Bei strukturorientierten, aus relativ großen Holzpartikeln aufgebauten Holzwerkstoffen wie z.B. OSB (oriented strand board) addieren sich die gerichteten Festigkeiten der einzelnen Lagen je nach Orientierung der Partikel und der Verteilung ihrer Größenparameter. Wünschenswert wäre eine Messung der Partikelgeometrie und Orientierung möglichst im Prozess, z.B. am Formstrang vor der Presse direkt durch den „Blick auf das Vlies“. Bisher sind regelmäßige on-line-Messungen der Spangeometrie aber nicht möglich, und Einzelspanmessungen werden nicht vorgenommen, weil sie zu aufwändig wären. Um die Partikelkonturen zunächst hinreichend für die Vermessung zu restaurieren und dann zu vermessen, muss ein mehrstufiges Verfahren angewendet werden, das eine Szene mit Strands und mehr oder weniger deutlichen Kanten zunächst als „Grauwertgebirge“ auffasst. Zur Segmentierung reicht ein Watershed-Algorithmus nicht aus. Auch ein zweistufiger Kantendetektor nach Canny liefert allein noch kein ausreichendes Ergebnis, weil sich keine geschlossenen Objektkonturen ergeben. Hinreichend dagegen ist ein komplexes Verfahren auf der Grundlage der Höhenschichtzerlegung und nachfolgenden Synthese: Nach einer Transformation der Grauwerte des Bildes in eine reduzierte, gleichverteilte Anzahl von Höhenschichten werden zwischen diesen die lokalen morphologischen Gradienten berechnet und herangezogen für die Rekonstruktion der ursprünglichen Spankonturen. Diese werden aus den Höhenschichten aufaddiert, wobei allerdings nur Teilflächen innerhalb eines für die gesuchten Spangrößen plausiblen Größenintervalls einbezogen werden, um Störungen zu unterdrücken. Das Ergebnis der Rekonstruktion wird zusätzlich verknüpft mit den bereits durch einen Canny-Operator im Originalbild detektierten deutlichen Kanten und morphologisch bereinigt. Diese erweiterte Höhenschichtanalyse ergibt ausreichend segmentierte Bilder, in denen die Objektgrenzen weitgehend den Spankonturen entsprechen. Bei der nachfolgenden Vermessung der Objekte werden Standard-Algorithmen eingesetzt, wobei sich die Approximation von Spankonturen durch momentengleiche Ellipsen als sinnvoll erwies. Verbliebene Fehldetektionen können bei der Vermessung unterdrückt werden durch Formfaktoren und zusätzliche Größenintervalle. Zur Darstellung und Charakterisierung der Größenverteilungen für die Länge und die Breite wurden die nach der Objektfläche gewichtete, linear skalierte Verteilungsdichte (q2-Verteilung), die Verteilungssumme und verschiedene Quantile verwendet. Zur Umsetzung und Demonstration des Zusammenwirkens der verschiedenen Algorithmen wurde auf der Basis von MATLAB das Demonstrationsprogramm „SizeBulk“ entwickelt, das Bildfolgen verarbeiten kann und mit dem die verschiedenen Varianten der Bildaufbereitung und Parametrierung durchgespielt werden können. Das Ergebnis des Detektionsverfahrens enthält allerdings nur die vollständigen Konturen der ganz oben liegenden Objekte; Objekte unterhalb der Außenlage sind teilweise verdeckt und können daher nur unvollständig vermessen werden. Zum Test wurden daher synthetische Bilder mit vereinzelten und überlagerten Objekten bekannter Größenverteilung erzeugt und dem Detektions- und Messverfahren unterworfen. Dabei zeigte sich, dass die Größenstatistiken durch den Überlagerungseffekt und auch die Spanorientierung zwar beeinflusst werden, dass aber zumindest die Modalwerte der wichtigsten Größenparameter Länge und Breite meist erkennbar bleiben. Als Versuchsmaterial dienten außer den synthetischen Bildern verschiedene Sortimente von OSB-Strands aus Industrie- und Laborproduktion. Sie wurden sowohl manuell vereinzelt als auch zu einem Vlies arrangiert vermessen. Auch bei realen Strands zeigten sich gleiche Einflüsse der Überlagerung auf die Größenverteilungen wie in der Simulation. Es gilt aber auch hier, dass die Charakteristika verschiedener Spankontingente bei gleichen Aufnahmebedingungen und Auswerteparametern gut messbar sind bzw. dass Änderungen in der gemessenen Größenverteilung eindeutig den geometrischen Eigenschaften der Späne zugeordnet werden können. Die Eignung der Verarbeitungsfolge zur Charakterisierung von Spangrößenverteilungen bestätigte sich auch an Bildern, die ausschließlich am Vlies auf einem Formstrang aufgenommen wurden. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass mit der erweiterten Höhenschichtanalyse auch Bilder von Spanplattenoberflächen ausgewertet werden könnten und daraus auf die Größenverteilung der eingesetzten Deckschichtspäne geschlossen werden kann. Das vorgestellte Verfahren ist daher eine gute und neuartige Möglichkeit, prozessnah an Teilflächen von OSB-Vliesen anhand von Grauwertbildern die Größenverteilungen der Strands zu charakterisieren und eignet sich grundsätzlich für den industriellen Einsatz. Geeignete Verfahren waren zumindest für Holzpartikel bisher nicht bekannt. Diese Möglichkeit, Trends in der Spangrößenverteilung automatisch zu erkennen, eröffnet daher neue Perspektiven für die Prozessüberwachung. / The strength of wood-based materials made of several layers of big and oriented particles like OSB (oriented strand board) is a superposition of the strengths of the layers according to the orientation of the particles and depending from their size distribution. It would be desirable to measure particle geometry and orientation close to the production process, e.g. with a “view onto the mat”. Currently, continuous on-line measurements of the particle geometry are not possible, while measurements of separated particles would be too costly and time-consuming. Before measuring particle shapes they have to be reconstructed in a multi-stage procedure which considers an image scene with strands as “gray value mountains”. Segmentation using a watershed algorithm is not sufficient. Also a two-step edge detector according to Canny does not yield closed object shapes. A multi-step procedure based on threshold decomposition and recombination however is successful: The gray values in the image are transformed into a reduced and uniformly distributed set of threshold levels. The local morphological gradients between these levels are used to re-build the original particle shapes by adding the threshold levels. Only shapes with a plausible size corresponding to real particle shapes are included in order to suppress noise. The result of the reconstruction from threshold levels is then matched with the result of the strong edges in the original image, which had been detected using a Canny operator, and is finally cleaned with morphological operators. This extended threshold analysis produces sufficiently segmented images with object shapes corresponding extensively to the particle shapes. Standard algorithms are used to measure geometric features of the objects. An approximation of particle shapes with ellipses of equal moments of inertia is useful. Remaining incorrectly detected objects are removed by form factors and size intervals. Size distributions for the parameters length and width are presented and characterized as density distribution histograms, weighted by the object area and linearly scaled (q2 distribution), as well as the cumulated distribution and different quantiles. A demonstration software “SizeBulk” based on MATLAB has been developed to demonstrate the computation and the interaction of algorithms. Image sequences can be processed and different variations of image preprocessing and parametrization can be tested. However, the detection procedure yields complete shapes only for those particles in the top layer. Objects in lower layers are partially hidden and cannot be measured completely. Artificial images with separated and with overlaid objects with a known size distribution were generated to study this effect. It was shown that size distributions are influenced by this covering effect and also by the strand orientation, but that at least the modes of the most important size parameters length and width remain in evidence. Artificial images and several samples with OSB strands from industrial and laboratory production were used for testing. They were measured as single strands as well as arrangements similar to an OSB mat. For real strands, the same covering effects to the size distributions revealed as in the simulation. Under stable image acquisition conditions and using similar processing parameters the characteristics of these samples can well be measured, and changes in the size distributions are definitely due to the geometric properties of the strands. The suitability of the processing procedure for the characterization of strand size distributions could also be confirmed for images acquired from OSB mats in a production line. Moreover, it could be shown that the extended threshold analysis is also suitable to evaluate images of particle board surfaces and to draw conclusions about the size distribution of the top layer particles. Therefore, the method presented here is a novel possibility to measure size distributions of OSB strands through the evaluation of partial gray value images of the mat surface. In principle, this method is suitable to be transferred to an industrial application. So far, methods that address the problem of detecting trends of the strand size distribution were not known, and this work shows new perspectives for process monitoring.

