Introduction: Current medical treatment for individuals diagnosed with schizophrenia (SCHZ) primarily relies on the inhibition of the dopamine D2 receptor that has been shown to be supersensitive in these patients. Treatment occurs through the use of antipsychotic medication which leads to a number of debilitating dose-dependent side effects, such as weight gain, agranulocytosis, and seizures. Patients diagnosed with SCHZ have also been shown to have increased inflammation in their central nervous system (CNS), particularly within specific brain regions such as the prefrontal cortex and hippocampus. This is in large part due to the interaction between a pro-inflammatory cytokine called tumor necrosis factor-alpha (TNFa) and microglia, which are resident CNS defense cells. TNFa is a cell-signaling protein, regulates a variety of immune cells, and is involved in the acute phase reaction of inflammation. Upon activation by TNFa secretion, microglial cells switch from being anti-inflammatory (M2) to pro-inflammatory (M1), thereby resulting in neuroinflammation as well as synaptic loss and neuronal death. In this project, we hypothesized oral administration through the diet of a novel TNFa modulator (PD2024) developed by P2D Biosciences, Inc. (Cincinnati, OH) would significantly reduce microglia activation in rats neonatally treated with Polyinosinic:polycytidylic acid (poly I:C). Methods and Results: To test our hypothesis, four groups (Neonatal Poly I:C/TNFa, Neonatal Poly I:C/Control, Neonatal Saline/TNFa, and Neonatal Saline/Control) were intraperitoneally injected with either poly I:C or saline during postnatal days (P)5-7. Poly I:C is an immunostimulant that mimics neonatal infection in humans, which also has been found to be a factor for the development of SCHZ later in life. Between days (P)30-(P)60, the Neonatal Poly I:C/TNFa and Neonatal Saline/TNFa groups were orally administered PD2024 through the diet. After (P)60, brain tissue was evaluated by immunohistochemistry (IHC) and confocal microscopy. Immunohistochemistry was used to label microglial cells in the prefrontal cortex and hippocampus with a green fluorescent dye attached to Iba1, a protein that specifically binds to these cells. Upon completion of IHC, tissue was evaluated using a confocal microscope and then analyzed with NIH ImageJ software. Analysis parameters included cell count, sampled cell body fluorescence, and overall image fluorescence. The results obtained showed a significant decrease in microglia activation for the Poly I:C/TNFa group when compared to the Poly I:C/Control group, as well as similarities in activation levels with the Saline/Control group. These results were demonstrated in both sampled cell body fluorescence and overall image fluorescence measurements. Conclusion: This data supports the hypothesis that PD2024 is successful in reducing microglia activation through the modulation of TNFa. Therefore, treatment with a TNFa modulator such as PD2024 alongside of current antipsychotic medication could mediate neuroinflammation and reduce the dose-dependent side effects. This approach could be a promising therapeutic treatment option for those diagnosed with schizophrenia, as well as potentially for other neurocognitive and behavioral disorders.

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Im Jahr 2008 gab es weltweit 347 Millionen Diabetiker bei weiter zunehmender Inzidenz. Die beiden größten Unterformen sind mit 90 % Typ 2- und 10 % Typ 1-Diabetes (Danaei et al. 2011). Beiden Diabetesformen sind eine Dysfunktion und ein Zelltod der Betazellen durch Apoptose gemeinsam, die Betazellschädigung wird dabei über ähnliche Signaltransduktionwege vermittelt. Ein wichtiger Gegenspieler der Betazellapoptose ist der Transkriptionsfaktor CREB, der an der Regulation der Insulingentranskription beteiligt und wichtig für das Betazellüberleben ist (Oetjen et al. 1994, Jhala et al. 2003). Durch die MAP3-Kinase DLK kann die transkriptionelle Aktivität von CREB in Betazellen gehemmt werden (Oetjen et al. 2006). Als übergeordnete MAP3K kann DLK die Apoptose-regulierende MAP-Kinase JNK aktivieren und von ihr wieder aktiviert werden (Handley et al. 2007). Die bei Diabetes mellitus Typ 1 und Typ 2 vermehrt produzierten proinflammatorischen Zytokine TNF-Alpha und IL-1 Beta können ebenfalls JNK aktivieren (Mandrup-Poulsen 2003). In dieser Arbeit wurde die Wirkung von TNF-Alpha und IL-1 Beta auf die CREB-abhängige Gentranskription im Luciferase-Reporter-Assay und auf das Absterben und die Apoptose von Betazellen im MTT-Test und Immunfluoreszenz-Assay in der Betazelllinie HIT-T15 untersucht. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Zytokinwirkung DLK-abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass TNF-Alpha und IL-1 Beta die stimulierte CRE-/CREB-abhängige Gentranskription hemmen, Überexpression von DLK verstärkt diese Wirkung, bei TNF-Alpha mehr als bei IL-1Beta. Verminderung der endogenen DLK durch siRNA reduziert die TNF-Alpha- und IL-1 Beta-induzierte CREB Hemmung. Beide Zytokine konnten eine Betazellapoptose auslösen, die ebenfalls durch die DLK verstärkt wird. Bei Überexpression einer Kinase-toten DLK-Mutante konnte durch TNF-Alpha keine Apoptose induziert werden, aber durch IL-1 Beta, dies spricht dafür, dass die Wirkung von TNF-Alpha zu einem größeren Teil abhängig von der DLK ist als die Wirkung von IL-1 Beta, die zum Teil DLK-unabhängig vermittelt wird. Zusammengefasst könnte TNF-Alpha über Aktivierung von DLK und JNK und anschließend gegenseitiger Signalamplifikation beider Kinasen zu einer DLK-vermittelten Hemmung der CREB-abhängigen Gentranskription führen, eine Betazelldysfunktion und Apoptose vermitteln und zur Entstehung von Diabetes beitragen. Dagegen könnte IL-1 Beta über Aktivierung von JNK indirekt die DLK aktivieren und zu einer CREB-Hemmung führen. Die DLK scheint eine zentrale Rolle in der Zytokin-induzierten Betazellschädigung einzunehmen. Eine gewebespezifische Hemmung der DLK, wie z.B. über den Proteinkinaseinhibitor Tozasertib im Glaukommodell gezeigt (Welsbie et al. 2013), könnte daher auch einen neuen Ansatz in der Therapie des Diabetes mellitus darstellen.