Carcinome hépatocellulaire (CHC) est le sixième cancer et la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde. Dans la majorité des cas, le CHC se développe sur une maladie chronique associée à des étiologies variées telles que l'infection par le virus de l'hépatite B ou l’hépatite C, la consommation excessive d'alcool et des maladies métaboliques. Le développement des maladies chroniques du foie qui conduisent à la cirrhose puis au cancer induisent des modifications de la composition chimique des cellules et des tissus. En effet, la carcinogenèse hépatique est un processus en plusieurs étapes caractérisé par la progression de nodules de régénération, de nodules dysplasiques de bas grade puis de grade et enfin du CHC. Le traitement du CHC reste difficile et la transplantation du foie est la seule option thérapeutique curative à long terme. Le problème est qu'il n'y a pas de marqueur objectifs et quantifiables pour contrôler la qualité d’un greffon. Des biomarqueurs spécifiques marquant la progression du CHC font également défauts.Dans ce travail de thèse, nous avons évalué l’intérêt de la microspectroscopie infrarouge (IR) pour le diagnostic de la stéatose, qui est le facteur le plus important affectant la reprise de la fonction hépatique après greffe de foie. La microspectroscopie infrarouge permet de détecter de façon qualitative et quantitative les caractéristiques biochimiques liées aux différents constituants moléculaires présents dans l'échantillon biologique. Nos travaux ont montré que la progression de la stéatose hépatique correspond non seulement à l'accumulation de lipides, mais également à des changements spectaculaires dans la composition qualitative du tissu. En effet, le bas grade de stéatose présente une diminution de la teneur en glycogène et une augmentation concomitante de lipides par rapport au foie normal. La stéatose intermédiaire montre une augmentation de glycogène et des changements majeurs sont observés en ce qui concerne les lipides, avec une contribution significative des acides gras estérifiés, des chaînes de carbone allongées et des lipides insaturés. Ces caractéristiques sont encore plus prononcées dans les hauts degrés de stéatose. De plus, nous avons mis en évidence que des changements biochimiques majeurs se produisent dans la partie non-stéatosique du tissu malgré son aspect normal sur le plan histologique, ce qui suggère que l’organe dans son ensemble reflète le degré de la stéatose.La deuxième partie de la thèse est focalisée la carcinogenèse hépatique. Il s’agit d’un processus en plusieurs étapes qui se caractérise dans la plupart des foies cirrhotiques par la progression de nodules hyperplasiques de régénération vers des lésions précancéreuses telles que les nodules dysplasiques de bas grade puis de haut grade et enfin le CHC. Le diagnostic différentiel entre nodules dysplasiques en particulier de haut garde et CHC reste extrêmement difficile. Nous avons abordé le potentiel de la microspectroscopie IR pour le diagnostic des nodules cirrhotiques. Nous avons observé de profondes modifications de la composition biochimique du foie pathologique. En effet, des changements importants ont été détectés dans la composition des lipides, des protéines et des sucres mettant en évidence la reprogrammation métabolique dans la carcinogenèse. Les principaux changements ont été observés dans le domaine de fréquence 950-1480 cm-1 dans lequel plusieurs bandes permettaient la discrimination des nodules cirrhotiques, dysplasiques et tumoraux. Enfin, nous avons montré que le diagnostic peut être réalisé à l’aide d’un microscope de laboratoire qui peut être facilement mis en œuvre en milieu hospitalier. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most common neoplasm and the second most common cause of death in the world. Hepatocarcinogenesis is a multistep process characterized in patients with chronic liver diseases by a spectrum of hepatic nodules that mark the progression from regenerative nodules to dysplastic lesions followed by HCC. Liver transplantation remains the curative therapeutic option able to treat both the HCC and the underlying liver disease. The issue is that there is no objective and quantifiable marker for quality control of liver graft. Specific biomarkers of early stages of HCC are also an unmet need.In this study, we have evaluated the potential of infrared (IR) microspectroscopy for the diagnosis of steatosis, one of the most important factors affecting the liver allograft function. Vibrational microspectroscopy, such as Fourier transform infrared microspectroscopy (FTIR), allows detecting spectral characteristics associated with different molecular components present in the biological sample, both qualitatively and quantitatively. Our first working hypothesis was that the progression of liver steatosis corresponds not only to the accumulation of lipids but also to dramatic changes in the qualitative composition of tissue. Indeed, a lower grade of steatosis showed a decrease in glycogen content and concomitant increase in lipids in comparison with normal liver. Intermediate steatosis exhibited an increase in glycogen and major changes in lipids, with a significant contribution of esterified fatty acids with elongated carbon chains and unsaturated lipids, and these features