Bei strukturorientierten, aus relativ großen Holzpartikeln aufgebauten Holzwerkstoffen wie z.B. OSB (oriented strand board) addieren sich die gerichteten Festigkeiten der einzelnen Lagen je nach Orientierung der Partikel und der Verteilung ihrer Größenparameter. Wünschenswert wäre eine Messung der Partikelgeometrie und Orientierung möglichst im Prozess, z.B. am Formstrang vor der Presse direkt durch den „Blick auf das Vlies“. Bisher sind regelmäßige on-line-Messungen der Spangeometrie aber nicht möglich, und Einzelspanmessungen werden nicht vorgenommen, weil sie zu aufwändig wären. Um die Partikelkonturen zunächst hinreichend für die Vermessung zu restaurieren und dann zu vermessen, muss ein mehrstufiges Verfahren angewendet werden, das eine Szene mit Strands und mehr oder weniger deutlichen Kanten zunächst als „Grauwertgebirge“ auffasst. Zur Segmentierung reicht ein Watershed-Algorithmus nicht aus. Auch ein zweistufiger Kantendetektor nach Canny liefert allein noch kein ausreichendes Ergebnis, weil sich keine geschlossenen Objektkonturen ergeben. Hinreichend dagegen ist ein komplexes Verfahren auf der Grundlage der Höhenschichtzerlegung und nachfolgenden Synthese: Nach einer Transformation der Grauwerte des Bildes in eine reduzierte, gleichverteilte Anzahl von Höhenschichten werden zwischen diesen die lokalen morphologischen Gradienten berechnet und herangezogen für die Rekonstruktion der ursprünglichen Spankonturen. Diese werden aus den Höhenschichten aufaddiert, wobei allerdings nur Teilflächen innerhalb eines für die gesuchten Spangrößen plausiblen Größenintervalls einbezogen werden, um Störungen zu unterdrücken. Das Ergebnis der Rekonstruktion wird zusätzlich verknüpft mit den bereits durch einen Canny-Operator im Originalbild detektierten deutlichen Kanten und morphologisch bereinigt. Diese erweiterte Höhenschichtanalyse ergibt ausreichend segmentierte Bilder, in denen die Objektgrenzen weitgehend den Spankonturen entsprechen. Bei der nachfolgenden Vermessung der Objekte werden Standard-Algorithmen eingesetzt, wobei sich die Approximation von Spankonturen durch momentengleiche Ellipsen als sinnvoll erwies. Verbliebene Fehldetektionen können bei der Vermessung unterdrückt werden durch Formfaktoren und zusätzliche Größenintervalle. Zur Darstellung und Charakterisierung der Größenverteilungen für die Länge und die Breite wurden die nach der Objektfläche gewichtete, linear skalierte Verteilungsdichte (q2-Verteilung), die Verteilungssumme und verschiedene Quantile verwendet. Zur Umsetzung und Demonstration des Zusammenwirkens der verschiedenen Algorithmen wurde auf der Basis von MATLAB das Demonstrationsprogramm „SizeBulk“ entwickelt, das Bildfolgen verarbeiten kann und mit dem die verschiedenen Varianten der Bildaufbereitung und Parametrierung durchgespielt werden können. Das Ergebnis des Detektionsverfahrens enthält allerdings nur die vollständigen Konturen der ganz oben liegenden Objekte; Objekte unterhalb der Außenlage sind teilweise verdeckt und können daher nur unvollständig vermessen werden. Zum Test wurden daher synthetische Bilder mit vereinzelten und überlagerten Objekten bekannter Größenverteilung erzeugt und dem Detektions- und Messverfahren unterworfen. Dabei zeigte sich, dass die Größenstatistiken durch den Überlagerungseffekt und auch die Spanorientierung zwar beeinflusst werden, dass aber zumindest die Modalwerte der wichtigsten Größenparameter Länge und Breite meist erkennbar bleiben. Als Versuchsmaterial dienten außer den synthetischen Bildern verschiedene Sortimente von OSB-Strands aus Industrie- und Laborproduktion. Sie wurden sowohl manuell vereinzelt als auch zu einem Vlies arrangiert vermessen. Auch bei realen Strands zeigten sich gleiche Einflüsse der Überlagerung auf die Größenverteilungen wie in der Simulation. Es gilt aber auch hier, dass die Charakteristika verschiedener Spankontingente bei gleichen Aufnahmebedingungen und Auswerteparametern gut messbar sind bzw. dass Änderungen in der gemessenen Größenverteilung eindeutig den geometrischen Eigenschaften der Späne zugeordnet werden können. Die Eignung der Verarbeitungsfolge zur Charakterisierung von Spangrößenverteilungen bestätigte sich auch an Bildern, die ausschließlich am Vlies auf einem Formstrang aufgenommen wurden. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass mit der erweiterten Höhenschichtanalyse auch Bilder von Spanplattenoberflächen ausgewertet werden könnten und daraus auf die Größenverteilung der eingesetzten Deckschichtspäne geschlossen werden kann. Das vorgestellte Verfahren ist daher eine gute und neuartige Möglichkeit, prozessnah an Teilflächen von OSB-Vliesen anhand von Grauwertbildern die Größenverteilungen der Strands zu charakterisieren und eignet sich grundsätzlich für den industriellen Einsatz. Geeignete Verfahren waren zumindest für Holzpartikel bisher nicht bekannt. Diese Möglichkeit, Trends in der Spangrößenverteilung automatisch zu erkennen, eröffnet daher neue Perspektiven für die Prozessüberwachung. / The strength of wood-based materials made of several layers of big and oriented particles like OSB (oriented strand board) is a superposition of the strengths of the layers according to the orientation of the particles and depending from their size distribution. It would be desirable to measure particle geometry and orientation close to the production process, e.g. with a “view onto the mat”. Currently, continuous on-line measurements of the particle geometry are not possible, while measurements of separated particles would be too costly and time-consuming. Before measuring particle shapes they have to be reconstructed in a multi-stage procedure which considers an image scene with strands as “gray value mountains”. Segmentation using a watershed algorithm is not sufficient. Also a two-step edge detector according to Canny does not yield closed object shapes. A multi-step procedure based on threshold decomposition and recombination however is successful: The gray values in the image are transformed into a reduced and uniformly distributed set of threshold levels. The local morphological gradients between these levels are used to re-build the original particle shapes by adding the threshold levels. Only shapes with a plausible size corresponding to real particle shapes are included in order to suppress noise. The result of the reconstruction from threshold levels is then matched with the result of the strong edges in the original image, which had been detected using a Canny operator, and is finally cleaned with morphological operators. This extended threshold analysis produces sufficiently segmented images with object shapes corresponding extensively to the particle shapes. Standard algorithms are used to measure geometric features of the objects. An approximation of particle shapes with ellipses of equal moments of inertia is useful. Remaining incorrectly detected objects are removed by form factors and size intervals. Size distributions for the parameters length and width are presented and characterized as density distribution histograms, weighted by the object area and linearly scaled (q2 distribution), as well as the cumulated distribution and different quantiles. A demonstration software “SizeBulk” based on MATLAB has been developed to demonstrate the computation and the interaction of algorithms. Image sequences can be processed and different variations of image preprocessing and parametrization can be tested. However, the detection procedure yields complete shapes only for those particles in the top layer. Objects in lower layers are partially hidden and cannot be measured completely. Artificial images with separated and with overlaid objects with a known size distribution were generated to study this effect. It was shown that size distributions are influenced by this covering effect and also by the strand orientation, but that at least the modes of the most important size parameters length and width remain in evidence. Artificial images and several samples with OSB strands from industrial and laboratory production were used for testing. They were measured as single strands as well as arrangements similar to an OSB mat. For real strands, the same covering effects to the size distributions revealed as in the simulation. Under stable image acquisition conditions and using similar processing parameters the characteristics of these samples can well be measured, and changes in the size distributions are definitely due to the geometric properties of the strands. The suitability of the processing procedure for the characterization of strand size distributions could also be confirmed for images acquired from OSB mats in a production line. Moreover, it could be shown that the extended threshold analysis is also suitable to evaluate images of particle board surfaces and to draw conclusions about the size distribution of the top layer particles. Therefore, the method presented here is a novel possibility to measure size distributions of OSB strands through the evaluation of partial gray value images of the mat surface. In principle, this method is suitable to be transferred to an industrial application. So far, methods that address the problem of detecting trends of the strand size distribution were not known, and this work shows new perspectives for process monitoring.

