Estudos populacionais, assim como modelos animais demonstram que além dos fatores já conhecidos, como uma dieta não balanceada e sedentarismo, insultos nutricionais no período gestacional ou durante a lactação, causam alterações metabólicas importantes que levam ao surgimento da obesidade, Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e doenças cardiovasculares em longo prazo. Nesse estudo, analisamos o pâncreas de camundongos hiperalimentados adultos (150 dias) e camundongos hiperalimentados jovens (21 e 28 dias). Os camundongos hiperalimentados de 21 dias receberam transplante de células mononucleares de medula óssea (CMO) e o resultado desse transplante foi observado aos 28 dias, quando os animais foram sacrificados. Nós investigamos: a apoptose das células beta através do fator pró-apoptótico Bax; a proliferação das células da ilhota pancreática através do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA); a expressão da citocina TNF-α, relacionado com a resistência à insulina em animais obesos e a expressão de células tronco CD133 com o objetivo de estudar a participação dessa célula na renovação da massa de células beta durante o estabelecimento da DM2. As análises das proteínas citadas no pâncreas foram realizadas através de microscopia de luz, microscopia confocal, microscopia eletrônica e Western blotting. O peso dos animais, a morfometria das ilhotas pancreáticas, bem como os níveis de glicose e insulina plasmáticos também foram determinados. Nossos resultados confirmaram que os camundongos hiperalimentados adultos apresentavam elevados níveis de glicose e insulina plasmática quando comparados ao grupo controle. Além disso, camundongos hiperalimentados adultos apresentaram aumento na expressão de Bax, indicando apoptose das células beta, maior expressão de TNF-α nas ilhotas pancreáticas, e presença de células CD133 nas ilhotas e ductos pancreáticos de camundongos hiperalimentados. Ao analisarmos os animais com 21 dias também observamos elevados níveis de glicose e insulina plasmática no grupo hiperalimentado. Após o transplante de CMO, os camundongos hiperalimentados apresentaram os níveis de glicose e insulina normalizados em relação ao grupo controle, porém os níveis de TNF-α no pâncreas continuavam elevados. A expressão de células CD133 foi observada tanto aos 21 quanto aos 28 dias nas ilhotas pancreáticas nos grupos hiperalimentados. Porém, a expressão estava aumentada no pâncreas dos animais que receberam transplante de CMO aos 28 dias. Portanto, podemos concluir que camundongos hiperalimentados durante a lactação quando adultos se encontram em um estágio inicial do estabelecimento da DM2, com hiperglicemia e hiperinsulinema, ilhotas pancreáticas hipertrofiadas, evidência de apoptose das células beta, neogênese de células beta a partir de células do ducto pancreático, replicação de células beta já existentes e células tronco endógenas marcadas com CD133. Nos camundongos jovens, além dos parâmetros também observados nos animais adultos, observamos os benefícios das CMO para o restabelecimento da glicemia e insulinemia nos camundongos hiperalimentados. Além disso, demonstramos pela primeira vez, células CD133 marcadas com insulina nas ilhotas pancreáticas. O aumento da expressão de células CD133 no pâncreas de camundongos hiperalimentados que mantinham níveis elevados de TNF-α e receberam transplante de CMO, nos sugere a importância dessa citocina para o recrutamento e diferenciação das células tronco CD133 para melhoria do percurso da diabetes. / Population studies as well as animal models show that besides the factors already known as an unbalanced diet and sedentary lifestyle, nutritional insults during pregnancy or during lactation, causes important metabolic changes that lead to the emergence of obesity, type 2 diabetes mellitus (DM2) and cardiovascular diseases in long-term. In this study, we analyzed the pancreas of overfed adult mice (150 days) and young mice (21 and 28 days). At day 21, overfed mice were transplanted with bone marrow mononuclear cells (BMCs) and the results of this transplantation were observed at day 28. We investigated beta-cell apoptosis through pro-apoptotic factor Bax, the proliferation of pancreatic islet cells by proliferating cell nuclear antigen (PCNA), expression of TNF-α which has been linked to insulin resistance in obese animals and the expression of CD133 stem cells, in order to study the participation of this cell on the recovery of beta-cell mass during the establishment of DM2. The protein analysis, were performed using light microscopy, Confocal microscopy, electron microscopy and Western blotting. The animals weight, morphology of pancreatic islets, as well as plasma levels of glucose and insulin were also determined. Our results confirmed that adult overfed mice had high levels of blood glucose and insulin when compared to control mice. Moreover, overfed adult mice showed an increased expression of Bax, indicating apoptosis of beta cells, also confirmed by transmission electron microscopy, increased expression of TNF-α in pancreatic islets when compared with the control group, and interestingly we observed the presence of CD133 cells in the pancreas of overfed mice. By analyzing the animals with 21 days, we also observed high levels of blood glucose and insulin in the overfed group, but we did not observe Bax expression at this lifetime. The expression of TNF-α was also increased in the pancreas of overfed mice at day 21. After BMCs transplantation, the overfed group showed normal levels of blood glucose and insulin when compared with the control group, but the levels of TNF-α remained high. The expression of CD133 cells was observed in the pancreatic islets both at 21 and 28 days in overfed groups. However, the expression of CD133 was increased in the pancreas of animals that received BMCs transplantation at day 28. Therefore, we conclude that overfed mice when adults are at an early stage of stablishment of DM2 with hyperglycemia and hyperinsulinemia, pancreatic islet hypertrophy, evidence of apoptosis and neogenesis of beta cells from pancreatic duct cells, replication of existing beta cells and endogenous stem cells. In young mice, further the parameters observed in adult animals, we observed the benefits of the BMCs for the restoration of glucose and insulin in overfed mice. Moreover, we demonstrated for the first time the CD133 stem cells in pancreatic islets in colocalization with insulin, suggesting that CD133 could be a progenitor beta cell marker in pancreas. Also, the increased expression of CD133 cells in the pancreas of overfed mice with elevated levels of TNF-α after BMCs transplantation, suggests the importance of this cytokine for the recruitment and recovery of CD133 stem cells to improve the course of diabetes.