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glutaric acidemia type I (GA-I) is an inborn error of metabolism (EIM), characterized biochemically by major accumulation of glutaric acid (GA) and pathologically by a characteristic striatal degeneration. The clinical manifestations are mainly neurological and develop during childhood (up to 5 years old). Among these changes, there are the seizures and cognitive deficits, which may be precipitated by infectious processes. From this, the first hypothesis to be tested in this study was to investigate whether lipopolysaccharide E. coli 055 B5 serotype (LPS; 2 mg/Kg; i.p.), an inflammatory agent, could facilitate seizures induced by GA in young rats (21 days of life). For this, firstly it was determined the acute dose of intrastriatal GA (1.3 μmol/striatum) that cause behavioral and electroencephalographic (EEG) seizures in young rats. Moreover, it was shown that LPS administration 3 hours before GA intrastriatal injection did not change the seizures, but when LPS was administered 6 hours before the GA, it reduced the latency and increased the duration of behavioral and EEG seizures induced by GA in young rats. It also was observed that LPS injection caused an initial drop in rectal temperature of young rats (up to 2 hours), followed by a rise in temperature that started at 3 hours and remained high until 6 hours after LPS injection. Furthermore, it was shown that LPS injection 3 and 6 hours before intrastriatal injection of GA caused an increase in striatal levels of IL-1β in young rats, and this increase was statistically higher in 6 than in 3 hours. In addition, it was observed that the increase in IL-1β striatal levels, caused by LPS administration, positively correlated with total time of seizures. Finally, it was observed that previous use of IL-1β antibody prevented the latency reduction and the increased duration of seizures caused by LPS administration 6 h before intrastriatal injection of GA in young rats. Thus, these findings suggest that the signaling of IL-1β present in inflammation produced by LPS contributes significantly to neuronal hyperexcitability, and thus to reduce latency and increase the duration of seizures induced by GA. Therefore, pharmacological treatments that block the specific functions or overproduction of IL-1β in GA-I, may represent an unconventional strategy to treat this condition. However, clinical studies should be conducted to evaluate the effectiveness of treatment in glutaricoacidemic patients with convulsions. Since patients with GA-I have other important neurological changes addition to the seizures, as cognitive impairments, the second hypothesis to be tested in this study was to determine whether chronic treatment with GA (5 μmol/g; s.c.; twice per day; from the 5th to the 28th day of life) could cause spatial memory impairment in young rats, and verify whether the inflammation produced by LPS (2 mg/Kg; i.p.; one per day; from the 25th to the 28th day of life) could facilitate the cognitive deficit induced by GA. In addition, it also was evaluated the possible impact of these treatments on functional and structural changes in the hippocampus of these animals. Initially it was shown that chronic treatment with GA, as well as the treatments with LPS and GA-LPS, caused a deficit in spatial learning of young rats. However, it was demonstrated that the treatment with GA-LPS produced a greater impairment in spatial memory compared to other treatments. In addition, it was observed that none of the treatments affected weight or locomotor activity/exploratory of animals. It also was shown that chronic treatment with GA, as well as treatments with LPS and GA-LPS, increased the hippocampal levels of IL-1β and TNF-α in young rats. Furthermore, it was demonstrated that treatments with GA, LPS and GA-LPS caused a reduction in total hippocampal volume of young rats. Finally it was observed that treatments with GA, LPS and GA-LPS caused a reduction of α1 subunit activity of Na+,K+-ATPase enzyme. On the other hand, it was shown that treatments with GA and LPS caused an increase in activity of α2/3 subunits of the enzyme. Thus, only treatment with GA-LPS showed a reduction in total activity of Na+,K+-ATPase in the hippocampus of young rats. These data indicate that the impairment in spatial learning observed in rats treated with GA, LPS and GA-LPS was due to increased levels of inflammatory cytokines, the reduction in hippocampal volume and the inhibition of α1 subunit activity of Na+,K+-ATPase enzyme. However, the worsening in spatial memory observed in rats treated with GA-LPS was due to inhibition of total activity of Na+,K+-ATPase, which was specific α2/3 isoforms, since only this group showed no compensatory response the activity of these subunits. Therefore, this second part of the study showed that chronic treatment with GA caused a deficit in spatial learning in young rats, and that the presence of an inflammatory process increased the impairment in spatial memory induced by GA alone. Thus, understanding the mechanisms involved in seizures and cognitive