were more pronounced in a high grade of steatosis. Furthermore, we have shown, that FTIR approach allows a systemic discrimination of morphological features, leading to a separate investigation of steatotic vesicles and the non-steatotic counterpart of the tissue. This highlighted the fact that dramatic biochemical changes occur in the non-steatotic part of the tissue also despite its normal histological aspect, suggesting that the whole tissue reflects the grade of steatosis. The second part of the thesis focused on hepatocarcinogenesis; a multistep process that is characterized in most cirrhotic livers by the progression from hyperplastic regenerative nodules to low grade dysplastic nodules (LGDN), high grade dysplastic nodules (HGDN) and finally small HCC which corresponds either to vaguely nodular well differentiated HCC so called early HCC or to distinctly nodular moderately differentiated hepatocellular carcinomas. Since the differential diagnosis between precancerous dysplastic nodules and early HCC remains extremely difficult, we addressed the potential of FTIR microspectroscopy for grading cirrhotic nodules. The study was focused on 39 surgical specimens including normal livers as controls, dysplastic nodules, early HCC and the progressed HCC. Profound alterations of the biochemical composition of the pathological liver were demonstrated by FTIR microspectroscopy. Indeed, dramatic changes were observed in lipids, proteins and sugars highlighting the metabolic reprogramming in carcinogenesis. The major changes were observed in the frequency domain 950-1480 cm-1 in which several bands allowed significant discrimination of cirrhotic nodules, dysplastic lesions and HCC. Finally, a significant discrimination between benign, dysplastic nodules and early HCC remained possible using a FTIR microscope equipped with a laboratory-based infrared source that can be easily implemented in hospital environment. In conclusion, our study positions FTIR microspectroscopy as a versatile and powerful approach for investigating liver diseases, such as steatosis, dysplastic lesions and cancer. Further studies on larger series of patients as well as on biopsies will allow confirming the clinical reliability of such spectral signatures. Therefore, we anticipate that FTIR microspectroscopy will open new avenue in clinical diagnosis.

Titan, le plus grand satellite de Saturne, possède une atmosphère dense, majoritairement composée d’azote (N_2) et de méthane (〖CH〗_4) et qui s’étend sur environ 1500 km d’altitude. L’interaction entre ces espèces et le rayonnement solaire ouvre la voie à des réactions de photodissociation et de photoionisation qui constituent le point de départ d’une croissance moléculaire très rapide et efficace dès les plus hautes couches de l’atmosphère. Cette croissance aboutie à la synthèse d’aérosols vers 1000 km d’altitude qui précipitent ensuite dans l’atmosphère.L’objectif de cette thèse est, de s’intéresser expérimentalement à l’interaction entre les espèces peuplant la haute atmosphère de Titan et le rayonnement solaire énergétique dans la gamme de l’UV sous vide (VUV), (longueur d’onde < 150 nm). Tout d’abord, nous avons étudié l’interaction avec les petites espèces chimiques neutres et majoritaires grâce à une nouvelle source VUV spécialement conçue pour cette thèse couplée au réacteur photochimique APSIS. Ce dispositif met en lumière la photochimie du système couplé azote-méthane, encore très mal connue.Ensuite, nous nous sommes penchés sur l’effet du VUV sur les aérosols formés dès les plus hautes couches, en photoionisant avec le rayonnement synchrotron de la ligne DESIRS des analogues de ces aérosols produits avec le dispositif PAMPRE. Cette méthode permet d’obtenir des informations sur leur photoionisation (seuil et section efficaces, spectres de photoélectrons) ainsi que sur leurs propriétés optiques. / Titan, Saturn's biggest satellite, possesses a dense atmosphere, mainly composed of nitrogen (N2) and methane (CH4), which goes up to 1500 km in altitude. The interaction between those chemical species and the solar light leads to some photodissociation and photoionization reactions that are the starting point of a fast and efficient molecular growth in the upper layers of the atmosphere. This growth ends with the synthesis of aerosols around an altitude of 1000 km that will then precipitate into the atmosphere.The aim of this thesis is to experimentally study the interaction between the species present in the upper atmosphere and the energetic solar radiations in the vacuum ultraviolet (VUV) range (wavelength below 150 nm). First, we looked at the interaction with the small, neutral and most abundant species thanks to a new VUV source specially designed for this thesis and coupled to photochemical reactor called APSIS. This new platform sheds some light on the photochemistry of a coupled nitrogen-methane system, which remains poorly understood.Then, we focused on the effects of the VUV light on the aerosols formed in the upper layers, by photoionizing, with synchrotron light from the DESIRS beamline, analogs of those aerosols produced on the PAMPRE platform. This method gives information about their photoionization (threshold and cross sections, photoelectron spectra) but also about their optical properties.