Made available in DSpace on 2015-03-03T13:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlminoAOP_DISSERT.pdf: 2473203 bytes, checksum: bef6a29e74144b9845b6ff4ab8398a69 (MD5) Previous issue date: 2010-09-13 / Fucans seaweed Lobophora variegata estructures are known for their chemical and biological properties. In this study, we analyzed, the action of fucans L. variegata and the fractions purified with acetone in Zymosan-induced arthritis. After differential fractionation with acetone, six fractions were obtained and named F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 and F2. The results showed that the fraction F1 showed high yield (51.9%) and was chosen for studies of antioxidant activity and induced arthritis. Nuclear magnetic resonance (NMR) of 13C showed signals at 103.3 and 15.78 ppm that are assigned to links ?13 galactose and of the C6 methyl fucose, respectively. The infrared (IR) showed absorbance at 1238 and 850 cm-1 which are attributed to sulfate. The fraction F1 showed antioxidant activities in vitro. For analysis of inflammatory parameters chosen the polysaccharide was administered in different doses (25, 50 and 75 mg / kg ip, per body weight) and diclofenac sodium (5 mg / kg ip) and L-NAME (25 mg / kg ip) in groups of animals (n = 6). After 6 h, were analyzed for cellular influx and levels of nitrite. In experiment five days, were made analysis of swelling and serum TNF-?. Histopathological analysis were performed for confirmation of results. The fraction F1 (25, 50 and 75 mg / kg ip) reduced the cellular influx (52.1 to 96.7%) and nitric oxide levels (27.2 - 39%) compared to control group. The reduction of edema (63.4 - 100%) and serum TNF-? (p <0.001) were observed when the polysaccharide F1 administered at a dose (50 mg / kg) These results suggest that these heterofucanas of Lobophora variegata have besides the activity antioxidant and potential anti-inflammatory activity in arthritis induced by zymosan / Fucanas da alga Lobophora variegata s?o conhecidas por suas estruturas qu?micas e propriedades biol?gicas. Nesse estudo, analisou-se a a??o de fucanas de L. variegata e suas fra??es purificadas com acetona na artrite induzida por Zymosan. Ap?s fracionamento diferencial com acetona, 6 fra??es foram obtidas e nomeados F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 e F2. Os resultados mostraram que a fra??o F1 apresentou alto rendimento (51,9%) e foi escolhida para estudos da atividade antioxidante e artrite induzida. A resson?ncia magn?tica nuclear (RMN) de 13C mostrou sinais a 103,3 e 15,78 ppm que s?o atribu?dos ?s liga??es ?1 3 da galactose e metil do C6 da fucose, respectivamente. O infravermelho (IV) mostrou absorb?ncia a 1238 e 850 cm-1 que s?o atribu?das ao sulfato. A fra??o F1 apresentou atividades antioxidantes in vitro. Para an?lise de par?metros inflamat?rios a fra??o polissacar?dica escolhida foi administrada em diferentes doses (25, 50 e 75 mg/kg i.p, por peso corporal), assim como diclofenaco de s?dio (5 mg/kg i.p.) e L-NAME (25 mg/kg i.p.) em grupos de animais (n=6). Depois de 6 h, foram realizadas an?lises de influxo celular e n?veis de nitrito. Em experimento de cinco dias, foram efetuadas analises de edema e TNF-? s?rico. An?lises histopatol?gicas foram realizadas para confirma??o de resultados. A fra??o F1 (25, 50 e 75 mg/kg i.p.) reduziu o influxo celular (52,1 ? 96,7%) e os n?veis ?xido n?trico (27,2 ? 39%) em rela??o ao grupo controle. A redu??o do edema (63,4 - 100%) e TNF-? s?rico (p < 0,001) foram observadas quando administrado o polissacar?deo F1 na dosagem (50 mg/kg) Esses resultados sugerem que essas heterofucanas de Lobophora variegata possuem al?m da atividade antioxidante, potencial atividade anti-inflamat?ria na artrite induzida por zymosan

Estudos populacionais, assim como modelos animais demonstram que além dos fatores já conhecidos, como uma dieta não balanceada e sedentarismo, insultos nutricionais no período gestacional ou durante a lactação, causam alterações metabólicas importantes que levam ao surgimento da obesidade, Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e doenças cardiovasculares em longo prazo. Nesse estudo, analisamos o pâncreas de camundongos hiperalimentados adultos (150 dias) e camundongos hiperalimentados jovens (21 e 28 dias). Os camundongos hiperalimentados de 21 dias receberam transplante de células mononucleares de medula óssea (CMO) e o resultado desse transplante foi observado aos 28 dias, quando os animais foram sacrificados. Nós investigamos: a apoptose das células beta através do fator pró-apoptótico Bax; a proliferação das células da ilhota pancreática através do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA); a expressão da citocina TNF-&#945;, relacionado com a resistência à insulina em animais obesos e a expressão de células tronco CD133 com o objetivo de estudar a participação dessa célula na renovação da massa de células beta durante o estabelecimento da DM2. As análises das proteínas citadas no pâncreas foram realizadas através de microscopia de luz, microscopia confocal, microscopia eletrônica e Western blotting. O peso dos animais, a morfometria das ilhotas pancreáticas, bem como os níveis de glicose e insulina plasmáticos também foram determinados. Nossos resultados confirmaram que os camundongos