O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

Uma das consequências mais devastadoras do tratamento do câncer na população jovem do sexo feminino é a falência ovariana, que resulta na diminuição do potencial de fertilidade. Nenhum tratamento curativo para a falência ovariana primária é conhecido, no entanto, as células-tronco mesenquimais, através de seu potencial de auto-renovação e de regeneração, vem sendo utilizadas com o intuito de avaliar o seu papel no tratamento da falência ovariana. O objetivo deste estudo foi explorar o impacto das células-tronco adiposo derivadas (ADSC), células de macerado de ovário e células –tronco femininas germinativas mouse vasa homologue positivas (MVH+) na falência ovariana induzida pela cisplatina em camundongos e esclarecer quais tipos celulares promovem melhor recuperação neste modelo. Quarenta e oito camundongas adultas foram injetadas com 7,5 mg/kg de cisplatina para induzir a falência ovariana. Como doadores de células foram utilizadas fêmeas C57BL6 transgênicas para a proteína verde fluorescente (GFP +) . Os animais foram subdivididos em três grupos: grupo controle (que recebeu somente solução salina) grupo ADSC- animais que receberam injeção intra ovariana de células-tronco mesenquimais adiposo derivadas (1x104), grupo ovário - animais que receberam injeção intra ovariana de células obtidas a partir de macerado de ovário (1x104) e grupo FGSC- animais que receberam injeção de células tronco germinativas MVH positivas(1x104). Todos os grupos foram avaliados em dois tempos de eutanásia: 7 e 14 dias após o transplante das células. A partir das análises histológicas, pode-se perceber um aumento significativo (p≤ 0,05) na probabilidade de obtenção de folículos viáveis nos grupos ADSC (43%) e suspensão de células de ovário (48%) quando comparados ao grupo controle (24%) no dia 7 e um amumento significativo na probabilidade de obtenção de folículos viáveis no número no grupo FGSC (71%) quando comparado aos outros grupos. Nos grupos eutanasiados 14 dias pós transplante os animais do grupo MVH apresentaram 72% de probabilidade de folículos viáves em comparação aos grupos: controle (50%), ADSC (58%) e suspensão de ovário (52%) diferença não foi estatisticamente significativa. A dosagem de estradiol não mostrou diferença estatística entre os grupos, nos diferentes tempos de eutanásia. / One of the most devastating consequences of cancer treatment in the young female population is ovarian damage, resulting in diminished fertility potential. No curative treatment is known for primary ovarian failure; however, mesenchymal stem cells, trough self -renewal and regeneration, was tested to evaluate their role in the treatment of ovarian failure. The aim of this study was to explore the impact of adipose derived stem cells (ADSC), ovarian cells macerated and female germline stem cells MVH + (FGSC) in ovarian failure induced by cisplatin in mice and to clarify the mechanism (s) by which the ADSCs exert their action. Methods: Thirty-six adult female mice were injected with 7.5 mg / kg of cisplatin to induce ovarian failure. As donor cells used C57BL6 females GFP +. Animals were divided into three groups: control group (which received only saline), ADSC-group: animals received intra ovarian 1x104 adipose derived stem cells; Ovarian cell group - animals received intra ovarian 1x104 cells obtained from macerated ovarian tissue and FGSC-group: animals received 1x104 female germline stem cells MVH positive. All groups were assessed at two times of euthanasia: 7 and 14 days after cell transplantation. Results: From the histological analysis, one can see a significant increase in the number of viable follicles in groups and MVH ADSC compared to the control group at day 7. On day 14 we also observed a tendency to better recovery in group MVH compared to the control group and the other groups, although this difference was not statistically significant. There was no difference in estradiol serum levels between all groups.