L'imagerie par diffraction des rayons X coh´erents (CDI) en condition de Bragg est utilis´e pour ´etudier la d´eformation de nano-objets uniques. Ceci est possible grˆace au d´eveloppement d'optique focalisante, comme les lentilles de Fresnel (FZP), produisant un faisceau sub-micronique coh´erent. Les nanostructure ´etudi´ees sont reconstruite avec des algorithmes d'inversion `a partir de donn´ees de diffraction, sous la forme d'un objet complexe, o`u l'amplitude correspond `a la densit´e ´electronique 3D et la phase correspond `a la projection de la d´eformation de l'objet (par rapport `a un r´eseau cristallin parfait) dans la direction du vecteur de diffraction. Dans ce travail, nous avons ´etudi´e la d´eformation dans des nanofils h´et´erognes (nanofil de GaAs avec une mono-couche de boˆıtes quantiques de InAs) et homog`enes (silicium fortement contraint sur isolant (sSOI)). Lorsqu'un faisceau focalis´e de rayons X est utilis´e, `a la fois l'amplitude et la phase de l'onde incidente doivent ˆetre connu pour une ´etude quantitative. Le faisceau focalis´e utilis´e pendant les exp´eriences a ´et´e recontruit avec la technique CDI, et les effets de cette fonction d'illumination sur l'imagerie de nanofils contraints ont ´et´e ´etudi´es. Mots-cl´es: Imagerie par diffraction x coh´erente, contrainte, nanofils, algorithms d'inversion / The coherent diffraction imaging technique (CDI) in Bragg condition can be used to study strain in single nanowires. This is possible due to the recent development of dedicated focusing optics, e.g. Fresnel Zone Plate (FZP), offering the possibility of focusing x-ray beams to sub-micron sizes while preserving a coherent beam. This technique allows to reconstruct (using phase retrieval algorithms) the studied nanostructure as a complex-valued density map, where the amplitude corresponds to the electronic density and the phase to the displacement of the atoms with respect to a perfect crystalline lattice projected onto the scattering vector. The application of CDI to image the strain into heterogeneous (GaAs nanowire with an insertion of 1 monolayer of quantum dots and InSb nanowire with and insertion of InP) and homogeneous highly stressed nano-structures (strained Silicon-on-Insulator lines) has been studied in this work. When using focused X-ray beams, both the amplitude and of the incoming wavefield must be known for a quantitative reconstruction. CDI has been used to reconstruct the coherent wavefield used during experiments and the effects of this illumination function for the imaging of strained nanowires have been also studied. Keywords: Coherent X-ray diffraction imaging, strain, nanowires, phase retrieval algorithm

Une large hystérèse centrée autour de la température ambiante constitue l'un des objectifs principaux de la recherche sur les matériaux commutables fonctionnels. Dans le domaine très étudié de la conversion de spin, un tel comportement apparaît très rarement. Un nouveau composé, le complexe [Fe(PM-PeA)2(NCSe)2] présentant une large hystérèse autour de la température ambiante a été synthétisé, sous forme de monocristal et de poudre. Ce composé a été la base de deux axes de recherche. Le premier concerne l’étude multi-échelles des relations structure-propriétés en combinant la diffraction des rayons X sur poudre et sur monocristal, à température variable. Un focus tout particulier a été fait sur l’échelle microstructurale, très peu explorée à ce jour. Pour la première fois,la taille des domaines cohérents et le taux de microdéformations, ont été quantifiés pour un composé moléculaire discret à conversion de spin. Le deuxième axe concerne l’investigation de la transition de spin induite par la pression. L’étude in situ par diffraction des rayons X sur monocristal a permis une caractérisation complète de la structure cristalline des deux états de spin, sous pression. Par la suite, un suivi fin de la transition de spin, révélant une piezo-hystérèse, a été fait grâce à la diffraction des rayons X sur poudre, sous pression in situ à l’aide du rayonnement synchrotron. Les expériences couplant pression et température ont donné accès à des informations cruciales, telles que la variation des modules d’élasticité avec la température, les effets de la température sur la pression de transition, le caractère coopératif de la transition et la largeur de la piezo-hystérèse. / Spin crossover (SCO) compounds with a large hysteresis centered around room temperature (RT) are being constantly pursued although such behavior is very rare and most often noticed in coordination networks. In this context, a new molecular discrete compound, the complex [Fe(PM-PeA)2(NCSe)2], showing a large SCO hysteresis spanning RT has been synthesized in both singlecrystal and powder forms. Then, two research lines emerged. The first one concerns the multi-scales study of the structure-properties relationships, combining single-crystal and powder X-ray diffraction at variable temperature. A particular focus has been made on the microstructural scale, almostunexplored until now. For the first time, the coherent domain sizes and the micro-deformation rate has been quantified for a molecular discrete SCO compound. The second part of this work investigates in detail the pressure-induced SCO. The in situ single-crystal X-ray diffraction studies has been carried out to perform a complete characterization of the crystal structure under pressure. Thereafter, an accurate high-pressure X-ray diffraction measurement on the powder, with a synchrotron radiation,provides a fine track of the pressure-induced SCO and showed a piezo-hysteresis. Experiments coupling pressure and temperature brought crucial information pertaining to variation of bulk moduli withtemperature, the piezo-hysteresis width, the temperature dependence of the pressure transition and pressure-induced SCO abruptness, are provided in detail for the first time.