hiperalimentados adultos apresentavam elevados níveis de glicose e insulina plasmática quando comparados ao grupo controle. Além disso, camundongos hiperalimentados adultos apresentaram aumento na expressão de Bax, indicando apoptose das células beta, maior expressão de TNF-&#945; nas ilhotas pancreáticas, e presença de células CD133 nas ilhotas e ductos pancreáticos de camundongos hiperalimentados. Ao analisarmos os animais com 21 dias também observamos elevados níveis de glicose e insulina plasmática no grupo hiperalimentado. Após o transplante de CMO, os camundongos hiperalimentados apresentaram os níveis de glicose e insulina normalizados em relação ao grupo controle, porém os níveis de TNF-&#945; no pâncreas continuavam elevados. A expressão de células CD133 foi observada tanto aos 21 quanto aos 28 dias nas ilhotas pancreáticas nos grupos hiperalimentados. Porém, a expressão estava aumentada no pâncreas dos animais que receberam transplante de CMO aos 28 dias. Portanto, podemos concluir que camundongos hiperalimentados durante a lactação quando adultos se encontram em um estágio inicial do estabelecimento da DM2, com hiperglicemia e hiperinsulinema, ilhotas pancreáticas hipertrofiadas, evidência de apoptose das células beta, neogênese de células beta a partir de células do ducto pancreático, replicação de células beta já existentes e células tronco endógenas marcadas com CD133. Nos camundongos jovens, além dos parâmetros também observados nos animais adultos, observamos os benefícios das CMO para o restabelecimento da glicemia e insulinemia nos camundongos hiperalimentados. Além disso, demonstramos pela primeira vez, células CD133 marcadas com insulina nas ilhotas pancreáticas. O aumento da expressão de células CD133 no pâncreas de camundongos hiperalimentados que mantinham níveis elevados de TNF-&#945; e receberam transplante de CMO, nos sugere a importância dessa citocina para o recrutamento e diferenciação das células tronco CD133 para melhoria do percurso da diabetes. / Population studies as well as animal models show that besides the factors already known as an unbalanced diet and sedentary lifestyle, nutritional insults during pregnancy or during lactation, causes important metabolic changes that lead to the emergence of obesity, type 2 diabetes mellitus (DM2) and cardiovascular diseases in long-term. In this study, we analyzed the pancreas of overfed adult mice (150 days) and young mice (21 and 28 days). At day 21, overfed mice were transplanted with bone marrow mononuclear cells (BMCs) and the results of this transplantation were observed at day 28. We investigated beta-cell apoptosis through pro-apoptotic factor Bax, the proliferation of pancreatic islet cells by proliferating cell nuclear antigen (PCNA), expression of TNF-&#945; which has been linked to insulin resistance in obese animals and the expression of CD133 stem cells, in order to study the participation of this cell on the recovery of beta-cell mass during the establishment of DM2. The protein analysis, were performed using light microscopy, Confocal microscopy, electron microscopy and Western blotting. The animals weight, morphology of pancreatic islets, as well as plasma levels of glucose and insulin were also determined. Our results confirmed that adult overfed mice had high levels of blood glucose and insulin when compared to control mice. Moreover, overfed adult mice showed an increased expression of Bax, indicating apoptosis of beta cells, also confirmed by transmission electron microscopy, increased expression of TNF-&#945; in pancreatic islets when compared with the control group, and interestingly we observed the presence of CD133 cells in the pancreas of overfed mice. By analyzing the animals with 21 days, we also observed high levels of blood glucose and insulin in the overfed group, but we did not observe Bax expression at this lifetime. The expression of TNF-&#945; was also increased in the pancreas of overfed mice at day 21. After BMCs transplantation, the overfed group showed normal levels of blood glucose and insulin when compared with the control group, but the levels of TNF-&#945; remained high. The expression of CD133 cells was observed in the pancreatic islets both at 21 and 28 days in overfed groups. However, the expression of CD133 was increased in the pancreas of animals that received BMCs transplantation at day 28. Therefore, we conclude that overfed mice when adults are at an early stage of stablishment of DM2 with hyperglycemia and hyperinsulinemia, pancreatic islet hypertrophy, evidence of apoptosis and neogenesis of beta cells from pancreatic duct cells, replication of existing beta cells and endogenous stem cells. In young mice, further the parameters observed in adult animals, we observed the benefits of the BMCs for the restoration of glucose and insulin in overfed mice. Moreover, we demonstrated for the first time the CD133 stem cells in pancreatic islets in colocalization with insulin, suggesting that CD133 could be a progenitor beta cell marker in pancreas. Also, the increased expression of CD133 cells in the pancreas of overfed mice with elevated levels of TNF-&#945; after BMCs transplantation, suggests the importance of this cytokine for the recruitment and recovery of CD133 stem cells to improve the course of diabetes.

