Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans cette thèse, nous avons abordé l'étude du fonctionnement de Ccc2, l'ATPase à cuivre de S. Cerevisiae sous deux aspects. Le premier, cellulaire, concerne une étude de sa localisation et de sa fonction; le second, biochimique, est une étude du mécanisme du transport du cuivre par l'ATPase. L'étude de la distribution intra-cellulaire de Ccc2 montre que l'ATPase n'est pas confinée dans l'appareil de Golgi, mais qu'elle est distribuée dans tous les compartiments de la voie sécrétoire, ainsi qu'à la membrane de la vacuole. Cette dernière localisation, qui n'avait jamais été décrite, nous a permis de montrer la participation de Ccc2 à l'accumulation de cuivre dans la vacuole. Il s'agit du premier transporteur actif découvert pour cette fonction. D'autre part, l'étude biochimique nous a permis de mettre en évidence la fixation de deux cuivres dans le domaine nucléotidique isolé. Deux acides aminés importants pour cette liaison du cuivre ont été identifiés, les cystéines 708 et 718. Reste à découvrir le rôle de ces sites dans le transport du cuivre par Ccc2.

Les interférons (IFNs) de type I sont des cytokines qui jouent un rôle capital dans les défenses immunes, antivirales et antiprolifératives de l'organisme. En se liant à leur récepteur de surface, composé des deux sous-unités IFNAR1 et IFNAR2, ils induisent la cascade de signalisation JAK/STAT qui aboutit à leur effets biologiques. L'objectif de ma thèse était d'identifier des mécanismes de régulation de la signalisation des IFNs. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la palmitoylation du récepteur de l'IFN de type I, une modification lipidique souvent impliquée dans le trafic et la signalisation des protéines. Par marquage métabolique au palmitate tritié, nous avons montré qu'IFNAR1 et IFNAR2 sont palmitoylées. Le domaine cytoplasmique d'IFNAR1 contient deux cystéines, Cys463 et Cys502, qui sont des sites potentiels de palmitoylation. A l'aide de mutants sur chacune de ces cystéines, nous avons montré qu'IFNAR1 est palmitoylée uniquement sur sa cystéine la plus proche de la membrane plasmique, la Cys463. Un mutant non palmitoylé dans lequel cette cystéine a été remplacée par une alanine nous a permis de constater que la palmitoylation d'IFNAR1 n'est pas impliquée dans son trafic intracellulaire, dans son endocytose ni dans sa stabilité, mais qu'en revanche elle joue un rôle crucial dans l'activation de la voie de signalisation JAK/STAT. De façon concordante, la palmitoylation d'IFNAR1 est requise pour l'activation transcriptionnelle des gènes induits spécifiquement par l'IFN-a. Par contre, un défaut de palmitoylation n'influence nullement l'activité antiproliférative de l'IFN-a, en dépit du rôle de cette modification dans la signalisation.

Les canaux potassiques forment la classe de canaux ioniques dont la diversité structurale et fonctionnelle est la plus grande. Trois grandes familles de canaux potassiques ont été identifiées, dont celle des canaux potassiques à deux domaines P, qui compte 15 membres. Ces canaux génèrent des courants « de fond », qui sont impliqués dans la régulation de l'excitabilité cellulaire et en particulier les épilepsies, l'anesthésie, la neuroprotection ou encore la dépression. Une étude approfondie des mécanismes régulant leur activité est nécessaire pour comprendre leurs rôles. Nous avons étudié l'environnement protéique du canal TREK1 et nous avons montré l'existence d'une interaction entre le canal et une protéine cytosolique associée aux microtubules Mtap2. Cette association augmente l'expression du canal à la membrane plasmique sans en modifier les paramètres biophysiques. Cette protéine est la seconde protéine associée à TREK1 décrite. Toutes deux sont capables de se fixer simultanément sur le canal et d'additionner leurs effets plaçant ainsi le canal au cœur d'un complexe multiprotéique. Ces résultats montrent combien l'environnement protéique des canaux est important pour leur activité. Nous avons aussi montré que le canal TWIK1 est localisé dans un compartiment subapical proche de la membrane plasmique. Il est en fait inséré dans la membrane puis très vite internalisé et envoyé dans les endosomes de recyclage. La sortie de ce compartiment et l'insertion à la membrane plasmique est déclenchée par l'activation de récepteurs couplés à la protéine Gi. Cette activation serait le signal physiologique permettant d'accroitre la quantité de canaux TWIK1 à la membrane plasmique.

