L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle majeur chez les organismes vivants. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur de fer racinaire IRT1 est endocyté à la suite de la monoubiquitination de deux résidus lysine situés au niveau de sa grande boucle cytosolique. Cependant, les mécanismes régissant l’endocytose médiée par l’ubiquitine ainsi que son rôle biologique restent flous. Au cours de ma Thèse, j’ai mis en évidence que la dynamique d’IRT1 était contrôlée par les métaux substrats secondaires du transporteur (à savoir le zinc, le manganèse et le cobalt). En l’absence de ces métaux, IRT1 est localisé à la membrane plasmique avec une polarité latérale le positionnant sur la face externe des cellules de l’épiderme racinaire. La présence de ces mêmes métaux à un niveau physiologique entraîne la monoubiquitination d’IRT1 et son internalisation vers les endosomes précoces. J’ai démontré que lorsque les métaux substrats secondaires d’IRT1 sont présents en excès, les modifications monoubiquitine sont alors allongées en chaînes de polyubiquitines liées par le résidu lysine-63, entrainant ainsi son adressage vers la vacuole et sa dégradation. Mes travaux ont par ailleurs permis d’élucider les mécanismes moléculaires impliquées dans la réponse des plantes à l’excès de métaux substrats d’IRT1. J’ai notamment montré que l’endocytose d’IRT1 était dépendante i) d’un motif riche en résidus histidine dans la séquence d’IRT1 qui est capable de fixer ces métaux autres que le fer, ii) de la phosphorylation d’IRT1 au niveau d’un résidu thréonine par une protéine kinase en cours d’investigation, et iii) de l’E3 ligase à domaine RING IDF1. D’un point de vue physiologique, l’endocytose d’IRT1 médiée par l’ubiquitine et dépendante des métaux protège la plante d’une suraccumulation de ces métaux autres que le fer qui sont hautement réactifs. / Ubiquitination is a post-translational modification playing a major role in living organisms. In Arabidopsis thaliana, the root iron transporter IRT1 is endocytosed following the monoubiquitination of two lysine residues located in its large cytosolic loop. However, the mechanisms driving IRT1 ubiquitin-mediated endocytosis and its biological relevance remains unclear. During my PhD, I uncovered that IRT1 dynamics is controlled by its secondary metal substrates (i.e. zinc, manganese and cobalt). In the absence of these non-iron metals, IRT1 is found at the cell-surface of root epidermal cells with an outer lateral polarity, while their presence at physiological levels triggers IRT1 monoubiquitination, internalization and accumulation in early endosomes. However, upon non-iron metal excess, monoubiquitin modifications are extended into K63 polyubiquitin chains to promote the vacuolar targeting of IRT1 and its degradation. I investigated further the molecular mechanisms driving plant responses to non-iron metal excess. I notably showed that this regulation by non-iron metals is dependent on i) a histidine-rich stretch in IRT1 that is able to directly bind to non-iron metals, ii) the subsequent recruitment of a kinase currently under investigation which phosphorylates IRT1 at a threonine residue, and iii) the RING E3 ligase IDF1. Altogether, the metal-dependent ubiquitin-mediated endocytosis of IRT1 protects the plant from overaccumulation of highly reactive non-iron metals.

Afin d’assurer les échanges entre ses différents organites, la cellule eucaryote dispose d’un système ingénieux de trafic vésiculaire intracellulaire. Le transport directionnel de divers cargos tels que des organites membranaires et des complexes protéiques est assuré par des moteurs moléculaires auxquels appartiennent les protéines de la superfamille des kinésines (également appelées KIF pour KInesin Family). Celles-ci se servent des microtubules comme rails et se déplacent vers leur extrémité positive. Parmi elles, la kinésine II est composée de KIF3A et KIF3B, deux protéines motrices et de KAP3, une protéine de liaison au cargo à véhiculer. Ce moteur moléculaire est connu pour participer à l’assemblage du cil primaire à la surface des cellules ainsi qu’au trafic plus conventionnel tel que l’acheminement de protéines à la membrane. <p>Afin d’étudier le rôle précis de la kinésine II dans la glande thyroïde, nous avons invalidé spécifiquement le gène Kif3a dans cet organe chez la souris. Bien que cette inactivation ait conduit à un développement complet du tissu thyroïdien, les souris invalidées présentent une hypothyroïdie congénitale caractérisée par des concentrations sériques élevées de TSH et basses de T4. Par la suite, nous avons mis en évidence une expression fortement diminuée du transporteur d’iodure NIS chez ces souris, causant une déficience en iodure intracellulaire, une iodation insuffisante de la thyroglobuline et une sécrétion anormale de l’hormone T4 dans la circulation sanguine. De plus, ex vivo, nous avons montré que la réponse à la TSH en terme d’AMPc est altérée dans la thyroïde de ces souris. Ces observations nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’invalidation du gène Kif3a spécifiquement dans la glande thyroïde mène à une anomalie dans la voie de signalisation du récepteur de la TSH, en amont de la production d’AMPc. Finalement, in vitro, par l’utilisation de cellules Kif3a-/-, nous avons analysé l’expression à la membrane plasmique et la réponse à un agoniste du récepteur β2 adrénergique, un membre de la même sous-famille de récepteurs couplés aux protéines G que le récepteur de la TSH. De cette façon, nous avons obtenu des données indiquant que le transport de ce récepteur à la surface cellulaire était altéré en l’absence de Kif3a. <p>Au vu de ces éléments et de ceux de la littérature, nous suggérons que la kinésine II, et plus particulièrement sa sous-unité KIF3A, joue un rôle important dans le transport du récepteur de la TSH nouvellement synthétisé vers la membrane basale de la cellule de la thyroïde.