The primary aim of the work presented in this thesis is to elucidate novel information regarding the uptake, storage, distributions, and functions of both copper and zinc in mammalian cells by predominantly using a combination of the high resolution imaging modalities, synchrotron radiation X-ray fluorescence microscopy (SXRF) and standard fluorescence imaging. Results from studies using cell permeable, metal ion selective fluorescent probes suggested the presence of labile pools of copper and zinc localized within the mitochondria and Golgi apparatus. Furthermore, SXRF imaging of a cell line defective in the copper transporter, Atox1, revealed intriguing differences in the Cu distribution of Atox1-/- cells compared to the corresponding wild-type cells. Finally, spatially well-resolved SXRF elemental maps of single, adherent mouse cells revealed remarkable changes in the distributions of both zinc and copper as the cells progressed through the cell cycle. Taken together, findings suggested major roles for copper and zinc within a native biological setting.

Η μεταπτυχιακή εργασία αφορά στον δομικό χαρακτηρισμό πρωτεϊνών φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Στα πλαίσια της εργασίας πραγματοποιείται κρυστάλλωση και μετρήσεις περίθλασης ακτινών-Χ. Κρυσταλλογραφικές μέθοδοι εφαρμόζονται για την ανάλυση και την ερμηνεία των πειραματικών δεδομένων. Επιπλέον, σε συνεργασία με την φαρμακευτική εταιρεία Novo Nordisk A/S μελετάμε την ενδεχόμενη δημιουργία φαρμάκων υπό την μορφή μικροκρυσταλλικών ιζημάτων η οποία έχει εφαρμοστεί ήδη στην περίπτωση της ανθρώπινης ινσουλίνης. Τα πλεονεκτήματα των μικροκρυσταλλικών φαρμάκων έναντι των φαρμάκων υπό την μορφή διαλύματος περιλαμβάνουν την μεγαλύτερη σταθερότητα, υψηλότερη συγκέντρωση φαρμακευτικής ουσίας και τον ακριβή δομικό χαρακτηρισμό του μορίου . Η τεχνική περίθλασης ακτινοβολίας από πολυκρυσταλλικά υλικά (powder diffraction) αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για τον χαρακτηρισμό των διάφορων πολυμόρφων πρωτεϊνικών μικροκρυσταλλικών ιζημάτων. Για αυτό τον σκοπό, πραγματοποιούμε πειράματα κρυστάλλωσης των υπό μελέτη βιομορίων κάτω από διαφορετικές συνθήκες (pH, προσδέτες) και στη συνέχεια, συλλέγουμε δεδομένα περίθλασης ακτινών-Χ από επιλεγμένα δείγματα, χρησιμοποιώντας όργανα υψηλής ευκρίνειας που βρίσκονται σε ερευνητικά ινστιτούτα μεγάλης κλίμακας (Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF, Grenoble, France & Ελβετικό σύγχροτρον, SLS, Villigen, Switzerland). / The main subject of this master thesis is the structural characterization of pharmaceutically interesting proteins. For this purpose, protein crystallization experiments, as well as X-ray diffraction measurements were conducted. Crystallographic methods were employed for the analysis and interpretation of the experimental data. Furthermore, in collaboration with the pharmaceutical company Novo Nordisk A/S, we are investigating the possibility of developing polycrystalline drug formulations, as has already been done in the case of human insulin. The advantages of polycrystalline drugs, as opposed to drugs in solution, include higher stability and concentration of the pharmaceutical substance, as well as allowing for its accurate structural characterisation. The technique of X-ray powder diffraction is considered an important tool for the characterization of the various protein polymorphs that form polycrystalline precipitates. Protein crystallization experiments were performed under a variety of conditions (such as pH alteration, co-crystallization with ligands) and X-ray powder diffraction data were collected using high resolution instruments (European Synchrotron Radiation Facility, ESRF and Swiss Light Source, SLS).

