Portal hypertension (PHT) is a condition with serious complications, such as variceal bleeding, refractory ascites and bowel ischemia. The cause of PHT may be pre-, intra- or post-hepatic. Initial treatment is pressure-reducing drugs and the treatment of acute symptoms. Ten patients presented with severe abdominal pain and acute portomesenteric venous thrombosis. Their response to systemic anticoagulation was insufficient. Treatment with primary continuous thrombolysis by a transhepatic or transjugular approach in four patients resulted in major complications, incomplete recanalization and a 75% survival rate. Treatment with repeated transjugular thrombectomy (TT) combined with the creation of a transjugular intrahepatic portosystemic shunt (TIPS) achieved near complete recanalization, prompt symptom relief and 100% survival in five patients treated with this method as the primary intervention. In one patient, treated with TT and TIPS secondary to surgical thrombectomy and bowel resection, the outcome was fatal. Nineteen patients with portal vein thrombosis presented with acute or threatening variceal bleeding or refractory ascites. TIPS was feasible in 16 of the 18 patients in whom it was attempted and symptom relief was achieved in the majority of them. In 14 patients with Budd-Chiari syndrome, 13 patients were treated with TIPS, four of them after previous liver vein angioplasty. The 5-year transplantation-free survival rate was 100% in patients treated with primary TIPS. In 131 patients with variceal bleeding treated with TIPS, the survival at 12 months in patients with and without cirrhosis was 70% and 100% respectively and in accordance with previous studies. A high Child-Pugh score prior to TIPS and severe HE within 12 months after TIPS was related to an increased mortality. The occurrence of HE after TIPS did not correlate with the PSG after TIPS. Re-bleeding within 12 months after TIPS occurred in 10 patients and was associated with TIPS dysfunction. In conclusion, endovascular intervention, mainly TIPS, seems to be safe and effective for treating patients with complications of PHT, regardless of the underlying cause of disease and site of venous blood flow obstruction. HE may occur more frequently after TIPS than medical and endoscopic treatment, but is often mild and easily treated. In selected patients with PHT, TIPS may improve survival.

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Bakgrund: Djup ventrombos (DVT) är en allvarlig komplikation efter kirurgiska och ortopediska ingrepp. Detta leder till ökat lidande för patienten, längre vårdtider och därav ökade kostnader för samhället. För att förebygga DVT krävs kunskap om vilka preventiva omvårdnadsåtgärder som har effekt och hur de ska användas. Syfte: Syftet med studien var att genom en systematisk litteraturstudie se vad kunskapsläget säger om preventiva omvårdnadsåtgärder mot DVT samt vad som ser mest effektivt ut. Syftet var också att genom en enkät ta reda på hur sjuksköterskor arbetar kliniskt för att förebygga DVT. Metod: Litteraturstudie som baserades på tio orginalartiklar. Som komplement till litteraturstudien gjordes även en enkätstudie som inkluderade tio sjuksköterskor. Resultat: Tidig mobilisering tillsammans med mekanisk profylax ses som effektivt för att förebygga DVT. I många av studierna som granskats gavs patienterna lågmolekylärt heparin (LMH). Det var dock ingen lägre frekvens av DVT hos dessa patienter jämfört med de som ej fick LMH. Det var vid införandet av profylaktiska omvårdnadsåtgärder som tidig mobilisering, kompressionsstrumpor och kompressionspumpar som frekvensen av DVT sjönk. Sjuksköterskorna arbetar aktivt med förebyggande omvårdnadsåtgärder men det finns dock inga specifika riktlinjer för dessa omvårdnadsåtgärder i den kliniska verksamheten. Slutsats:  Studien visar att ett behov finns för utvecklandet av att arbeta med individanpassad profylax då patienterna utifrån olika riskgrupper har olika behov av profylaxtyper. Stor vikt bör läggas på att utveckla och implementera riktlinjer för tidig mobilisering då detta utifrån denna studies resultat har god effekt för att förebygga uppkomsten av DVT. / Background: Deep vein thrombosis is a serious complication during surgical and orthopaedic procedures. This leads to increased patient suffering, longer hospital stays and thereby also higher cost for society. To prevent DVT requires knowledge about preventive care measures that are effective, and how they will be used. Aim: The aim of this study was to examine the current state of knowledge about preventive care measures against DVT and how effective they are. The aim was also, by conducting a survey, to find out how nurses work clinically for the prevention of DVT. Study design: A literature study was conducted. The study was based on ten original articles. As a complement to the literature study a questionnaire was created and handed out to ten surgical and orthopaedic nurses. Results: Early mobilization in combination with mechanical prophylactics is seen as effective for preventing DVT. In many of the included studies patients were given low molecular weight heparin (LMH). However the frequency of DVT in these patients was not lower compared to those who did not get LMH. Instead it was at the introduction of prophylactic care measures such as early mobilization, compression stockings and compression pumps as the frequency of DVT fell. The questionnaires showed that clinical nurses worked actively with care measures. However, there were no specific guidelines for the measures in the organisation. Conclusion: The study shows that there is a need for developing methods for individual prophylactic care as patients from different risk groups have different needs. There should also be focus on developing and implementing guidelines for early mobilization as this study has shown it is effective in preventing DVT.

