Plasmamembranet är en komplex struktur som består av biomolekyler som lipider, proteiner och glykaner. Membranets rena komplexitet begränsar vår förmåga att förstå den spatiotemporala dynamiken hos sådana komponenter och deras kollektiva biofysiska membranparametrar. En sådan parameter som är svår att studera är asymmetri mellan lagren. Celler investerar mycket energi i den ojämna fördelningen av lipider mellan de inre och yttre lagren under olika cellulära händelser. Kunskapen om sådana parametrar kan vara av stor betydelse för förståelsen av cellers biologi och för att utveckla läkemedel och vacciner. Plasmamembranets tjocklek på 4-6 nm är en stor begränsande faktor eftersom det blir svårt att särskilja skillnaden mellan cytosoliska och exoplasmatiska signaler i plasmamembranet med fluorescent konfokalmikroskopi och superupplösande mikroskopi. I det här projektet använde jag MAP-expansionsmikroskopiprotokollet för att fysiskt öka avståndet mellan cytosoliska och exoplasmatiska lager, tillsammans med tvåfärgsmärkning av båda dessa strukturer för att förbättra deras visualisering. Biomimetiska cellmembranmodeller som Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMVs), användes för att identifiera lämpliga märkningsstrategier. Klickkemibaserad märkningsstrategi valdes för exoplasmatisk märkning av lager och fluorescerande proteinbaserad märkning valdes för cytosolisk märkning av lager. GPMV-modellen användes för att identifiera de membranproteiner som specifikt aggregerar i de vätskestörda regionerna av membranet. MAP-expansionsprotokoll, när det utfördes på både celler och GPMV: er, visade att celler var mer tillförlitliga för expansion eftersom närvaron av cytoskeletts fysikalisk-mekaniska egenskaper som hjälper till med deras deformation. Expansionsfaktorn för MAP-protokollet beräknades till 3,3 med användning av kärnexpansion och en isotrop expansion observerades i densamma. Med denna expansionsfaktor och mer rödfärgsbaserade märkningsstrategier, antar jag att det skulle vara möjligt att visualisera asymmetrin mellan broschyrerna med hjälp av Superupplösande stimulerad emission utarmningsmikroskopi. / The plasma membrane is a complex structure comprised of biomolecules such as lipids, proteins, and glycans. The sheer complexity of the membrane limits our ability to understand the spatiotemporal dynamics of its components and their collective biophysical membrane parameters. One such parameter that is difficult to study is inter-leaflet asymmetry. Cells invest a lot of energy in the inhomogeneous distribution of lipids between the inner and outer leaflets during different cellular events. The knowledge of this parameter could be of great importance for understanding the membrane biology of cells and for designing drugs and vaccines. The 4-6nm thickness of the plasma membrane is a major limiting factor since it becomes difficult to distinguish the difference between the cytosolic and exoplasmic plasma membrane leaflet signals with fluorescence confocal and super-resolution microscopy. In this project, I employed the MAP expansion microscopy protocol to physically increase the distance between the cytosolic and the exoplasmic leaflets, coupled with two-colour labelling of both these structures to improve their visualization. Biomimetic cell membrane models like the Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMVs), were used for identifying suitable labelling strategies. Click chemistry-based labelling strategy was chosen for exoplasmic leaflet labelling and fluorescent protein-based labelling was chosen for cytosolic leaflet labelling. The GPMV model was used to identify that the membrane proteins specifically aggregate in the liquid-disordered regions of the membrane. MAP expansion protocol, when performed on both cells and GPMVs, revealed cells to be more reliable for expansion, since the presence of cytoskeleton conferred physicomechanical properties to cells, aiding in their deformation. The expansion factor of the MAP protocol was calculated to be 3.3 using nuclear expansion and an isotropic expansion was observed in the same. With this expansion factor and more red dye-based labelling strategies, I hypothesize that it would be possible to visualize the inter-leaflet asymmetry using super-resolution Stimulated Emission Depletion microscopy.