Une radiothérapie efficace nécessite un dépôt de dose localisé à la tumeur, et donc un contraste entre le tissu tumoral et les tissus sains environnants. Une irradiation de basse énergie monochromatique au synchrotron d'une tumeur chargée en éléments lourds permet de maximiser l'interaction photoélectrique dans la tumeur et d'épargner les tissus sains, car les photoélectrons et les électrons Auger produits ont un TEL très élevé et déposent leur énergie autour des éléments lourds, augmentant fortement le dépôt de dose. Ils peuvent induire des dommages à l'ADN (cassures double brin) fortement létaux. Un autre phénomène permet également de promouvoir l'émission d'électrons Auger et d'augmenter ainsi la dose, l'effet Mössbauer. Cette interaction résonante et sans recul spécifique à certains isotopes dont le 57Fe présente une section efficace 450 fois plus importante que celle de l'effet photoélectrique. Ce travail de doctorat a évalué l'utilisation in vitro de nanoparticules de magnétite combinées à ces deux effets physiques. Les nanoparticules présentent une internalisation et une distribution dans les cellules F98 qui sont très propices à la radiosensibilisation : de grandes concentrations proches du noyau des cellules, et peu de toxicité ont été obtenues. Ceci a permis d'obtenir par photoactivation des NPFe un facteur d'augmentation de 3 ce qui est considérable. Ce travail multidisciplinaire rassemble des expériences de physique, de biologie et de chimie, pour évaluer les applications de nanoparticules de fer à la radiothérapie. / An efficient radiotherapy needs a localized dose to the tumour, which means a high contrast between tumorous and healthy tissues. A synchrotron low energy monochromatic irradiation of a tumour charged in high-Z elements allows maximizing photoelectric interactions in the tumour and spare the healthy tissues. Photoelectrons and high LET Auger electrons thus produced deposit their energy locally, enhancing radiation dose to tumor cells. Another interaction allows to enhance the dose by Auger electrons: the Mössbauer effect. This resonant and recoilless interaction specific to some isotopes like 57Fe has a cross section 450 times bigger than photoelectric effect. This thesis evaluates the in vitro use of magnetite nanoparticles combined with those 2 types of interactions. The nanoparticles evaluated present a high internalisation and a perinuclear distribution inside F98 cells. A dose-enhancement factor of 3 was obtained by photo activation of the iron Nps, this represents a huge increase. This multidisciplinary work encompasses experiments in chemistry, physics and biology in order to evaluate the applications of magnetite nanoparticles to radiotherapy.

Le rayonnement synchrotron est l'un des facteurs clés du grand succès de la cristallographie macromoléculaire au cours des dernières décennies. Plus de 90% de toutes les structures de protéines de la base de données PDB a été résolu par cristallographie en utilisant des sources de rayonnement synchrotron et environ 95% d'entre elles a été déterminé à partir de cristaux congelés.Cependant, les structures déterminées par des techniques de congélation sont limitées par la nature statique des cristaux congelés. Avec le développement récent des sources de RX produites par lasers à électrons libres (XFEL), qui sont en mesure de produire des impulsions femtosecondes très intenses de rayons X, l'ère de la « diffraction avant destruction » et de la cristallographie sérielle femtoseconde utilisant des micro- ou nano- cristaux a commencé (SFX).Au cours du procédé SFX un cristal de protéine n'est exposé qu'une fois au faisceau de rayons X pendant quelques dizaines de femtosecondes avant qu'il ne soit complètement détruit. Les données sont collectées à partir de cristaux orientés de façon aléatoire par rapport au faisceau de rayons X; une seule exposition par cristal est possible. Afin de recevoir un ensemble de données plus complet, de nouvelles techniques d'analyse de données de diffraction ont été développées.La première expérimentation réussie du procédé (SFX) a été réalisée au LCLS à Stanford en décembre 2009 sur des cristaux du photosystème I et de lysozyme. Les experts en cristallographie des installations XFEL peuvent déterminer des structures de protéines à température ambiante presque exemptes de dégâts d'irradiation, en raison des pulses de FEL femtosecondes si brèves, qu'ils passent à travers l'échantillon avant que des dommages de rayonnement importants ne se produisent.Après la présentation des premières expériences SFX réussies, des efforts pour effectuer une cristallographie en série de cristaux de taille de l’ordre des micromètres à température ambiante ont commencé au sein des synchrotrons. Une première tentative de cristallographie synchrotron en série et à température ambiante a été tentée à PETRA III à DESY à Hambourg. Cette méthode a été nommée SMX (synchrotron serial millisecond crystallography), où des milliers d'échantillons sont collectés à partir de cristaux individuels passant par le faisceau à rayons X. Avec le développement des techniques de cristallographie série à température ambiante au sein des synchrotrons, la répartition de la dose sur un grand nombre de cristaux