Adoptive immunotherapy using chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells is an effective treatment for hematological malignancies that are refractory to conventional chemotherapy. To address a wider variety of cancer entities, there is a need to identify and characterize additional target antigens for CAR-T cell therapy. The two members of the receptor tyrosine kinase-like orphan receptor family, ROR1 and ROR2, have been found to be overexpressed on cancer cells and to correlate with aggressive cancer phenotypes. Recently, ROR1-specific CAR-T cells have entered testing in phase I clinical trials, encouraging us to assess the suitability of ROR2 as a novel target for CAR-T cell therapy. To study the therapeutic potential of targeting ROR2 in solid and hematological malignancies, we selected two representative cancer entities with high unmet medical need: renal cell carcinoma and multiple myeloma. Our data show that ROR2 is commonly expressed on primary samples and cell lines of clear cell renal cell carcinoma and multiple myeloma. To study the efficacy of ROR2-specific CAR T cell therapy, we designed two CAR constructs with 10-fold binding affinity differences for the same epitope of ROR2. We found both cell products to exhibit antigen-specific anti-tumor reactivity in vitro, including tumor cell lysis, secretion of the effector cytokines interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma (IFNγ), and T cell proliferation. In vivo studies revealed ROR2 specific CAR-T cells to confer durable responses, significant survival benefits and long-term persistence of CAR-expressing T cells. Overall, there was a trend towards more potent anti-tumor efficacy upon treatment with T cells that expressed the CAR with higher affinity for ROR2, both in vitro and in vivo. We performed a preclinical safety and toxicology assessment comprising analyses of ROR2 expression in healthy human and murine tissues, cross-reactivity, and adoptive T cell transfer in immunodeficient mice. We found ROR2 expression to be conserved in mice, and low-level expression was detectable in the male and female reproductive system as well as parts of the gastrointestinal tract. CAR-T cells targeting human ROR2 were found to elicit similarly potent reactivity upon recognition of murine ROR2. In vivo analyses showed transient tissue-specific enrichment and activation of ROR2-specific CAR-T cells in organs with high blood circulation, such as lung, liver, or spleen, without evidence for clinical toxicity or tissue damage as determined by histological analyses. Furthermore, we humanized the CAR binding domain of ROR2-specific CAR-T cells to mitigate the risk of adverse immune reactions and concomitant CAR-T cell rejection. Functional analyses confirmed that humanized CARs retained their specificity and functionality against ROR2-positive tumor cells in vitro. In summary, we show that ROR2 is a prevalent target in RCC and MM, which can be addressed effectively with ROR2-specific CAR-T cells in preclinical models. Our preliminary toxicity studies suggest a favorable safety profile for ROR2-specific CAR-T cells. These findings support the potential to develop ROR2-specific CAR-T cells clinically to obtain cell products with broad utility. / Adoptive Immuntherapie mit T-Zellen, die chimäre Antigenrezeptoren (CAR) exprimieren, ist ein effektiver Behandlungsansatz für Chemotherapie-resistente Blutkrebserkrankungen. Die Übertragung dieses Konzepts auf weitere Krebsarten erfordert die Identifikation und Charakterisierung neuer Zielstrukturen für die CAR-T Zelltherapie. ROR1 und ROR2, die beiden Mitglieder der Familie der Rezeptortyrosinkinase-ähnlichen Orphan-Rezeptoren, werden auf einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert und korrelieren mit einer schlechten Prognose und höherer Krebs-Invasivität. Kürzlich konnte ROR1 als Zielstruktur für die CAR-T Zelltherapie bestätigt werden und die Effektivität und Sicherheit ROR1 spezifischer CAR-T Zellen wird derzeit im Rahmen klinischer Phase-I Studien näher untersucht. Aus diesem Grund waren wir daran interessiert, das therapeutische Potenzial ROR2-spezifischer Zelltherapie zu untersuchen. Als Modellsysteme hierfür wählten wir das Nierenzellkarzinom und das Multiple Myelom als repräsentative hämatologische und solide Krebserkrankungen mit hohem medizinischem Bedarf aus. Unsere Daten zeigen, dass ROR2 häufig auf Zelllinien und primären Tumorproben des klarzelligen Nierenzellkarzinoms und des Multiplen Myeloms vorkommt. Um die Effektivität ROR2-spezifischer CAR-T Zellen zu untersuchen, wurden zwei CAR Konstrukte mit zehnfach unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für dasselbe Epitop von ROR2 hergestellt. Beide Zellprodukte zeigten hohe, antigen-spezifische Antitumor-Reaktivität in vitro – insbesondere im Hinblick auf Tumorzell-Lyse, Sekretion der Zytokine Interleukin-2 (IL-2) und Interferon gamma (IFNγ) und T-Zell Proliferation. In vivo beobachteten wir langanhaltende Antitumor-Effektivität durch ROR2-spezifische CAR-T Zellen, sowie signifikante Überlebensvorteile und langfristige T-Zell Persistenz. Außerdem beobachteten wir, sowohl in vitro als auch in vivo, einen Trend zu stärkerer Antitumor-Effektivität von T-Zellen, die den CAR mit höherer Affinität für ROR2 exprimierten. Im Rahmen einer präklinischen Toxikologie-Studie analysierten wir die Expression von ROR2 im gesunden Gewebe, die Kreuz-Reaktivität ROR2-spezifischer CAR-T Zellen und deren Sicherheit durch adoptiven T-Zell Transfer in immun-defiziente Mäuse. Unsere Daten zeigen, dass ROR2 in H. sapiens und M. musculus gleichermaßen exprimiert wird und ROR2 Expression war