deficits observed in patients with GA-I in the presence of an inflammatory process is important for the development of new therapies to treat this condition, as well as other diseases associated with the presence of inflammatory mediators. / A acidemia glutárica tipo I (GA-I) é um erro inato do metabolismo (EIM) caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo principal de ácido glutárico (GA) e patologicamente por uma característica degeneração estriatal. As manifestações clínicas são predominantemente neurológicas, e desenvolvem-se principalmente na infância (até os 5 anos de idade). Entre estas alterações, destacam-se as convulsões e os déficits cognitivos, os quais podem ser precipitados por processos infecciosos. A partir disso, a primeira hipótese a ser testada neste estudo foi investigar se o lipopolissacarídeo sorotipo E. coli 055 B5 (LPS; 2 mg/Kg; i.p.), um agente inflamatório, facilitaria as convulsões induzidas pelo GA em ratos jovens. Para isso, primeiramente determinou-se a dose intraestriatal aguda de GA (1.3 μmol/estriado) que causa convulsões comportamentais e eletroencefalográficas (EEG) em ratos jovens (21 dias). Em seguida foi verificado que a administração de LPS 3 horas antes da injeção intraestriatal de GA não alterou as convulsões, mas quando o LPS foi administrado 6 horas antes do GA, ele reduziu a latência e aumentou a duração das convulsões comportamentais e EEG induzidas pelo GA em ratos jovens. Observou-se também que injeção de LPS causou uma queda inicial na temperatura retal dos ratos jovens (até 2 horas), seguida de uma elevação na temperatura que iniciou em 3 horas e permaneceu alta até 6 horas após a injeção de LPS. Além disso, foi verificado que injeção de LPS 3 e 6 horas antes da injeção intraestriatal de GA causou um aumento nos níveis estriatais de IL-1β nos ratos jovens, sendo esse aumento estatisticamente maior em 6 do que em 3 horas. Também foi observado que o aumento nos níveis estriatais de IL-1β, causado pela administração de LPS, correlacionou-se positivamente com o tempo total de convulsões. Por fim, verificou-se que uso prévio do anticorpo da IL-1β preveniu a redução da latência e o aumento da duração das convulsões causadas pela administração de LPS 6 horas antes da injeção intraestriatal de GA nos ratos jovens. Assim, estes achados sugerem que a sinalização da IL-1β presente no processo inflamatório produzido pelo LPS contribui decisivamente para a hiperexcitabilidade neuronal e, consequentemente, para a redução da latência e o aumento da duração das convulsões induzidas pelo GA. Dessa maneira, tratamentos farmacológicos específicos que bloqueiam a superprodução ou as funções da IL-1β na GA-I, podem representar uma estratégia não convencional para o tratamento dessa patologia. Entretanto, estudos clínicos devem ser realizados a fim de avaliar a eficácia desse tratamento nos pacientes glutaricoacidêmicos que apresentam convulsões. Desde que os pacientes com GA-I apresentam outras alterações neurológicas importantes além das convulsões, como prejuízos cognitivos, a segunda hipótese a ser testada neste estudo foi verificar se o tratamento crônico com GA (5 μmol/g; s.c.; duas vezes por dia; do 5° ao 28° dia de vida) causaria déficit de memória espacial em ratos jovens, bem como se a inflamação produzida pelo LPS (2 mg/Kg; i.p.; uma vez por dia; do 25° ao 28° dia de vida) facilitaria o déficit cognitivo induzido pelo GA. Além disso, também foi objetivo avaliar o impacto desses tratamentos sobre possíveis alterações funcionais e estruturais no hipocampo desses animais. Inicialmente verificou-se que o tratamento crônico com GA, assim como os tratamentos com LPS e GA-LPS, causaram um déficit no aprendizado espacial dos ratos jovens. No entanto, foi observado que o tratamento com GA-LPS produziu um maior prejuízo na memória espacial comparado com os outros tratamentos. Em seguida foi observado que nenhum dos tratamentos alterou o peso ou a atividade locomotora/exploratória dos animais. Verificou-se também que o tratamento crônico com GA, assim como os tratamentos com LPS e GA-LPS, aumentaram os níveis hipocampais de IL-1β e TNF-α nos ratos jovens. Além disso, foi observado que tratamentos com GA, LPS e GA-LPS causaram uma redução no volume hipocampal total dos ratos jovens. Finalmente verificou-se que os tratamentos com GA, LPS e GA-LPS causaram uma redução na atividade da subunidade α1 da enzima Na+,K+-ATPase. Por outro lado, foi observado que os tratamentos com GA e LPS causaram um aumento na atividade das subunidades α2/3 da enzima. Assim, somente o tratamento com GA-LPS apresentou uma redução na atividade total da enzima Na+,K+-ATPase no hipocampo dos ratos jovens. Estes dados indicam que o prejuízo no aprendizado espacial observado nos ratos tratados com GA, LPS e GA-LPS parece estar relacionado a um aumento nos níveis de citocinas inflamatórias, a uma redução no volume hipocampal e a uma inibição na atividade da subunidade α1 da enzima Na+,K+-ATPase. No entanto, o maior prejuízo na memória espacial observado nos ratos tratados com GA-LPS ocorreu devido a inibição na atividade total da enzima Na+,K+-ATPase, que foi específica das isoformas α2/3, já que somente este grupo não apresentou resposta compensatória na atividade destas subunidades. Portanto, esta segunda parte do estudo demonstrou que o tratamento crônico com GA causou um déficit no aprendizado espacial de ratos jovens, e que a presença de um processo inflamatório potencializou o prejuízo na memória espacial induzida pelo GA sozinho. Assim, o entendimento dos mecanismos envolvidos nas convulsões e no déficit cognitivo observados nos paciente com GA-I frente a um processo inflamatório é importante para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento dessa patologia, bem como de outras doenças associadas à presença de mediadores inflamatórios.