Die Atherosklerose ist eine progressiv fortschreitende entzündliche Erkrankung der Gefäße. Dem Chemokin CCL5 kommt in der Modulation sowie der Progression eine entscheidende Rolle zu. In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss der genetischen CCL5-Defizienz auf dem Boden einer Hypercholesterinämie nach Induktion einer experimentellen Gefäßwandläsion hinsichtlich der arteriellen Thrombose und Bildung einer Neointima untersucht. Diesbezüglich wurden Tiere mit dem doppelten Gen-Knockout für ApoE-/- und CCL5-/- (Versuchsgruppe) sowie Tiere mit dem einzelnen Gen-Knockout für ApoE-/- und CCL5+/+ (Kontrollgruppe) generiert. Im Experiment wurde das FeCl3-Modell zur Induktion einer arteriellen Gefäßwandläsion der A.carotis communis sin. verwendet, in deren Folge innerhalb weniger Minuten eine arterielle Thrombose verursacht wurde und die Bildung einer Neointima innerhalb von drei Wochen zur Folge hatte. In beiden Gruppen führte die Gefäßwandverletzung zu einer Thrombusbildung, ein Unterschied bedingt durch die CCL5-Defizienz konnte nach sieben Tagen nicht gezeigt werden. Hingegen konnte eine signifikante Reduktion der Neointima-Fläche sowie eine signifikant verringerte Lumenstenose in der ApoE-/- x CCL5-/--Gruppe (jeweils p<0,05) bei ähnlicher Media-Fläche mit einer signifikant reduzierten I/M-Ratio (p<0,05) ermittelt werden. Immunhistochemische Analysen zeigten eine signifikante Reduktion der CCR5+-Gesamtfläche und eine Steigerung der CCR1+-Neointima-Fläche in der ApoE-/- x CCL5-/--Gruppe (jeweils p<0,05) sowie einen signifikanten Anstieg der CD45+-Neointima-Fläche, der Mac-+Neointima-Fläche (p<0,05) und der Mac-2+-Media-Fläche und der Mac-2+-Gesamtfläche in der ApoE-/- x CCL5-/--Gruppe (jeweils p<0,05). Darüber hinaus konnte eine signifikante Steigerung des antiatherogen wirkenden Transskriptionsfaktors KLF4 in der KLF4+-Neointima-Fläche in der ApoE-/- x CCL5-/--Gruppe (p<0,05) gezeigt werden, sodass die Hypothese einer gegenseitigen Beeinflussung nahe liegt. Zusammenfassend führt die CCL5-Defizienz zu einer signifikant reduzierten Neointima-Fläche nach Induktion einer Gefäßwandläsion mit der Folge einer arteriellen Thrombose. Hämodynamische und Histologische Analysen ergaben jedoch keinen Hinweis dafür, dass dieser Unterschied auf Veränderungen in der Thrombusformation bedingt durch die CCL5- Defizienz beruht. Möglicherweise könnte der atheroprotektive Effekt der CCL5- Defizienz bedingt durch die Hochregulation des atheroprotektiven Transskriptionsfaktors KLF4 oder durch pleiotrope Effekte im Signalweg, aufgrund der verschiedenen Rezeptoren, vermittelt sein.