insbesondere in den weiblichen und männlichen Reproduktionsorganen und Teilen des Gastrointestinaltrakts detektierbar. Wir konnten außerdem zeigen, dass CAR-T Zellen, die menschliches ROR2 erkennen, vergleichbare Antitumor-Reaktivität gegen Zellen, die murines ROR2 exprimieren, auslösen. Unsere in vivo Analysen zeigten temporäre Anreicherung und Aktivierung ROR2-spezifischer CAR-T Zellen in gut durchbluteten Geweben, wie Lunge, Leber und Milz, in der Abwesenheit klinischer Anzeichen für Toxizität oder histologisch nachweisbarer Gewebsschädigungen. Um die Risiken immunologischer Nebenwirkungen und die damit einhergehende Abstoßung ROR2-spezifischer CAR-T Zellen zu reduzieren, humanisierten wir die CAR Bindedomäne. Unsere Daten zeigen, dass humanisierte ROR2-spezifische CAR-T Zellen vergleichbare Spezifität und Funktionalität gegen ROR2-positive Tumorzellen in vitro aufweisen. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass ROR2 eine häufig auftretende Zielstruktur auf der Oberfläche von RCC und MM Zellen ist und diese in präklinischen Modellen effektiv mittels ROR2-spezifischer CAR-T Zellen adressiert werden kann. Unsere vorläufigen Toxizitätsdaten deuten darauf hin, dass ROR2-spezifische CAR-T Zellen ein vorteilhaftes Sicherheitsprofil aufweisen. Alles in allem unterstützen diese Daten das Potenzial der klinischen Entwicklung ROR2-spezifischer CAR-T Zellen als Zellprodukte mit breit gefächerter Anwendbarkeit.

Adoptive immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR)-T cells has dramatically altered the landscape of cancer therapy. However, despite impressive clinical responses and high rates of complete remission observed in B-cell acute lymphoblastic leukemia, lymphomas and multiple myeloma, there is still a considerable proportion of CAR-T cell treatment failure. Recent clinical data in hematological tumors has reported antigen down-regulation as one of the main mechanisms correlated with disease relapse after CAR-T cell infusion. Furthermore, solid tumor heterogenic expression of tumor associated antigens (TAA) presents an additional barrier for the translation of CAR T cell therapies. ROR1, a cross-entity TAA expressed in both hematological and solid tumors, is known to display in-tumor heterogenic expression patterns. Strategies that improve CAR-antigen detection of TAAs like ROR1 have the potential to improve future CAR products as well as clinical outcomes of a wide array of tumor entities. Most often, the lack of detailed knowledge on how CARs induce T-cell activation deters its optimization. Recently, the field has focused on the importance of kinase recruitment and engagement to improve CAR-T cell functionality. Here, we hypothesized that increasing the availability of LCK in close proximity to a second generation 4-1BB based ROR1-specific CAR would facilitate signaling initiation and correlate to increased target-dependent tumor cell lysis, proliferation and cytokine expression, especially evident against low antigen expressing tumor cell lines. In this manuscript, we have addressed two strategies for LCK recruitment: 1) direct LCK fusion or 2) supplementation with LCK binding chimeric co-receptors (CcoR). Our results show that direct tethering of LCK to ROR1-specifc CARs (CAR-L) results in the improvement of the lower antigen detection thresholds with benefits to all measured functional parameters. In vitro characterization of CAR-L-T cells against a panel of hematologic tumor cells with varying amounts of target antigen demonstrated improved detection and consequent lysis of low antigen expressing tumor variants. Our results could be reproduced in a renal cell carcinoma cell line showing its potential applicability against solid tumor entities. Additionally, glass supported lipid bilayer antigen titration experiments confirmed a sensitivity gain with a higher proportion of CAR L T cells being able to induce robust T-cell activation at lower ROR1 densities when compared to conventional CAR-T cells. CAR L T cells also demonstrated higher expansion potential which resulted in enhanced tumor control on a long-term re-stimulation stress test. As a tradeoff, CAR-LCK fusion receptors displayed increased basal ZAP-70 phosphorylation. Here, we confirmed that this increase in tonic signaling is not translated into unspecific T-cell triggering, response attenuation or exhaustion nor is it a prerequisite for enhanced antigen detection. In parallel, we have shown the concomitant targeting of the same antigen at multiple epitopes by both CAR and CcoRs as a viable strategy to increase CAR-T cell overall antigen detection while enabling the possibility to expand the complexity of the immune synapse (IS) composition. While we have shown that CD4 trans-supplementation did not improve antigen detection, inclusion of a CD3ε derived CcoR increased the CAR-associated ITAM diversity while improving antigen detection and overall killing of antigen low expressing tumor cell lines. Additionally, we implemented the “knobs-into-holes” (KiH) heterodimerizing technology to CAR-T cell design allowing for the co-localization of both CAR and CcoRs. Here, we have shown that trans supplementation CD3ε with a mutated ITAM in the KiH format contributed to improved cytokine release of CAR-T cells upon antigen-specific stimulation. Furthermore, this technology opens new possibilities to arm CARs with additional trans-acting cargos. Taken together, this thesis presents a toolbox of novel CAR formats that explore LCK recruitment to enhance CAR-T cell functionality and antigen detection. Application of these novel CAR designs, specifically CAR-LCK fusions, can be of further significance for