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O desenvolvimento de mudanças neuropatológicas características da doença de Alzheimer (DA) nos portadores de síndrome de Down (SD) a partir dos 40 anos de idade e a alta taxa de indivíduos com SD em famílias nas quais a DA está presente sugerem uma susceptibilidade comum entre as duas doenças. Além disso, mulheres jovens (<35 anos na concepção) que tiveram filhos com a SD têm um risco cinco vezes maior de desenvolverem DA do que a população em geral. Esta alta suscetibilidade compartilhada poderia envolver um processo de envelhecimento acelerado, que levaria à SD em filhos de mães jovens e a um risco aumentado de demência nestas mães. Até o momento, os genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945;, envolvidos direta ou indiretamente na deposição cerebral de beta amilóide e reconhecidos dentre os determinantes genéticos para a DA, parecem também intervir na patogênese da demência na SD. Neste estudo, analisamos a freqüência dos alelos &#949;2, &#949;3 e &#949;4 do gene APOE e dos polimorfismos -48C>T no gene PSEN1 e -850C>T no gene TNF-&#945; em mães de portadores da SD em comparação com mães de indivíduos cromossomicamente normais. Para isto, amostras de DNA foram extraídas a partir do sangue periférico de 114 mães de portadores da trissomia livre do cromossomo 21 com idade inferior a 35 anos no momento da concepção e de 110 mães controle. Para a triagem dos polimorfismos dos alelos do gene APOE e dos polimorfismos PSEN1 -48C>T e TNF-&#945; -850C>T foi realizada a técnica de PCR seguida da digestão dos produtos amplificados com as endonucleases de restrição HhaI, HgaI e HincII, respectivamente. Os produtos digeridos foram analisados através de eletroforese em géis de poliacrilamida corados por prata. A análise estatística através do teste exato de Fisher revelou que não houve diferenças significativas entre as distribuições genotípicas observadas nas amostras caso e controle tanto para os alelos do gene APOE, quanto para os polimorfismos PSEN1-48C>T e TNF-&#945; -850C>T (c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectivamente). Diferenças significativas também não foram observadas tanto na análise da interação gênica multiplicativa entre os alelos dos genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945; como na interação entre estes alelos e polimorfismos participantes do metabolismo do folato (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). No Brasil, este é o primeiro relato da investigação destes genes entre as mães de indivíduos com SD. Nossos resultados sugerem que os alelos APOE e4, PSEN1-48 C e TNF-&#945; -850T não são fatores de risco independentes para a DA nestas mães. Entretanto, em virtude da complexidade tanto da SD como da DA, a análise de variantes em outros genes é de fundamental importância para melhor elucidar o aparecimento insidioso de DA em mães jovens que tiveram filhos com SD. / The development of neuropathological changes of Alzheimer's disease (AD) in patients with Down syndrome (DS) from 40 years old and the high rate of DS births in families of DA individuals suggest a common susceptibility between the two diseases. Besides a five-fold higher risk for AD has been reported in young mothers of DS individuals. This shared genetic susceptibility involving DS and AD could be due to an accelerated ageing process, leading to the birth of a DS child in the offspring of young mothers and to an increased risk of dementia among them. Between the genetic risk factors for AD, APOE, PSEN1 and TNF-&#945; genes are directly or indirectly involved in cerebral amyloid deposition and seem to play a role in the pathogenesis of dementia in DS. In this study, we analyzed the frequency of APOE alleles &#949;2, &#949;3 e &#949;4 and the polymorphisms -48C>T in the PSEN1 gene and -850C>T in the TNF-&#945; gene in DS young mothers in comparison to mothers who had had chromosomicaly normal children. With this purpose, DNA samples were extracted from 114 mothers of DS individuals (full trisomy 21) with less than 35 years-old at conception, and from 110 control mothers. For the screening of the APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms, polymerase chain reaction (PCR) was accomplished, followed by the digestion of the amplification products with the restriction endonucleases HhaI, HgaI and HincII, respectively. The digested products were analysed by polyacrilamide gels electrophoresis followed by silver staining. No significant differences were observed between the genotype distributions observed in control and case samples with respect APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms (Fisher exact test: c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectively). No differences were also observed in the gene multiplicative interaction analysis for APOE, PSEN1 and TNF-&#945; alleles and in the interaction of these alleles with folate pathway polymorphisms (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). This is the first study reporting the investigation of these genes in Brazilian DS mothers. Our findings suggest that APOE &#949;4, PSEN1 -48C and TNF-&#945; -850T alleles are not independent risk factors for AD in young DS mothers. However, considering the complexity of both DS and AD, polymorphisms in other genes should be investigated to evaluate the actual relationship between the genetic risk factors and AD in DS young mothers.