compense l’augmentation des dommages liés à l’irradiation à température ambiante.Bien que les sources de rayonnement synchrotron n'atteindront probablement jamais la même luminosité que les impulsions de rayons X comme dans les XFELs, elles ont un certains nombre d'avantages. L'un d'eux est la flexibilité de configuration grâce au paramétrage de lignes de faisceaux microfocus. Un autre est que plusieurs expositions par cristal sont possibles. En outre, les synchrotrons sont plus répandus dans le monde: la probabilité d'obtenir un temps d'expérimentation dans un synchrotron est plus élevée que pour une installation XFEL. En effet, maintenant deux installations XFEL sont ouvertes pour les utilisateurs .L'objectif de cette thèse est de proposer et de mettre en œuvre des méthodes qui permettront de recueillir des données en utilisant l'approche de la cristallographie série à l'installation synchrotron européen (ESRF, Grenoble, France). Cette thèse présente différentes techniques pour réaliser la cristallographie sérielle sur la ligne ID13 à l’ESRF. L'objectif était de développer la cristallographie sérielle sur synchrotron basée sur la numérisation micro-diffraction pour démontrer que les sources de rayonnement synchrotron peuvent être utilisées comme un instrument de routine pour cette technique avec des protéines globulaires et membranaires. Les aspects de la collecte de données et leur traitement seront également discutés. / Synchrotron radiation is one of the key factors for the tremendous success of macromolecular crystallography during the past decades. More than 90 % of all protein structures in PDB database were solved by crystallography using synchrotron radiation sources and around 95 % of them were determined from cryocooled crystals1,2. A whole data set can be collected from one flash-cooled crystal. Data-collection at cryogenic temperatures drastically reduces radiation damage effects. However, structures determined using cryo freezing techniques are limited by static nature of frozen crystals.With the recent development of X-ray free-electron laser facilities (XFELs), which are able to produce extremely intense femtosecond X-ray pulses, the era of “Diffraction before destruction” and serial femtosecond crystallography (SFX) for micro-/nano-sized crystals has begun3. In the SFX technique a protein crystal is only exposed once to the X-ray beam for tens of femtoseconds before it is completely destroyed. The data is collected from randomly oriented crystals that are exposed to the X-ray beam; only one shot per crystal is possible. In order to receive a complete data set, new data analysis techniques that are capable of dealing with large quantities of diffraction data have been developed. First experiment where serial femtosecond crystallography (SFX) approach was first carried out was performed at the Linac Coherent Light Source (LCLS, Stanford, USA) in December 2009 on photosystem I and lysozyme crystals4,5,6. At XFELs facilities crystallographers can perform room temperature structure determination of proteins almost free of radiation damage, due to the fact that femtosecond flashes of FEL is so brief, that it passes through the sample before the significant radiation damage occurs.After presenting first successful experiments with SFX technique, efforts to perform serial crystallography of micron-sized crystals at room-temperature started at synchrotron sources. First attempt to perform synchrotron room-temperature serial crystallography has been done at PETRA III at DESY in Hamburg using glass capillary based microfluidics7. This method was named synchrotron serial millisecond crystallography (SMX), where thousands of patterns are collected from individual crystals passing through the X-ray beam8. With development of room-temperature serial crystallography techniques at the synchrotrons, the exposure distributed on a large number of crystals in the sample, which helps compensating the effect of increased radiation damage at ambient temperature.Although synchrotron sources most certainly will never reach the same brightness of X-ray pulses like XFELs, they have some advantages. One of them is possibility to perform any set up due to the flexibility of the parameters of microfocus beamlines. Another advantage of SMX is that several shots per crystals are possible. Also should be mentioned that synchrotrons are more widespread all over the world, so possibility to get a beamtime at the synchrotron is much higher than at XFELs, because currently only two XFEL facilities are open for users (LCLS, USA and SACLA, Japan).The aim of this dissertation is to propose and to implement methods that will allow to collect data using the serial crystallography approach at the European synchrotron radiation facility (ESRF, Grenoble, France). This dissertation presents different techniques to perform synchrotron serial crystallography at ID13 beamline. The goal was to develop synchrotron serial crystallography based on scanning micro-diffraction to demonstrate that synchrotron sources can be used as a routine instrument to perform serial crystallography with soluble and membrane proteins. The aspects of the data collection and data processing also will be discussed.