DNA provides an ideal substrate for nanoscale construction and programmable dynamic mechanisms. DNA mechanisms can be used to produce DNA motors which do mechanical work, e.g. transportation of a substrate along a track. I explore a method for control of a DNA mechanism ubiquitous in DNA motor designs, toehold-mediated strand displacement, by which one strand in a duplex can be swapped for another. My method uses a mismatch between a pair of nucleotides in the duplex, which is repaired by displacement. I find that displacement rate can be fine-tuned by adjusting the position of the mismatch in the duplex, enabling the design of complex kinetic behaviours. A bipedal motor [1, 2] is designed to walk along a single-stranded DNA track. Previously the motor has only taken a single step, due to a lack of designs to extend the single-stranded track. I present a novel design for track held under tension using a 3D DNA origami tightrope, and verify its assembly. The bipedal motor design is adapted and a method to specifically place motors on tightropes is demonstrated. Motor operation is investigated on truncated tracks and tightrope tracks by electrophoresis and spectrofluorometry. The motor does not accumulate appreciably at the track end; this is tentatively attributed to rearrangement of the motor between track sites without interaction with fuel. Tightrope origami can hold single-stranded DNA under pN tension. I use tightropes to study hybridization kinetics under tension and find dramatic, non-monotonic changes in hybridization rate constants and dissociation constants with tension in the range ∼0-15 pN. Extended tracks for a 'burnt-bridges' motor which destroys its track as it moves [3] are created on the inside of DNA nanotubes, which can be polymerised to create tracks up to a few mm in length, and on tiles which I attempt to join in a specific order. Crossing of the motor between tubes is verified, and microscopy experiments provide some evidence that track is being cleaved by the motor, a requirement for movement along the track. Tile based tracks are imaged by super-resolution DNA PAINT [4], providing proof-of-principle for track observation to infer motor movement.

The strand similarity and inclusion removal capability are two critical parameters to measure the performance of multi-strand tundish in clean steel production. In this work, the effect of two flow regulators, i.e., Flow Control Devices (FCD) and Electromagnetic Stirring (EMS) on eight-strand tundish performance have been investigated by establishing a water model and conducting numerical simulations of water model. The water model was focused on revealing the effect of stirring while the simulation was employed to investigate the effect of two FCDs, namely baffle wall and turbo-stopper. The analysis of strand similarity and inclusion removal were conducted by analyzing flow characteristics derived from Combined Model of Residence Time Distribution (RTD) curve and observing the flow movement in the tundish model. In addition, the tundish capability to remove inclusions was also studied by injecting inclusion particles using Discrete Phase Model (DPM) in ANSYS Fluent. Experiment results cause the Combined Model needs to be modified. This modification was employed when analyzing tundish configuration involving stirring. By using the modified Combined Model, the stirring can significantly increase the well-mix volume to almost 100% as it annihilates dead zone. The stirring also increases the similarity between strands and makes the RTD curve more similar to ideal mixing curve.  However, the problem of short-circuiting flow need to be solved and care should be taken into consideration regarding the selection of stirring direction as well as bath surface condition when implementing EMS in reality. The simulation results show that the addition of baffle wall and turbo-stopper are beneficial to improve mixing as well as to avoid the short-circuiting flow. Furthermore, compared to individual FCD, the combination of baffle wall and turbo-stopper results in the best performance to remove inclusions by providing surface-directed flow and generating a higher plug flow.