O objetivo geral da presente tese é testar a hipótese que a pineal faz parte integrante da resposta ao estresse, da mesma forma que está integrada ao processo inflamatório. Dois modelos de estresse, contenção e frio, foram aplicados aos ratos por 30 min ou 2 horas. Os resultados foram: ausência de úlceras gástricas e TNF em nível sérico por ambos os estresses, apenas aumento de corticosterona; somente em duas horas qualquer um dos estresses aumentou significativamente melatonina da pineal; tratamento tanto com metirapona como com mifepristone aboliram indistintamente os efeitos dos estresses; tratamento tanto com talidomida como com fenilefrina não modificaram os efeitos dos estresses. Concluímos que, o estresse moderado agudo, pela ação da corticosterona, promove modulação da pineal na dependência do estado fisiológico da mesma. Confirmamos a existência de uma relação entre as glândulas adrenais e pineal. Afirmamos que a glândula pineal exerce, além de suas clássicas funções cronobióticas, um papel de grande sensor do estado geral ao organismo inteiro. / The objective of this thesis is to test the hypothesis that the pineal is a player on stress response, likewise that it is one player in inflammatory process. Two stress models, restraint and cold, were applied to the rats for 30 min or 2 hous. The results were: absence of gastric ulcers and TNF serum levels in both stresses, just enhancement of corticosterone plasma levels; only in two hours anyone stress increased significantly pineal melatonin; metyrapone or mifepristone treatment abolish indistinctly the effects of the stresses; thalidomide or phenylephrine treatment did not modify the effects of the stresses. We conclude that the acute moderate stress by the corticosterone action promote modulation of pineal on the dependence of the physiological status of itself. We confirm the existence of a network between the adrenal and pineal glands. We affirm that the pineal gland performs, beyond of its chronobiotical classical functions, one role of the great sensor of internal body state to the whole organism.

O perfil de ativação do NF-B foi avaliado em biópsias de 47 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de hanseníase, seguidos no Ambulatório de Hanseníase do Centro de Referência Nacional em Dermatologia Tropical com Ênfase em Hanseníase do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo. O índice de ativação NF-B foi calculado de acordo com a porcentagem de positividade na histoquímica Southwestern. Índice de ativação NF-B >1 foi considerado representativo de ativação. Trinta e seis por cento dos pacientes apresentaram NF-B ativado na biópsia, o que foi mais frequente em multibacilares (54,6%) que em paucibacilares (20%), p=0,018. Hanseníase tuberculóide esteve associada com ausência de NF-B ativado (p=0,039). Forma dimorfa e neural pura estiveram associadas com ativação de NF-B, com odds ratio de 44 (p=0,014) e 30 (p=0,029), respectivamente. A ativação correlacionou-se com detecção in situ de fator de necrose tumoral por imuno-histoquímica (p=0,0064). Observou-se grande variação da ativação do NF-B nas formas clínicas de hanseníase. Ativação foi nula em granulomas de hanseníase tuberculóide, que representa a reação inflamatória mais efetiva contra o M. leprae. A ativação do NF-B ocorreu predominantemente em formas clínicas com maior suscetibilidade (multibacilares) e instabilidade imunológica (dimorfa), indicando condição favorável à infecção pela ativação do NF-B, por seus efeitos antiapoptóticos, visto que o bacilo depende das funções celulares para sobreviver. / NF-B activation profile was evaluated in cutaneous biopsies from 47 patients with clinical and laboratorial diagnosis of leprosy followed at a referral center for treatment of leprosy, the leprosy outpatient clinic of the Hospital of Clinics of Faculty of Medicine of Ribeirão Preto University of São Paulo. NF-B activation index (ranging from 0 to 4) was calculated according to the percentage of positivity in Southwestern histochemistry. Activation index >1 was considered representative of activation. Thirty-six percent of patients presented activated NF-B, which was more frequent in multibacillary (54,6%) than in paucibacillary (20%), p=.018. Tuberculoid leprosy was associated with absence of activated NF-B (p=.039). Borderline and pure neural leprosy clinical forms were associated with NF-B activation, with odds ratio of 44 (p=.014) and 30 (p=.029), respectively. NF-B activation was correlated with in situ detection of tumor necrosis factor- by immunohistochemistry (p=.0064). Great variation of NF-B activation was found in clinical forms of leprosy. Activation was absent in tuberculoid leprosys granulomas, which represent effective inflammatory reaction pattern against M. leprae. NF-B activation was present in clinical forms with increased susceptibility (multibacillary) and immunological instability (borderline), which suggests favorable conditions towards infection, probably due to the anti-apoptotic effects of NF-B, since bacillary survival is dependent of cellular functions.