Pump thrombosis is the epitome of left ventricular assist device dysfunction for end-stage heart failure patients. With the increased utilization of implantable, long-term, left ventricular assist devices (LVADs), understanding the implications associated with device orientation and interaction with the body is exceedingly important. Components associated with pump thrombosis in the Thoratec© HeartMate II™ (HMII) and the HeartWare© HVAD® devices include the inflow cannula, the outflow graft, and the pump elements as well as pump pocket depth for the HMII specifically. Several studies have been conducted to analyze these interactions with the HMII, however there is minimal to no data available analyzing how the device orientation of the HeartWare HVAD affects hemodynamics and a patient’s risk for developing pump thrombosis. Therefore, the purpose of this pilot study is the simulate the hemodynamic implications associated with Sub-optimal cannula angulation of the HVAD. Using Solidworks 2016 Ed., a simplified, hemo-static model of the left side of the heart was created. Dimensions for the atria, ventricle, and mitral valve were determined through the combination of Trans-Esophageal Echo cardiogram data as well as literature references. Three different inflow cannula angle scenarios were developed including a Control, a Clinically Optimal, and a Sub-optimal. Assumptions included body temperature, no accumulation within the ventricle, and no ejection or contraction. The model consists of static continuous flow set to 5 liters per minute with the assumption that the HeartWare HVAD is completely supporting the left ventricle. The results include both qualitative and quantitative data. Flow trajectory plots for each cannula scenario depict the hemodynamic flow patterns for different time points. Results show visible changes in the Sub-optimal orientation when compared to both the Control and the Clinically Optimal scenario. Additionally, it was determined that there were no statistically significant differences in the velocity vectors for any of the scenarios however, the shear stress values were determined to be significantly different for all time points, p < 0.001 for all scenarios when compared to Control. Though there are several limitations of this study, with sub-optimal inflow cannula angulation, there is a potential increased risk of hemolysis due to increased shear stress.

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires. / CD40 ligand (CD40L) is an inflammatory molecule of the tumor necrosis factor (TNF) superfamily originally identified on cells of the immune system. Interaction of CD40L with its respective receptor on B cells, CD40, is of critical importance for immunoglobulin isotype switching during the immune response. Today, we know that these two molecules are also present on cells of the vascular system and have important implications in various inflammatory reactions, such that CD40L is now regarded as a thrombo-inflammatory molecule that predicts cardiovascular events. Platelets constitute the major source of soluble CD40L (sCD40L) found in plasma and it has been shown in return to influence platelet activation, albeit the exact functional impact and underlying mechanisms remain undefined. Hence, this project was designed to investigate the effects of sCD40L on platelet function and to elucidate the cellular and molecular mechanisms involved. The specific aims of this study are four fold: 1) evaluate the impact of sCD40L on platelet activation and aggregation in vitro; 2) determine through which receptor (CD40 or other) these responses are mediated; 3) elucidate the underlying intracellular signalling pathways and molecular mechanisms involved, including the potential participation of the Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor (TRAF) family and 4) assess the impact of sCD40L on thrombus formation in vivo. sCD40L strongly enhances activation and aggregation of washed human platelets induced by sub-threshold concentrations of agonists. Human platelets treated with a mutated form of sCD40L that does not bind CD40 and CD40 deficient (CD40-/-) mouse platelets failed to elicit such responses. Furthermore, we found that platelets express multiple members of the TRAF family, among which only TRAF-2 associates with CD40 upon sCD40L stimulation. Noticeably, sCD40L primes resting platelets through activation of the small GTPase Rac1 and its downstream target p38 mitogen activating protein kinase (MAPK), which leads to platelet shape change and actin polymerization. Interestingly, CD40-/- mice exhibit impaired platelet aggregation in response to collagen, thus highlighting the importance of CD40 in platelet-platelet interactions. Moreover, sCD40L dose-dependently enhances whole blood platelet aggregation and accelerates platelet function analyzer (PFA)-100 closure times in a CD40-dependant fashion. Preincubation of whole blood with sCD40L significantly increases platelet adhesion to collagen in an ex-vivo perfusion system under flow. In addition, in a ferric chloride-induced murine arterial thrombosis model, infusion of sCD40L exacerbates thrombus formation in wild type (WT), but not in CD40-/- mice. This was further associated with increased leukocyte infiltration within the thrombus mass of WT mice treated with sCD40L. In this project, we identify a new TRAF-2/Rac1/p38 MAPK signaling pathway in response to sCD40L and its effects on platelet activation and aggregation. More importantly, we establish a direct positive correlation between levels of sCD40L and thrombus formation in vivo, while highlighting the requirement of CD40 in this process. Thus, sCD40L is an important platelet primer predisposing platelets to enhanced thrombus formation in response to vascular injury. These results may explain the link between circulating levels of sCD40L and the occurrence of cardiovascular diseases.