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-01T18:44:35Z No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-01T18:44:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-01T18:45:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-01T18:45:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Background: Immunologic and skeletal muscle morphology changes are associated with functional capacity impairment after myocardial infarction (MI), added central modifications. A better understanding of the hemodynamic and peripheral mechanism involved in heart failure is necessary to develop specific therapeutic strategies, as stem cells (SC) or granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) to slow or prevent muscular atrophy present in this syndrome beyond the deleterious immunologic changes. Aims: Therefore, the purpose of this study was to evaluate the effects of stem cells (SC) or/and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) administration into heart and peripheral tissues after experimental myocardial infarction induction. Methods: In Balb/C was induced ligation of the left coronary artery. Animals in the control group underwent the surgical procedure without ligation of the artery. One week after the procedure, animals were treated with PBS (IM+PBS), G-CSF (IM+G-CSF) or G-CSF associated with hematopoietic CT (IM+G-CSF+CT). The animals were observed for a period of four weeks and underwent echocardiography, stress testing and collection of tissues (heart, lung, diaphragm, liver and peripheral muscle) for analysis of cytokines and structural changes. Results: The results demonstrate that all the treatments were able to reduce infarct, more evident following administration of G-CSF. Moreover, G-CSF induced response in the worst stress test (smaller total distance and final velocity achieved). Analysis of cytokines skeletal tissue demonstrated increased frequency of high producers of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL-1-β and IL-4 in mice infarcted, resulting in imbalance in balance anti/pro-inflammatory immune response. The treatments had impaired negative when using G-CSF alone and satisfactory results when combined with the use of SCs. Conclusion: We conclude that using G-CSF alone appears to be responsible for amplifying the inflammatory process in infarcted animals leading to reduced functional capacity of skeletal muscle, which reflects in lower performance in exercise stress testing. In contrast, the use of G-CSF in association with hematopoietic CT appears to have a beneficial effect in modulating the inflammatory response and result in lower deleterious effect on the heart failure syndrome. / Introdução: Alterações imunológicas e morfológicas na musculatura esquelética são associadas com piora da capacidade funcional após infarto do miocárdio, somado às modificações centrais. Um melhor entendimento dos mecanismos centrais e periféricos envolvidos na insuficiência cardíaca é necessário para desenvolvimento de estratégias terapêuticas específicas, como a utilização de células tronco (CT) ou fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) para diminuir ou prevenir atrofia muscular presente nesta síndrome, além das mudanças imunológicas deletérias. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da administração de células tronco ou/e fator estimulador de colônia de granulócitos nas modificações cardíacas e mudanças teciduais periféricas após a indução de infarto do miocárdio experimental. Metodologia: Em camundongos Balb/C foi induzida a ligadura da artéria coronária esquerda. Os animais do grupo Controle foram submetidos ao procedimento cirúrgico sem a ligadura da artéria. Uma semana após o procedimento, os animais foram submetidos a tratamento com PBS (IM+PBS), G-CSF (IM+G-CSF) ou G-CSF associado à CT hematopoética (IM+GCSF+ CT). Os animais foram observados por um período de quatro semanas, sendo então realizada análise ecocardiográfica, teste de esforço e coleta de tecidos (coração, pulmão, diafragma, fígado e músculo periférico) para análise de citocinas e mudanças estruturais. Resultados: Os resultados demonstram que todos os tratamentos propostos foram capazes de diminuir a área de infarto, de maneira mais evidente após a administração de G-CSF. Por outro lado, o G-CSF induziu a pior resposta no teste de esforço (menor distancia total percorrida e velocidade final alcançada). A análise das citocinas teciduais esqueléticas demonstrou aumento da frequência de altos produtores de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL1-β e IL-4 em camundongos infartados, resultando em desequilíbrio no balanço anti/pró-inflamatório da resposta imune. Os tratamentos propostos apresentaram comprometimento negativo durante o uso de G-CSF isolado e resultados satisfatórios quando associado ao uso das CTs. Conclusão: Concluiu-se que a utilização de G-CSF sozinho parece ser responsável por ampliar o processo inflamatório em animais infartados conduzindo a uma diminuição da capacidade funcional do músculo esquelético, o qual reflete em desempenho inferior no teste de esforço. Em contraste, a utilização de G-CSF, em associação com CT hematopoiéticas parece ter um efeito benéfico no processo inflamatório modulando a resposta e refletindo em menor efeito deletério na síndrome da insuficiência cardíaca.