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-03-02T15:00:57Z No. of bitstreams: 1 michelefernandesrodrigues.pdf: 2239638 bytes, checksum: a1bfd99261016639937e0a5a3ee8fb49 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T01:36:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michelefernandesrodrigues.pdf: 2239638 bytes, checksum: a1bfd99261016639937e0a5a3ee8fb49 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T01:36:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michelefernandesrodrigues.pdf: 2239638 bytes, checksum: a1bfd99261016639937e0a5a3ee8fb49 (MD5) Previous issue date: 2013-04-10 / A tuberculose (TB) é uma doença de importância mundial. Os bacilos que causam a tuberculose entram no organismo principalmente pelas vias aéreas e a interação inicial nos pulmões é com os macrófagos alveolares, que servem como células hospedeiras. A morte dos macrófagos infectados por apoptose constitui uma alternativa de defesa do hospedeiro capaz de remover o ambiente de suporte para o crescimento bacteriano. No entanto, cepas virulentas de micobactérias parecem ser capazes de modular este processo. Alguns estudos tem destacado a importância do fator de necrose tumoral alpha (TNF-α) na modulação da apoptose de macrófagos infectados. O TNF-a exerce suas atividades biológicas através de dois receptores de superfície celular, TNFR1 e TNFR2, cujos domínios extracelulares podem ser clivados por proteólise formando receptores solúveis (sTNFR-1 e sTNFR-2). A sinalização através do TNFR1 desencadeia a maioria das funções biológicas do TNF-a, resultando em sobrevivência ou morte celular, enquanto que o TNFR2 induz a sobrevivência da célula. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do TNF e seus receptores na modulação da apoptose de macrófagos alveolares durante a fase inicial de infecção por cepas atenuada e virulenta de Mycobacterium bovis, bem como, a possível interferência da micobactéria na sinalização TNF-TNFR. Para tal, camundongos C57BL/6 foram infectados, via intratraqueal, com as cepas atenuada (BCG Moreau) ou virulenta (ATCC19274) de M. bovis. Após 3 e 7 dias de infecção, os seguintes parâmetros foram avaliados: (1) expressão de receptores de TNF (TNFR1 e TNFR2) na superfície de macrófagos alveolares, (2) expressão gênica dos receptores TNFR1 e TNFR2, (3) níveis dos receptores solúveis sTNFR1 e sTNFR2 no lavado broncoalveolar e níveis de TNF-a no pulmão (4) freqüência da apoptose de macrófagos alveolares e (5) número de bacilos nos macrófagos alveolares. Além disso, o efeito do bloqueio da sinalização TNF-TNFR1 na modulação da apoptose de macrófagos foi avaliado em camundongos deficientes em TNFR1 infectados com M. bovis BCG. Um aumento significativo da apoptose e da expressão superficial de TNFR1 foram observadas em macrófagos alveolares 3 e 7 dias após a infecção com M. bovis atenuado, mas apenas no 7º dia de infecção com o M. bovis virulento. Baixa expressão superficial de TNFR1 e aumento dos níveis de sTNFR1 no 3º dia após a infecção pela cepa virulenta foram associados com reduzidas taxas de macrófagos apoptóticos. Além disso, uma redução significativa da apoptose de macrófagos alveolares foi observada em camundongos TNFR1-/- no 3º dia após a infecção com BCG. Estes resultados sugerem um papel potencial do TNFR1 na apoptose de macrófagos durante a infecção pela micobactéria. Neste contexto, a clivagem do TNFR1 parece contribuir para a modulação da apoptose de macrófagos. / Tuberculosis (TB) is a disease of worldwide importance. The tubercle bacilli enter the organism mainly via respiratory tract and initial interaction in the lungs is with the alveolar macrophages, which serve as host cells. Apoptosis of the infected macrophages constitutes a host defense alternative capable of removing the environment supporting bacterial growth. However, virulent strains of mycobacteria appear to be capable of modulate this process. Some studies have highlighted the importance of tumor necrosis factor-a (TNF-α) in the modulation of apoptosis of infected macrophages. TNF-a exerts its biological activities via two distinct cell surface receptors, TNFR1 and TNFR2, whose extracellular domain can be released by proteolysis forming soluble TNF receptors (sTNFR-1 and sTNFR-2). The signaling through TNFR1 initiates the majority of the biological functions of TNF-a, leading to either survival or cell death, whereas TNFR2 induces survival. The aim of this study was to evaluate the influence of TNF-TNFR signaling in the modulation of apoptosis of alveolar macrophages during early stage of infection by virulent and attenuated strains of Mycobacterium bovis, as well as the possible interference of mycobacteria in this signaling. C57BL/6 mice were intratracheally infected with attenuated (BCG Moreau) or virulent (ATCC19274) strains of M. bovis. After 3 and 7 days of infection, the following parameters were assessed: (1) expression of TNF receptors (TNFR1 and TNFR2) on the surface of alveolar macrophages, (2) expression mRNA for TNF receptors, (3) levels of soluble receptors sTNFR1 e sTNFR2 in BAL and levels of TNF-a in lung (4) frequency of apoptosis alveolar macrophage and (5) number of bacilli in alveolar macrophages. Furthermore, the effect of abrogation of TNF-TNFR1 signaling in the modulation of macrophage apoptosis was assessed in TNFR1 deficient mice infected with M. bovis BCG. A significant increase of apoptosis and high expression of TNFR1 were observed in alveolar macrophages at 3 and 7 days after infection with attenuated M. bovis but only on day 7 in infection with the virulent M. bovis. Low surface expression of TNFR1 and increased levels of sTNFR1 on day 3 after infection by the virulent strain were associated with reduced rates of apoptotic macrophages. In addition, a significant reduction in apoptosis of alveolar macrophages was observed in TNFR1-/- mice at day 3 after BCG infection. These results suggest a potential role of TNFR1 in macrophage apoptosis during infection by mycobacteria. In this context, the shedding of TNFR1 appears to contribute to the modulation of macrophage apoptosis.