the translation into ROR1 expressing tumor entities, both of solid or hematologic origin. We are confident of the potential that such strategies represent to the advancement and future of CAR-T cell therapy. / Die adoptive Immuntherapie mit chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen hat die Krebstherapie revolutioniert. Trotz beeindruckender klinischer Ergebnisse und hoher Raten kompletter Remissionen bei akuter lymphatischer B-Zell-Leukämie, Lymphomen und multiplem Myelom gibt es jedoch immer noch einen beträchtlichen Anteil an Patienten, bei denen die CAR-T-Zelltherapie nicht den gewünschten Therapieerfolg zeigt. Jüngste klinische Daten bei hämatologischen Tumoren haben gezeigt, dass die Herunterregulierung des Zielantigens einer der Hauptgründe für eine Tumorprogression nach CAR-T-Zell-Infusion ist. Darüber hinaus stellt die heterogene Expression tumorassoziierter Antigene (TAA) bei soliden Tumoren ein zusätzliches Hindernis für den erfolgreichen Einsatz von CAR-T-Zelltherapien auf diesem Gebiet dar. ROR1, ein TAA, welches sowohl in hämatologischen als auch in soliden Tumorentitäten vorkommt, weist bekanntermaßen heterogene Expressionsmuster in Tumoren auf. Strategien zur Verbesserung der Detektion von TAAs wie ROR1 durch den CAR haben das Potenzial, zukünftige CAR-Produkte sowie die klinischen Ergebnisse bei einer Vielzahl von Tumorentitäten zu verbessern. Die Optimierung von CARs wird häufig dadurch erschwert, dass grundlegende Mechanismen der T-Zell- Aktivierung durch den CAR nicht hinreichend bekannt sind. In jüngster Zeit hat sich die Forschung auf die Bedeutung der Rekrutierung und Aktivierung von Kinasen konzentriert, um die Funktionalität von CAR-T-Zellen zu verbessern. Hier stellten wir die Hypothese auf, dass eine erhöhte Verfügbarkeit von LCK in unmittelbarer Nähe eines 4-1BB-basierten ROR1-spezifischen CARs der zweiten Generation die Initiierung von Signalen erleichtern und zu einer verbesserten lytischen Aktivität, Proliferation und Zytokinausschüttung durch CAR-T-Zellen führen könnte, was sich insbesondere bei Tumorzelllinien mit geringer Antigenexpression positiv auswirken sollte. In diesem Manuskript haben wir zwei Strategien für die LCK-Rekrutierung untersucht: 1) eine direkte CAR-LCK-Fusion oder 2) eine zusätzliche Expression eines LCK-bindenden chimären Co-Rezeptors (CcoR). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die direkte Fusion von LCK an ROR1-spezifische CARs (CAR-L) den Schwellenwert für eine effektive Antigenerkennung senkt, was sich auf alle gemessenen funktionellen Parameter positiv auswirkt. Die in vitro Charakterisierung von CAR-L-T-Zellen gegen eine Reihe von Tumorzellen mit unterschiedlichen Expressionsleveln an Zielantigen zeigte eine verbesserte Erkennung und damit einhergehend auch Lyse von Tumorvarianten mit geringer Antigenexpression. Unsere Ergebnisse in hämatologischen Zelllinien konnte auch für die Nierenzellkarzinomzelllinie 786-O bestätigt werden. Darüber hinaus konnten wir in Experimenten zur Antigentitration mit Lipiddoppelschichten auf Glas einen Sensitivitätsgewinn bestätigen, da ein höherer Anteil der CAR-L- T-Zellen im Vergleich zu herkömmlichen CAR-T-Zellen in der Lage war, eine robuste T-Zell-Aktivierung bei niedrigeren ROR1-Antigendichten zu induzieren. CAR-L-T-Zellen zeigten auch ein höheres Expansionspotenzial, was zu einer verbesserten Tumorkontrolle in einem Langzeit- Restimulationsbelastungstest führte, aber auch zu einer erhöhten ZAP-70-Phosphorylierung in ruhenden T-Zellen führt. Hier konnten wir bestätigen, dass dieses erhöhte tonische Signal nicht zu einer unspezifischen Aktivierung von T-Zellen, einer durch Hyperstimulation ausgelösten Antigendesensibilisierung oder zur T-Zell-Erschöpfung führt und dies aber auch keine Voraussetzung für eine verbesserte Antigenerkennung ist. Parallel dazu haben wir gezeigt, dass die gleichzeitige Erkennung verschiedener Epitope desselben Antigens durch CAR und CcoRs eine praktikable Strategie ist, um die Antigenerkennung von CAR-T- Zellen insgesamt zu erhöhen und gleichzeitig die Komplexität der Zusammensetzung der immunologischen Synapse (IS) zu erweitern. Während wir auf der einen Seite gezeigt haben, dass die CD4-Trans-Supplementierung die Antigenerkennung der CAR-T-Zellen nicht verbessern konnte, konnten wir auf der anderen Seite zeigen, dass die Einbeziehung eines CD3ε-abgeleiteten CcoR die CAR-assoziierte ITAM-Diversität erhöht und gleichzeitig die Antigenerkennung und die Lyse von Tumorzelllinien mit geringer Antigenexpression verbessert. Darüber hinaus haben wir die "Knobs-into-holes"- (KiH) Heterodimerisierungstechnologie in das Design von CAR-T-Zellen implementiert, um die Ko-Lokalisierung von CAR und CcoRs zu ermöglichen. Hier konnten wir zeigen, dass die Trans-Supplementierung mit CD3ε, welches ein mutiertes ITAM aufweist, im KiH-Format zu einer erhöhten Zytokinproduktion der CAR-T-Zellen nach Stimulation mit Zielzellen, welche eine hohe Antigendichte aufweisen, beiträgt. Darüber hinaus eröffnet diese Technologie neue Möglichkeiten, CARs mit zusätzlichen trans-aktivierenden Modifikationen auszustatten. Insgesamt stellt diese Arbeit ein Instrumentarium neuartiger CAR-Formate vor, welche die LCK- Rekrutierung untersuchen, um die Funktionalität und Antigenerkennung von CAR-T-Zellen zu verbessern. Die Anwendung dieser neuartigen CAR-Designs, insbesondere CAR-LCK-Fusionen, kann von weiterer Bedeutung für die zukünftige Nutzung dieses CAR-Formats bei ROR1-exprimierenden soliden und hämatologischen Tumorentitäten sein. Wir sind daher zuversichtlich, dass solche Strategien für die Weiterentwicklung und Zukunft der CAR-T-Zelltherapie von Bedeutung sind.