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6711_1.pdf: 6478547 bytes, checksum: 84b780bdf71e36a16d090b4b3bad079b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / O propósito deste estudo foi avaliar o efeito do campo eletromagnético de rádio frequência modulada em 60 Hz no processo de diferenciação in vitro de células estromais mesenquimais multipotentes em osteoblastos, através da análise do reparo do tecido ósseo. Materiais e Métodos: Duas cavidades de 5 mm de diâmetro foram realizadas em ambos ossos parietais de seis ratos machos adultos da linhagem Wistar, os quais foram divididos em dois grupos: grupo CEMM (Células Estromais Mesenquimais Multipotentes) e grupo CEMM-RF (implantação de célulastronco expostas à onda de rádio freqüência modulada em 60 Hz e densidade de potência de onda de 100 mW/cm2). Em cada animal foi apontada aleatoriamente uma cavidade teste (T) e uma controle (C). A cavidade C foi preenchida apenas pelo coágulo sanguíneo enquanto que no grupo CEMM a cavidade T foi preenchida com enxerto de células estromais mesenquimais multipotentes diferenciadas, in vitro, em osteoblastos, numa quantidade de aproximadamente 106/ 10μl de NaCl, utilizandose o cimento de hidroxiapatita como veículo para fixação e no Grupo CEMM-RF as células diferenciadas in vitro foram expostas a um campo eletromagnético rádio freqüência de 60 Hz e densidade de potência de onda de 100 mW/cm2. Após sessenta dias, os animais foram eutanasiados e a calota craniana retirada para o processo de análise. As amostras foram submetidas a avaliação histológica mediante três avaliadores de forma cega. Os dados foram submetidos à análise estatística exploratória. Resultados: As cavidades C dos dois grupos apresentaram processo cicatricial intermediário. Não foi observado presença de tecido ósseo neoformado nas cavidades T do grupo CEMM-RF, enquanto que no grupo CEMM houve regeneração tecidual com presença de osso maturo. Conclusão: O campo de rádio frequência modulada de 60 Hz e densidade de potência de onda de 100 mW/cm2, emitido pelo aparelho de ondas curtas foi capaz de inibir a diferenciação das células estromais mesenquimais multipotentes em osteoblastos

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-12T14:57:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1524148 bytes, checksum: 532c85124f737066f3d9d77a94ae8a1a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T14:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1524148 bytes, checksum: 532c85124f737066f3d9d77a94ae8a1a (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O tratamento da insuficiência cardíaca em decorrência do infarto do miocárdio (IM) conta atualmente com diversos tipos de intervenções. O treinamento físico (TF) e a terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) têm sido utilizados, contudo, os efeitos da associação dessas terapias são pouco estudados. Este estudo teve como objetivo verificar se o exercício físico de baixa intensidade associado à terapia com CTM poderia afetar de modo benéfico o remodelamento e a função cardíaca de ratos infartados. Ratos Wistar (idade: 30 dias, peso corporal: 118 ± 11g) foram divididos nos grupos: sedentário sham (SED SH); sedentário infartado (SED IM); sedentário infartado + CTM (SED IM CT); exercitado sham (EX SH); exercitado infartado (EX IM) e exercitado infartado + CTM (EX IM CT). Animais dos grupos IM foram submetidos à toracotomia e ligadura da artéria coronária anterior descendente esquerda. O programa de treinamento consistiu de 60 minutos, 5x/semana, 60% da velocidade máxima de corrida, iniciado 24 horas após o IM com duração de 12 semanas. Células-tronco mesenquimais da medula óssea do fêmur de ratos Wistar (concentração: 1 x 106 células) foram injetadas de forma alogênica via veia caudal imediatamente após o IM. Foram avaliados: teste físico em esteira; análise ecocardiográfica; tamanho do IM; conteúdo de colágeno; percentual de vasos; hipertrofia cardíaca e celular; expressão proteica de AKT, mTOR, calcineurina, NFAT e VEGF; expressão gênica de α-actina esquelética, FNA, α-MCP e -MCP. O IM promoveu alterações deletérias ao coração, aumentando os parâmetros: massa cardíaca, índice cardiossomático, diâmetro da parede do ventrículo esquerdo, diâmetro da câmara ventricular esquerda, comprimento e volume dos cardiomiócitos e fibrose intersticial, além de prejudicar parâmetros funcionais como fração de ejeção e fração de encurtamento. O protocolo de exercício aeróbio de