Le CD40 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale ("Tumour necrosis factor", TNF), initialement identifié sur des cellules de carcinome de la vessie. L'interaction du CD40 avec son ligand (CD40L) est d'une importance cruciale pour le développement des cellules B et de la commutation d'isotype au cours de la réponse immunitaire acquise. L'expression du complexe CD40/CD40L était initialement cru d'être limiter aux cellules du système immunitaire, mais aujourd'hui il est bien connu que ce complexe est également exprimé sur les cellules du système circulatoire et vasculaire, et est impliqué dans diverses réactions inflammatoires; de sorte que le CD40L est maintenant considéré comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des événements cardiovasculaires. Les plaquettes expriment constitutivement le CD40, alors que le CD40L n'est exprimé que suite à leur l'activation. Il est ensuite clivé en sa forme soluble (sCD40L) qui représente la majorité du sCD40L en circulation. Il fut démontré que le sCD40L influence l'activation plaquettaire mais son effet exact sur la fonction plaquettaire, ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à son action demeurent inconnus. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’adresser les objectifs spécifiques suivants: 1) évaluer les effets in vitro du sCD40L sur l'activation et l'agrégation plaquettaire; 2) identifier les récepteurs plaquettaires impliqués dans l’action du sCD40L; 3) élucider les voies signalétiques intracellulaires induits par le sCD40L; 4) évaluer les effets du sCD40L sur la formation de thrombus in vivo. Nous avons trouvé que le sCD40L augmente fortement l'activation et l'agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations d'agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n'interagit pas avec le CD40, et les plaquettes de souris déficientes en CD40 ne furent pas en mesure d'induire de telles réponses, indiquant que le récepteur principal du sCD40L au niveau des plaquettes est le CD40. En plus, nous avons identifié la présence de plusieurs membres de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("TNF receptor-associated factor", TRAF) dans les plaquettes et nous avons montré que seulement le TRAF2 s'associe avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Nos résultats indiquent aussi que le sCD40L agisse sur les plaquettes au repos par l'entremise de deux voies signalétiques distinctes. La première voie implique l'activation de la petite GTPase Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase p38 activée par le mitogène ("p38 mitogen-activated protein kinase", p38 MAPK ), menant au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l'actine; alors que la deuxième voie implique l'activation de la cascade signalétique du NF-kB. Par ailleurs, à la suite d'une lésion artérielle induite par le chlorure de fer, le sCD40L exacerbe la formation de thrombus et l'infiltration leucocytaire au sein du thrombus dans les souris du type sauvage, mais pas chez les souris déficientes en CD40. En conclusion, ce projet a permis d'identifier pour la première fois deux voies signalétiques distinctes en aval du CD40 plaquettaire et a permis d'établir leur implication dans l'activation et l'agrégation plaquettaire en réponse au sCD40L. De manière plus importante, ce projet nous a permis d'établir un lien direct entre les niveaux élevés du sCD40L circulant et la formation de thrombus in vivo, tout en soulignant l'importance du CD40 dans ce processus. Par conséquent, l'axe CD40/CD40L joue un rôle important dans l'activation des plaquettes, les prédisposant à une thrombose accrue en réponse à une lésion vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer en partie la corrélation entre les taux circulants élevés du sCD40L et l'incidence des maladies cardiovasculaires. / CD40 is a member of the tumour necrosis factor (TNF) receptor family, originally identified on human bladder carcinoma cells. Interaction of CD40 with its ligand (CD40L) is of crucial importance for B cell development and immunoglobulin isotype switching during the adaptive immune response. Expression of the CD40/CD40L dyad was initially thought to be restricted to cells of the immune system, but today it is known to be also expressed on cells of the circulatory and vascular systems, and have important implications in various inflammatory reactions, such that CD40L is now regarded as a thrombo-inflammatory molecule and a reliable predictor of cardiovascular events. Platelets constitutively express CD40, whereas CD40L is expressed upon activation and subsequently cleaved into its soluble form (sCD40L), accounting for the majority of circulating sCD40L. Soluble CD40L has been shown to influence platelet activation but its precise effect on platelet function, and the underlying cellular and molecular mechanisms remain undefined; hence the purpose of this project. The specific aims of this study are: 1) to evaluate the in vitro effects of sCD40L on platelet activation and aggregation; 2) to determine the receptor(s) on platelets involved in the action of sCD40L; 3) to elucidate the intracellular signalling pathways induced by sCD40L; and 4) to evaluate the in vivo effects of sCD40L on thrombus formation. We have showed that sCD40L strongly enhances activation and aggregation of washed human platelets in response to sub-threshold concentrations of agonists. Human platelets treated with a mutated form of sCD40L that lacks CD40 binding, and platelets from CD40 deficient mice failed to elicit such responses, indicating that CD40 is the major platelet receptor for sCD40L. Moreover, we identified the presence of multiple members of the TNF receptor-associated factor (TRAF) in platelets and showed that only TRAF2 associates with CD40 after sCD40L stimulation. Interestingly, sCD40L primes resting platelets through two distinct signalling pathways. The first pathway involves activation of the small GTPase Rac1 and its downstream target p38 mitogen-activated protein kinase, leading to platelet shape change and actin polymerization; whereas the second pathway involves activation of the NF-κB signalling cascade. Furthermore, sCD40L exacerbates thrombus formation and leukocyte infiltration within the thrombus mass in wild-type mice but not in CD40 deficient mice following ferric chloride-induced arterial injury. In conclusion, we have identified for the first time two distinct signalling pathways downstream of platelet CD40, and established their implication in platelet activation and aggregation in response to sCD40L. Noticeably, we established a direct link between elevated levels of sCD40L and in vivo thrombus formation, while emphasizing the requirement of CD40 in this process. Therefore, the CD40/CD40L dyad plays an important role in platelet priming that predisposes platelets to enhanced thrombus formation in response to vascular injury. These results may partly explain the correlation between elevated circulating levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular diseases.