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Η αντικαρκινική ένωση δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται ευρέως είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών, του πνεύμονα αλλά και σε περιπτώσεις οξείας λευχαιμίας και σαρκωμάτων. Σε προηγούμενη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο μας, σε λεμφοκύτταρα ανθρώπου αλλά και στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12, βρέθηκε ότι επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων ως αποτέλεσμα κυρίως χρωμοσωματικής θραύσης. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε περαιτέρω η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού καθώς και η ικανότητά της να επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης σε λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60. Η μελέτη του κερματισμού του DNA λόγω της δράσης της δοξορουβικίνης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (SCGE) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Εκτιμήθηκαν οι παράμετροι tail length, % DNA in tail, tail moment, και olive tail moment που αποκαλύπτουν θραύση του DNA. Επιπρόσθετα, η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού αναλύθηκε μέσω δημιουργίας κλάσεων με ελάχιστη έως μέγιστη βλάβη. O μηχανισμός με τον οποίο προκαλεί θραύση του DNA διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση των επιδιορθωτικών ενζύμων Fpg και hOOG1. Μετέπειτα, εξετάστηκε η ικανότητα της δοξορουβικίνης να επάγει την απόπτωση. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN). Επίσης, με τη μέθοδο CBMN πραγματοποιήθηκε μελέτη του φαινομένου της χρωμοσωματικής θραύσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίον η υπό εξέταση χημική ένωση επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης, αναλύθηκε η ικανότητά της να τροποποιεί την έκφραση της κασπάσης-3, μιας πρωτεΐνης που παίζει σημαντικό ρόλο στον καταρράκτη των μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος ανοσοαποτύπωσης της παραπάνω πρωτεΐνης (Western blot). Με βάση τα ευρήματά μας, η δοξορουβικίνη παρουσιάζει θραυσματογόνο δράση, όπως φάνηκε από την αύξηση της εξόδου του DNA από τους πυρήνες των κυττάρων μετά από ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες. Η δημιουργία των ρηγμάτων είναι ισχυρότερη σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού σχετίζεται με την οξείδωση των βάσεων του DNA, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες θέσεων (alkali labile sites). Επίσης, προκαλεί οριακή αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν, ενώ δε φαίνεται να επάγει τη δημιουργία των μικροπυρήνων στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με την ιδιότητά της να προκαλεί μεγαλύτερη συχνότητα ρηγμάτων του DNA στις μικρές συγκεντρώσεις. Επιπρόσθετα, επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης. Η επαγωγή αυτή είναι ισχυρότερη σε υψηλές συγκεντρώσεις και δικαιολογεί τις μειωμένες συχνότητες ρηγμάτων και μικροπυρήνων στις συγκεντρώσεις αυτές. Η κασπάση 3 συμμετέχει στην επαγόμενη από τη δοξορουβικίνη απόπτωση όπως φάνηκε από την αύξηση της έκφρασης της κασπάσης 3, μετά από ανάλυση κατά western, σε κυτταρικές καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία δοξορουβικίνης. / The anticancer drug doxorubicin is widely used, either alone or in combination with other anticancer drugs, in the treatment of solid tumours of the breast, lung, ovary, as well as in acute leukemia and sarcomas. Previous research in our laboratory showed that doxorubicin is able to induce micronucleus generation, in human lymphocytes and mouse cell line C2C12, mainly due to chromosome breakage. In the present study we investigated the clastogenic activity of doxorubicin as well as its ability to induce apoptosis. Ηuman leukemic cells HL-60 were chosen as the cell system to proceed our research. The clastogenic activity of doxorubicin was investigated by alkaline Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE assay-Comet assay). Four parameters were analyzed, tail length, % DNA in tail, tail moment, and olive tail moment, which reveal DNA breakage. Additionally