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-03T14:02:51Z No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 1765527 bytes, checksum: 348a19d6219196394409151345b86399 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-10-03T15:17:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 1765527 bytes, checksum: 348a19d6219196394409151345b86399 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T15:17:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 1765527 bytes, checksum: 348a19d6219196394409151345b86399 (MD5) Previous issue date: 2010-03-05 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As leishmanioses são doenças infecto parasitárias que atingem aproximadamente 12 milhões de pessoas em 88 países em todo o mundo, incluindo o Brasil. Esta doença é causada por diferentes espécies de Leishmania, as quais invadem e se multiplicam dentro de macrófagos no hospedeiro vertebrado. Ainda não existe vacina e a quimioterapia é baseada principalmente nos antimoniais pentavalentes, anfotericina B e pentamidina. Entretanto, estas drogas tem uso limitado devido a toxicidade, longo tempo de tratamento e alto custo. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas drogas para as leishmanioses. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade leishmanicida de 12 derivados de aminoquinolinas, mais especificamente 4-amino-7-cloro-quinolinas, as quais apresentam grupos diaminas mono e di substituídas com alquil alcino. Em análise preliminar os compostos foram testados em formas promastigotas de L. amazonensis, L. major, L. chagasi e L. braziliensis e a atividade leishmanicida foi estabelecida pelo método do MTT. Nossos resultados mostraram variada sensibilidade das espécies de Leishmania aos compostos testados. Derivados com grupo das aminas-livre demonstraram melhor atividade leishmanicida do que outros compostos mono e di-alquil alcino substituídos. O composto 3 (4-amina-7-cloro-N-butilamina)quinolina mostrou o melhor CI50 (0,16 M para L. chagasi) demonstrando um CI50 ainda melhor do que o apresentado pela anfotericina-B (1,90 M para L. chagasi). Interessantemente, foi observada relação estrutura atividade principalmente em promastigotas de L. chagasi, sendo importante a presença do grupo amino-livre e o número de átomos de carbono. A maioria dos compostos não mostraram citotoxicidade para células de mamíferos, exceto os compostos com grupo amino-livre. O composto 5 (4-amina-7-cloro-quinolina-N-(prop-2-inil)quinolina foi escolhido para avaliação da atividade em amastigotas intracelulares e a atividade leishmanicida foi a partir da contagem dos parasitos após coloração por Giemsa. O tratamento com o composto em macrófagos infectados com L. major e L. amazonensis não demonstrou atividade leishmanicida para a primeira espécie deste parasito. Em L. amazonensis, o tratamento mostrou significante atividade nas formas intracelulares, reduzindo o número de amastigotas/macrófagos, número de células infectadas e a carga parasitária acima de 90% após 72 horas. O efeito antiamastigota foi dose e tempo dependente. Nenhuma alteração nos níveis de óxido nítrico pelos macrófagos infectados tanto com L. amazonensis quanto por L. major foi observada após tratamento com o composto 5. Entretanto, esta aminoquinolina significativamente aumentou e inibiu a produção de TNF- em células infectadas com as respectivas espécies. Conjuntamente, estes resultados sugerem que a atividade leishmanicida do composto 5 pode atuar diretamente no parasito ou através de mecanismos imunomodulatórios. Este estudo indica que derivados de aminoquinolinas tem promissoras propriedades leishmanicidas sendo bons candidatos para alvos de pesquisas para desenvolvimento de novas drogas anti-protozoários. / The leishmaniasis are parasitic-infection diseases that affect 12 million people in 88 countries, it remains a serious public health problem worldwide, including in Brazil. This disease is caused by different Leishmania species, which invade and multiply within macrophages in vertebrate host. No vaccine exists yet and chemotherapy has been based mainly in pentavalent antimonials, amphotericinB e pentamidina. However, these drugs have limited use due to their toxicities, long term treatment and high costs. Therefore, there is an urgent need for development of new drugs for leishmaniasis. The aim of this study was to evaluate the leishmanicidal activity in twelve aminoquinolines derivatives, but specifically, 4-amino-7-chloro-quinoline, those present diamine with amine-free, mono-alkyne or di-alkyne groups. In a previous analysis the compounds were tested in promastigote forms of