Die vergangenen Jahre haben eindrucksvoll gezeigt, dass CD19 und BCMA chimäre Antigen-Rezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien nicht nur das Potential haben, die progres¬si-ons¬freie Überlebenszeit von Patienten mit hämatologischen Neoplasien zu verlängern, sondern auch diese erkrankten Menschen in einigen Fällen dauerhaft zu heilen. Trotz der noch immer bestehenden großen Herausforderung CAR-T-Zell-Therapien für mehr Tumorentitäten verfügbar zu machen, insbesondere was die Bekämpfung solider Tumore betrifft, haben die Entdeckung neuer Tumorantigene und Checkpoint-Inhibitoren in den letzten Jahren dazu beigetragen, dass sich immuntherapeutische Ansätze, insbesondere die der adoptiven Immunzelltherapie stetig weiterentwickeln konnten. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene maligne Bluterkrankung mit schlechten Überlebens¬prognosen und die am häufigsten auftretende Leukämieform bei Erwachsenen. AML ist somit eine der hämatologischen Krebserkrankungen, die noch immer dringend medizini¬sche Innovation benötigt. CAR-T-Zell-Therapien gelten als attraktive neue Strategie, um AML zu bekämpfen, da die leukämischen Blasten empfindlich für T-Zell-vermittelte Lyse sind. In dieser Studie stellen wir Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec) 6 als neues Zielmolekül für CAR-T-Zell-Therapien in AML vor. Wir entwickelten einen Siglec 6-spezifischen CAR mit einer vom humanen monoklonalen Antikörper JML 1 abgeleiteten Antigen-bindenden Domäne. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Siglec 6 auf AML-Zelllinien als auch primären AML-Blasten sowie leukämischen Stamm¬zellen (LSCs) detektierbar ist. Die Behandlung mit Siglec 6 CAR-T-Zellen vermittelte eine anti-leukämische Reaktivität, die mit der Siglec 6-Expressionsstärke in präklinischen Modellen korrelierte. So bewirkten Siglec 6 CAR-T-Zellen eine komplette Remission in einem Xenograft-AML-Modell mit immundefizienten Mäusen und Tumorzellen mit hoher Siglec 6-Expression (NSG/U937). Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass Siglec 6 nicht auf gesunden hämatopoetischen Stamm(vor)läuferzellen (HSC/Ps) exprimiert wird. Unsere Daten legen damit nahe, dass die Siglec 6 CAR-T-Zell-Therapie zur AML-Behandlung eingesetzt werden kann, ohne dass eine nachfolgende hämatopoetische Stammzelltransplantation notwendig wird. In gesunden Blutzellen detektierten wir Siglec 6 auf einer Fraktion naiver B-Zellen und B-Gedächtniszellen sowie basophiler Gra¬nulozyten, sodass insgesamt mit einer limitierten On-Target Off-Tumor-Reaktivität ge¬rechnet werden kann. Die fehlende Siglec 6-Expression auf gesunden HSC/Ps ist ein sig¬nifikantes Unterscheidungsmerkmal zur Expression anderer zuvor untersuchter AML-CAR-Antigene wie CD33 oder CD123. Auch CD70 wird von HSC/Ps nicht exprimiert und wurde in dieser Studie als möglicher Kombinationspartner für duales Targeting in AML evaluiert. Dabei konnten wir feststellen, dass mehrheitlich mindestens eines der beiden CAR-Antigene, Siglec 6 oder CD70, von AML-Zelllinien und primären AML-Zellen expri¬miert wird. Ebenso ließ sich experimentell bestätigen, dass Siglec 6 CAR-T-Zellen mit JML 1-single chain variable fragment (scFv) und jeweils optimierten CAR-Spacersequen¬zen, keine signifikanten Funktionalitätsunter¬schiede aufweisen. Die Vorbehandlung von AML-Zellen mit Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren konnte die zytolytische Aktivität der Siglec 6 CAR-T-Zellen durch Steigerung der Siglec 6-Oberflächenexpression auf den Targetzellen erhöhen. Sowohl Siglec 6 als auch CD70 CAR-T-Zellen konnten erfolgreich mit virusfreiem Gentransfer hergestellt werden, wobei die getesteten CD70 CAR-Kon¬strukte aufgrund der CD70-Expression aktivierter T-Zellen zu Fratricide führten und die CAR-Antigen-abhängige als auch unabhängige Proliferation der CD70 CAR-T-Zellen limitierte. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass sowohl Siglec 6 als auch CD70 hilf¬reiche Targetantigene zur CAR-T-Zellbehandlung der AML sein können und dass eine klinische Überprüfung, insbesondere von Siglec 6 CAR-T-Zellprodukten, gewährleistet ist. / In recent years, it could be impressively demonstrated that CD19 and BCMA chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies not only have the potential of prolonging progression-free and overall survival of patients with hematological malignancies, but in many cases are even able to cure them. Despite major challenges still hampering the broad applicability of CAR T-cells therapies, especially in the combat against solid tumors, the discoveries of novel tumor antigens and checkpoint inhibitors in past years have contributed to the steady development of immunotherapeutic approaches particularly those of adoptive immune cell therapy. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous malignant blood disorder with poor survival prognosis that accounts for the most common form of leukemia in adults. Hence, AML is still one of the hematologic cancers with high unmet medical need. CAR T-cell therapies are considered an attractive new strategy to tackle AML as leukemic blasts are susceptible to T-cell-mediated lysis. In this study, we introduce sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec)-6 as a novel target for CAR T-cell treatment in AML. We developed a Siglec-6-specific CAR with an antigen-binding domain derived from the human monoclonal antibody JML-1. Our studies revealed that Siglec-6 is detectable on AML cell lines as well as primary AML blasts and leukemic stem cells (LSCs). Siglec-6 CAR T-cell treatment conferred anti-leukemic reactivity that correlated with Siglec-6 expression levels in preclinical models. Thus, Siglec-6 CAR T-cells induced complete