Osteoporosis is defined as an osteometabolic disease characterized by the reduction of bone mineral density (BMD) and micro-architectural deterioration, leading to enhanced bone fragility and increased susceptibility to fractures. Chronic inflammation affecting bone resorption and/or bone formation is an important mechanism in the hystopathology of osteoporosis. In this regard, several inflammatory markers are associated in special, tumor necrosis factor alpha (TNFα). Recent evidence from the literature pointed out that other members of the TNF superfamily, the tumor necrosis factor TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK), in its soluble bioactive form (sTWEAK), has been related with diverse endocrine metabolic disarrangements such as diabetes mellitus or metabolic syndrome. Thus, we hypothesized a possible association between sTWEAK plasma levels and bone fractures and diabetes mellitus in post menopausal women. This was a cross sectional study nested in a cohort of 1057 post menopausal women outpatients attending the UBS, Unidades Básicas de Saúde, of Santa Maria. We used data from 52 individuals recruited who reported major bone fractures. For the control group, we aleatory recruited 110 individuals without the history of major bone fractures. All subjects in this study proceeded to a standard questionnaire about clinical data and were submitted to anthropometry evaluation. Blood samples were obtained for the biochemical profile consisting in fast glucose, total cholesterol, TG, HDL, LDL, creatinine, albumin, calcium and phosphorus in serum. sTWEAK concentration was established by ELISA. Assimetric variables were logN transformed. Student T test or Mann-Whitney test were used to comparison of data between two groups. For statistical analysis that form more than two groups were employed ANOVA or Chi quadrate and Fisher s test. An statistical significant reduction (p=0.002) of sTWEAK (log transformed) was observed in diabetes mellitus (DM) subjects in comparison to non-diabetics. There was no differences in the plasma levels of sTWEAK when the history of major bone fractures was analysed. Even when stratified for DM and fractures, Ln sTWEAK remained consistently reduced in the group of individuals with DM without fractures against non-diabetics no-fractures women (p <0.01). Findings from this study indicated that plasma levels of sTWEAK was not related with bone fragility in post menopausal women population. Nevertheless, low plasma levels of this biomarker were associated with diabetes mellitus, as previously described in the literature. / A osteoporose é um transtorno osteometabólico caracterizado pela diminuição da densidade mineral óssea (DMO) e deterioração de sua microarquitetura com o consequente aumento da fragilidade do osso e suscetibilidade à fraturas. A fisiopatologia dessa doença tem a inflamação crônica como importante mecanismo no aumento da reabsorção e redução da formação óssea. Entre os marcadores inflamatórios associados à osteoporose destacam-se aqueles do grupo dos fatores de necrose tumoral, em particular, o fator de necrose tumoral alfa (TNFα). Evidências recentes da literatura observaram que um outro membro da mesma família, o TNFlike weak inducer of apoptosis (TWEAK), em sua forma solúvel (sTWEAK), foi relacionado com a presença de outros distúrbios endócrino metabólicos, tais como diabetes mellitus (DM) e síndrome metabólica. Com base nisso, testamos a hipótese de associação entre sTWEAK e fraturas ósseas maiores, e também DM, em mulheres na pós menopausa. Este é um estudo transversal que partiu de uma coorte de 1057 pacientes na pós menopausa que consultam nas Unidades Básicas de Saúde da cidade de Santa Maria-RS. Foram recrutadas 52 pacientes com histórico de fraturas ósseas maiores e, para o grupo controle, escolhidas aleatoriamente 110 pacientes sem história de fraturas ósseas. Todos os indivíduos do estudo responderam a um questionário padronizado sobre a sua história clínica além de serem submetidos a avaliação antropométrica e exames bioquímicos (glicose de jejum, colesterol total, triglicerídeos, HDL, LDL, creatinina, albumina, cálcio e fósforo). Os níveis plasmáticos de sTWEAK foram avaliados pelo método de ELISA. As variáveis com distribuição assimétrica foram submetidas à transformação para o seu logaritmo natural e então comparadas. Para a análise estatística entre dois grupos foi feita a utilização dos testes T de Student ou Mann-Whitney. Para mais de dois grupos foram empregados ANOVA ou os testes de Chi Quadrado ou Fisher. Foi observada redução significativa (p=0.002) dos valores do sTWEAK (transformado para logN) nos indivíduos com DM em comparação com os sem DM. Não houveram diferenças quando analisado somente o histórico de fraturas. Estratificando a população em subgrupos de acordo com o critério de existência de fratura reportada ou de diagnóstico de DM, permaneceu somente a diferença entre os grupos com DM sem fratura e sem DM sem fratura (p<0.01). Os achados indicam que na população de mulheres na pós menopausa com e sem história de fraturas ósseas maiores, os níveis plasmáticos de sTWEAK não tem associação com a fragilidade óssea. Entretanto, níveis baixos deste biomarcador estão associados com o diagnóstico de DM, como reportado na literatura.