baixa intensidade em esteira melhorou a capacidade física dos animais, induziu a bradicardia de repouso, aumentou a fração de ejeção e fração de encurtamento, reduziu o tamanho do infarto e a fibrose intersticial no ventrículo esquerdo, reduziu a expressão de genes marcadores de hipertrofia cardíaca patológica (actina α-esquelética, FNA e -MCP) e aumentou a relação de α/ -MCP. A terapia celular com CTM, por sua vez, reduziu o tamanho do infarto e a fibrose intersticial e melhorou os parâmetros de fração de ejeção e encurtamento nos animais sedentários. A associação dos tratamentos não causou alterações significativas nos parâmetros avaliados. Conclui-se que os tratamentos, avaliados de forma isolada, causaram adaptações benéficas que resultaram em melhora da função cardíaca geral. No entanto, ao serem associados, não mostraram sinergia que pudesse potencializar seus benefícios. / The treatment of heart failure as a consequence of myocardial infarction (MI) has currently various types of interventions. The exercise training (ET) and therapy with mesenchymal stem cells (MSC) has been used, however, the effects of the combination of these therapies are poorly studied. This study aimed to verify if the exercise of low intensity associated with MSC therapy could affect beneficially the cardiac function and remodeling in infarcted rats. Male Wistar rats (age: 30 days; body weight: 118 ± 11g) were divided into six groups: sedentary sham (SED SHAM), sedentary infarction (SED MI), sedentary infarction plus stem cells (SED MI SC), trained sham (TR SHAM), trained infarction (TR MI) and trained infarction plus stem cells (TR MI SC). Animals from MI groups were subjected to throcotomy ligation of the anterior descending coronary artery. Animals from TR groups were submitted to a progressive treadmill running training for 12 weeks, being the final duration and intensity of 60 min and 60% of maximal running speed. MSCs from the Wistar rat femoral bone marrow were used to allogenic cell transplantation through the tail vein immediately after MI (concentration: 1 x 106 cells). There were assessed: physical capacity; hemodynamic analysis; MI size; collagen content; vessels percentage; cellular and cardiac hypertrophy; protein expression of AKT, mTOR, calcineurin, NFAT and VEGF; gene expression of actin-α-skeletal, ANF, α- and MHC-MHC. The IM promoted deleterious changes to the heart, increasing the parameters following: cardiac mass, cardiac somatic index, diameter of the left ventricular wall, diameter of the left ventricular chamber, length and volume of cardiomyocytes; interstitial fibrosis, and impair functional parameters as the fractions of ejection and shortening. The aerobic exercise protocol of low intensity treadmill improved the physical capacity of the animals, induced rest bradycardia, increased shortening and ejection fraction, reduced infarct size and interstitial fibrosis in the left ventricle, reduced the expression of pathological cardiac hypertrophy markers genes (α-skeletal actin, atrial natriuretic factor (ANF) and - myosin heavy chain ( -MHC) and increased the ratio of α / -MHC. Cell therapy with MSC, in turn, reduced infarct size and interstitial fibrosis and improved shortening and ejection fraction parameters in the sedentary animals. The combination of the treatments did not cause significant changes in the evaluated parameters. In conclusion, the treatments evaluated in isolation, caused beneficial adaptations which resulted in improved overall cardiac function. However, when combined, they showed no synergy that could enhance their benefits.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-21T17:34:19Z No. of bitstreams: 1 Ana Claudia Mallet de Souza Ramos.pdf: 923885 bytes, checksum: 8abdfd61e6d345ec8e6d3633951b0d80 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-21T17:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Claudia Mallet de Souza Ramos.pdf: 923885 bytes, checksum: 8abdfd61e6d345ec8e6d3633951b0d80 (MD5) Previous issue date: 2014-03-29 / Introduction: Chronic kidney disease is a worldwide growing problem. The kidney has the ability for nearly complete regenerate after ischemia/reperfusion or toxic injury. However, in some injuries the kidney undergoes epithelial-mesenchymal transition and fibrosis with loss of function. The best treatment is transplantation; nevertheless less than one third of patients are able to receive a kidney transplant due to lack of organs. Cell therapy may retard the progression of chronic kidney disease boht in allograft or in native kidney. This study aims to evaluate the feseabilty