L'activité constitutive est une propriété pharmacologique que possèdent de nombreuxrécepteurs couplés aux protéines G. Cependant, son rôle biologique reste largement inconnu.Nous avons étudié les relations entre la pharmacologie et le trafic intracellulaire du récepteurcannabinoïque CB1, un récepteur abondamment exprimé dans le cerveau qui possède uneactivité constitutive avérée. Exprimé dans les cellules HEK-293, l'activité constitutive durécepteur CB1 provoque un cycle continu d'endocytose et de recyclage du récepteur entre lamembrane plasmique et les endosomes intracellulaires : à l'équilibre, le récepteur CB1 estmajoritairement présent dans les endosomes. Le cycle fait intervenir une endocytose par puitsrecouverts de clathrine et un trafic intracellulaire dépendant de Rab5 et de Rab4, mais pas deRab11. Dans les neurones d'hippocampe en culture, ce cycle d'endocytose/recyclage durécepteur CB1 est limité au compartiment somatodendritique, et le récepteur est stable à lasurface de l'axone. Ce cycle dépend de l'activité constitutive du récepteur CB1 etl'endocytose sélective du récepteur dirige l'établissement de l'expression axonale durécepteur CB1 à la surface du neurone.

La contraction musculaire est initiée par des relâchements massifs de calcium intracellulaire après stimulation par le motoneurone. Le couplage entre la stimulation neuronale et la libération de calcium dépend du complexe de relâchement du calcium (CRC), et est réalisé dans un compartiment particulier des cellules musculaires : la triade. Les triades sont formées par une apposition de trois systèmes membranaires, deux citernes terminales du réticulum sarcoplasmique qui encadrent un tubule transverse, qui est une invagination de la membrane plasmique. Toutes les protéines du CRC sont exclusivement localisées à la triade, cependant les mécanismes de formation des triades et d'adressage des protéines du CRC dans ce compartiment spécifique sont encore largement inconnus. Au niveau de la triade, des points de contacts réguliers avec les microtubules ont été observés, et la triadine, une protéine du CRC, a été proposée comme pouvant servir de lien entre les microtubules et les autres protéines du CRC.L'objectif de ce travail est d'étudier les mécanismes à l'origine de l'organisation des membranes de la triade, de la localisation des protéines du CRC, ainsi que l'implication des microtubules dans ces processus. Nous nous sommes intéressés au rôle de deux protéines associées aux microtubules, Climp63 et MAP6. Des travaux de microscopie ont également permis de caractériser le comportement de chimères fluorescentes de triadine exprimées dans des myotubes de souris différenciés en culture.Climp63 en association avec la triadine, forme un lien entre les triades et le réseau microtubulaire. Cependant, la relation fonctionnelle entre le réseau de microtubules et le relâchement de calcium reste complexe à envisager. Si l’étude d’un modèle animal montre clairement que l’absence de la protéine MAP6 affecte la force musculaire, il n’a pas été possible de montrer que ce défaut est sous-tendu par un dysfonctionnement des microtubules. L’étude de la mise en place des triades a révélé que les microtubules participent à cette organisation, en supportant la mobilité des triades en cours de positionnement dans la fibre musculaire. Enfin, nous avons pu montrer que l’adressage de la triadine à la triade se fait par une diffusion de la protéine au sein du RS, et une rétention dans la citerne terminale grâce à un mécanisme complexe, potentiellement indépendant de RYR1, et nécessitant à la fois les domaines lumenal et cytosolique de la protéine. / Muscle contraction is initiated by massive intracellular calcium releases after motoneuron stimulation. The coupling between neuronal stimulation and calcium release depends on the calcium release complex (CRC), and takes place in a very special compartment of muscle cells : the triad. Triads are formed by the apposition of three membrane systems, two terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum, on each side of a transverse tubule, which is an invagination of the plasma membrane. All CRC proteins are exclusively localized at the triads, however the mechanisms leading to triad formation, and CRC protein targeting at this special compartment are still largely unknown. At the triads, regular cross-talks with microtubules were observed, and triadin, one of the CRC protein, was proposed to serve as a link between microtubules and the other CRC proteins.The goal of this work is to study the mechanisms leading to the organization of triad membranes, and to triad CRC proteins targeting, as well as the involvement of microtubules in these processes. We focused our interest on the role of two microtubule-associated proteins, Climp63 and MAP6. Microscopy studies allowed us to characterize the behaviour of fluorescent triadin chimeras expressed in mouse myotubes, differentiated in culture.Climp63 when associated to triadin forms a link between triads and microtubules. However the functional relationship between microtubules and calcium releases remains complex to consider. Even if the study of an animal model shows clearly that the lack of MAP6 protein affects muscle force, we were not able to show that this defect depends on microtubule dysfunction. The study of triad set up revealed that microtubules participate in that organization, by sustaining triads mobility during positioning in the muscle cell. Finally we were able to show that triadin targeting to triads is done by diffusion of the protein in the SR membrane, and retention in the terminal cisternae thanks to a complex mechanism. This mechanism could be independant of RyR1, but needs the lumenal and cytosolic domains of the protein.