The clinical severity of Covid-19 varies greatly between individuals, and all underlying risk factors are not yet well understood. Previous studies have shown Covid patients to be enriched with autoantibodies against type I interferons, suggesting autoimmunity may be an underlying factor of susceptibility to severe disease. In this project, the interplay between severe Covid-19 and autoimmunity was investigated in 114 Swedish patients, sampled in April- May 2020 as well as longitudinal re-samplings 4 and 8 months later, using the infrastructure of the Human Protein Atlas and the SciLife lab autoimmunity and serology profiling unit. First, 16 patients with few comorbidities were analyzed for autoantibodies at a near proteome-wide scale using planar microarrays, after which a custom antigen panel was assembled based on observed reactivities and literature studies. The antigen panel was implemented in a 384-plex suspension bead array which was run for all patient samples and a control group. Among the Covid patients, 23 antigens were called as differentially reactive and 8 of them were proposed as relevant to immunoregulation or Covid pathogenesis. The results partially replicated previous findings of autoimmunity directed to type I interferons and offer a list of candidate autoantigens for further inquiries. / Allvarlighetsgraden av sjukdomen Covid-19 varierar kraftigt mellan individer och alla underliggande riskfaktorer är ännu inte förstådda. Tidigare studier har påvisat Covidpatienter som överrepresenterade med autoantikroppar mot typ I interferoner, vilket förespråkar autoimmunitet som en möjlig underliggande riskfaktor till att utveckla allvarlig Covid. I detta projekt användes infrastrukturen av det mänskliga proteinatlasprojektet och enheten för autoimmunitets- och serologiprofilering på SciLife lab för att undersöka samspelet mellan allvarlig Covid-19 och autoimmunitet i 114 st svenska patienter inlagda under april-maj 2020, samt från uppföljningsprover 4 resp. 8 månader senare. Till en början undersöktes 16 patienter med låg grad av samsjukdom för förekomst av autoan- tikroppar mot proteomet i stort med hjälp av mikroarrayer. En panel av antigen sammanställdes därefter baserat på resultaten och litteraturstudier. Panelen implementerades som en 384-plex kulsuspensionsarray vilken kördes för alla patientprover samt en kontrollgrupp. Ibland Covidpatienterna klassades 23 st antigen som överrepresenterade, varav 8 st avsågs relevanta för immunoreglering eller sjukdomsförlopp. Resultaten visades delvis återskapa tidigare fynd av autoimmunitet riktad mot typ I interferoner och erbjuda en lista av potentiella autoantigen för vidare efterforskningar.

Pancreatic islets are composed of endocrine cells that secrete hormones essential for blood-glucose homeostasis. Prior research has revealed that the gene expression and functionality of human islet cells is heterogenous. However, it is not currently understood how the heterogeneity correlates to normal islet cell function and dysfunction in diabetes pathogenesis. Subsequently, an international collaborative project has been initiated to elucidate what constitutes islet cell heterogeneity from a transcriptional, proteomic, and functional perspective in both health and disease. In this study, a highly multiplex tissue image assay was developed to allow for the study of the localization and distribution of proteins previously identified to correlate with functional activity and heterogeneity in islet cells using the CO-Detection by indEXing (CODEX) platform. In total, 22 proteins were studied simultaneously of which 10 were specifically expressed in islet cells. These included generic pancreatic markers such as C-peptide (C-pep) marking insulin-secreting β-cells, glucagon (GCG) and somatostatin (SST), but also less well-characterized proteins such as Shisa like 2B (FAM159B) and Neural proliferation, differentiation and control 1 (NPDC1). The multiplex tissue imaging allowed for single-cell analysis of protein expression in human islet cells showing that most islet specific proteins were heterogeneously expressed. The observations made in this study serves as a validation to that the human islet microenvironment is highly complex due to islet cell heterogeneity. Additionally, the study demonstrated that multiplex tissue imaging has the potential to reveal novel cell types and interactions. / Langerhanska öar består av endokrina celler som utsöndrar hormoner nödvändiga för reglering av blodsockernivåerna. Tidigare forskning har visat att genuttrycket och funktionaliteten är heterogen i de celler som utgör mänskliga Langerhanska öar. Dock är förståelsen för hur heterogeniteten korrelerar till normal cellfunktion och dysfunktion i diabetespatogenes fortfarande ofullständig. Följaktligen har ett internationellt samarbete inletts i syfte att  undersöka  vad som utgör heterogenitet  i  Langerhanska öar ur ett transkriptionellt, proteomiskt och funktionellt perspektiv i såväl friska som sjuka individer. I denna studie utvecklades en metod för multiplex mikroskopisk avbildning av vävnad för att möjliggöra undersökningen av hur proteiner som tidigare korrelerats med endokrin cellspecifik aktivitet och heterogenitet i Langerhanska öar var lokaliserade med hjälp av plattformen för Co-Detection by indEXing (CODEX). Totalt undersöktes 22 proteiner samtidigt varav 10 var specifikt uttryckta i celler som utgör Langerhanska öar. Bland dessa proteiner fanns generella markörer för vanligt förekommande celltyper i Langerhanska öar såsom C-peptid (C-pep) som markör för insulinsekreterande β-celler, glukagon (GCG) och somatostatin (SST) såväl som proteiner med färre kända funktioner såsom Shisa like B (FAM159B) och Neural proliferation, differentiation and control 1 (NPDC1). Med hjälp av multiplex mikroskopisk avbildning av vävnad kunde uttrycket av proteiner specifikt uttryckta i celler som utgör Langerhanska öar analyseras för enskilda celler i vävnaden. Denna analys visade att de flesta proteiner specifikt uttryckta i celler som Langerhanska öar består av var heterogent uttrycka. Resultaten från denna studie validerar att mikromiljön i Langerhanska öar är mycket komplex på grund av cellernas heterogenitet. Vidare visade denna studie att multiplex mikroskopisk avbildning av vävnad har potentialen att identifiera nya celltyper och interaktioner.

