Liu, Xin. / "December 2009." / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (leaves 119-126). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract in English --- p.i / Abstract in Chinese --- p.iv / Acknowledgements --- p.vi / List of abbreviations --- p.vii / List of Tables List of Figures --- p.X xii / List of Publications --- p.xiv / Chapter Chapter 1 --- Literature Review --- p.1 / Chapter 1.1 --- Gastric cancer epidemiology and etiology --- p.1 / Chapter 1.2 --- Molecular carcinogenesis --- p.4 / Chapter 1.3 --- Tumor suppressor gene and the modes of tumor suppressor gene inactivation --- p.4 / Chapter 1.4 --- DNA methylation and carcinogenesis --- p.8 / Chapter 1.5 --- Identification of tumor suppressor genes --- p.15 / Chapter 1.6 --- "Vitamins, vitamin B complex, thiamine transporters and diseases" --- p.18 / Chapter 1.7 --- "Glucose metabolism, glycolysis and carcinogenesis" --- p.22 / Chapter 1.8 --- Clinical implications of DNA methylation --- p.28 / Chapter Chapter 2 --- Research Aim and Procedure --- p.31 / Chapter Chapter 3 --- Materials and Methods --- p.35 / Chapter 3.1 --- Cell lines and human tissue samples --- p.35 / Chapter 3.2 --- Cell culture --- p.35 / Chapter 3.3 --- Total RNA extraction --- p.36 / Chapter 3.4 --- Genomic DNA extraction --- p.37 / Chapter 3.5 --- Reverse transcription PCR (RT-PCR) --- p.38 / Chapter 3.5.1 --- Reverse transcription (RT) --- p.38 / Chapter 3.5.2 --- Semi-quantitative RT-PCR --- p.40 / Chapter 3.5.3 --- Real time RT-PCR --- p.42 / Chapter 3.6 --- General techniques --- p.44 / Chapter 3.6.1 --- DNA and RNA quantification --- p.44 / Chapter 3.6.2 --- Gel electrophoresis --- p.44 / Chapter 3.6.3 --- LB medium and LB plate preparation --- p.44 / Chapter 3.6.4 --- Plasmid DNA extraction --- p.45 / Chapter 3.6.4a --- Plasmid DNA mini extraction --- p.45 / Chapter 3.6.4b --- Plasmid DNA midi extraction --- p.46 / Chapter 3.6.5 --- DNA sequencing --- p.46 / Chapter 3.7 --- Methylation status analysis --- p.49 / Chapter 3.7.1 --- CpG island analysis --- p.49 / Chapter 3.7.2 --- Sodium bisulfite modification of DNA --- p.49 / Chapter 3.7.3 --- Methylation-specific PCR (MSP) --- p.50 / Chapter 3.7.4 --- Bisulfite genomic sequencing (BGS) --- p.53 / Chapter 3.8 --- Construction of expression plasmid DNA --- p.55 / Chapter 3.8.1 --- Construction of the SLC19A3-expressing vector --- p.55 / Chapter 3.8.2 --- Construction of the FBP1-expressing vector --- p.57 / Chapter 3.9 --- Functional analyses --- p.58 / Chapter 3.9.1 --- Monolayer colony formation assay --- p.58 / Chapter 3.9.2 --- Cancer cell growth curve analysis --- p.59 / Chapter 3.9.3 --- Lactate assay --- p.60 / Chapter 3.10 --- Statistical analysis --- p.61 / Chapter Chapter 4 --- Results --- p.62 / Chapter 4.1 --- Identification of novel candidate tumor suppressor genes downregulated by DNA methylation --- p.62 / Chapter 4.2 --- Selection of genes for further study --- p.62 / Chapter 4.3 --- Identification of SLC19A3 as a novel candidate tumor suppressor gene in gastric cancer --- p.64 / Chapter 4.3.1 --- Pharmacological restoration of SLC 19A3 downregulation in gastric cancer --- p.64 / Chapter 4.3.2 --- Methylation analysis of SLC 19A3 promoter region --- p.66 / Chapter 4.3.3 --- Functional analysis of SLC 19A3 in gastric cancer --- p.72 / Chapter 4.3.4 --- Clinicopathologic characteristics of SLC 19A3 promoter methylation in gastric cancer --- p.75 / Chapter 4.3.5 --- Discussion --- p.78 / Chapter 4.4 --- Identification of FBP1 as a novel candidate tumor suppressor gene regulated by NF-kB in gastric cancer --- p.85 / Chapter 4.4.1 --- Pharmacological restoration of FBP1 downregulation in gastric cancer --- p.85 / Chapter 4.4.2 --- Methylation analysis of FBP 1 promoter region --- p.87 / Chapter 4.4.3 --- Functional analysis of FBP 1 in gastric cancer --- p.93 / Chapter 4.4.4 --- Reduction of lactate generation under FBP1 expression --- p.95 / Chapter 4.4.5 --- Clinicopathologic characteristics of FBP 1 promoter methylation in gastric cancer --- p.98 / Chapter 4.4.6 --- NF-kB mediated FBP1 promoter hypermethylation in gastric cancer --- p.104 / Chapter 4.4.7 --- Discussion --- p.106 / Chapter Chapter 5 --- General discussion --- p.112 / Chapter Chapter 6 --- Summary --- p.117 / Reference list --- p.119

O câncer gástrico tem alta incidência. Seu quadro clínico é silencioso e sua malignidade é alta, o que tornam seu prognóstigo reservado. A inflamação tem papel fundamental no desenvolvimento e na progressão da doença neoplásica, induzida por citocinas inflamatórias produzidas pelo tumor e/ou liberadas pelo sistema imune. Nos últimos anos, tem sido documentada a variabilidade na expressão gênica de citocinas inflamatórias na doença neoplásica. Objetivos: Em amostras de sangue periférico de pacientes com neoplasia gástrica, avaliar a concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), dos receptores solúveis tipo 1A e 1B do fator de necrose tumoral (TNFR1A e TNFR1B), da interleucina 6 (IL-6), da interleucina 1 beta (IL-1?), do receptor solúvel da interleucina 1 (IL-1R), do interferon-gama (INF- ?) e interleucina 10 (IL-10), além da expressão gênica dessas citocinas, da zinco-alfa2-glicoproteina (ZAG) e do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPAR-?). Além disso, o estudo visou identificar possíveis diferenças nos dados avaliados entre os pacientes que foram ou não submetidos à quimioterapia neoadjuvante. Casuística: O estudo transversal foi conduzido com 25 pacientes (Grupo Câncer) com adenocarcinoma gástrico. Numa etapa posterior, esses sujeitos foram subdivididos em Subgrupos Sem-quimioterapia (n=15) e Subgrupo Quimioterapia (n=10). Todos os voluntários estavam no período pré-operatório. O estudo incluiu também 15 pacientes em pré-operatório imediato de herniorrafia eletiva (Grupo Controle). Métodos: A avaliação da ingestão, o estado clínico e nutricional foram avaliados, além das dosagens de citocinas TNF-?, IL-6, IL-1?, INF-?, IL-10, de receptores solúveis TNF1A, TNF1B e IL-1R. Determinou-se a expressão do RNAm do TNF-?, IL-6, INF-?, IL-10, de receptores solúveis TNFR1A, TNFR1B, IL-1R, da ZAG e do PPAR-? no sangue total. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar grupos e subgrupos de pacientes. Resultados: Os pacientes do Grupo Câncer apresentaram menor ingestão de proteínas, vitamina B12, ferro e zinco em relação aos controles, assim como valores mais baixos de massa livre de gordura. Perda de peso maior que 10% foi documentada em 32% dos pacientes com adenocarcinoma gástrico. Em relação ao Grupo Controle, o Grupo Câncer apresentou menores valores séricos de proteínas totais, ferro, zinco, vitamina A e E, além de maiores níveis de proteína C-reativa. As concentrações séricas de TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL-1? e IL-10 foram maiores no8 Grupo Câncer em relação aos controles. A comparação entre subgrupos mostrou que a concentração sérica de IL-1? foi maior no Subgrupo Quimioterapia. A expressão do RNAm de TNFR1A, INF-?, IL-10 e PPAR-? em sangue total foi maior bo Grupo Câncer em relação ao Grupo Controle. Não foram observadas alterações na concentração sérica de IL-1R, assim como na expressão do RNAm de IL-1R e de ZAG em sangue total nos grupos e subgrupos do estudo. Conclusões: As alterações na ingestão alimentar, na composição corporal e nos marcadores bioquímicos de resposta inflamatória sistêmica foram evidentes em pacientes com câncer gástrico, além do aumento nos níveis séricos de TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL- 1? e IL-10 e na expressão do RNAm de TNFR1A, INF-?, IL-10 e PPAR-? em sangue total. Exceto pelos valores séricos mais elevados de IL-1?, a quimioterapia não resultou em mudanças na concentração sérica e na expressão de RNAm das citocinas inflamatórias avaliadas. / Gastric cancer has a high incidence. His clinical symptons and signals are silent and his malignancy is high, which makes his prognosis reserved. Inflammation plays a key role in the development and progression of neoplastic disease, induced by inflammatory cytokines produced by the tumor and/or released by the immune system. In recent years, the variability in the gene expression of inflammatory cytokines in neoplastic disease has been documented. Objectives: To assess in peripheral blood samples from patients with gastric neoplasia the concentration of tumor necrosis factor alpha (TNF-?), soluble type 1A and 1B receptors of tumor necrosis factor (TNFR1A and TNFR1B), interleukin-6 (IL- 6), interleukin- 1? (IL-1?), interleukin 1 (IL-1R), interferon-gamma (INF?) and interleukin-10 (IL-10), and the gene expression of these cytokines, of zinc-alpha-2-glycoprotein (ZAG) and gamma peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-?) Casuistic: The cross-sectional study was conducted with 25 patients with gastric adenocarcinoma (Cancer Group). At a later stage, these subjects were subdivided into Subgroups, Without Chemotherapy (n = 15) and Chemotherapy (n = 10). All volunteers were in the preoperative period. The study also included 15 patients in the immediate preoperative period of elective herniorrhaphy (Control Group). Methods: Intake evaluation, clinical and nutritional status, as well as the dosages of TNF-?, IL-6, IL-1?, INF-?, IL-10, soluble receptor of TNF1A, TNF1B and IL-1R cytokines . The mRNA expression of TNF- ?, IL-6, INF-?, IL-10, soluble receptors TNFR1A, TNFR1B and IL-1R; ZAG and PPAR-? were determined in whole blood. The Mann-Whitney test was used to compare groups and subgroups of patients. Results: Patients in the Cancer Group had lower intakes of proteins, vitamin B12, iron and zinc than control subjects, as well as lower values of fat-free mass. Weight loss greater than 10% was documented in 32% of patients with gastric cancer. In relation to the Control Group, the Cancer Group presented lower serum levels of total proteins, iron, zinc, vitamin A and E, in addition to higher levels of C-reactive protein. Serum concentrations of TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL-1? and IL-10 were higher in the Cancer Group than in controls. The comparison between subgroups showed that the serum concentration of IL-1? was higher in the Chemotherapy Subgroup. The mRNA expression of TNFR1A, INF-?, IL-10 and PPAR-? in whole blood was higher in the Cancer Group than in the Control Group. No changes were observed in serum concentration of IL- 1R, as well as in the mRNA expression of IL-1R and ZAG in whole blood in the groups and subgroups studied. Conclusions: Changes in dietary intake, body composition and biochemical markers of systemic inflammatory response were evident in patients with gastric cancer, in addition, the increased serum levels of TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL-1? and IL- 10; and the higher mRNA expression of TNFR1A, INF-?, IL-10 and PPAR-? in whole blood. The mRNA expression of ZAG in whole blood was similar across all study groups. Except for the higher serum IL-1? values, chemotherapy did not result in changes in serum concentration and mRNA expression of the inflammatory cytokines evaluated.