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le transport intracellulaire du cholestérol et sa distribution correcte au niveau des différentes membranes sont essentiels pour assurer de nombreuses fonctions cellulaires. Malgré l'importance de ce transport les mécanismes de sa régulation restent encore mal connus. L'objectif de cette thèse était de mieux caractériser les acteurs du transport intracellulaire du cholestérol. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à deux acteurs de ce transport : la dynamine et les Rab GTPases. Dans la première partie de la thèse nous avons utilisé le dynasore, un inhibiteur pharmacologique de la dynamine pour étudier le rôle de la dynamine dans le contrôle du transport endolysosomal dans les cellules HeLa et les macrophages humains. Nous avons ainsi confirmé le rôle de la dynamine dans la sortie du compartiment endolysosomal et la régulation de l'homéostasie du cholestérol. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié le rôle de Rab7 et de Rab9 dans le transport du cholestérol en utilisant la technique d'ARN interférence ainsi que l'expression de mutants dominant négatifs. Nous avons montré qu'en plus de son rôle classique dans les étapes tardives du transport du cholestérol, Rab7 contrôle les étapes précoces du transport endosomal. Enfin, nous avons évalué le rôle de Rab7 dans notre modèle de macrophages humains surchargés. Nous avons mis en évidence un effet limité de l'inactivation de Rab7 sur le contrôle de l'homéostasie du cholestérol mais à l'inverse un effet majeur pour l'efflux du cholestérol vers l'apo AI. En conclusion, notre étude a permis de mieux caractériser le transport vésiculaire du cholestérol et de démontrer son importance dans la régulation de l'homéostasie intracellulaire en cholestérol. Nos résultats permettent également d'établir le rôle critique de Rab7 dans le trafic des LDL au niveau des endosomes précoces.

Chlamydia trachomatis est une bactérie intracellulaire obligatoire. Ce pathogène de l’Homme est la première cause infectieuse de cécité ainsi que de maladies sexuellement transmissible d’origine bacterienne.Utilisant une souche de C. trachomatis L2 exprimant une protéine fluorescente, nous avons développé des méthodes de microscopie et de cytométrie en flux permettant de suivre les différentes étapes du développement de la bactérie. Ces méthodes faciliteront les futures études de l’infection par Chlamydia.Chlamydia interagit avec différents processus cellulaires, et plus particulièrement via la sécrétion d’effecteurs par le système de sécrétion de type 3 (ST3). Nous avons identifié une famille de protéines possédant un signal de ST3 qui partagent un domaine, le DUF582, présent uniquement chez les Chlamydia pathogènes.Nous avons montré que les 5 protéines DUF582 de C. trachomatis sont exprimées à partir du milieu du cycle infectieux. Nous avons démontré que la protéine Hrs interagit avec le DUF582 et que la protéine DUF582 CT619 interagit avec Tsg101. Hrs et Tsg101 sont d’importants composants de la machinerie ESCRT impliquée dans de nombreux processus de fission membranaire.Utilisant l’interférence ARN, nous avons montré que Hrs et Tsg101 ne sont requis ni pour l’entrée, ni pour le développement de la bactérie. Ceci suggère que les protéines DUF582 bloquent des processus dépendant de Hrs/Tsg101. A l’inverse, la bactérie pourrait utiliser la machinerie ESCRT mais l’existence de mécanismes redondants expliquerait l’absence de phénotype dans les expériences d’interférence. Nous discutons trois hypothèses concernant le rôle des protéines DUF582 dans l’infection. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen. It is the first infectious cause of blindness and the most common cause of sexually transmitted diseases of bacterial origin. Using a strain of C. trachomatis serovar L2 expressing a fluorescent protein we developed microscopy and flow cytometry based methods to quantify several steps of its developmental cycle. These methods will facilitate future studies aimed at testing anti-bacterial compounds or various culture conditions. Chlamydiae interfere with many cellular processes, in particular via the secretion of bacterial proteins through a type 3 secretion (T3S) system. We identified a family of proteins that possess T3S signals. They share a domain designated as DUF582, which is only found in pathogenic chlamydiae. We showed that the five DUF582 proteins of C. trachomatis are expressed from the mid phase of infection. We demonstrated that the protein Hrs is a common interactor for the DUF582. In addition the N-terminal part of the DUF582 protein CT619 interacts with Tsg101. Hrs and Tsg101 are both important components of the ESCRT machinery, which is an ancient machinery required for several processes involving membrane fission.Using RNA interference we showed that Hrs and Tsg101 are dispensable for bacterial entry and growth. This last result suggest that DUF582 proteins actually prevent Hrs and/or Tsg101 driven processes. Alternatively, the bacteria might highjack the ESCRT machinery but redundant mechanisms would explain the absence of phenotype on bacterial development observed in the silencing experiments. We discuss three hypotheses as to the possible role of the DUF582 proteins in infection.