microRNA (miRNA) är korta icke-kodande RNA sekvenser som har fått ökande uppmärksamhet då de kan binda till mRNA och styra vårt genuttryck. Omkring trettio procent av våra proteinkodande gener styrs av miRNA. miRNA binder till mRNA vilket hindrar dess translation eller leder till nedbrytning av mRNA. Studier visar att miRNA är involverade i olika cancersjukdomar där miRNAs kan ha olika roller. De kan antingen hämma cancern (tumörsupressor) eller agera som en onkogen. Idag pågår mycket forskning kring miRNAs påverkan på cancer och hur eventuellt miRNA kan användas som läkemedel i framtiden. Trots pågående forskning saknar vi avgörande insikter om både strukturer och biofysiska egenskaperna hos miRNA: mRNA-interaktionen som bestämmer deras funktionella resultat. Att förstå detta är viktigt för att förstå miRNA fulla terapeutiska potential. För att bidra med kunskap inom detta område var rapportens första fokus att studera bindningen mellan mRNA HNF4α och miRNA-34a med hjälp av en metod som kallas SHAPE MaP. Genom att studera bindningen är det möjligt att få mer kunskap om dess reaktiva områden och därmed öka förståelsen för den inre strukturen. SHAPE MaP är baserad på en metod som utför massiv parallell sekvensering för att identifiera mutationer introducerade med ett SHAPE-reagens. Efter detta utförs kartläggning av dessa mutationer med hjälp av ett datorprogram för att få fram en struktur. Strukturen är avgörande för att förstå de biofysiska egenskaperna såsom stabilitet, vikningsdynamik och interaktioner med andra biomolekyler. Under arbetets gång flyttades fokus till att optimera SHAPE MaP-experimentet. En serie experiment utfördes för att bestämma den optimala tiden mellan transfektion av miRNA och modifiering av SHAPEreagens med qPCR. Detta tydde på att den optimala tiden är 100 minuter, men ytterligare studier behövs dock för validering. Sammanfattningsvis beskriver denna rapport ett optimeringsexperiment för SHAPE MaP-applikationen. / microRNA (miRNA) are short non-coding RNA sequences that are important as they can bind to mRNA and control our gene expression. miRNAs control around thirty percent of our protein-coding genes. They bind to mRNAs and induce cleavage, transcriptional inhibition, or degradation. Studies show that miRNAs are involved in various cancers, where they can have different roles under different conditions. They can either act as a tumor suppressor or act as an oncogene. Today, there is extensive research into the impact of miRNAs on cancer and how miRNAs can potentially be used as drugs in the future. Nevertheless, we lack crucial insights into their intrinsic structural and biophysical properties and interactions with mRNAs that determine their functional outcomes. Addressing this knowledge gap is essential for unlocking their full therapeutic potential. To contribute knowledge in this area, the first focus of this report was studying the binding between the mRNA HNF4α and miRNA-34a using a method called SHAPE MaP. By studying the binding, it is possible to get more knowledge about their reactive sites, and by knowing this, it is possible to investigate the intrinsic structure. SHAPE MaP is based on a method that performs massively parallel sequencing to detect mutations made by a SHAPE reagent. These mutations are then mapped using a computer program to extract a structure. The structure is crucial for understanding the biophysical properties such as stability, folding dynamics, and interactions with other biomolecules. During the work, however, the focus shifted towards optimizing the SHAPE MaP experiment. A series of experiments were conducted to determine the optimal time between transfection of miRNA and modification of SHAPE reagent with qPCR. This indicated that the optimal time is 100 minutes, but further studies are needed for validation. In conclusion, this report describes an optimization experiment for the SHAPE MaP application.