Source: Masters Abstracts International, Volume: 47-03, page: 1618. Adviser: Victor M. Cardenas. Includes bibliographical references.

INTRODUÇÃO: O adenocarcinoma gástrico precoce (AGP) atinge até a camada submucosa em profundidade, independentemente da presença de metástases linfonodais (MLF). Tumores mucosos, bem diferenciados, menores que 20 mm e sem ulceração são candidatos à ressecção endoscópica (RE) por mucosectomia com taxas de MLF praticamente nulas. Com o advento da técnica de dissecção endoscópica da submucosa (ESD) e após observar ausência de MLF em grande série de pacientes no Japão, foi sugerido que os critérios clássicos pudessem ser expandidos, evitando a gastrectomia em alguns pacientes. Em países ocidentais autores e sociedades têm visto com restrição a ESD para critérios expandidos devido à observação de MLF em alguns subgrupos. A análise crítica e validação dos critérios expandidos de RE para tratamento do AGP em coorte brasileira poderá indicar os pacientes com menor risco de metástases linfonodais nesta população, de modo a individualizar o tratamento com excelência e qualidade de vida. OBJETIVO: Avaliar a presença MLF em produtos de gastrectomia com linfadenectomia de pacientes elegíveis à ressecção endoscópica seguindo os critérios clássicos e expandidos. MÉTODO: Inclusão de pacientes com AGP submetidos a tratamento cirúrgico com dissecção linfonodal. Estadiamento linfonodal e avaliação de características clínicas, macroscópicas e histopatológicas segundo critérios de RE. RESULTADOS: Foram incluídos 389 espécimens cirúrgicos de gastrectomia, dentre os quais 135 cumpriam critérios para ressecção endoscópica. Nenhum dos 31 pacientes com critérios clássicos apresentou MLF (N = 31; 0% IC95% 0 - 13,4%). Dos 104 com critérios expandidos, 3 apresentaram MLF (N = 104; 2,9% IC95% 0,7 - 8,6%), todos pertencentes ao grupo de tumores indiferenciados sem ulceração e menores que 20 mm. Dos pacientes com indicação de tratamento cirúrgico houve 50 MLF positivos (N = 254; 19,7% IC95% 15,3 - 25,1%). CONCLUSÃO: Existe risco mínimo de metástases linfonodais quando adotados os critérios expandidos de RE. Este risco é praticamente nulo para os critérios clássicos e quando se exclui o tumor indiferenciado do critério expandido / INTRODUCTION: Early gastric cancer (EGC) is known to present low rate of lymph nodal metastasis (LNM). Gastrectomy with D2 lymphadenectomy is usually curative for EGC. Endoscopic submucosal dissection (ESD) is a well-accepted treatment modality for lesions that meet the classic criteria, a well-differentiated adenocarcinoma measuring less than 20 mm size and without ulceration. Expanded criteria for ESD have been recently proposed, based on null LNM rate from large gastrectomies series coming from Japan. The expanded criteria for ESD are as follows: intramucosal non-ulcerative well-differentiated tumor > 20 mm, intramucosal ulc mo <= 30 mm, intramucosal non-ulcera mo <= 20 mm, or superficially submucosal ( m1) mo <= 30 mm. There is some resistance to adoption of the expanded criteria, since patients with positive LNM have already been reported in western centers. OBJECTIVE: Evaluate LNM staging in patients who met the expanded endoscopic treatment criteria for ESD. METHOD: Evaluation of gastrectomy specimens including LNM staging of patients submitted to gastrectomy for EGC in a 39-year retrospective cohort. A senior pathologist reviewed the histology slides. RESULTS: A total of 389 surgical specimens were included, of whose 135 met criteria for endoscopic resection. None of the 31 patients with classic criteria had LNM. Of the 104 patients with expanded criteria, 3 had LNM (n = 104, 2.9% CI 95% 0.7 - 8.6%), all of them with undifferentiated tumors without ulceration and less than 20 mm. In the patients with surgical criteria there were 50 LNM positive (n = 254; 19.7% CI 95% 15.3 - 25.1%). CONCLUSION: There is minimal risk of LNM in EGC when expanded criteria for ESD are met. This risk is practically nil for the classic criteria and when the undifferentiated tumor is excluded of the expanded criteria. Refinement of the expanded criteria for the risk of LNM may be desirable. Meanwhile the decision to complement the endoscopic treatment with LNM dissection or D2 gastrectomy will have to take into consideration the individual risk of perioperative morbidity and mortality

O câncer gástrico tem alta incidência. Seu quadro clínico é silencioso e sua malignidade é alta, o que tornam seu prognóstigo reservado. A inflamação tem papel fundamental no desenvolvimento e na progressão da doença neoplásica, induzida por citocinas inflamatórias produzidas pelo tumor e/ou liberadas pelo sistema imune. Nos últimos anos, tem sido documentada a variabilidade na expressão gênica de citocinas inflamatórias na doença neoplásica. Objetivos: Em amostras de sangue periférico de pacientes com neoplasia gástrica, avaliar a concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), dos receptores solúveis tipo 1A e 1B do fator de necrose tumoral (TNFR1A e TNFR1B), da interleucina 6 (IL-6), da interleucina 1 beta (IL-1?), do receptor solúvel da interleucina 1 (IL-1R), do interferon-gama (INF- ?) e interleucina 10 (IL-10), além da expressão gênica dessas citocinas, da zinco-alfa2-glicoproteina (ZAG) e do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPAR-?). Além disso, o estudo visou identificar possíveis diferenças nos dados avaliados entre os pacientes que foram ou não submetidos à quimioterapia neoadjuvante. Casuística: O estudo transversal foi conduzido com 25 pacientes (Grupo Câncer) com adenocarcinoma gástrico. Numa etapa posterior, esses sujeitos foram subdivididos em Subgrupos Sem-quimioterapia (n=15) e Subgrupo Quimioterapia (n=10). Todos os voluntários estavam no período pré-operatório. O estudo incluiu também 15 pacientes em pré-operatório imediato de herniorrafia eletiva (Grupo Controle). Métodos: A avaliação da ingestão, o estado clínico e nutricional foram avaliados, além das dosagens de citocinas TNF-?, IL-6, IL-1?, INF-?, IL-10, de receptores solúveis TNF1A, TNF1B e IL-1R. Determinou-se a expressão do RNAm do TNF-?, IL-6, INF-?, IL-10, de receptores solúveis TNFR1A, TNFR1B, IL-1R, da ZAG e do PPAR-? no sangue total. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar grupos e subgrupos de pacientes. Resultados: Os pacientes do Grupo Câncer apresentaram menor ingestão de proteínas, vitamina B12, ferro e zinco em relação aos controles, assim como valores mais baixos de massa livre de gordura. Perda de peso maior que 10% foi documentada em 32% dos pacientes com adenocarcinoma gástrico. Em relação ao Grupo Controle, o Grupo Câncer apresentou menores valores séricos de proteínas totais, ferro, zinco, vitamina A e E, além de maiores níveis de proteína C-reativa. As concentrações séricas de TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL-1? e IL-10 foram maiores no8 Grupo Câncer em relação aos controles. A comparação entre subgrupos mostrou que a concentração sérica de IL-1? foi maior no Subgrupo Quimioterapia. A expressão do RNAm de TNFR1A, INF-?, IL-10 e PPAR-? em sangue total foi maior bo Grupo Câncer em relação ao Grupo Controle. Não foram observadas alterações na concentração sérica de IL-1R, assim como na expressão do RNAm de IL-1R e de ZAG em sangue total nos grupos e subgrupos do estudo. Conclusões: As alterações na ingestão alimentar, na composição corporal e nos marcadores bioquímicos de resposta inflamatória sistêmica foram evidentes em pacientes com câncer gástrico, além do aumento nos níveis séricos de TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL- 1? e IL-10 e na expressão do RNAm de TNFR1A, INF-?, IL-10 e PPAR-? em sangue total. Exceto pelos valores séricos mais elevados de IL-1?, a quimioterapia não resultou em mudanças na concentração sérica e na expressão de RNAm das citocinas inflamatórias avaliadas. / Gastric cancer has a high incidence. His clinical symptons and signals are silent and his malignancy is high, which makes his prognosis reserved. Inflammation plays a key role in the development and progression of neoplastic disease, induced by inflammatory cytokines produced by the tumor and/or released by the immune system. In recent years, the variability in the gene expression of inflammatory cytokines in neoplastic disease has been documented. Objectives: To assess in peripheral blood samples from patients with gastric neoplasia the concentration of tumor necrosis factor alpha (TNF-?), soluble type 1A and 1B receptors of tumor necrosis factor (TNFR1A and TNFR1B), interleukin-6 (IL- 6), interleukin- 1? (IL-1?), interleukin 1 (IL-1R), interferon-gamma (INF?) and interleukin-10 (IL-10), and the gene expression of these cytokines, of zinc-alpha-2-glycoprotein (ZAG) and gamma peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-?) Casuistic: The cross-sectional study was conducted with 25 patients with gastric adenocarcinoma (Cancer Group). At a later stage, these subjects were subdivided into Subgroups, Without Chemotherapy (n = 15) and Chemotherapy (n = 10). All volunteers were in the preoperative period. The study also included 15 patients in the immediate preoperative period of elective herniorrhaphy (Control Group). Methods: Intake evaluation, clinical and nutritional status, as well as the dosages of TNF-?, IL-6, IL-1?, INF-?, IL-10, soluble receptor of TNF1A, TNF1B and IL-1R cytokines . The mRNA expression of TNF- ?, IL-6, INF-?, IL-10, soluble receptors TNFR1A, TNFR1B and IL-1R; ZAG and PPAR-? were determined in whole blood. The Mann-Whitney test was used to compare groups and subgroups of patients. Results: Patients in the Cancer Group had lower intakes of proteins, vitamin B12, iron and zinc than control subjects, as well as lower values of fat-free mass. Weight loss greater than 10% was documented in 32% of patients with gastric cancer. In relation to the Control Group, the Cancer Group presented lower serum levels of total proteins, iron, zinc, vitamin A and E, in addition to higher levels of C-reactive protein. Serum concentrations of TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL-1? and IL-10 were higher in the Cancer Group than in controls. The comparison between subgroups showed that the serum concentration of IL-1? was higher in the Chemotherapy Subgroup. The mRNA expression of TNFR1A, INF-?, IL-10 and PPAR-? in whole blood was higher in the Cancer Group than in the Control Group. No changes were observed in serum concentration of IL- 1R, as well as in the mRNA expression of IL-1R and ZAG in whole blood in the groups and subgroups studied. Conclusions: Changes in dietary intake, body composition and biochemical markers of systemic inflammatory response were evident in patients with gastric cancer, in addition, the increased serum levels of TNF-?, TNFR1A, TNFR1B, IL-6, IL-1? and IL- 10; and the higher mRNA expression of TNFR1A, INF-?, IL-10 and PPAR-? in whole blood. The mRNA expression of ZAG in whole blood was similar across all study groups. Except for the higher serum IL-1? values, chemotherapy did not result in changes in serum concentration and mRNA expression of the inflammatory cytokines evaluated.