Les pathogènes neurotropiques représentent une banque d’outils biologique afin de cibler spécifiquement le système nerveux central (SNC), pour son étude mais aussi dans l’optique d’une thérapie. Parmi eux, l’adénovirus canin de type 2 (CAV-2) est un vecteur prometteur pour cibler le SNC. CAR a été principalement étudié en tant que récepteur viral. Cependant, plusieurs études montrent que CAR est essentiel dans le développement du cœur ainsi que du système lymphatique. De manière intéressante, CAR est fortement exprimé pendant le développement du SNC, suggérant un rôle dans l’établissement des réseaux neuronaux. Dans ce travail, nous avons confirmé que CAR est lié aux mécanismes d’endocytoses et au trafic intracellulaire. L’endocytose de CAR est ligand dépendant. La partie intracellulaire de CAR régule son endocytose. Nos données suggèrent que CAR est l’unique récepteur pour CAV-2. Le présent travail de recherche montre aussi que CAR ne semble pas participer à la formation du SNC. En revanche, au niveau du SNC mature, CAR est impliqué dans la plasticité synaptique, dans la neurogénèse adulte et participe à l’homéostasie des synapses, mécanismes impliqués dans les processus mnésiques. / The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is a single-pass transmembrane protein belonging to the CTX subfamily of the immunoglobulin superfamily. CAR has been extensively studied as a viral receptor for coxsackie B viruses and some adenoviruses (AdVs). CAR is essential for the development of the cardiovascular and lymphatic system. Interestingly, CAR is highly expressed in the developing brain and has been hypothesized to regulate the establishment of the neuronal networks. In my PhD work, I showed that CAR can be link to the endocytic pathways and intracellular trafficking. CAR endocytosis is ligand-dependent and is regulated by CAR intracellular domain (ICD), suggesting strongly that CAR is most likely the unique receptor for canine adenovirus type 2 (CAV-2). Moreover, we demonstrated that CAR depletion in the developing brain did not significantly perturb brain development. In the healthy adult brain, CAR is relatively abundant and we demonstrated that CAR loss of function affected hippocampal plasticity, adult neurogenesis and synapse homeostasis, which affect cognition.

La Maladie d’Alzheimer (MA) est un des challenges sanitaires les plus importants du XXIème siècle. En effet, elle touche 35,6 millions de personnes en 2010, et en atteindra probablement quatre fois plus en 2050.Cependant, peu d’éléments sont à ce jour connus concernant les mécanismes de toxicité de cette maladie. Il semble néanmoins acquis que l’agrégation du peptide amyloïde Aβ est l’élément déclenchant une cascade d’événements cellulaires aboutissant à trois types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires, les plaques amyloïdes et une atrophie corticale, révélatrice d’une importante mort neuronale.Différents modèles transgéniques d’étude de la toxicité du peptide Aβ ont été créés au cours des vingt dernières années. Cependant, aucun modèle de levure n’a encore vu le jour, alors que cet organisme est utilisé depuis de nombreuses années pour l’étude des protéines amyloïdes.J’ai donc cherché à créer ce modèle de toxicité au cours de ma thèse. L’adressage d’une protéine de fusion Aβ-GFP à la voie de sécrétion permet de rendre son expression toxique chez la levure. J’ai démontré que le trafic intracellulaire était un élément important pour la génération d’espèces toxiques. Les orthologues de PICALM, facteur de prédisposition à la MA, sont impliqués dans la toxicité, montrant une conservation des mécanismes de toxicité avec l’Homme. Les constructions semblent avoir la capacité de traverser les membranes afin d’atteindre des cibles cellulaires comme la mitochondrie.Le modèle ainsi construit nous permettra de mettre en place une étude de la relation entre la structure et la toxicité du peptide Aβ et mieux comprendre les mécanismes cellulaires régissant la MA. / Alzheimer’s Disease (AD) is one of the most important sanitary challenges of the XXIst century. Indeed, 35.6 million people are affected in 2010, and there will be probably four times more in 2050. However, little is known about the mechanisms of toxicity of this disease. Nevertheless, it seems that aggregation of the Aβ peptide is the triggering factor of a cascade of cellular events that leads to three characteristic lesions: neurofibrillary tangles, amyloid plaques and a cortical atrophy, revealing an important neuronal death. Different transgenic models for the study of the Aβ peptide toxicity have been created during the past twenty years. However, no