of a cell therapy. The main objective of this study is to evaluate the cell response to uremic toxins, specially indoxil sulfate. Methods: Human kidney cells were obtained by digestion method from human kidneys discard from Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP-EPM. Immunofluorescence technique and flow cytometry (FACS) were performed to characterize cells. Indoxil sulfate was used to stimulate injury FACS and immunofluorescence were performed to determine the expression of apha smooth muscle actin. Results: Eight donors were included, only six cultrues were kept. Donors were 46,25 years old on avarage, 100% received vasoactive drugs and 50% received nefrotoxic drugs.Cells were kept for 7 days until confluency were obtain in the passage zero, for the other passages duplication time was 72h.In the primary culture, 3.3% were proximal tubule cells, 1.7% distal tubule cells, 4.6% were EPO producing fibroblasts, 3.6% were mesenchymal cells and 8.9% pluripotente stem cells. There were no changing on cells phenotype while indoxil sulfate were added to the cultures. Conclusions: Primary culture from deceased donors do not change phenotype when exposed to indoxil sulfato. / Introdução: A doença renal crônica é um problema mundial em crescimento nas últimas décadas.O rim tem a capacidade de se regenerar após isquemia-reperfusão e lesões tóxicas. Entretanto, em alguns insultos inicia o processo de transição epitelial-mesenquimal com consequente acúmulo de tecido fibrótico e perda da função. O melhor tratamento doença renal crônica é o transplante, porém existeescassez de órgãos.Potencialmente a terapia celular poderá retardar a progressão da doença renal em humanos tanto em rins nativos como em rins transplantados. Este estudo tem como objetivo avaliar células renais para terapia celular no tratamento da doença renal crônica.O objetivo central é avaliar a resposta celulara toxinas urêmicas especialmente o indoxil sulfato. Métodos: Células renais foram obtida por método de digestão à partir de rins descartados do Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP_EPM.Imunofluorescencia e citometria de fluxo(FACS) foram utilizados para caracterização de células. O indoxil sulfato foi utilizado para estimular lesão renal sendo avaliadas quanto a expressão de alpha-smooth muscle actin. Resultados: Oito doadores foram incluídos neste estudo. Seis culturas foram continuadas. Os doadores apresentaram idade média de 46,25 anos, 100% fez uso de drogas vasoativas e 50% fez uso de drogas nefrotóxicas. O tempo de confluência na passagem zero foi de 7 dias e duplicação celular foi de 72 h. 3,3% das células da cultura primária são de túbulo proximal, 1,7% de túbulo distal, 4,6% fibroblastos produtores de EPO, 3,6% céulas mesenquimais e 8,9%progenitoras multipotentes. As células da cultura primária não tiveram seu fenótipo aletrado com o tratamento com indoxil sulfato. Conclusões:Não houve alteração do fenótipo celular em resposta ao indoxil sulfato.

Las células de un organismo multicelular se comunican a través una amplia variedad de mecanismos que incluyen no sólo la transferencia directa por contacto célula-célula, sino también la secreción de las moléculas y vesículas que viajan a otras células. Las células de mamíferos segregan una gran variedad de vesículas extracelulares (EV). Los exosomas son vesículas extracelulares con un tamaño de entre 20-100 nanometros que pueden transferir información en forma ácidos nucleicos o proteínas entre diferentes células por lo que son reconocidos como un potente mecanismo de comunicación intercelular. Este tipo de vesículas está siendo objeto de intensa investigación no solo en el proceso de metástasis tumoral, ya que se cree que los exosomas están relacionados con la extensión del tumor a órganos no relacionados, sino en el ámbito de la medicina regenerativa, puesto que se consideran potenciales candidatos implicados en los mecanismos paracrinos inducidos por las células madre. Por este motivo, en este trabajo se analizó el potencial terapéutico de los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC). Así, nos planteamos la hipótesis de que las MSC fueran capaces de transferir exosomas hacia las células de los tejidos que reparan. Un trabajo reciente de nuestro grupo de investigación demostró que la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) en MSC (MSC-HIF) potenciaba la capacidad terapéutica de las MSC para mejorar la función cardiaca tras un infarto agudo de miocardio (IAM). En consecuencia, estudiamos el contenido de microRNAs en los exosomas derivados de las MSC y las MSC-HIF. Se