Introdução: Câncer gástrico é uma doença multifatorial influenciada por fatores externos e hereditários. Embora a síndrome do câncer gástrico difuso hereditário causada por mutações germinativas no gene CDHl seja uma condição rara, sua influência sobre a incidência de câncer gástrico no Brasil, que é considerado um país de alta incidência desta neoplasia, é desconhecida. Objetivos: Avaliar a frequência de variantes germinativas em CDHl e os hábitos de dieta/estilo de vida em pacientes diagnosticados câncer gástrico com idade precoce «55 anos) no Brasil. Metodologia: De outubro de 2013 a agosto 2015, foram recrutados 88 pacientes consecutivos e não aparentados diagnosticados com câncer gástrico em idade precoce em um hospital público brasileiro. Todos os éxons e regiões intrônicas flanqueadoras do CDHl foram sequenciados. Os hábitos de dieta/estilo de vida dos pacientes com câncer gástrico em idade precoce foram comparados com informações sobre os hábitos da população armazenados em bancos de dados populacionais brasileiros. Resultados: Dos 88 pacientes, 51,1% eram do sexo feminino e a média de idade no momento do diagnóstico do câncer era de 39 anos (variação, 20-55); 23% relataram história familiar de câncer gástrico em parentes de primeiro ou de segundo. A maioria dos tumores era do tipo difuso (74%), pouco diferenciado (74%) e localizava-se no terço médio ou distal do estômago (67%). No total, 24 variantes germinativas foram detectadas: 3 (12.5%) benignas, 17 (70.8%) provavelmente benignas e 4 (16.7%) variantes de significado clínico incerto (VSI). Todas as VSI são mutações missense e nunca foram relatadas previamente na literatura: c.313T> A, c.387G> T, c.1676G> A e c.1806C> A. Os pacientes com câncer gástrico diagnosticados em idade precoce apresentaram maior consumo de carne vermelha (OR: 2.591, IC 95%: 1.371-4.894) e carne processada (OR: 3.093, IC 95%: 1.591- 6.009) em comparação com os hábitos alimentares da população brasileira. Conclusão: De acordo com o nosso conhecimento, esta é a maior série investigando a contribuição de mutações germinativas de CDHl em pacientes diagnosticados com câncer gástrico em idade precoce na América Latina. Para um país considerado de alta incidência, a frequência encontrada de variantes germinativas em CDHl foi maior do que o esperado; 4 novas mutações missense foram identificadas e mais estudos são necessários para confirmar a patogenicidade dessas variantes. Fatores de risco modificáveis, como o consumo de carne vermelha e/ou de carne processada podem ter contribuído para o desenvolvimento de câncer gástrico em idade precoce na população estudada / Introduction: Gastric cancer is a multifactorial disease influenced by inherited and noninherited factors. Although hereditary diffuse gastric cancer syndrome caused by germline mutation in CDHl is arare condition its contribution to gastric cancer burden in Brazil, which is considered a high-incidence country for this neoplasia, is unknown. Objectives: To evaluate the frequency of CDHl germline variants and the dietjlifestyle habits in early-onset gastric cancer (EOGC, < 55 years old) patients in Brazil. Methodology: From October 2013 to August 2015, a total of 88 unrelated and consecutive patients attending a Brazilian public hospital with EOGC were enrolled. Ali CDHl exons and intronic boundaries were sequenced. The dietjlifestyle habits of EOGC patients have been compared to Brazilian population data bases. Results: Of 88 patients, 51.1% were female and the mean age at gastric cancer diagnosis was 39 years (range 20-55); 23% reported family history of gastric cancer in first- or second-degree rei atives. The majority of the tumors were diffuse (74%), poorly differentiated (74%), and located in the middle and distal-third of the stomach (67%). In total, 24 germline variants were detected: 3 (12.5%) benign, 17 (70.8%) likely benign, and 4 (16.7%) variants of unknown significance (VUS). Ali VUS were missense novel mutations: c.313T > A, c.387G > T, c.1676G > A, and c. 1806C > A. EOGC patients had ahigher red (OR: 2.591, 95% CI: 1.371-4.894) and processed (OR: 3.093, 95% CI: 1.591-6.009) meat intake compared to eating habits of the Brazilian population. Conclusion: To our knowledge, this is the largest series investigating the contribution of CDHl germline mutations in EOGC cancer in Latin America. For a high-incidence country, the incidence of CDHl germline variants was higher than expected; 4 novel CDHl missense mutations were identified and further studies are warranted to confirm their pathogenicity. Modifiable risk factors, such as the consumption of red and/or processed meat may have contributed to early- onset gastric cancer development in our studied population

Introdução: Agregação familial é observada em cerca de 10% dos casos de câncer e 1 a 3% é hereditário. O tipo difuso pode estar relacionado à agregação familial e a alterações genéticas no gene CDH1, que codifica a proteína E-caderina. Alterações na imunoexpressão de Beta-catenina e p53 também são observadas. Objetivos: Analisar a imunoexpressão da E-caderina, Beta-catenina e TP53 em adenocarcinomas gástricos de pacientes com câncer gástrico familial e comparar com os dados clinicopatológicos, além dos achados das alterações genéticas destes pacientes, estudadas previamente nesta Instituição. Casuística e Métodos: Vinte e seis casos de adenocarcinoma gástrico em blocos de parafina de pacientes do HC-FMUSP foram submetidos ao estudo imunoistoquímico para detecção e análise do padrão de imunoexpressão da E-caderina, Beta-catenina e TP53 através do método da streptavidina-biotina-peroxidase. A análise da imunoexpressão dos marcadores foi classificada segundo escala de intensidade e distribuição e os testes estatísticos utilizados foram o Teste t de Student e Exato de Fisher. Resultados: A localização predominante do tumor foi no antro (61,5%). 