualidade do sêmen congelado, relacionada principalmente a variações consideráveis na composição da membrana plasmática do espermatozoide. Neste contexto, estudos investigam alternativas para aumentar a fertilidade ao se usar sêmen congelado, e a adição de ácidos graxos polinsaturados ao diluente de congelamento é sugerida. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição de diferentes níveis de ácidos graxos poli-insaturados: ácido eicosanóico e ácido docosahexaenóico, em meio diluente específico para a espécie sobre as características do espermatozoide pós-descongelamento. Foi utilizado sêmen de quatro garanhões (quatro ejaculados por garanhão) da raça Crioula. O sêmen foi diluído em diluente de congelamento comercial a base de gema de ovo, glicerol e dimetilformamida (Botu-Crio©) ajustando a concentração para 200 x 10⁶ espermatozoides viáveis/mL (grupo controle) e, na sequência, os demais tratamentos: adição de ácido docosahexaenóico nas doses 25μm e 50μm /mL e ácido eicosanóico nas doses 25μm e 50μm /mL. Após o descongelamento foram realizadas análises de cinética espermática no sistema de Análise Computadorizada para Avaliação Espermática, das seguintes variáveis: motilidade total, motilidade progressiva, motilidade rápida, motilidade lenta, motilidade local, velocidade de trajeto, velocidade progressiva, velocidade curvilinear, amplitude do deslocamento lateral da cabeça, frequência de batimentos, retilinearidade e linearidade; e avaliação da integridade física através do uso de sondas fluorescentes, e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. Não ouve diferença nas variáveis avaliadas. Este é o primeiro estudo que descreve a adição de ácido eicosanóico ao sêmen equino. Concluí-se a adição de ácido docosahexaenóico e eicosanóico nas concentrações testadas não alterou as variáveis avaliadas no sêmen de garanhões da raça Crioula. / In equines, a variability in the quality of frozen semen is described, mainly related to the considerable variations in the composition of the sperm plasma membrane. In this context, studies investigate alternatives to increase fertility when using frozen semen, and the addition of polyunsaturated fatty acids to the freezing diluent is suggested. The objective of this study was to evaluate the effect of the addition of different levels of polyunsaturated fatty acids: eicosanoic acid and docosahexaenoic acid, in specific diluent medium for the species on the characteristics of the post-thawing spermatozoa. Semen was used of four stallions (four ejaculates per stallion) of the Crioula breed. The semen was diluted in commercial freezing diluent based on egg yolk, glycerol and dimethylformamide (Botu-Crio ©) by adjusting the concentration to 200 x 10 vi viable spermatozoa / mL (control group) and, in sequence, the other treatments: addition of docosahexaenoic acid at 25μm and 50μm / mL and eicosanoic acid at 25μm and 50μm / mL. After thawing, sperm kinetics analyzes were performed in the Computerized Analysis System for Sperm Evaluation, of the following variables: total motility, progressive motility, rapid motility, slow motility, local motility, path velocity, progressive velocity, curvilinear velocity, lateral head displacement amplitude, beating frequency, linearity and linearity; and evaluation of physical integrity through the use of fluorescent probes, and membrane functionality by the hyposmotic test. No difference in the variables evaluated. This is the first study to describe the addition of eicosanoic acid to equine semen. We concluded that with the addition of docosahexaenoic and eicosanoic acid at the concentrations tested did not alter the variables evaluated in the semen of Crioula stallions.