remission in a xenograft AML model with immunodeficient mice and engrafted tumor cells with high Siglec-6 expression (NSG/U937). Furthermore, we observed that Siglec-6 is not expressed on healthy hematopoietic stem/precursor cells (HSC/Ps). Our data suggest that Siglec-6 CAR T-cell therapy can be effectively used for AML treatment without the need for subsequent hematopoietic stem cell transplantation. In healthy blood cells, we detected Siglec-6 on a fraction of naïve and memory B cells as well as on basophilic granulocytes, therefore overall on-target off-tumor reactivity may be expected to be limited. The lack of Siglec-6 expression on healthy HSC/Ps is a significant distinctive feature from the expression of other previously studied AML CAR antigens e.g. CD33 or CD123. Also, CD70 is not expressed by HSC/Ps and was evaluated in this study as potential combination partner for dual targeting in AML. We found that the majority of AML cell lines and primary AML cells are expressing at least one of the two antigens, either Siglec-6 or CD70. We also confirmed that Siglec-6 CAR T-cells with JML-1-single chain variable fragment (scFv) and two optimized CAR spacer sequences did not show significant differences in function. Pretreatment of AML cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors could augment cytolytic activity of Siglec-6 CAR T-cells by increasing Siglec-6 surface expression on AML target cells. Both, Siglec-6 and CD70 CAR T-cells were successfully manufactured via non-viral gene transfer, whereby tested CD70 CAR constructs induced fratricide due to CD70 expression of activated T-cells resulting in limited CAR antigen-dependent as well as antigen-independent proliferation of CD70 CAR T-cells. In summary, this study suggests that Siglec-6 as well as CD70 may be useful target antigens for CAR T-cell treatment of AML and warrants clinical investigation of Siglec-6 CAR T-cells in particular.

Die Mehrzahl der im Thymus generierten CD4+CD25high regulatorischen T-Zellen (Treg) besitzt hohe Affinität gegenüber körpereigenen Antigenen. Es ist bekannt, dass T-Zell Rezeptoren (TCR) auf Treg Zellen in der Peripherie zusätzlich auch fremde Antigene verschiedener Pathogene wie Parasiten, Bakterien und Viren erkennen. Wenig ist bekannt über das klonale T-Zell Rezeptor Repertoire dieser Treg Populationen und ihre Beziehung zu CD4+CD25low effektor T-Zellen (Teff) im Menschen. In dieser Studie analysieren wir humane TCR auf expandierten Treg and Teff Zellen mit definierter Antigen Spezifität für Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II restringierte „fremde“ Epitope des Cytomegalovirus (CMV). Bemerkenswerterweise fanden wir, dass der gleiche TCR Vb-CDR3 Klon in beiden funktionell unterschiedlichen Subpopulationen in vitro dominant expandiert ist. Im Unterschied zu ihren klonal-identischen Teff Gegenspielern, exprimieren die suppressiven Treg Zellen kaum CD127 und IL-2, aber hohe Mengen an IFNg und IL-10. Zusammen mit der signifikant erhöhten FOXP3 Expression, trotz unvollständiger foxp3-DNA Demethylierung, lassen sich die CMV-spezifischen CD4+CD25high Treg Zellen einem induzierten Treg (iTreg) Phänotyp zuordnen mit Ähnlichkeit zum beschriebenen Tr-1 Phänotyp. Darüber hinaus konnten wir die klonale TCR Identität auch in frisch isolierten CD4+CD25low und CD4+CD25high Subpopulationen bestätigen, was die Entstehung von CMV-spezifischen Treg Zellen bereits in vivo nahe legt. Periphere CD25high Treg Zellen supprimieren die anti-virale Immunantwort in Patienten mit häufigen CMV-Reaktivierungen, was auf ihre Bildung als Reaktion chronischer Antigenexposition interpretiert werden kann. Unsere Ergebnisse beweisen erstmals direkt, dass aus dem gleichen humanen T-Zell Klon Teff und Treg Zellen mit identischer Spezifität entstehen können und lassen vermuten, dass die Treg Induktion in der Peripherie durch häufige Antigenexposition vorangetrieben wird. / The majority of thymically arised regulatory CD4+CD25high T cells (Treg) show high affinity to self-antigens. It has been proposed that T-cell receptors (TCR) on Treg cells in the periphery also recognize foreign-antigens from pathogens, such as bacteria and viruses. Studies in mice have shown that peripheral Treg cells can be generated not only from naïve T cells but also from effector T cells (Teff). However, in humans the clonal TCR-repertoire of these Treg populations and their relation to effector CD4+CD25low Teff is not sufficiently known up to date. Here, we analyzed human TCRs derived from expanded Treg and Teff cells with defined specificity to MHC class-II restricted “foreign” epitopes of Cytomegalovirus (CMV). Remarkably, we found that both functionally distinct subsets share the same dominant TCR-CDR3 clones in vitro. In contrast to their Teff counterparts, the Treg cells express low CD127 and IL-2, but high IL-10 upon antigen stimulation. Therefore, together with increased FOXP3 expression, but incomplete foxp3 DNA-demethylation, human CMV-antigen specific Treg cells exhibit an induced phenotype (iTreg) in vitro with similarity to recently described Tr-1 phenotype. Moreover, the clonal identity was confirmed in freshly isolated CD4+CD25low and CD4+CD25high subsets, suggesting their generation occurred already in vivo. Peripheral CD25high Treg cells suppress the anti-viral immune response in patients with frequent CMV-reactivations, implying their development as reaction on chronic antigen-exposure. Our results demonstrate directly for the first time, that the same human T-cell clone can possess the phenotype of Teff and Treg cells with specificity to identical foreign epitopes and suggest that Treg-induction in the periphery is supported by frequent antigen-exposure.