11 (42,3%) casos alterados para a imunoexpressão da E-caderina, sendo todos do tipo difuso; 15 (57,7%) casos normais, sendo 9 do tipo difuso e 6 do tipo intestinal (p=0,02). Em estudo prévio realizado nesta instituição, uma mutação missense no exon 12 do gene CDH1, códon 617, nucleotídeo 1849 G>A foi encontrada no mesmo caso em que foi observada ausência de imunorreatividade da E-caderina. 11 (42,3%) casos alterados para a imunoexpressão de Beta-catenina e 46,2% de imunorreatividade nuclear positiva para TP53. Conclusões: 1) O tipo difuso de Laurén está associado à alteração da imunoexpressão da E-caderina no Câncer Gástrico Familial; 2) Não houve associação entre a imunoexpressão da E-caderina, idade, gênero e localização do tumor; tampouco houve associação entre a imunoexpressão da Beta-catenina e os dados clínico-patológicos; houve associação inversa entre a imunoexpressão da E-caderina e TP53; 3) Nos casos em que foram detectadas alterações na imunoexpressão, parece haver duas rotas distintas de carcinogênese envolvidas no CGF. / Introduction: Familial clustering is observed in about 10% of the gastric cancer cases and 1-3% is hereditary. Diffuse type gastric cancer is related to genetic alterations in CDH1 gene, which translates the E-cadherin protein. The abnormal expression of E-cadherin is characterized by low expression of cytoplasmatic staining, or loss of membranous immunoreactivity. Aim: to analyze the immunoexpression of E-cadherin, Beta-catenin and TP53 in gastric adenocarcinomas in patients with Familial Gastric Cancer and compare with clinical-pathologic data, including the genetic alterations of these patients, found previously on this institution. Methods: 26 cases of paraffin-embedded gastric adenocarcinoma tissue of patients of Hospital das Clinicas - School of Medicine of University of Sao Paulo underwent immunostaining to detect the presence and to analyze the pattern of immunoexpression of E-cadherin, Beta-catenin and TP53 using Streptavidine-Biotine-Peroxidade technique. The immunoexpression evaluation was performed utilizing a semiquantitative scale for intensity and distribution. The statistical analysis was done through Students t test and Fishers Exact test. Results: E-cadherin immunoexpression was negative in 11 cases (42.3%), and all of them were diffuse type of Laurén. 15 cases (57.7%) were positive for E-cadherin, from which 9 were of the diffuse type and 6 of intestinal type (p=0.02). In previous study performed on this institution, one missense mutation in exon 12 of CDH1 gene, codon 617, nucleotide 1849 G>A was found on the same case that absence of E-cadherin immunostaining was observed. 61.5% of the tumors were located in the antrum. Beta-catenin immunoexpression was altered in 43.2% and TP53 nuclear immunoreactivity was positive in 46.2% of the tumors. TP53 was solely detected in 12 (46.2%) of the tumors, while E-cadherin was altered in 10/26 (38.5%) negative TP53 tumors, p=0.01. Conclusions: 1) Diffuse type of Laurén is associated to E-cadherin immunoexpression alteration in Familial Gastric Cancer; 2) There was no association between E-cadherin immunoexpression and age, gender or tumor location, as well as there was no association between Beta-catenin and the clinical-pathologic data; there was an inverse association between immunoexpression of TP53 and E-cadherin; 3) There may be two distinct carcinogenesis pathways on familial gastric cancer cases that imunoexpression alterations were detected.

Orientadores: Nelson Marcio Gomes Caserta, Nelson Adami Andreollo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:57:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_RicardoHoelzdeOliveira_M.pdf: 3905509 bytes, checksum: 23dca8471ab6fab1bb855e172bbb54ac (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Objetivo: Avaliar a tomografia computadorizada com múltiplas fileiras de detectores no estadiamento pré-operatório da profundidade de invasão tumoral, acometimento linfonodal e metastático, de acordo com a classificação TNM, em pacientes com adenocarcinoma gástrico. Métodos: 50 pacientes com câncer gástrico foram submetido a estadiamento pré-operatório com tomografia computadorizada de 64 canais de detectores. Dois radiologistas analisaram independentemente as imagens e classificaram os achados. A sensibilidade, especificidade, acurácia e acurácia global para cada avaliador foram calculadas. A concordância inter-observador também foi avaliada. Resultados: A acurácia na classificação das categorias T variou entre 74% e 96% para o observador 1 e entre 80% e 92% para o observador 2. A acurácia global foi de 70% para ambos os observadores. O kappa ponderado foi de 0,75, consistente com uma concordância inter-observador substancial. A acurácia na classificação do acometimento linfonodal (categoria N) variou entre 55% e 79% para o observador 1 e entre 73% e 82% para o observador 2. A avaliação do acometimento metastático evidenciou acurácia global foi de 89,6 % para ambos os observadores. Conclusão: A tomografia computadorizada com 64 canais de detectores evidenciou acurácia clinicamente relevante no estadiamento pré-operatório do adenocarcinoma gástrico / Abstract: Aims: To evaluate the diagnostic performance of multidetector computed tomography (MDCT) with regard to preoperative staging of tumor invasion depth and the presence of lymph node and metastatic involvement according to the TNM classification, in patients with gastric carcinoma. Methodology: Fifty patients with biopsy-confirmed gastric cancer were subjected to pre-surgical staging by 64 channel MDCT. Two radiologists independently analyzed the images and classified the findings. The sensitivity, specificity, accuracy and overall accuracy were calculated for each reviewer. The inter-reviewer agreement was also evaluated. Results: When classifying the T categories, accuracy varied from 74 to 96% for reviewer 1 and from 80 to 92% for reviewer 2. The overall accuracy was 70% for both reviewers. There was substantial inter-reviewer agreement (kappa = 0.75). The accuracy of the lymph node involvement (category N) classification varied from 55¿79% for reviewer 1 and 73¿82% for reviewer 2. The evaluation of metastatic involvement showed an overall accuracy of 89.6% for both reviewers. Conclusion: The 64 channel MDCT showed clinically relevant accuracy in the preoperative staging of gastric carcinoma / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestre em Ciências