observó que las poblaciones de microRNAs presentes exosomas derivados de MSC y MSC-HIF cambiaron de manera reproducible en función de la disponibilidad de oxígeno que poseían las células, lo que interpretamos como un mecanismo respuesta celular mediada por exosomas. Así también, observamos que en las MSC-HIF la combinación de la sobreexpresión de HIF-1α con las bajas tenciones de oxigeno generaban exosomas cargados con microRNAs con potencial terapéutico para el tratamiento del IAM. Sin embargo, no fuimos capaces de demostrar el potencial terapéutico de los exosomas aislados de dichas poblaciones celulares en un modelo de infarto experimental en rata, lo que pudo ser ocasionado por un diseño incorrecto del procedimiento experimental. Esto provocó un giro en la orientación de la tesis y decidimos centrarnos en los mecanismos celulares inducidos por los exosomas en el entorno cardiaco. En este contexto, recientemente se ha descrito la presencia de exosomas en cardiomiocitos (CM) humanos. A nivel de ultraestructura, la anatomía del tejido cardiaco revela una intrínseca relación entre los CM y las células endoteliales (ECs) que componen el endotelio microvascular coronario, el cual se encarga de nutrir a los CM realizando el transporte de combustibles metabólicos desde la sangre hacia los CM. El espacio perivascular que separa a los CM de las ECs es de tan solo 1µm, permitiendo el flujo de información a corta distancia entre los CM y las ECs. Mantener esta disposición es fundamental para lograr un acople metabólico entre ambos tipos celulares. El corazón no posee reservas apreciables de combustibles metabólicos por lo el aporte de nutrientes y oxigeno debe ser continuo y regulado. Por esto pensamos que el aporte energético del endotelio hacia el corazón debería estar finamente coordinado, no solo por el control exógeno del metabolismo en todo el organismo sino también por algún mecanismo en el que el propio cardiomiocito regule el trasporte de su célula endotelial asociada. Además se sabe que las ECs liberan factores que alteran la actividad de los CM, y de la misma manera que los CM liberan factores que alteran las ECs. Sin embargo, se conoce poco a cerca de los mecanismos que regulan el flujo de nutrientes desde las ECs hacia los CM, especialmente es situaciones de estrés agudo en donde se requiere un mecanismo activo a nivel local que regule el trasporte endotelial. En este trabajo se estudió cómo los exosomas derivados de los CM alteraban el transporte de glucosa en ECs. En primer lugar mostramos datos que indican que el ayuno de glucosa incrementa la síntesis y secreción de exosomas en cultivos de CM neonatales de rata. En segundo lugar demostramos que estos exosomas derivados de CM son internalizados por las ECs en una manera dependiente de la disponibilidad de glucosa del medio. Por último aportamos evidencias de que los exosomas derivados de los CM que fueron cultivados en condiciones de ayuno de glucosa fueron capaces de trasferir trasportadores de glucosa (GLUTs) hacia las ECs, en donde estos GLUTs trasferidos mediante exosomas incrementaron la captación de glucosa y la actividad glicolítica de las ECs. Tomando en conjunto los resultados, en la presente tesis se propone un modelo de comunicación entre los CM y las ECs, en el cual el tráfico de proteínas mediado por exosomas desde los CM hacía las ECs trasladaría las necesidades metabólicas de los CM a las ECs las cuales están en contacto directo con los nutrientes presentes en el flujo coronario. Este novedoso mecanismo de acción a corta distancia revela una relación intrínseca entre la demanda de glucosa de los CM y el transporte de glucosa de las ECs permitiendo una rápida respuesta desde las ECs al incrementar la cantidad de transportadores de glucosa sin necesidad de síntesis de novo ni de la modificación de los perfiles de transcripción génica, lo que sin duda aumenta la eficiencia del proceso de comunicación celular. / García, NA. (2014). Estudio de la comunicación intercelular mediada por exosomas y sus implicaciones terapéuticas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48165 / TESIS