Der adoptive Transfer von T-Zell-Rezeptor (TZR) modifizierten T-Zellen gegen krebsspezifische Antigene ist ein vielversprechender Ansatz in der Immuntherapie. Geeignete Zielmoleküle für diese Therapie sollten wichtig für das Überleben von Krebszellen sein und zudem in ausreichenden Mengen auf der Zelloberfläche exprimiert werden, um von T-Zellen erkannt zu werden. Die Identifizierung dieser Zielmoleküle ist jedoch eine Herausforderung und erfordert eine intensive Charakterisierung, um eine ausreichende Prozessierung und Präsentation auf den Tumorzellen zu validieren. Ziel dieser Arbeit war, HLA-A2-spezifische Neoepitope als Zielmoleküle für adoptive T-Zell-Therapie zu validieren. Dafür wurden erfolgreich Immunantworten in einem humanen transgenen Mausmodell nach Peptidimmunisierung induziert und TZRs mit hoher Affinität isoliert. Trotz einer hohen funktionellen Avidität von H3.3K27M-spezifischen T-Zellen wurde keine Erkennung von Tumorzellen erreicht. Zweitens wurden TZR-transduzierte T-Zellen gegen die häufige Melanommutation Rac1P29S isoliert, welche zytotoxisch gegen Melanomzelllinien waren. Letztlich wurde beobachtetet, dass TZRs mit hoher Affinität gegen gespleißte Kras und Rac2 Epitope, welche durch Proteasom-katalysiertes Peptidspleißen erzeugt wurden, keine Immunantwort gegen endogen exprimierte Mutationen hervorrufen konnten. Daraus lässt sich schließen, dass gespleißte Epitope wahrscheinlich seltener vorkommen als zuvor angenommen und daher möglicherweise irrelevant für die adoptive T-Zelltherapie sind. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Auswahl von Zielmolekülen für die adoptive T-Zell-Therapie mit Hilfe reverser Immunologie auf der Grundlage von Bindungsalgorithmen und der Häufigkeit von Mutationen allein nicht ausreicht. Daher sind vor der Isolierung und Charakterisierung von TZRs zusätzliche Strategien wie z.B. die Analyse des MHC-Immunopeptidoms erforderlich, um die Auswahl geeigneter Zielmoleküle für die T-Zelltherapie zu verbessern. / Adoptive transfer of T cell receptor (TCR)-engineered T cells against tumour-specific neoantigens is a promising approach in cancer immunotherapy. Ideally, targeted antigens are crucial for cancer cell survival and are generated in sufficient amounts to be recognised by T cells. However, the identification of ideal targets remains challenging and requires intensive characterisation to validate sufficient antigen processing and presentation by the tumour cells. This thesis focused on the validation of HLA-A2 binding neoepitopes carrying the recurrent cancer mutations H3.3K27M, Rac1P29S, Rac2P29L or KrasG12V as targets for adoptive T cell therapy. After peptide immunisation, immune responses in a human transgenic mouse model were elicited and high-affinity TCRs successfully isolated. Although H3.3K27M-specific T cells showed high functional avidity, no recognition of cells endogenously expressing mutant H3.3 was achieved. Furthermore, a mechanism to target the common melanoma mutation Rac1P29S with a TCR raised against a heterologous mutation with higher peptide-MHC affinity was described. TCR-transduced T cells induced cytotoxicity against Rac1P29S expressing melanoma cell lines. Lastly, high-affinity TCRs specific for mutant Kras and Rac2 spliced epitopes generated by proteasome-catalysed peptide splicing were successfully isolated, however, TCR-transduced T cells did not induce an immune response against endogenously expressed mutant transgenes. The results indicate that spliced epitopes are probably less abundant than previously estimated and therefore may play a minor role in the generation of targets for adoptive T cell therapy. These data suggest that target selection using a reverse immunology approach based on binding algorithms and frequency of mutations alone is not sufficient. Thus, additional strategies to improve the selection of suitable targets such as the analysis of the MHC immunopeptidome are required prior to TCR isolation and characterisation.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein Vektorsystem zu entwickeln, dass den simultanen Transfer verschiedener Transgene in CD8+ und CD4+ T-Zellen und dadurch die Herstellung eines immunotherapeutischen T-Zell-Produkts ermöglicht, welches aus zwei unterschiedlich modifizierten T-Zell-Subtypen besteht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Targeting-Technologie von lentiviralen auf γ-retrovirale Vektoren übertragen. Anschließend wird die Herstellung von Vektoren beschrieben, die spezifisch für murines CD4 oder CD8 sind. Deren Spezifität wurde zum einen durch die exklusive Expression von GFP in CD4+ oder CD8+ Zellen und zum anderen durch den Dosis-abhängigen Verlust des GFP-Signals nach Inkubation dieser Zellen mit CD4- und CD8-blockierenden Antikörpern nachgewiesen. Im dritten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass MVm8 und MVm4 primäre T-Zellen spezifisch transduzieren. MVm8-vermittelter Transfer des Ovalbumin (OVA)-reaktiven TZRs OT-I führte zu