INTRODUÇÃO: Recentemente, a classificação molecular do câncer gástrico (CG) emergiu como opção promissora para definir subgrupos prognósticos, distinguir o comportamento biológico, além de permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos para drogas específicas. Por meio de técnicas moleculares, o CG foi dividido em 4 subtipos: instabilidade de microssatélites (MSI), vírus Epstein-Barr (EBV)-positivo, genomicamente estável (GS) e instabilidade cromossômica (CIN). Os custos associados à complexidade técnica das metodologias moleculares são ainda um obstáculo para sua implantação na prática de rotina. OBJETIVOS: Determinar os grupos da classificação molecular por meio da expressão proteica de marcadores associados a cada subtipo. Comparar as diferentes classificações moleculares existentes e propor um novo modelo. MÉTODOS: Foram avaliados, retrospectivamente, 287 pacientes com CG submetidos à gastrectomia-D2 curativa, por meio da construção de tissue microarray. A expressão das proteínas de reparo do DNA, E-caderina e p53 foram avaliadas por imuno-histoquímica (IH), determinando os grupos MSI, GS e CIN, respectivamente. O EBV foi detectado por hibridização in situ (ISH). RESULTADOS: Após avaliação histopatológica, 179 (62,4%) pacientes foram classificados como CIN, 58 (20,2%) MSI, 30 (10,5%) EBV e 20 (7%) como GS. Os subtipos associaram-se com características distintas, tais como: gênero masculino (EBV, p=0.101); idade avançada (MSI, p=0,017), menor relação neutrófilo-linfócito (CIN, p=0,029), gastrectomia total (EBV, p < 0,001), localização distal (MSI, p=0,004), Laurén difuso (GS, p < 0,001), e estádio avançado (GS, p=0,014). O subtipo MSI apresentou melhor sobrevida livre de doença (SLD) (82,8%), seguido pelo EBV e CIN (ambos com 70%) e GS (50%) (p=0.005). A sobrevida global (SG) foi maior nos tumores MSI (75,9%), seguido pelo EBV (73,3%), CIN (65.4%) e GS (45%, mediana de 25 meses) (p=0.007). Em análise multivariada, gastrectomia total, pT, pN e os subtipos tumorais foram fatores significativos associados à SLD (MSI p=0,012; EBV p=0,037; CIN p=0,018; GS referência). Do mesmo modo, o tipo de cirurgia, pT, e os subtipos tumorais foram fatores independentes associados a SG (MSI p=0,010; EBV p=0,006; CIN p=0,025; GS referência). Com base no risco de recidiva dos pacientes do estudo, nova classificação, que inclui 5 subtipos, foi proposta. Evidenciou-se que a classificação por risco e cluster tiveram melhor acurácia para identificar recidivas e óbitos respectivamente. CONCLUSÃO: A análise IH/ISH foi capaz de determinar subtipos de CG com características clinicopatológicas e prognósticos distintos, reproduzindo os subtipos obtidos pela classificação molecular / BACKGROUND: Recently, the molecular classification of gastric cancer (CG) emerged as a promising option to define prognostic subgroups, to distinguish biological behavior, and to identify potential therapeutic targets for specific drugs. Through molecular techniques, GC was divided into 4 subtypes: microsatellite instability (MSI), Epstein-Barr virus (EBV) positive, genomically stable (GS) and chromosomal instability (CIN). The costs associated with the technical complexity of the molecular methodologies are still an obstacle to its implementation in routine practice. OBJECTIVES: To determine molecular classification groups by means of protein expression of markers associated with each subtype. To compare the different existing molecular classifications and propose a new model. METHODS: We retrospectively evaluated 287 CG patients submitted to curative D2-gastrectomy through the construction of tissue microarray. Expression of the DNA repair proteins, E-cadherin and p53 were evaluated by immunohistochemistry (IH), determining the MSI, GS and CIN subtypes, respectively. EBV was detected by in situ hybridization (ISH). RESULTS: After the histopathological evaluation, 179 (62.4%) patients were classified as CIN, 58 (20.2%) MSI, 30 (10.5%) EBV and 20 GS (7%) as GS. The subtypes presented associations with distinct characteristics, such as: male gender (EBV, p=0.101); advanced age (MSI, p=0.017), Laurén diffuse type (GS, p < 0.001), lower neutrophil-lymphocyte ratio (CIN, p=0.029), total gastrectomy (EBV, p < 0.001), distal location (MSI, p=0.004), and advanced stage (GS, p=0.014). The MSI subtype presented better disease-free survival (DFS) (82.8%), followed by the EBV and CIN subtypes (both with 70%) and GS (50%) (p=0.005). Overall survival (OS) was higher in MSI tumors (75.9%), followed by EBV (73.3%), CIN (65.4%) and GS (45%, median of 25 months) (p=0.007). In multivariate analysis, total gastrectomy, tumor invasion, lymph node metastasis, and tumor subtypes were significant factors associated with SLD (MSI p=0.012, EBV p=0.037, CIN p=0.018, GS reference). Likewise, type of surgery, pT, and tumor subtypes were independent factors associated with OS (p=0.010, p=0.010, EBV p=0.006, CIN p=0.025, GS reference). Based on the risk of recurrence, a new classification including 5 subtypes was proposed. It was evidenced that the risk classification and cluster had better accuracy to identify recurrences and deaths respectively. CONCLUSION: The IH / ISH analysis was able to determine CG groups with clinicopathological characteristics and distinct prognoses, reproducing the subtypes obtained by the molecular classification