Thrombin is a key enzyme of the coagulation cascade exhibiting important roles in both pro-coagulation and anti-coagulation processes. Most clinically used anticoagulant drugs, including polymeric heparin, warfarin, hirudin, argatroban and the recently approved dabigatran, aim to reduce thrombin activity. There are several binding domains on thrombin including the active site, anion-binding exosites I and II, and the sodium binding site. We hypothesized that thrombin may be better regulated through an allosteric process mediated by small molecules binding to either exosite I or II. An appropriately designed allosteric regulator that reduces the procoagulant signal in a finely tuned manner may maintain a delicate balance between procoagulant and anticoagulant signals in blood resulting reduced bleeding complications. In this work, we synthesized and studied a library of potent, small, aromatic molecules as allosteric inhibitors of thrombin. Of the 28 potential inhibitors, 11 molecules inhibited thrombin with reasonable potency. Structure activity relationship studies showed that sulfation at the 5-position of the benzofuran scaffold was essential for targeting thrombin. Michaelis-Menten kinetic studies indicated a non-competitive, allosteric mechanism of inhibition. Site-directed mutagenesis, competitive binding and molecular modeling studies led to the identification of the most plausible binding pose for a potent sulfated dimer. To further improve the potency, a small library of sulfated benzofuran trimers was synthesized and studied for thrombin inhibition. Further, to find new scaffold to inhibit thrombin allosterically, docking-based virtual screening approach was used. All these molecules were found to be moderately potent thrombin inhibitors and can serve as lead to develop allosteric inhibitor. Overall, this work presents the first small, synthetic, sulfated aromatic molecules as potent allosteric modulators of thrombin. Finally, this work also highlights the opportunity of exploring allosteric modulators of other coagulation enzymes, e.g., factors Xa, IXa and XIa, based on the sulfated benzofuran scaffold.

Chez le chien, les thromboses représentent une complication majeure de nombreuses conditions qui sont revues dans ce manuscrit. L’arsenal thérapeutique actuel présente certaines limites: des effets anticoagulants variables d’un patient à l’autre, des hémorragies et une administration par voie sous-cutanée pour l’héparine. Le rivaroxaban est un nouvel anticoagulant oral approuvé pour la prévention et le traitement des thromboses chez l’humain. C’est un inhibiteur direct du facteur Xa. La présente étude a pour objectif d’évaluer les effets hémostatiques du rivaroxaban chez des chiens en santé, en utilisant les tests de coagulation suivants: temps de prothrombine (PT), temps partiel de thromboplastine (aPTT), activité anti-facteur X, génération de thrombine (GT) et thromboélastographie (TEG®). Tout d’abord, l’effet anticoagulant du rivaroxaban a été évalué in vitro : le plasma citraté pauvre en plaquettes provenant de 20 Beagle en santé a été aliquoté et enrichi avec des solutions de rivaroxaban à des concentrations de 0 à 1000 mg/L d’anticoagulant. Une prolongation concentration-dépendante de tous les tests de coagulation a été notée. Les concentrations de 0.024 et 0.053 mg/L diminuent respectivement de 50% la vitesse de propagation de la GT et la densité optique de l’activité anti-facteur X. Ces derniers tests sont les plus sensibles et précis pour détecter l’effet anticoagulant du rivaroxaban. Ensuite, 24 Beagle en santé ont été répartis aléatoirement en 3 groupes (n=8). Chaque groupe a reçu par voie orale un placebo, ou 20 mg de rivaroxaban une ou deux fois à 8h d’intervalle. Quinze échantillons sanguins ont été prélevés pour chaque chien sur 30 heures. Pour tous les tests de coagulation excepté la TEG®, une différence significative a été notée dans les résultats entre les groupes traités et le groupe placebo (p<0.0001). La durée de l’effet anticoagulant du rivaroxaban était de 7.9-18.7h dans le groupe traité une fois; et de 17.5-26.8h dans le groupe traité deux fois. Le pic d’action de