yeast model has yet seen the light of day, whereas this organism is used for several years to study amyloid proteins.Therefore I worked to create this model during my thesis. Addressing an Aβ-GFP fusion to the secretory pathway enable this construction to become toxic in yeast. I proved intracellular pathways are important for generation of toxic species. PICALM orthologs, an AD predisposing factor, are involved in toxicity, showing conservation in the mechanisms of toxicity between yeast and man. The constructions seem to be able to cross membranes and reach cytoplasmic targets as mitochondria.Thus, this model will allow us to set a study of the relationship between structure and toxicity of the Aβ peptide and better understand the cellular mechanisms governing AD

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative avec une transmission dominante, qui entraîne la mort dans les 15 à 20 ans suivant les premiers signes pathologiques. Le gène muté dans la MH contient une répétition de trinucléotide CAG instable qui code pour une expansion de polyglutamine (polyQ) dans la protéine huntingtine (HTT). Lorsque le gène code pour une protéine avec plus de 35 glutamines, il déclenche un dysfonction puis une mort neuronale notamment dans le striatum et le cortex, entrainant l'apparition de symptômes cognitifs, psychiatriques et moteurs. HTT est exprimée dans de nombreux tissus et est impliquée dans diverses fonctions cellulaires. Il est admis que dans la MH, l'expansion polyQ conduit à un gain de nouvelles fonctions toxiques, mais également à une perte des fonctions neuroprotectrices de HTT sauvage. Avant même l'apparition des premiers symptômes, des dysfonctions existent au sein du réseau neuronal corticostriatal. Cependant, les études in vivo des dysfonctions précoces au sein de ce réseau sont techniquement difficiles à l’échelle cellulaire.Le premier enjeu de ma thèse a été de reconstituer et de caractériser in vitro le réseau corticostriatal. Pour cela nous avons utilisé une plateforme microfluidique, compatible avec de la vidéomicroscopie haute résolution, dans laquelle chaque compartiment est identifié et où la progression de la croissance axonale à la formation des synapses est régulée. Nous avons observé des défauts majeurs au sein des différents compartiments du réseau corticostriatal, de la dynamique présynaptique à des défauts de structure et de transmission synaptiques, ainsi que des dysfonctions du trafic et des voies de signalisation post-synaptique. De manière intéressante, nous avons montré que le statut génétique du compartiment présynaptique était nécessaire et suffisant pour altérer ou restaurer le réseau corticostriatal.Le second aspect de ma thèse a été d’étudier la dynamique intracellulaire, depuis le réticulum endoplasmique jusqu’au compartiment final, au sein de cellules modèles de la MH. Pour cela nous avons utilisés le système RUSH (Retention Using Selective Hooks) couplé à une molécule utilisant la voie standard de biosynthèse des protéines. Au sein de cellules modèles de la MH, la dynamique intracellulaire est perturbée. L’utilisation de molécules inhibitrices d’une classe d’enzyme au sein de cellules modèles de la MH, est capable de restaurer une dynamique intracellulaire. En particulier, grâce au système microfluidique, nous avons montré qu’une molécule a la capacité de restaurer un réseau corticostriatal sauvage. Les études pharmacologiques de passage ont montré que cette molécule a un haut pouvoir de passage de la barrière hémato encéphalique. Le traitement pendant un mois de souris modèles de la MH et l’analyse de leur coordination motrice et de leur état anxiodépressif suggère que cette molécule est capable d’améliorer les symptômes chez les souris MH.Ces travaux ont permis de mettre en évidence 1/ l’importance du cortex comme région d’intérêt thérapeutique dans la MH, et 2/ le trafic de protéines comme une nouvelle cible thérapeutique. / Huntington Disease (HD) is a mid-life onset inherited neurodegenerative disorder that leads to death within 15 to 20 years after appearance of the first symptoms. The defective gene in HD contains an unstable trinuocleotide CAG repeat which encodes for a polyglutamine stretch (polyQ) in the huntingtin (HTT) protein. When the number of glutamines coded by the gene exceeds 35 repeats, it triggers neuronal dysfunction and death, affecting in particular the striatum and the cortex, causing cognitive, psychiatric, and motor symptoms. HTT is widely expressed and it is involved in numerous functions. In HD, it is accepted that, the polyQ strech leads to a gain of toxic functions, and converselyto a loss of neuroprotective functions