A galectina-3, um membro da família das proteínas de ligação a glicanas, tem sido objeto de intensa pesquisa nos últimos anos devido ao seu importante papel na biologia tumoral, como a proliferação, transformação, apoptose, angiogênese, adesão, invasão e metástase tumoral. As diferentes funções de galectina-3 nas células tumorais resultam das suas diversas localizações inter- e subcelulares que lhe permite interagir com diferentes proteínas. Esta tese teve como objetivo identificar um papel específico de galectina-3 na regulação da via de sinalização Notch, que cada vez mais tem sido associada com a progressão tumoral e angiogênese. Inicialmente, demonstramos que galectina-3 interage com o receptor Notch-1 e modula diferencialmente a ativação da via pelos ligantes DLL4 e Jagged1. A galectin-3 regulou a expressão dos ligantes de Notch assim como o receptor Notch-1 e extracelularmente recuperou a ativação de Notch na ausência de galectina-3 endógena. Em câncer gástrico humano, a galectina-3 encontrou-se positivamente correlacionada com a expressão de Jagged1, enquanto que a galectina-1, um outro membro da família das galectinas, foi positivamente correlacionado com DLL4. De seguida estudou-se o papel biológico da regulação da via Notch pela galectina-3 na angiogênese. Demonstramos que nas células endoteliais, galectina-3 liga e aumenta a meia vida de Jagged1 promovendo a ativação preferencial da Jagged1/Notch em vez de DLL4/Notch de uma forma independente de VEGF. Verificamos que condições de hipóxia alteraram a expressão de galectina-3 assim como o status de glicosilação das células endoteliais de forma a promover a ativação de Jagged1/Notch e o aumento de angiogênese. A superexpressão de Jagged1 num modelo de carcinoma de pulmão de Lewis, acelerou o crescimento tumoral in vivo que foi inibido em camundongos Lgals3-/-. Por fim, avaliou-se o papel de galectina-3 na resistência das células tumorais a quimioterápicos. Observamos que a expressão de sialil-Tn, um produto biossintético da ST6GalNAc-I, diminuiu in vitro como in vivo a presença e os sítios de ligação de galectina-3 na superfície da células levando à sua acumulação no meio intracelular. Extracelularmente, galectina-3 não levou à indução de morte celular, no entanto contribuiu para a morte induzida por quimioterápicos. As células expressando sialil-Tn encontraram-se protegidas. Em amostras de tumor gástrico, os sítios de ligação de galectina-3 encontraram-se negativamente correlacionados com a expressão de sialil-Tn. Este conhecimento possui implicações diretas no desenvolvimento de estratégias visando o controle do crescimento tumoral e angiogênese e abre novas perspectivas no combate à resistência tumoral à terapia / Galectin-3, a member of a family of glycan binding proteins has been the subject of an intense research over the past few years due to its important role in cancer biology, such as cancer cell growth, transformation, apoptosis, angiogenesis, adhesion, invasion and metastasis. The different roles of galectin-3 on cancer cells behavior appears to have originated from its diverse inter- and subcellular localizations where it interacts with several different binding partners. The aim of this thesis was to pinpoint a specific role for galectin-3 in regulating Notch signaling pathway in cancer. Notch signaling has emerged as an important pathway in carcinogenesis, and activated Notch-1 signaling has being associated with cancer progression and angiogenesis. Initially, we found that galectin-3 was able to interact with Notch-1 receptor and to differentially modulate Notch signaling activation by DLL4 and Jagged1 ligands. Galectin-3 was found to regulate the expression of the Notch ligands and Notch-1 receptor and its extracellular form was able to rescue Notch activation in the absence of endogenous galectin-3. In human gastric cancer, galectin-3 was positively correlated with the expression of Jagged1 whereas galectin1, another member of the galectin family, was positively correlated with DLL4. Furthermore, we studied the biological role of Notch regulation by galectin-3 in angiogenesis. We showed that, in endothelial cells, galectin-3 binds to and increases Jagged1 protein half-life promoting Jagged1/Notch over DLL4/Notch signaling in a VEGF independent way. Hypoxic conditions changed galectin-3 expression and the glycosylation status of endothelial cells, acting in concert to promote Jagged1/Notch activation and sprouting angiogenesis. Jagged1 overexpression in Lewis lung carcinoma accelerated tumor growth in vivo that was prevented in Lgals3-/- mice. Finally, we evaluated the role of galectin-3 in cancer cell resistance to therapy. We found that the expression of sialyl-Tn, a biosynthetic product of ST6GalNAc-I, was able to decrease cell surface galectin-3 and galectin-3-binding sites both in vitro and in vivo leading to an intracellular accumulation of this protein. Exogenously added galectin-3 was found to have no effect on cancer cell death but contributed to chemotherapy-induced apoptosis. Sialyl-Tn expressing cells were protected. In human gastric cancer samples, galectin-3 binding sites were negatively correlated with the expression of sialyl-Tn. This knowledge has direct implications for the development of strategies aimed at controlling tumor growth and angiogenesis and open novel perspectives to overcome tumor resistance to therapy