Huntingtons sjukdom (HD) är ett neurodegenerativt tillstånd som orsakas av mutationer i huntingtin gen (Htt), och resulterar till upprepade glutamin (polyQ) i Htt-proteinet. Muterad Htt kan inte vika sig ordentligt och börjar därför aggregera i celler. I detta projekt undersöktes molekylära mekanismerna bakom HD genom att analysera genuttryck hos musvävnader och jämföra detta med biomarkörer identifierats hos HD-patienter. För närvarande finns det ingen behandling för att stoppa utveckling av HD. Därför behövs det mer kunskap om sjukdomen. Projektets mål var att öka vår förståelse på regulatoriska mekanismer som ligger bakom den neurodegenerativa sjukdomen och identifiera potentiella diagnostiska biomarkörer. För denna studie användes mRNA-seq-data från 11 distinkta vävnader från Q175 HD-möss. Vävnader som analyserades inkluderar hjärnstammen, cerebellum, corpus callosum, hippocampus och thalamus/hypothalamus, fettvävnader (brun, vit nära gonad och vit nära tarm) och andra vävnader så som hjärta, hud och gastrocnemius muskel. Efter en grundlig genomgång av HD-litteraturen valdes biomarkörer som sedan undersöktes för mRNA-uttryck hos Q175-möss via Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Genuttrycksförändringar hos HD-möss visade sig vara vävnadsspecifika, med betydande effekter på hud och fettvävnader, men mindre effekter hos hjärnvävnader. Även om gemensamma mRNA-förändringar inte hittas bland de olika vävnader, uppvisade relaterade vävnader förändringar i samma pathways. Immunsvar och ribosomal dysfunktion var utbredd, men varje hjärnregion visade unika förändringar relaterade till sömn, synaptisk signalering och energiprocesser. Muskel- och fettvävnader uppvisar också distinkta mönstrar. Detta understryker vikten av vävnadsspecifik biomarkörforskning för neurodegenerativa sjukdomar. / Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative condition caused by a mutation in the Huntingtin (Htt) gene which results in glutamine repeats (polyQ) and a longer Htt-protein. The mutated Htt-protein cannot fold properly and thus, is prone to aggregate in cells. There is currently no treatment available to stop the progression of HD. Therefore, there is a need for more knowledge regarding the disease. This project investigates the molecular mechanisms underlying HD by analysing gene expression program in wild type (Wt) and HD mice. The objective is to investigate changes in gene regulatory mechanisms underlying the neurodegenerative disease and identify potential diagnostic markers. For this study, mRNA-seq data from 11 distinct tissues from Q175 HD model mouse were analysed. These tissues included brainstem, cerebellum, corpus callosum, hippocampus, and thalamus/hypothalamus, adipose tissues (brown, white near gonad and white near intestine), heart, skin and gastrocnemius muscle. Following a thorough literature review, biomarkers of HD were chosen, and their expression investigated in the HD mouse using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Gene expression changes in HD mouse were specific to different tissues, with significant changes identified in skin and adipose tissues, while smaller changes were detected in the brain tissues. While common changes across the 11 tissues were not found, related tissues exhibited alterations in the same pathways. Changes in immune response and ribosomal dysfunction were widespread across tissues. Moreover, each brain region showed unique changes related to sleep, synaptic signalling, and energy processes. Muscle and adipose tissues displayed distinctive patterns. These results underscore the importance of tissue-specific biomarker research for neurodegenerative diseases.