L. amazonensis, L. major, L. chagasi and L. braziliensis and the leishmanicidal activities was established by MTT method. Our results showed varied sensibility of the Leishmania species to the tested compounds. Derivatives with amine-free groups demonstrated better leishmanicidal activity than the others compounds and the compound 3(4-amine-7-cloro-N-butilamine)quinoline showed the best IC50 (=0,16 M for L. chagasi) displaying an IC50 better than anfothericin B (1,90 M para L. chagasi) Interestingly, it was observed structure-activity relationships (SAR) mainly in promastigotes of L. chagasi, being important the presence of amine-free group and number of carbon atoms. The majority of compounds didn’t showed citotoxicity for the mammalian cells, except compounds containing amine-free groups. The compound 5 (4-amine-7- chloro-quinoline-N-prop-2-ynil)quinoline was chosen for antileishmanial evaluation in an intramacrophage amastigotes model and the leishmanicidal activity was achieved from the count of parasites after coloration by Giemsa. The treatment with this compound from infected macrophages with L. major e L. amazonensis didn’t show leishmancidal activity for the first specie of this parasite. In L. amazonensis, the treatment showed a significant activity against intracellular forms, reducing the number of amastigotes/macrophage, the infected cells and the parasite burden above 90% after 72 hours. The antiamastigote effect was dose and time response. No alteration in nitric oxide levels by infected macrophages as for L. amazonensis as well for L. major was observed after treatment with the compound 5. However, this aminoquinoline significantly enhanced and inhibit the TNF- production in infected cells with the respective Leishmania species. Together, these results suggest strongly that leishmanicidal acitivity from compound 5 can be directly in parasites or through the immune modulatory mechanism. This study indicate that aminoquinolines have promising leishmanicidal properties being a good candidates for further research to develop of new anti-protozoan drugs.

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Entretanto, seus efeitos tóxicos e teratogênicos tornam sua utilização limitada e motivam pesquisas para a síntese de análogos que apresentem eficácia semelhante na imunomodulação, sem efeitos tóxicos. Diversos análogos da talidomida vêm sendo desenvolvidos no laboratório de química da UFJF. Em estudos anteriores, mostramos que a introdução de dois anidridos ftálicos na composição aumenta significativamente a atividade biológica e solubilidade em água do composto, sem aumento da toxicidade em modelos experimentais in vitro e in vivo. O presente trabalho visa a síntese de dois novos compostos análogos da talidomida, CAT-15 e CAT-16, formados por apenas um derivado anidrido ftálico aberto, mantendo um grupo amino livre, e a avaliação da sua atividade anti-inflamatória utilizando linhagem de célula HT-29 e células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) estimuladas com LPS. A citotoxicidade dos compostos foi avaliada pelo ensaio do MTT, com tratamento por 18 horas para células HT-29 e por 24 e 48 horas para PBMC, usando concentrações crescentes de talidomida, CAT-15, CAT-16. A dexametasona foi utilizada como controle positivo. A produção de TNF-α, CXCL-10, IL-6, IL-8 e IL-10 foi avaliada pelo método de ELISA. Os novos compostos não foram tóxicos para as células HT-29 e PBMC em nenhuma das concentrações testadas, com exceção de CAT-16 a 1600µM. Células HT-29 produziram grande quantidade de CXCL-10 em resposta ao LPS e os resultados deste trabalho mostram que a talidomida e os análogos CAT-16 e CAT-15 apresentam atividade inibitória sobre a produção desta quimiocina. O composto CAT-16 modulou a produção de CXCL-10 em concentrações menores que a talidomida em ambos os modelos de tratamento (simultâneo e prétratamento). Em contrapartida, a modulação por CAT-15 foi observada apenas no modelo de pré-tratamento. Com relação a IL-8, a talidomida e o CAT-16 inibiram a produção desta citocina por células HT-29 apenas na concentração de 100µM. Ao contrário das células HT-29, o PBMC produziu TNF-α em resposta ao LPS, tendo a talidomida e o análogo CAT-16 apresentado capacidade de inibição da produção do TNF-α em ambos os tempos de tratamento. O análogo CAT-15 não influenciou a produção de TNF-α por PBMC em nenhuma das concentrações e tempos de tratamento. Este estudo também mostra a atividade da talidomida e dos nos análogos sobre a produção de IL-6 e IL-10 por PBMC, havendo significativa inibição da produção de IL-6 por todos os compostos e tempos de tratamento e sobre IL-10 pelo composto CAT-15 após 48 horas de incubação. Nossos resultados sugerem a aplicabilidade dos novos compostos, CAT-15 e CAT-16, no controle de respostas inflamatórias uma vez que inibiram a produção de moléculas chave como TNF-α, IL6, IL-10, IL-8 e CXCL-10. Ainda, esses compostos possuem estruturas simplificadas, têm baixo custo de produção, são hidrossolúveis e não possuem centro quiral. Esses resultados podem contribuir no desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para certas condições inflamatórias. / Thalidomide is a potent anti-inflammatory drug used in the treatment of various pathologies including