En las últimas décadas, las células troncales o células madre han generado un gran interés en diversas áreas de la medicina y la investigación biomédica, sobre todo en campos como la regeneración y terapia celular. Las células mesenquimales estromales, pertenecientes al tipo de células madre adultas, están en el punto de mira en este campo debido a sus características biológicas favorables como su multipotencia, efecto paracrino, propiedades inmunomoduladoras, conducta migratoria, así como a la ausencia de connotaciones ético-morales. Uno de los problemas principales del mantenimiento de las células madre en cultivo es la rapidez con la que estas células se vuelven senescentes, habiéndose demostrado que cultivar estas células en condiciones de hipoxia favorece el mantenimiento de las características primordiales de las células madre. La habilidad de percibir y responder a cambios en la concentración de oxígeno es una propiedad fundamental de las células eucariotas. Dicha propiedad conduce a la adaptación del metabolismo celular y a la regulación de la transcripción génica mediante los factores inducibles por hipoxia (HIF), siendo el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) el mecanismo molecular mejor descrito para el mantenimiento de la homeostasis del oxígeno. Por otra parte, una de las principales vías implicadas en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células madre es la vía de Notch, que modula la transcripción en diversos tipos celulares, vinculando la decisión del destino celular de una célula a la de la célula vecina. Los efectos de Notch en el mantenimiento de la indiferenciación celular o en la iniciación de la diferenciación son dependientes de ambiente y tiempo, garantizando así un equilibrio adecuado entre las células madre y su progenie, interfiriendo o favoreciendo el compromiso celular. Numerosos artículos relacionan las vías HIF y Notch, pero todavía permanecen por esclarecer diversos puntos de la interacción entre ambas vías. La SUMOilación es una modificación postraduccional mediante la cual se une de manera covalente la pequeña proteína SUMO (Small Ubiquitin-related modifiers) a otras proteínas. Las consecuencias de la SUMOilación son diversas y dependen de la proteína que ha sido modificada. Las funciones que se ven alteradas mediante esta modificación son la transcripción, la proliferación, la reparación del ADN y la localización nuclear entre otras. Dada la relación ya descrita entre la hipoxia y la modificación postraduccional SUMO surge este trabajo, donde se describe la interacción entre las vías de HIF, Notch y SUMO. A lo largo de este estudio, hemos relacionado la estabilización de HIF-1¿ con el incremento directo de los niveles generales de SUMO1 y con la consecuente SUMOilación de las proteínas. Entre la SUMOilación de diferentes proteínas incluimos el dominio intracelular de Notch 1 (N1ICD), modificación no descrita hasta el momento. En la presente tesis, esclarecemos los mecanismos de interacción entre estas tres vías altamente conservadas en eucariotas y describimos los sitios clave de SUMOilación de N1ICD. Por otra parte, dilucidamos cómo esta interacción modula el comportamiento de las células mesenquimales estromales con el fin de poder mejorar sus propiedades en vistas a su uso terapéutico. / En les últimes dècades, les cèl·lules troncals o cèl·lules mare han generat un gran interès en diverses àrees de la medicina i la investigació biomèdica, sobretot en camps com la regeneració i teràpia cel·lular. Les cèl·lules mesenquimals estromals, pertanyents al tipus de cèl·lules mare adultes, estan en el punt de mira en aquest camp per les seves característiques biològiques favorables con la multipotencia, efecte paracrí, propietats immunomoduladores, conducta migratòria així com a l'absència de connotacions ètic-morals. Un dels principals problemes del manteniment de les cèl·lules mare en cultiu és la rapidesa amb la qual aquestes cèl·lules es tornen senescents, havent-se demostrat que cultivar aquestes cèl·lules en condicions d'hipòxia afavoreix el manteniment de les característiques primordials de les cèl·lules mare. L'habilitat de percebre i respondre a canvis en la concentració d'oxigen és una propietat fonamental de les cèl·lules eucariotes. Aquesta propietat condueix a l'adaptació del metabolisme cel·lular i a la regulació de la transcripció gènica mitjançant els factors induïbles per hipòxia (HIF), sent el factor induïble per hipòxia 1 (HIF-1) el mecanisme molecular millor descrit per al manteniment de l'homeòstasi de l'oxigen. D'altra banda, una de les vies implicades en el manteniment de l'estat indiferenciat de les cèl·lules mare és la via de Notch, que modula la transcripció en diversos tipus cel·lulars, vinculant la decisió del destí cel·lular d'una cèl·lula a la de la cèl·lula veïna. Els efectes de Notch en el manteniment de la indiferenciació cel·lular o en la iniciació de la diferenciació són dependents d'ambient i temps, garantint així un equilibri adequat entre les cèl·lules mare i la seva progènie, interferint o afavorint el compromís