Dans cette étude, les aspects méthodologiques pour la production de structures cristallines à haute résolution des protéines membranaires ont été combinés et rapportés ici, ainsi que leur implication pour le cas biologique concret d'étude structurale des principes de fonctionnement de l'histidine kinase transmembranaire.Dans la cristallographie de rayons X, les échantillons de cristaux de protéines varient selon les tailles, les formes et les capacités de diffraction. Pour pouvoir collecter les données de diffraction de la manière la plus efficace, l'échantillon de cristaux doit être correctement caractérisé dans chaque cas particulier. L'analyse raster par rayons X est considérée comme la technique la plus viable pour le faire et dans ce contexte, une méthode d'analyse des échantillons de cristaux pour la cristallographie des protéines est présentée ici, qui est basée sur la technique de balayage des mailles par rayons X développée à l'ESRF. La méthode estime les positions, les tailles et la qualité de la diffraction de chaque cristal dans la zone scannée qui pourrait être plus utile pour la conception rationnelle du processus de collecte de données. La performance de la méthode est démontrée sur plusieurs échantillons de cristaux de protéines.Un autre goulot d'étranglement dans la production des structures cristallines des protéines est un problème de phase communément connu. Les techniques les plus répandues pour traiter la structure qui ne peut pas être résolue avec le remplacement moléculaire sont les techniques de mise en phase expérimentales basées sur SAD ou MAD. Cela implique l'incorporation de divers diffuseurs anormaux à la structure cristalline. Dans la liste des diffuseurs disponibles, les halogénures se distinguent surtout principalement par leur faible toxicité et leur facilité de manipulation, mais en même temps leur capacité à produire un signal anormal. Le protocole de cryo-trempage des cristaux de protéines dans des solutions contenant des halogénures s'est avéré efficace sur les structures protéiques solubles. Dans l'étude actuelle, ce protocole a été testé sur quatre structures cristallines différentes des protéines membranaires. Les résultats présentés indiquent et soutiennent de manière expérimentale que l'iodure pourrait être facilement et efficacement utilisé pour résoudre le problème de phase dans le cas des structures de cristaux de protéines membranaires.Le capteur histidine kinases est l'un des récepteurs transmembranaires les plus communs présents dans tous les royaumes de la vie. La compréhension des principes de signalisation transmembranaire de l'histidine kinases sensorielle est une question fondamentale qui reste actuellement sans réponse. Pour arriver à l'idée de quels changements structurels fournissent la transmission du signal à travers la membrane lipidique dans ce travail, la structure cristalline de la construction tronquée de l'histidine kinase NarQ d'Escherichia coli – un capteur de nitrates/nitrites – qui contient le capteur périplasmique, les hélices transmembranaires et le domaine HAMP au niveau du côté cytoplasmique a été déterminée dans les états lié à un ligand et l'apo muté. Les structures présentées fournissent un aperçu des changements de conformation qui se produisent dans le domaine transmembranaire et dans le domaine HAMP en aval pendant la transduction du signal induite par le ligand. L'avancement de la recherche structurelle a été grandement renforcé par l'implication des résultats méthodologiques présentés dans ce travail. Cet impact et, en particulier, les résultats prospectifs de ce travail aux disciplines méthodologiques et appliquées de la biologie structurale et de la cristallographie des rayons X en particulier sont discutés. / In this study the methodological aspects for producing high-resolution crystal structures of membrane proteins were combined and reported here as well as their implication for the concrete biologically-relevant case of structural investigation of transmembrane histidine kinase working principles.In X-ray crystallography protein crystal samples vary in sizes, shapes and diffracting abilities. To be able to collect the diffraction data in the most efficient way the crystal sample should be properly characterised on-axis in every particular case. Raster X-ray scan has been found to be the most viable technique to do so and in this context a method of crystal sample analysis for protein crystallography is presented here which is based on the X-ray mesh scan technique developed at the ESRF. The method estimates the positions, sizes and quality of diffraction of each crystal in the scanned area which could be further useful for the rational design of the data collection process. The performance of the method is demonstrated on several protein crystal samples.Another bottleneck in production of crystal structures of proteins is in commonly known phase problem. The most widespread techniques to deal with the structure that cannot be phased using molecular replacement are SAD or MAD-based experimental phasing. This implies incorporation of various anomalous scatterers to the crystal structure. In the list of available scatterers halides are particularly stood out mostly because their low toxicity and easiness of handling but at the same time their capability of producing anomalous signal. The protocol of cryo-soaking of the protein crystals in halide-containing solutions has shown to be successful on soluble protein structures. In the current study this protocol was tested on four different crystal structures of membrane proteins. The presented findings state and further support experimentally that iodide could be easily and successfully used for addressing the phase problem in the case of membrane protein crystal structures.Sensor histidine kinases are ones of the most common transmembrane receptors present in all kingdoms of life. The understanding of transmembrane signalling principles of sensor histidine kinases is a fundamental question that currently remains unanswered. In order to get to the idea of which structural changes provide the transmission of the signal across the lipid membrane in this work the crystal structure of the truncated construct of the histidine kinase NarQ of Escherichia coli – a sensor of nitrates/nitrites – which contains periplasmic sensor domain, transmembrane helices and HAMP domain at the cytoplasmic side was determined in the ligand-bound and mutated apo states. The presented structures provide an insight on the conformational changes occurring in the transmembrane domain and in the downstream HAMP domain during the ligand-induced signal transduction. The progress of the structural investigation was greatly enhanced by the involvement of the methodological findings presented in this work. This impact and as well the prospective outcomes of this work to both methodological and applied disciplines of structural biology and X-ray crystallography in particular are discussed.