Ubiquitinbindande protein 2-liknande (UBAP2L) och Ras GTPas-aktiverande proteinsbindande protein 1 (G3BP1) är två kärn-RNA-bindande proteiner (RBPs) som är involverade i bildandet av SGs. Nyligen genomförda studier föreslog att UBAP2L kan fungera som ett upströmsprotein till G3BP1/2 med förmågan att främja SG-bildning oberoende. NTF2-domänen dimeriserar G3BP1 och bildar en plattform för protein-protein-interaktioner. Dess interaktion med UBAP2L-DUF-regionen var avgörande för bildandet av mogna SG. Detta projekt syftade till att avslöja protein-protein-interaktionen mellan G3BP1 och UBAP2L in vitro och karakterisera den kända interaktionen mellan G3BP1-NTF2 och UBAP2L-DUF-regionen. I detta projekt renades homodimeren av G3BP1-NTF2-domänen och komplexades med en syntetiserad peptid som motsvarar rester 505–534 av UBAP2L (UBAP2L 505-534). Låga diffraktionskristallträffar erhölls genom att co-kristallisera G3BP1-NTF2 med peptiden. Ytterligare optimeringar krävs fortfarande. Tre konstruktioner av UBAP2L (N, C och L) designades och utsattes för reningsförsök. Fullängds-G3BP1 renades för att identifiera domäninteraktionen inom UBAP2L-konstruktionerna. Pull-down-testet med His-G3BP och samuttrycket av G3BP1/UBAP2L-N föreslog en mycket svag interaktion mellan G3BP1 och UBAP2L-N. Med tanke på de tillgängliga resultaten från vår studie och co-IP-tester från andra publicerade artiklar bör vi fokusera mer på studien av G3BP2, som föreslogs spela en mer direkt roll i att binda UBAP2L. / Ubiquitin Binding Protein 2-like (UBAP2L) and Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 (G3BP1) are two core RNA-binding proteins (RBPs) involved in the assembly of SGs. Recent studies suggested that UBAP2L might serve as an upstream protein of G3BP1/2 with the ability to promote SG assembly independently. The NTF2 domain dimerizes G3BP1 and forms a platform for protein-protein interactions. Its interaction with the UBAP2L-DUF region was critical for mature SG formations. This project aimed to reveal the protein-protein interaction between G3BP1 and UBAP2L in vitro and characterize the known interaction between G3BP1-NTF2 and UBAP2L-DUF region. In this project, the G3BP1-NTF2 domain homodimer was purified and complexed UBAP2L-DUF derived peptide. Low diffraction crystal hits were obtained by co-crystallizing G3BP1-NTF2 with a synthesized peptide corresponding to residues 505 – 534 of UBAP2L (UBAP2L 505-534). While further optimizations are still required. Three constructs of UBAP2L (N, C, and L) were designed and subjected to purification trials.  Full-length G3BP1 was purified to identify the domain interaction within UBAP2L constructs. The his-G3BP pull-down assay and co-expression of G3BP1/UBAP2L-N suggested a very weak interaction between G3BP1 and UBAP2L-N. Considering the available results from our study and co-IP assays from other published papers, we should focus more on the study of G3BP2 which was suggested to play a more direct role in binding UBAP2L.

Affinity-based proteomics utilizes affinity binders to detect target proteins in a large-scale manner. This thesis describes a high-throughput method, which enables the search for biomarker candidates in human plasma and serum. A highly multiplexed antibody-based suspension bead array is created by coupling antibodies generated in the Human Protein Atlas project to color-coded beads. The beads are combined for parallel analysis of up to 384 analytes in patient and control samples. This provides data to compare protein levels from the different groups. In paper I osteoporosis patients are compared to healthy individuals to find disease-linked proteins. An untargeted discovery screening was conducted using 4608 antibodies in 16 cases and 6 controls. This revealed 72 unique proteins, which appeared differentially abundant. A validation screening of 91 cases and 89 controls confirmed that the protein autocrine motility factor receptor (AMFR) is decreased in the osteoporosis patients. Paper II investigates the risk proteome of inflammatory bowel disease (IBD). Antibodies targeting 209 proteins corresponding to 163 IBD genetic risk loci were selected. To find proteins related to IBD or its subgroups, sera from 49 patients with Crohn’s disease, 51 with ulcerative colitis and 50 matched controls were analyzed. From these targeted assays, the known inflammation-related marker serum amyloid protein A (SAA) was shown to be elevated in the IBD cases. In addition, the protein laccase (multi-copper oxidoreductase) domain containing 1 (LACC1) was found to be decreased in the IBD subjects. In conclusion, assays using affinity-based bead arrays were developed and applied to screen human plasma and serum samples in two disease contexts. Untargeted and targeted screening strategies were applied to discover disease-associated proteins. Upon further validation, these potential biomarker candidates could be valuable in future disease studies. / <p>QC 20180412</p>

Human papillomavirus (HPVs) is the most common causing agents for cervical cancer. Although the introduction of vaccination is reducing its prevalence, there is still no reliable treatment for HPV infections. Understanding the life cycle of HPV, especially the regulation of the viral E6 and E7 gene expression, is crucial because its dysregulation is associated with tumor development. This study aims to investigate the complex mechanism of HPV16 E6/E7 mRNA splicing with a focus on the regulatory role of RNA binding proteins, particularly members of the serine and arginine (SR) rich protein family. Our results indicate that SRSF2 enhances HPV16 SD226-SA409 mRNA splicing is of significance since the SD226-SA409-spliced mRNA is coding for the HPV16 oncogenes, thus 226-409 splicing is a  potential therapeutic target.