cel·lular. Nombrosos articles relacionen les vies HIF i Notch, però encara romanen per aclarir diversos punts de la interacció entre les dos vies. La SUMOilació és una modificació postraduccional mitjançant la qual s'uneix de manera covalent la proteïnaSUMO (Small ubiquitin-related modifiers) a altres proteïnes. Les conseqüències de la SUMOilació són diverses i depenen de la proteína que ha estat modificada. Les funcions que es veuen alterades mitjançant aquesta modificació són la transcripció, la proliferació, la reparació de l'ADN i la localització nuclear entre d'altres. Donada la relació ja descrita entre la hipòxia i la modificació postraduccional SUMO sorgeix aquest treball, on es descriu la interacció entre les vies de HIF, Notch i SUMO. Al llarg d'aquest estudi, hem relacionat l'estabilització d'HIF-1¿ l'increment directe dels nivells generals de SUMO1 i amb la conseqüent SUMOilació de diferentes proteïnes. Entre la SUMOilació de diferents proteïnes incloem el domini intracel·lular de Notch 1 (N1ICD), modificació no descrita fins al moment. En la present tesi, aclarim els mecanismes d'interacció entre aquestes tres vies altament conservades en eucariotes i descrivim els llocs clau de SUMOilació de N1ICD. D'altra banda dilucidem com aquesta interacció modula el comportament de les cèl·lules mesenquimals estromals per tal de poder millorar les seves propietats en vistes al seu ús terapèutic. / In the past few decades, stem cells have generated great interest in different areas of medicine and biomedical research, especially in fields such as regenerative medicine and cell therapy. Mesenchymal stromal cells, belonging to the group of adult stem cells, are in the spotlight in this field due to their favorable biological characteristics, as well as multipotence, paracrine effects, immunomodulatory properties, migratory behavior or the absence of ethical-moral connotations. One of the main problems of the maintenance of the stem cells in culture is that these cells become senescent in few passages. Our group and others have been shown that culture mesenchymal stromal cells as well as other kind of stem cells under hypoxic conditions, favors the maintenance of the main characteristics of the stem cells. The ability to perceive and respond to changes in oxygen concentration is a fundamental property of eukaryotic cells. This property leads to the adaptation of cellular metabolism and the regulation of gene transcription by hypoxia-inducible factors (HIF), being the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) the best-described molecular mechanism to maintain oxygen homeostasis. In addition, one of the pathways involved in maintaining the undifferentiated state of stem cells is the Notch pathway., that modulates transcription of a wide variety of cell types linking the fate of neighboring cells. Effects of Notch in the maintenance of stem properties or initiation of differentiation is environment and time dependent, thus ensures a proper balance between stem cells and their progeny, interfering or promoting cell commitment. Currently, there are articles in which the HIF and Notch pathways are related, but several points of this interaction between both pathways still remain to be clarified. SUMOylation is a postranslational modification where a small protein called SUMO (Small Ubiquitin-related modifiers) are covalently bound to other proteins. The several consequences of SUMOylation depend on the protein that has been modified. The functions that are altered by this modification include transcription, proliferation, DNA repair and nuclear localization among others. Given the already described relationship between hypoxia and the postranslational modification SUMO, this work emerges, where the interaction between the HIF, Notch and SUMO pathways is described. Throughout this study, we have been related the stabilization of HIF-1¿ with the direct increase of the general levels of SUMO1 and with the consequent protein SUMOylation including the intracellular domain of Notch 1 (N1ICD), modification not described until now. In the present thesis, we clarify the mechanisms of interaction between these three highly conserved pathways in eukaryotes and described the key SUMOylation sites of N1ICD. Furthermore, we elucidate how this interaction modulates the behavior of mesenchymal stromal cells in order to improve their properties in view of a therapeutic use. / Ciria Calduch, M. (2018). Interacción entre las vías HIF, Notch y SUMO y su implicación en la biología de las hMSCs [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/114769 / TESIS