l’effet anticoagulant était d’environ 2h. Seul le paramètre R de la TEG® était significativement affecté dans les groupes traités. En conclusion, le rivaroxaban exerce un effet anticoagulant chez le chien à la dose de 2 mg/kg. Une administration biquotidienne semble appropriée pour un effet de 24h. / In dogs, thrombosis is a major complication detected in many conditions. The limits of the current available anticoagulants in veterinary medicine are their variable effects from one patient to another, bleeding complications and subcutaneous injections for heparin administration. Rivaroxaban is a novel oral anticoagulant approved for the prevention and treatment of thrombosis in humans. It is a direct factor Xa inhibitor. The objectives of the study were to determine the haemostatic effects of rivaroxaban in healthy dogs by evaluating the following coagulation assays: prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (aPTT), anti-factor X activity, thrombin generation (TG) and thromboelastography (TEG®). An in vitro study was conducted: citrated platelet poor plasma from 20 healthy Beagles was aliquoted and mixed with rivaroxaban to obtain solutions ranging from 0 to 1000 mg/L of the anticoagulant. Rivaroxaban exerted a concentration-dependent anticoagulant effect. Rivaroxaban solutions at 0.024 and 0.053 mg/L cause 50% inhibition of the propagation of TG and of the optical density of anti-factor X activity respectively. These assays were the most sensitive to detect the anticoagulant effect of rivaroxaban. Secondly, 24 healthy Beagles were randomly divided in 3 groups (n=8) and received one placebo pill orally, or 20 mg rivaroxaban once or twice at 8h interval. Fifteen citrated blood samples were collected from each dog over 30h. For each coagulation assay except for TEG®, there was a significant difference in assay results between placebo and rivaroxaban groups (p<0.0001). The duration of the rivaroxaban anticoagulant effect was 7.9-18.7h in the group receiving rivaroxaban once, and 17.5-26.8h in the group receiving rivaroxaban twice. The peak of action of rivaroxaban appeared 2h after the dose. Only R parameter of TEG® was significantly affected by rivaroxaban administration. To conclude, rivaroxaban is an efficient anticoagulant in healthy dogs at 2 mg/kg. A twice daily administration seems appropriate to exert a 24h anticoagulation.

La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques. / The protein kinase C (PKC) family is essential for platelet function in response to thrombin, which signals and activates platelets via protease-activated receptors (PARs) and GPIbα, the low/medium and high affinity receptors in human platelets, respectively. PKCδ positively and negatively regulates platelet function depending on the nature of the stimulus. However, its importance in platelet function in response to thrombin downstream of GPIbα remains unknown. Here, we aimed to determine the involvement of the thrombin/GPIbα/PKCδ axis in platelet function and investigate the relevance of this axis in regulating thrombosis. In human platelets, pre-treatment with the specific PKCδ inhibitor δ(V1-1)TAT significantly potentiated platelet activation and aggregation in response to a priming concentration of α-thrombin, but not to γ-thrombin or PAR agonists. This potentiation process was associated with enhanced granule secretion, TXA2 generation and PKCδ phosphorylation on Tyr311, all of which were prevented by GPIbα blockade. Moreover, inhibition of p38 MAPK, Erk1/2 and TXA2 reverses this potentiation process. Platelets from PKCδ-/- mice show increased aggregation, whereas PKCδ-/- mice exhibit significantly decreased in vivo tail bleeding times and exacerbated pulmonary thrombo-emboli in response to α-thrombin. Blockade of GPIbα protects PKCδ-/- mice from these effects. This study adds new insights into the role of PKCδ in platelets downstream of GPIbα, where it negatively regulates platelet function in response to thrombin. Thus, the thrombin/GPIbα/PKCδ axis in platelets may represent a critical regulator of platelet function and hemostasis, and dysfunction of this pathway could lead to adverse thrombotic events.