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O desenvolvimento de mudanças neuropatológicas características da doença de Alzheimer (DA) nos portadores de síndrome de Down (SD) a partir dos 40 anos de idade e a alta taxa de indivíduos com SD em famílias nas quais a DA está presente sugerem uma susceptibilidade comum entre as duas doenças. Além disso, mulheres jovens (<35 anos na concepção) que tiveram filhos com a SD têm um risco cinco vezes maior de desenvolverem DA do que a população em geral. Esta alta suscetibilidade compartilhada poderia envolver um processo de envelhecimento acelerado, que levaria à SD em filhos de mães jovens e a um risco aumentado de demência nestas mães. Até o momento, os genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945;, envolvidos direta ou indiretamente na deposição cerebral de beta amilóide e reconhecidos dentre os determinantes genéticos para a DA, parecem também intervir na patogênese da demência na SD. Neste estudo, analisamos a freqüência dos alelos &#949;2, &#949;3 e &#949;4 do gene APOE e dos polimorfismos -48C>T no gene PSEN1 e -850C>T no gene TNF-&#945; em mães de portadores da SD em comparação com mães de indivíduos cromossomicamente normais. Para isto, amostras de DNA foram extraídas a partir do sangue periférico de 114 mães de portadores da trissomia livre do cromossomo 21 com idade inferior a 35 anos no momento da concepção e de 110 mães controle. Para a triagem dos polimorfismos dos alelos do gene APOE e dos polimorfismos PSEN1 -48C>T e TNF-&#945; -850C>T foi realizada a técnica de PCR seguida da digestão dos produtos amplificados com as endonucleases de restrição HhaI, HgaI e HincII, respectivamente. Os produtos digeridos foram analisados através de eletroforese em géis de poliacrilamida corados por prata. A análise estatística através do teste exato de Fisher revelou que não houve diferenças significativas entre as distribuições genotípicas observadas nas amostras caso e controle tanto para os alelos do gene APOE, quanto para os polimorfismos PSEN1-48C>T e TNF-&#945; -850C>T (c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectivamente). Diferenças significativas também não foram observadas tanto na análise da interação gênica multiplicativa entre os alelos dos genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945; como na interação entre estes alelos e polimorfismos participantes do metabolismo do folato (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). No Brasil, este é o primeiro relato da investigação destes genes entre as mães de indivíduos com SD. Nossos resultados sugerem que os alelos APOE e4, PSEN1-48 C e TNF-&#945; -850T não são fatores de risco independentes para a DA nestas mães. Entretanto, em virtude da complexidade tanto da SD como da DA, a análise de variantes em outros genes é de fundamental importância para melhor elucidar o aparecimento insidioso de DA em mães jovens que tiveram filhos com SD. / The development of neuropathological changes of Alzheimer's disease (AD) in patients with Down syndrome (DS) from 40 years old and the high rate of DS births in families of DA individuals suggest a common susceptibility between the two diseases. Besides a five-fold higher risk for AD has been reported in young mothers of DS individuals. This shared genetic susceptibility involving DS and AD could be due to an accelerated ageing process, leading to the birth of a DS child in the offspring of young mothers and to an increased risk of dementia among them. Between the genetic risk factors for AD, APOE, PSEN1 and TNF-&#945; genes are directly or indirectly involved in cerebral amyloid deposition and seem to play a role in the pathogenesis of dementia in DS. In this study, we analyzed the frequency of APOE alleles &#949;2, &#949;3 e &#949;4 and the polymorphisms -48C>T in the PSEN1 gene and -850C>T in the TNF-&#945; gene in DS young mothers in comparison to mothers who had had chromosomicaly normal children. With this purpose, DNA samples were extracted from 114 mothers of DS individuals (full trisomy 21) with less than 35 years-old at conception, and from 110 control mothers. For the screening of the APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms, polymerase chain reaction (PCR) was accomplished, followed by the digestion of the amplification products with the restriction endonucleases HhaI, HgaI and HincII, respectively. The digested products were analysed by polyacrilamide gels electrophoresis followed by silver staining. No significant differences were observed between the genotype distributions observed in control and case samples with respect APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms (Fisher exact test: c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectively). No differences were also observed in the gene multiplicative interaction analysis for APOE, PSEN1 and TNF-&#945; alleles and in the interaction of these alleles with folate pathway polymorphisms (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). This is the first study reporting the investigation of these genes in Brazilian DS mothers. Our findings suggest that APOE &#949;4, PSEN1 -48C and TNF-&#945; -850T alleles are not independent risk factors for AD in young DS mothers. However, considering the complexity of both DS and AD, polymorphisms in other genes should be investigated to evaluate the actual relationship between the genetic risk factors and AD in DS young mothers.