Cellers tillväxthastighet varierar avsevärt mellan olika celltyper. Fullt specialiserade celler delar sig sällan och fokuserar i stället på sina specifika funktioner, medan stamceller aktivt delar sig för att upprätthålla en balans av nya och gamla celler. Denna studie syftar till att odla och analysera två mänskliga blodcancercellinjer: erytroleukemiska K562-celler och L428-celler från Hodgkins lymfom. Studien fokuserar på de två cellinjernas olika tillväxthastighet samt transkriptionsaktivitet under olika förhållanden och behandlingar. Projektet inkluderar även att ta fram ett helt nytt, effektiviserat protokoll för extraktion och kvantifiering av DNA, nascent RNA, mRNA och protein från ett enda prov. Projektet tar också upp utmaningen att se om det finns en koppling mellan cellernas tillstånd och deras transkriptionsaktivitet, eftersom nuvarande sekvenseringsnormaliseringstekniker gör att de totala nivåerna av transkription inte blir jämförbara mellan olika cellinjer. Genom att kvantifiera cellernas tillväxthastighet och transkriptionsaktivitet identifierades en potentiell koppling mellan högre tillväxthastighet och ökad mängd RNA-produktion, vilket tyder på ett samband som ser till att tillräckligt stor mängd cellkomponenter produceras för dottercellerna. Dessutom syftar studien till att undersöka de två cellinjernas respons på behandling med differentieringsinducerande hemin, känt för att inducera erytroid differentiering hos myeloida celler såsom K562-cellinjen. Trots deras olika hematopoetiska ursprung visade sig både K562- och L428-cellinjerna reagera på behandlingen och utvecklas mot röda blodkroppar. Detta kan påvisas genom att hemin gör att deras respektive tillväxthastigheter påverkas på samma sätt, samt att cellerna får en djupröd färg, vilket indikerar produktion av hemoglobin och är ett välkänt tecken på erytroid differentiering. / Cell proliferation rates vary significantly among different cell types. Terminally differentiated cells rarely divide, focusing on their specialized functions, while stem cells actively proliferate to maintain tissue homeostasis. This study aims to culture and analyze two human blood cancer cell lines: erythroleukemia K562 cells and Hodgkin's lymphoma L428 cells. The investigation focuses on their proliferation rates and transcriptional activities under various conditions and treatments. The project also includes the establishment of a novel, streamline protocol for extracting and quantifying DNA, nascent RNA, mRNA and protein from one single sample. The study also addresses the challenge of correlating cell state with transcriptional activity, noting that current sequencing normalization techniques renders total levels of transcription incomparable between cell lines. By quantifying proliferation rates and transcriptional activity, a potential connection between proliferation rate and transcriptional activity was found. Higher proliferation rate corresponded to samples with larger amounts of RNA and higher transcription of nascent RNA, indicating an association that facilitates the production of sufficient cellular components necessary for the two daughter cells.  Additionally, the study investigates the two cell lines’ responsiveness to differentiation-inducing hemin, known to induce differentiation toward the erythrocyte lineage for myeloid cells such as the K562 cell line. The findings from this study show that, despite belonging to different parts of the hematopoietic lineage, both the K562 cells and the L428 cells are responsive to hemin-induced differentiation toward the erythrocyte lineage. This is demonstrated by the fact that their proliferation rates are equally affected upon hemin treatments, and because both K562 and L428 cells turn red as a reflection of the induced production of hemoglobin, which is a recognized effect of hemin-induced erythrocytic differentiation.