of wild-type HTT. Long before the appearance of the first symptoms, dysfunctions exist within the corticostriatal neuronal network. However, in vivo studies of early cell dysfunction in this network are technically difficult, especially at the subcellular resolution.The first objective of my thesis was to reconstitute and characterize the corticostriatal network in vitro. We used a microfluidic device in which each neuronal compartment is identified and in which the progression from axonal growth to synapse regulation is controlled. We observed major defects in the different compartments of the corticostriatal circuit, from presynaptic dynamics to synaptic structure and transmission and to postsynaptic traffic and signaling. Importantly, the genetic status of the presynaptic compartment was necessary and sufficient to alter or restore the circuit.The second aspect of my thesis was to study the intracellular dynamics, from the endoplasmic reticulum to the final compartment, in cellular models of HD. For this we used the RUSH system (Retention Using Selective Hooks) coupled to a molecule using the standard pathway of protein biosynthesis. In cellular models of HD, intracellular dynamics are disrupted. We found that molecules targeting enzyme protein trafficking restore intracellular dynamics in HD cells. In particular, thanks to the microfluidic system, we showed that a given molecule has the capacity to restore a HD mutant corticostriatal network. Pharmacological studies showed that this molecule has a high power of passage of the blood brain barrier. One month treatment of HD mouse models and their behavioral tests for motor and anxiety-depressive symptoms suggest that the molecule is able to ameliorate symptoms.These studies made it possible to highlight 1 / the importance of the cortex as a key region of therapeutic interest in HD, and 2 / protein trafficking as a new therapeutic target in HD.

La migration des cellules est nécessaire au cours du développement. Chez l’adulte, elle contribue au renouvellement des tissus, à la cicatrisation et à la circulation des cellules immunitaires. Les cellules cancéreuses acquièrent des capacités de migration qui échappent aux mécanismes normaux de régulation. Elles peuvent ainsi envahir les tissus environnants et, éventuellement, former des métastases. Les astrocytes représentent une majorité de cellules gliales du système nerveux central. Ils migrent en réponse à des facteurs inflammatoires et interviennent ainsi dans la cicatrisation et la régénération des tissus lésés. Les astrocytes peuvent être à l’origine de tumeurs appelées gliomes qui représentent la majorité des tumeurs cérébrales primaires. Les formes les plus agressives, appelées glioblastomes, sont des tumeurs extrêmement invasives, ce qui les rend particulièrement difficiles à traiter. Les microtubules jouent un role crucial dans la migration des astrocytes et des cellules de gliomes (Etienne-Manneville, 2013a). Au cours de la migration, le réseau de microtubules est totalement réorganisé pour permettre la polarisation de la cellule. Formés par association de dimères de tubuline, leur régulation intervient de multiples manières comme par exemple au niveau de leur dynamique de polymérisation à la périphérie de leurs interactions avec les composants cellulaires ou par leurs modifications post-traductionnelles (Etienne- Manneville, 2010). En effet, les dimères de tubulines polymérisées, inclues dans les microtubules, peuvent être, entre autres, détyrosinées, acétylées, mono ou poly-glutamylées, et mono ou poly-glycylées (Janke and Chloë Bulinski, 2011). Durant la migration cellulaire, ces modifications post-traductionnelles peuvent notamment jouer un rôle dans la régulation du trafic intracellulaire. L’objectif majeur de mon projet de thèse est d’étudier les mécanismesIii de régulation des microtubules au cours de la migration des astrocytes normaux et tumoraux, et plus particulièrement le rôle des modifications post-traductionnelles de la tubuline. Je me suis focalisée sur trois principales modifications post-traductionnelles des microtubules durant la migration : la polyglutamylation, la détyrosination et l’acétylation. En premier lieu, j’ai étudié le rôle potentiel de la polyglutamylation dans la mise en place de la polarité cellulaire chez les astrocytes. Je n’ai pas observé d’effet de cette modification durant la migration… / The migration of cells is necessary during the development. At the adult, she contributes to the renewal of fabrics, to the healing and to the traffic of immune cells. Cancer cells acquire capacities of migration which escape the normal mechanisms of regulation...