Erythema Nodosum Leprosum (ENL), cancer, Crohn's disease and other inflammatory and vascular disorders. However, its toxic and teratogenic effects make its use limited and motivate research groups to synthesize analogues presenting similar immunomodulation efficacy, without toxic effects. Several analogs of thalidomide have been developed in the laboratory of chemistry of the UFJF. Previously, we have shown that introduction of two phthalic anhydrides into the composition significantly enhances biological activity and water solubility, without enhanced toxicity. The present work aims at the synthesis of two new analogues of thalidomide, CAT-15 and CAT-16, formed by only one open phthalic anhydride derivative, maintaining a free amino group, and the evaluation of its anti-inflammatory activity using HT- 29 and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated with LPS. The cytotoxicity of the compounds was evaluated by the MTT assay, with 18 hours treatment for HT-29 cells and for 24 and 48 hours for PBMC, using increasing concentrations of thalidomide, CAT-15, CAT-16. Dexamethasone was used as a positive control. Production of TNF-α, CXCL-10, IL-6, IL-8 and IL-10 was evaluated by the ELISA method. The novel compounds were not toxic to HT-29 and PBMC cells at any of the concentrations tested, with the exception of CAT-16 at 1600μM. HT-29 cells produced large amounts of CXCL-10 in response to LPS and the results of this work show that thalidomide and the CAT-15 and CAT-16 analogs exhibit inhibitory activity on the production of this chemokine. CAT-16 compound modulated the production of CXCL-10 at lower concentrations than thalidomide in both treatment models (simultaneous and pretreatment). In contrast, CAT-15 modulation was observed only in the pre-treatment model. Regarding IL-8, thalidomide and CAT-16 inhibited their production by HT-29 cells only at the concentration of 100 μM. Unlike HT-29 cells, PBMC produced TNF-α in response to LPS, with thalidomide and CAT-16 analog being able to inhibit TNF- production at both treatment times. The CAT-15 analogue did not influence the production of TNF-α by PBMC at any of the concentrations and treatment times. This study also shows the activity of thalidomide and the analogs on IL-6 and IL-10 production by PBMC, with significant inhibition of IL-6 production by all compounds and treatment times and on IL-10 by compound CAT-15 after 48 hours of incubation. Our results suggest the applicability of the new compounds, CAT-15 and CAT-16, in the control of inflammatory responses since they inhibited the production of key molecules such as TNF-α, IL-6, IL-10, IL-8 and CXCL-10. Furthermore, these compounds have simplified structures, and low cost of production, are water soluble and have no chiral center. These results may contribute to the development of novel treatment strategies for certain inflammatory conditions.

English Abstract Crohn's disease together with ulcerative colitis, is a type of inflammatory bowel disease (IBD) with increasing incidence and prevalence in developed countries. IBD is an immunologically mediated multifactorial disease and it's mechanism of action is still unknown. Current well- established treatment targets the inflammation with corticosteroids and immunosuppressive drugs. Apart from the intestinal inflammation, which is the primary target of the treatment, patients are characteristically afflicted with intestinal dysbiosis. Therefore, possible interventions might be an adjuvant or biological therapy. Adjuvant therapy directly aims the microbiota with probiotics, whereas the target of biological therapy is TNF-α, a pro- inflammatory cytokine excessively secreted by macrophages. The aim of this thesis is to evaluate intestinal microbiota composition changes in IBD patients with regard to courses of adjuvant and biological therapy. Bacterial diversity was analyzed using three different DNA extraction techniques. Rapid beat beating + column (RBB+C) was chosen for analyzing patient samples, as it showed the highest DNA yield and the highest DNA purity. Primarily the bacterial diversity was analyzed using degradation gradient gel electrophoresis (DGGE) with subsequent sequencing of bands of...

The objectives of this thesis were to synthesize existing RCT evidence and post-market observational evidence of TNF-α inhibitors in IBD. Two separate systematic reviews were performed: an overview of systematic reviews of RCTs, and a systematic review of post-market observational studies of TNF-α inhibitors in Crohn’s disease and ulcerative colitis. The overview of systematic reviews included 37 studies. RCT evidence demonstrated superiority of all agents to placebo in Crohn’s disease and ulcerative colitis, with no increased risk of malignancy or serious adverse events. Network meta-analyses have not shown superiority of any agent compared to another. The second systematic review included 255 studies. Included studies were deemed to be unamenable to pooling with substantial methodological and clinical diversity. Available evidence is insufficient to determine whether real-world effectiveness and safety is consistent with RCTs, but suggests no increased risk of malignancy and no difference in efficacy between adalimumab and infliximab.