Kronisk myeloisk leukemi-celler kan överleva drogbehandling och utveckla resistens till dagens behandlingar som består av tyrosinkinasinhibitorer. Denna studie utforskar sättet på vilket K562 celler svarar till två tyrosinkinasinhibitorer, Imatinib och Bosutinib, på en transkriptionell nivå. Genom att designa studien kring ett tidsförlopp då prov för mRNA sekvensering togs vid en kontrolltidpunkt, 1, 6 och 24 timmar av behandling, samt en vecka efter 24 timmars behandling, med respektive läkemedel. K562 cellernas tillväxt var starkt hämmad av Bosutinib, även efter en veckas återhämtning från behandlingen. Imatinib-behandlade celler kunde växa nästan oförändrat både under och efter behandling. Skillnaden i inhibition av tillväxt mellan drogerna verkar även vara oberoende av dos, baserat på två testa koncentrationer för varje läkemedel: 1 µM och 3,9 µM för Imatinib, 1 µM och 0,27 µM av Bosutinib. Cellmorfologi var också ändrad av Bosutinib, då den var oförändrad vid behandling med Imatinib. Transkriptomiska analyser utfördes och gene set enrichment analysis (GSEA) användes tillsammans med over-representation analysis (ORA) för att identifiera mönster i genuttryck. Grupper av gener kopplade till nukleinsyrametabolism, RNA bearbetning och i synnerhet cellaktivering och proliferering var nedreglerade under behandling med båda läkemedlen. Efter återhämtning från behandling med Imatinib, K562 celler kunde återgå till deras ursprungliga transkriptionella profil, medan Bosutinib-behandlade celler upprätthöll långsiktig transkriptionell omprogrammering. MYC transkriptionsfaktorn var nedreglerad av både Imatinib och Bosutinib under behandlingen, och MYC kunde förknippas med en grupp av gener som var nedreglerade under läkemedelsbehandling. Resultaten i denna studie tydliggör att transkriptionell omprogrammering sker i K562 celler under behandling med TKI, och att denna omprogrammering sker på ett koordinerat sätt i grupper av gener relaterade till signaleringsvägar och viktiga cellulära processer. Hållbara förändringar i genuttryck efter Bosutinib-behandling kan länkas samman med drogens effektiva inhibition av cellernas tillväxt. / Chronic myeloid leukaemia cells are able to survive and develop resistance to current treatments consisting of tyrosine kinase inhibitors (TKIs). This study investigates the way in which K562 cells respond to two TKIs, Imatinib and Bosutinib, on a transcriptional level. Using a time course study design, mRNA sequencing (mRNA-seq) was performed on control, 1h, 6h and 24h treatment time points for each drug, as well as after one week of recovery following 24h of treatment. K562 proliferation was vastly inhibited by Bosutinib, even after one week of recovery from the 24-hour treatment period, while Imatinib-treated cells were able to proliferate almost normally during and after treatment. The difference in inhibitory effect between the two drugs seems to be dose-independent based on two tested concentrations, 1 µM and 3,9 µM Imatinib, as well as 1 µM and 0,27 µM Bosutinib. Cell morphology was also altered by Bosutinib while being unchanged during and after Imatinib treatment. Transcriptomics analysis was performed, and gene set enrichment analysis (GSEA) was used together with overrepresentation analysis (ORA) to identify patterns in gene expression. Groups of genes related to nucleic acid metabolism, RNA processing and notably regulation of cell activation and proliferation are repressed during both Imatinib and Bosutinib treatment. After recovery from Imatinib treatment, K562 cells are able to revert the transcriptional changes, while Bosutinib-treated cells sustain long-term transcriptional reprogramming. The MYC transcription factor is down-regulated by both drugs during treatment, and MYC is also linked to a collection of genes that are down-regulated during Imatinib and Bosutinib treatment. The findings from this study elucidate that transcriptional reprogramming occurs in K562 cells during TKI treatment, and that this reprogramming occurs in a concerted fashion across groups of genes related to signalling pathways and important cellular processes. Sustained changes in gene expression after Bosutinib treatment can linked to the drug’s effectiveness at inhibiting K562 cell growth.