T-Zellen, die OVA+ Tumor-Zelllinien erkannten und Interferon-γ sezernierten. Der vierte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der in vivo Transduktion primärer T-Zellen mithilfe von MVm8, welches den OT-I-TZR und eine Luciferase transferiert (MVm8/OT-I-luc). Durch systemische Applikation von MVm8/OT-I-luc wurden T-Zellen in vivo transduziert. Durch Immunisierungen konnten antigen-spezifisches Homing, Expansion und eine anschließende Kontraktion in vivo transduzierter T-Zellen gezeigt werden. Mäuse mit starker OT-I-luc-Expression waren gegenüber einer Infektion durch OVA-transgene listeria monocytogenes geschützt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Arbeit entwickelte Vektorsystem in der Lage ist zwischen Subtypen von T-Zellen zu unterscheiden und sie simultan mit unterschiedlichen Transgenen auszustatten. Für MVm8 konnte gezeigt werden, dass es T-Zellen direkt in vivo transduzieren kann. / The aim of this thesis was to generate a vector system that allows the simultaneous transfer of different transgenes into CD8+ and CD4+ T cells, allowing the generation of a immunotherapeutic T cell product comprised of two differently engineered T cell subsets. The first part of the thesis describes the transfer of the measles virus (MV) envelope-based targeting technology from lentiviral (LV) to γ-retroviral (gRV) vectors. The second part reports the generation of two targeting vectors specific for murine CD4 or CD8. The exclusive specificity of MVm4 and MVm8 was proven by expression of GFP in CD4+ and CD8+ reporter cells, respectively, but not in CD4-CD8- cells after transduction, and by a dose-dependent loss of GFP signal after incubation of reporter cells with CD4 or CD8 blocking antibodies before transduction. The third part shows that MVm8 but not MVm4 transduced primary T cells. MVm8-mediated transfer of the ovalbumin (OVA)-reactive TCR OT-I resulted in T cells secreting interferon-γ (IFNγ) upon recognition of OVA+ tumor cell lines. The final part of this thesis describes the in vivo transduction of primary T cells using MVm8 transferring OT-I and a luciferase (MVm8/OT-I-luc). To this end, B6 mice deficient for Rag2 have been repopulated with either polyclonal (B6) or monoclonal T cells derived from P14-TCR transgenic mice (P14). One day later the transferred T cells were transduced in vivo by systemic application of MVm8/OT-I-luc. Upon immunization in vivo-transduced T cells homed, expanded and contracted repeatedly in an antigen-dependent manner. Finally, mice exhibiting strong luc-signals showed improved protection against infections by OVA-transgenic listeria monocytogenes (LM-OVA). In conclusion, the viral vector system developed within this thesis is able to discriminate between the two main T cell subsets and to equip them with distinct transgenes simultaneously.

Das Zytokin Interleukin-7 (IL-7) ist für die Entstehung und das Überleben reifer T Zellen von zentraler Bedeutung. Die Gabe von IL-7 führt sowohl in der Maus als auch im Menschen zu erhöhten T Zellzahlen und einem veränderten T Zellphänotyp. Folglich könnte sich die therapeutische Gabe von IL-7 bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem positiv auswirken. Diese Hypothese wird derzeit in mehreren klinischen Studien untersucht. Bisher wurde allerdings nur die Wirkung von IL-7 auf T-Zellen studiert. Zu dessen Wirkung auf andere Immun- oder Stromazellen sowie deren IL-7-abhängigen Beitrag zur Regulation der T-Zellhomöostase ist nur wenig bekannt. Daher war es Ziel der Arbeit, den Einfluss einer therapeutischen Gabe von IL-7 auf adoptiv-transferierte T-Zellen in IL-7-Rezeptor (IL-7R)-kompetenten und defizienten lymphopenischen Mäusen zu studieren. Die Untersuchungen bestätigen, dass die Gabe von IL-7 T-Zellantworten unterstützt, zeigen jedoch auch, daß viele dieser Effekte von IL-7R-exprimierenden Wirtszellen abhängig sind. Dies weist darauf hin, dass IL-7R-vermittelte Signale in Wirtszellen indirekt T-Zellantworten beeinflussen. Zudem zeigte sich, dass effiziente anti-Tumor-T Zellantworten von IL 7R-vermittelten Signalen in Wirtszellen abhängen. Vor allem nicht-hämatopoetische Wirtszellen fungieren hier als Regulatoren der IL-7-Therapie-vermittelten T Zelldifferenzierung. Unsere Ergebnisse bestätigen außerdem, dass Stromazellen in verschiedenen Organen il-7 exprimieren und zeigen darüber hinaus, dass diese Zellen durch die Gabe von IL-7 beeinflusst werden. Wir folgern daraus, dass die Effekte der IL-7-Therapie auf T Zellhomöostase teilweise indirekt über il-7-exprimierende Stromazellen vermittelt werden. Um diese Zellen genauer identifizieren und untersuchen zu können, haben wir ein neues transgenes Mausmodell charakterisiert, was es erleichtern wird, die beteiligten molekularen Signalwege zu analysieren und den Erfolg der adoptiven T Zelltherapie zu verbessern. / Interleukin-7 (IL-7) is an essential cytokine required for the development and maintenance of mature T cell. Its availability is limited under normal