La Bruton tyrosine kinase ou Btk est une protéine dont le rôle dans la maturation des lymphocytes B est connu depuis plusieurs années. Par contre, son rôle dans le contrôle de l’immunité innée est moins établi. Nous avons montré que, en réponse à la voie des Toll like Receptors ou TLRs, Btk régule la stabilité de l’ARN messager du TNF-α par l’intermédiairede la protéine TTP ou Tristétraproline. Par ailleurs, nous avons montré que l’expression d’un microARN, le miR-346, régulait négativement la protéine Btk et donc la synthèse de TNF-α. L’amplification de l’expression de ce miR-346 par transfection permet d’avoir un effet anti-TNF-α et anti-Btk interessant notamment dans le modèle cellulaire de la polyarthrite rhumatoïde. Enfin, nous avons montré que, en réponse au TLRs, la modulation de l’expression du TNF-α en fonction de l’état de méthylation de l’ADN et d’acétylation des histones dépendait directement de l’expression du couple miR-346 et Btk. Btk est donc une protéine charnière dans le contrôle de l’inflammation par les mécanismes épigénétiques que sont les miARNs, la méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones. Sur le plan thérapeutique, l’inhibition de cette protéine par ces différents mécanismes de régulation semble donc être très interessante, à la fois dans les maladies inflammatoires et néoplasiques. / Bruton tyrosine kinase, or Btk, is a protein whose role in the maturation of B cells has been known for several years. However, its role in the control of innate immunity is less established. We have shown that, in response to Toll like Receptors pathway or TLRs, Btk regulates the stability of the mRNA of TNF-α via the TTP or Tristetraprolin protein. Furthermore, we showed that the expression of microRNA, the miR-346, negatively regulated the Btk protein and thus the synthesis of TNF-α. Upregulation of miR-346 by transfection act as an anti-TNF-α and anti-Btk drugs, especially in the cellular model of rheumatoid arthritis.Finally, we showed that, in response to TLRs, the modulation of the expression of TNF-α according to the state of DNA methylation and histone acetylation depended directly on crosstalk beetween miR-346 and Btk. Btk is a key protein in the control of inflammation by epigenetic mechanisms such as miRNAs, DNA methylation and histone acetylation. As therapeutic interest, inhibition of Btk by those different regulatory mechanisms seems to be very interesting, both in inflammatory and neoplastic diseases.

Os papilomavírus são pequenos vírus de DNA dupla-fita, não envelopados, mucoepiteliotrópicos, capazes de infectar inúmeros vertebrados superiores de maneira espécie-específica. A infecção por estes vírus está associada a uma série de desordens proliferativas que levam desde de a formação de verrugas comuns até a do carcinoma invasivo. Aproximadamente 200 tipos de papilomavírus humano (HPVs) foram identificados, sendo que cerca de 40 deles infectam o trato genital. Dentre estes, os chamados HPVs de alto-risco estão associados etiologicamente ao carcinoma de colo de útero, enquanto que os de baixo-risco estão relacionados às lesões epiteliais benignas. A infecção por HPVs de alto-risco é muito comum, no entanto, a maioria destas é transitória e somente uma pequena proporção de mulheres desenvolvem o carcinoma. Entretanto, algumas mulheres são incapazes de eliminar esta infecção, levando a persistência viral e o conseqüente desenvolvimento da neoplasia. Para que a infecção pelo HPV persista é necessário um mecanismo de escape ao sistema imune do hospedeiro. O mecanismo de escape à resposta imune inata parece ser característico da infecção pelo HPV, pois o ciclo infeccioso deste vírus não promove inflamação. A infecção por HPV promove a liberação de citocinas, tal como o fator de necrose tumoral (TNF). Esta citocina possui um potente efeito citostático em queratinócitos normais e imortalizados com HPV, enquanto que em queratinóctos imortalizados com HPV18 este efeito não é observado. Do mesmo modo, observamos que a expressão do oncogene E6 de HPV16 ou 18 é suficiente para promover resistência ao efeito antiproliferativo do TNF em culturas em monocamada e organotípica. A expressão aumentada e contínua destes ocogenes é sabidamente o principal evento favorável ao desenvolvimento do câncer de colo de útero. Estas proteínas são essenciais na indução da transformação celular, visto que interferem na regulação do ciclo celular e apoptose. O produto dos genes E6 e E7 se liga ao produto dos genes supressores de tumor p53 e pRb, respectivamente, levando a sua degradação pela via de proteólise dependente de ubiquitina. As bases moleculares desta resistência ao TNF ainda são pouco conhecidas. Neste estudo, comparamos o efeito desta citocina em queratinócitos normais e que expressam E6 ou E7. Observamos através de cDNA Microarray a expressão de um grupo de genes, entre eles TCN1, DEK, HMGB2, INHBA, MCM2, MCM5 e MMP9, com expressão diferencial entre as células sensíveis e as resistentes ao TNF. / Papillomaviruses are small, non-enveloped, epitheliotropic, double-stranded DNA viruses that infect mucosal and cutaneous epithelia in a wide variety of higher vertebrates in a species-specific manner. Papillomavirus infections are associated to a series of proliferative disorders that range from common warts to invasive carcinomas. Almost 200 types of human papillomaviruses (HPVs) have been identified and approximately 40 of them infect the genital tract. Only the so-called high-risk HPV types mediate human