the capacity of doxorubicin to induce DNA fragmentation was analyzed by stratifying the cells into five classes with various degrees of DNA damage, from undamaged DNA to severely damaged DNA. The mechanism by which doxorubicin exerts its clastogenic activity was studied by enzyme linked comet assay. We used Fpg and hOOG1 DNA glycosylases. The ability of doxorubicin to induce apoptosis was studied by Cytokinesis-block Micronucleus assay. Also, the CBMN assay was used to assess the micronucleation on HL-60 due to the action of doxorubicin. To further elucidate the mechanism by which doxorubicin induce apoptosis we examined the ability of this compound to alter the expression of caspase 3, that plays a key role in the cascade of molecular events of programmed cell death. This analysis was performed by Western blot. Our findings indicate that doxorubicin exerts clastogenic activity as it provokes DNA migration from the nucleus after SCG electrophoresis in alkaline conditions. The generation of breaks on DNA strands seems to be more potent at low concentrations. The ability of doxorubicin to induce fragmentation of genetic material is correlated with the oxidation of DNA bases resulting in the formation of alkali labile sites. Furthermore, it induces marginal increase in the frequency of micronuclei at lower concentrations, while it doesn’t seem to induce micronucleation at higher concentrations. This finding is in accordance with the ability of doxorubicin to generate higher frequency of DNA breaks at low concentrations. Additionally, doxorubicin induces apoptosis. This induction is more potent at higher concentrations and is consistent with the reduced frequency of breaks and micronucleus generation at these concentrations. Activation of apoptosis due to doxorubicin treatment seems to be mediated by caspase 3.

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Nucleotide synthesis is a conserved and highly regulated response to DNA damage, required for the efficient repair of DNA double strand breaks (DSB) by homologous recombination (HR). This is essential to prevent loss of heterozygosity (LOH) and maintain genome stability. The aim of this study was to identify new genes important for HR through roles in damage-induced nucleotide synthesis. A screen was performed to identify S. pombe gene deletion strains whose DSB sensitivity was suppressed by deleting the ribonucleotide reductase (RNR) inhibitor spd1⁺ to promote nucleotide synthesis. The screen identified a number of genes including ddb1⁺, cdt2⁺, rad3⁺ and csn1⁺ which have known roles in nucleotide synthesis. Distinct roles were identified for the DNA damage checkpoint in suppressing LOH. rad3⁺, rad26⁺, rad17⁺ and the rad9⁺, rad1⁺ and hus1⁺ genes encoding the 9-1-1 complex were required for DNA damage-induced nucleotide synthesis through Cdt2 induction to promote Spd1 degradation. The HR repair defect of rad3⁺ and rad26⁺ deletion strains was partially suppressed by spd1⁺ deletion. However, the HR repair defect of rad17⁺, rad9⁺, rad1⁺ and hus1⁺ deletion strains was not suppressed. An additional role was confirmed for Rad17 and the 9-1-1 complex in preventing LOH by promoting DSB resection. A role was identified for the Gcn5 histone acetyl transferase (HAT) protein module, consisting of Gcn5, Ngg1, Ada2 and Sgf29, in suppressing DSB sensitivity by promoting nucleotide synthesis. This was independent of Cdt2 or RNR protein levels. The Gcn5 HAT module was also found to regulate DSB repair pathway choice consistent with previous observations. Deletion of gcn5⁺, ngg1⁺ or ada2⁺ decreased HR and increased non-homologous end joining. Surprisingly, deletion of spd1⁺ in a gcn5∆, ngg1∆ or ada2∆ background also promoted HR. This predicts a role for nucleotide pools in regulating DSB repair pathway choice. Eleven other candidates showed repeatable suppression of DSB sensitivity following spd1⁺ deletion. However many of these candidates did not show reduced nucleotide levels. This suggests deleting spd1⁺ may also suppress DSB sensitivity by a different mechanism.