Le sujets de cette thèse sont l'évolution structurelle et la réponse magnétique particulière des films de cobalt observés lors de l'intercalation entre graphène et Ir (111).L'origine du comportement magnétique exotique de ces films n'a pas été trouvée encore. À cet égard, l'objectif final de ce travail est de sonder les effets de l'anisotropie structurale sur l'anisotropie magnétique.Plusieurs paramètres tels que l'épaisseur du film, les temps et les températures de la procedure du textit{annealing}, la présence de graphène et l'environnement local de Co ont été pris en compte comme possibles sources d'anisotropie structurale.Une analyse complète a été réalisée en utilisant des techniques complémentaires et avancées. Techniques comme la spectroscopie de photoélectrons de rayons X (XPS) et l'effet Kerr magnéto-optique (MOKE) ont fourni des informations sur la distribution de Co dans la direction perpendiculaire à la surface et sur la réponse magnétique. Cependant, techniques de rayonnement synchrotron comme la spectroscopie d'absorption de rayonnement X (XAS) et la diffraction de rayons X par incidence rasante (GIXD) ont sondé la structure locale et l'ordre à long terme des films.L'analyse présentée dans cette thèse inclut les effets de surface à l'interface Co/Ir, l'environnement local autour du Co, la structure cristalline du film, la rugosité du système et le désordre moyen.En particulier, l'évolution de ces paramètres est présentée et discutée en même temps que leur effet sur la réponse magnétique macroscopique des films intercalés.Les résultats démontrent que les traitements thermiques affectent la morphologie du Co, sa rugosité et sa coordination locale. Tels effets altèrent la structure du film affectant l'anisotropie magnétique globale. Cette information est utile à des fins applicatives. De plus, la description des modifications micro-structurales fournit un aperçu approfondi des propriétés physiques des films de Co intercalés. / This thesis focuses on the structural evolution and the peculiar magnetic response of Cobalt films observed upon intercalation between Graphene and Ir(111).The origin of the exotic magnetic behaviour of such films cite{ROUGEMAILLE} has not been found yet. In this respect, the final goal of this work is to probe the effects of the structural anisotropy on the magnetic anisotropy.Several parameters such as: film thickness, annealing times and temperatures, Graphene presence, and Co local environment were taken into account as possible sources of structural anisotropy.A complete analysis was carried out using complementary, state-of-the-art techniques. While laboratory techniques such as X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) and Magneto-Optic Kerr Effect (MOKE) provided information on the Co distribution along the direction perpendicular to the surface, and on the magnetic response, synchrotron radiation techniques such as X-ray Absorption Spectroscopy (XAS) and Grazing Incidence X-ray Diffraction (GIXD) probed the local structure and the long range order of the films.The analysis presented in this thesis includes the surface effects at the Co/Ir interface, the local Co environment, the crystalline structure of the film and the system roughness and average disorder.In particular, the evolution of such parameters is presented and discussed together with their effect on the macroscopic magnetic response of the intercalated films.The results demonstrate that thermal treatments affect Co morphology, roughness, and local coordination. Such effects alter the film structure affecting the overall magnetic anisotropy. This information alone is valuable for applicative purposes. Moreover, the description of the micro-structural modifications provides a deep insight into the physical properties of intercalated Co films.