carcinogenesis, whereas the low-risk HPVs have been linked to benign epithelial lesions. High-risk genital HPV infection is very common, and the majority of individuals clear their infection with time. However, a proportion of women cannot effectively clear the virus, and the persistence of a high-risk HPV is the major risk factor for the development of anogenital malignancies. To persist, HPV must escape the host immune system. Effective evasion of innate immune recognition seems to be the hallmark of HPV infections, since the infectious cycle is one in which viral replication and virion release is not associated with inflammation. Furthermore, HPV infections promote cytokine release, as tumor necrosis factor-alpha (TNF). This cytokine has a potent cytostatic effect on normal and HPV16 immortalized keratinocytes, while it does not affect HPV18 immortalized keratinocytes proliferation. In addition, we have observed that expression of HPV 16 or 18 E7 oncogene is sufficient to overcome TNF antiproliferative effect in monolayer and organotypic cell cultures. The increased and sustained expression of HPV oncogenes, E6 and E7, is the main contributor to the development of cervical cancer. Both E6 and E7 proteins are essential to induce and maintain cellular transformation, due to their interference with cell-cycle and apoptosis regulation. The most manifest function of the E6 protein is to promote the degradation of p53, while E7 is known to bind to and promote the proteasomal degradation of the retinoblastoma tumor suppressor gene product, pRb, and its family members. The molecular basis of TNF resistance is not well understood. In this study we compared the effect of TNF between normal and HPV16 E6 or E7 expressing keratinocytes. We observed by cDNA Microarray the differential expression of a common set of genes in TNF-sensitive cell lines, including TCN1, DEK, HMGB2, INHBA, MCM2, MCM5 and MMP9, that differs from those modulated in TNF-resistant cells.

A terapia endodôntica visa o selamento biológico do complexo sistema apical, contribuindo para isso, as substâncias usadas no tratamento e a resposta imune do paciente. A LILT tem mostrado atividade antiinflamatória, favorecendo o processo reparacional. Sendo assim, este trabalho objetivou analisar o efeito da LILT na atividade secretória de macrófagos, previamente ativados por IFN-? e LPS de E.coli, e estimulados por substâncias liberadas de três tipos de cimentos endodônticos, um a base de óxido de zinco e eugenol, outro a base de hidróxido de cálcio e um terceiro resinoso. A citotoxicidade dessas substâncias foi avaliada usando a técnica de análise do MTT. Macrófagos ativados foram estimulados por essas substâncias ou não (controle) e então, irradiados ou não (controle) e a secreção de proteínas próinflamatórias (interleucina-1 b, fator de necrose tumoral-a e metaloproteinase da matriz-1) foram analisadas pelo teste ELISA. As irradiações foram realizadas com um laser GaAlAs (780 nm, 70 mW, ponta da fibra de 4 mm2, 1.67 seg, 3 J/cm2). Foram usadas duas aplicações de irradiação com intervalo de 6 h. Os dados obtidos foram tratados por Análise de Variância, quando de distribuição normal, ou teste de Friedman, quando de distribuição não normal, com nível de significância de 5 % (p = 0,05). A viabilidade dos controles e células tratados pelos cimentos endodônticos foi similar. Produção de IL-1 b e TNF-a foram observadas. Houve alta produção de MMP-1. Entretanto, sem diferenças estatísticas entre os grupos experimentais. Os grupos irradiados apresentaram resultados similares aos não irradiados. Substâncias liberadas pelos cimentos endodônticos testados não se mostraram citotóxicas nas condições deste experimento. Essas substâncias, bem como a LILT, no parâmetro utilizado, não causam alteração na atividade de secreção de MMP-1, IL-1 b e TNF-a por macrófagos ativados. / The endodontic therapy seeks the dental root canal biological sealing, depending on substances used in this process and patient’s defense immune factors. LILT has shown an anti-inflammatory activity, improving the periapical repair process. This in vitro study aimed to analyze the effect of LILT at the secretory activity of macrophages previously activated by interferon-gamma and lypopolisaccharide from E.coli, and stimulated by substances leached from three endodontic sealers (zinc oxide-eugenol based, resinous and calcium hydroxide-based). Cytotoxicity of these substances was assessed by the MTT test. Activated macrophages were stimulated by the substances or not (control) and then, irradiated or not (control) and the secretion of pro-inflammatory proteins (interleukin-1 b, tumor necrosis factor-a and matrix metalloproteinase-1) was analyzed by ELISA test. The LILT was performed using a GaAlAs laser (780 nm, 70 mW, focal spot of 4.0 mm2, 1.67 sec, 3 J/cm2). Two irradiations with 6 h-intervals were done. The data was compared by either ANOVA test or Friedman’s test. The cell viabilities of controls and cells treated by the sealers were similar. Production of IL -1 b and TNF-a were observed. There was a high production of MMP-1. However, statistical differences were not observed amongst the groups. The irradiated groups presented results similar to those of non irradiated groups. Substances leached from the endodontic sealers are non cytotoxic at these experiments conditions . These substances, as well as the LILT, at the parameter used, were not able to change the secretion of MMP-1, IL-1 b e TNF-a by activated macrophages.