conditions, but rises during lymphopenia, leading to increased T cell proliferation. The administration of recombinant IL-7 to normal or lymphopenic mice and humans results in increased T cell numbers and altered T cell phenotype. Hence, IL-7 administration could mediate therapeutic benefits in immunocompromised patients and is currently tested in several clinical trials. However, besides its well-studied effects on T cells little is known about the effect of IL-7 on other immune and non-immune cells and their influence on T cell homeostasis. Therefore, we evaluated the effect of IL-7 therapy on adoptively transferred T cells in IL-7 receptor (IL-7R)-competent and IL-7R-deficient lymphopenic mice. We confirm the benefits of IL-7 therapy on T cell responses but additionally show that many of these effects are dependent on IL-7R expression by host cells, indicating that IL-7R signaling in host cells modulates T cell responses. We show that efficient T cell responses against cancer are dependent on host IL-7R signaling. Based on studies in bone-marrow chimeric mice, we identify non-hematopoietic host cells as main regulators of IL-7 therapy-modulated T cell differentiation. We conclude from these data that IL-7 therapy affects non-hematopoietic stromal cells that modulate the success of adoptive T cell therapy. Our results confirm that stromal cells in various organs express il-7 and show that these cells are targeted by IL-7 therapy in vivo. Hence, we propose that il-7-expressing cells regulate IL-7 therapy-modulated T cell homeostasis. To identify and study these il-7 expressing stromal cells in more detail, we characterized a new transgenic mouse model that will facilitate determining the molecular pathways to improve the success of adoptive T cell therapy.

Die adoptive T-Zell-Therapie (ATT) ist eine sich schnell entwickelnde Immuntherapie, die bei Patienten, die an verschiedenen Krebsarten leiden, eine positive klinische Reaktion anzeigt. Eine Variante der ATT ist eine T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Gentherapie, bei der Patienten-T-Zellen mit krebsspezifischen TCRs ausgestattet werden. Die Herstellung der TCR-erzeugten T-Zellen ist schnell und robust und erfordert eine geringe Anfangsmenge an Patienten-T-Zellen. Der Mangel an verfügbaren krebsspezifischen TCRs, die auf verschiedene Moleküle des menschlichen Leukozytenantigens (HLA) der Klasse I beschränkt sind, schließt jedoch viele Patienten von der Krebsbehandlung aus. Die Generierung einer krebsspezifischen TCR-Bibliothek, die aus gut definierten TCRs besteht, könnte die Zahl der Patienten, die an klinischen Studien teilnehmen, erhöhen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, Epstein-Barr-Virus (EBV)-spezifische TCRs zu identifizieren und zu isolieren, um eine EBV-spezifische TCR-Bibliothek als ein nützliches Werkzeug der TCR-Gentherapie bei der Behandlung von EBV-bedingten Krebserkrankungen zu generieren. Insgesamt wurden neun EBV-spezifische TCRs von EBV-positiven Spendern isoliert und charakterisiert, die verschiedene pHLA-Komplexe von EBV-Latentmembranproteinen (LMP1, LMP2A) und Kernprotein (EBNA3C) erkannten. Zusätzlich wurde ein neuartiges immunogenes LMP1-Epitop (QQNWWTLLV) entdeckt, das auf HLA-C*15:02 beschränkt ist. Definierte EBV-spezifische TCRs können als Grundlage für die EBV-spezifische TCR-Bibliothek verwendet werden, die eine wertvolle Quelle von TCRs für die schnelle Generierung von EBV-spezifischen T-Zellen zur Behandlung von Krebspatienten mit verschiedenen HLA-Typen darstellt. / Adoptive T cell therapy (ATT) is a fast developing immunotherapy indicating positive clinical response in patients suffering from different type of cancers. One type of the ATT is a T cell receptor (TCR) gene therapy, which involves endowing patient T cells with cancer-specific TCRs. Manufacturing of the TCR-engineered T cells is fast and robust, requiring small initial amount of patient T cells. However, lack of available cancer-specific TCRs restricted to various human leukocyte antigen (HLA) class I molecules eliminates many patients from cancer treatment. Generation of a cancer-specific TCR library consisting of well-defined TCRs could increase the number of patients enrolled in clinical trials. The aim of this PhD thesis was to identify and isolate Epstein-Barr virus (EBV)-specific TCRs in order to generate the EBV-specific TCR library as a useful tool of the TCR gene therapy for treatment of EBV-related malignancies. In total, nine EBV-specific TCRs of EBV-positive donors that recognized various pHLA complexes of EBV latent membrane proteins (LMP1, LMP2A) and nuclear protein (EBNA3C) were isolated and characterized. Additionally, a novel immunogenic LMP1 epitope (QQNWWTLLV) restricted to a HLA-C*15:02 was discovered. Defined EBV-specific TCRs can be used as a basis for the EBV-specific TCR library, which provides a valuable source of TCRs for rapid generation of EBV-specific T cells to treat cancer patients with different HLA types.