Une réponse immunitaire efficace contre un large spectre de pathogènes ou contre des cellules tumorales nécessite l’activation des lymphocytes T CD4+. L’engagement du récepteur T par un peptide antigénique apprêté sur les produits de classe-II du complexe majeur d’histocompatibilité (peptide-CMH, pCMH) portés par une cellules présentatrices d’antigène (CPAg), conduit à de nombreux remaniements du lymphocyte T. Il s’établit notamment à l’interface entre le lymphocyte T et la CPAg, une structure spécialisée qui est la synapse immunologique (ou synapse immune). La synapse est le siège d’événements de signalisation intenses où diverses molécules de signalisation nécessaires l’amplification et la diversification du signal provenant du TCR sont recrutées. Ces évènements de signalisation sont régulés par l’adaptateur transmembranaire LAT (« Linker for Activation of T cells ») qui est présent à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires. La fraction intracellulaire de LAT est recrutée à la synapse immune et il est proposé que ces compartiments vésiculaires participent à la signalisation lymphocytaire T. L’objectif de ce travail de thèse a été de déterminer les voies de trafic intracellulaire nécessaires au recrutement de la fraction intracellulaire de LAT à la synapse immunologique et de comprendre le rôle de ce transport dans l’activation et la réponse lymphocytaire T. Par des approches d’extinction de l’expression de différentes molécules de transport intracellulaires dans les cellules T Jurkat ou des lymphocytes T CD4+ primaires humains ou par l’utilisation de souris Knock-Out (KO), nous avons mis en évidence plusieurs voies de transport impliquées dans le transport de LAT. Nous avons ainsi mis en évidence que le recrutement de LAT à la synapse immunologique nécessite une voie de sécrétion dépendante de la protéine SNARE vésiculaire VAMP7. L’analyse plus avant du transport de LAT a par ailleurs permis de montrer que LAT est présente dans des compartiments de recyclage alors que VAMP7 est principalement localisée dans l’appareil de Golgi. L’étude de la petite GTPase Rab6 et de la protéine t-SNARE syntaxine-16 qui sont impliquées dans des voies de transport rétrograde entre les endosomes de recyclage et l’appareil de Golgi, a permis de dévoiler que cette voie de transport est requise dans le recrutement de LAT à la synapse immunologique, ainsi qu’à la réponse lymphocytaire T in vitro, ex vivo et in vivo. Enfin, le rôle de la protéine de transport intraflagellaire IFT20, qui a déjà été mis en cause dans le transport du TCR, a été analysé chez la souris et a également montré des défauts de recrutement de LAT à la synapse et dans l’activation lymphocytaire T ex vivo et in vivo. Nos résultats mettent ainsi en évidence que la régulation du transport intracellulaire dans les lymphocytes T joue un rôle crucial dans l’activation lymphocytaire T. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel LAT est constitutivement internalisé depuis la membrane plasmique et poursuit une voie de recyclage dépendante de l’appareil de Golgi qui contient la machinerie de sécrétion associé à VAMP7. Cette voie de transport intracellulaire, conditionnerait la resécrétion polarisée de LAT à la synapse immunologique dans les conditions d’activation et une réponse lymphocytaire T robuste. / The immune response against a broad spectrum of pathogens or against tumor cells requires the CD4 + T lymphocytes activation. The triggering of T Cell Receptor (TCR) by peptide-MHC through antigen-presenting cells (APC) leads to numerous T-cell remodeling and the establishment of a specialized structure at the interface between the T lymphocyte and the APC: the immunological synapse. The synapse is the site of intense signaling events where various signaling molecules are recruited in order to amplify and diversify the signal initiated by the TCR. These signaling events are regulated by the transmembrane adapter LAT ("Linker for activation of T cells") which is present at the plasma membrane as well as in intracellular compartments. The intracellular fraction of LAT is recruited at the immune synapse and it is proposed that these vesicular compartments participate in T lymphocyte signaling. The objective of this thesis work was to determine the intracellular trafficking pathways required for the recruitment of the intracellular pool of LAT to the immunological synapse and understand the role of this transport in T cell activation and response. By silencing the expression of different intracellular transport molecules in Jurkat T cells or primary human CD4 + T lymphocytes, or by using Knock-Out (KO) mice, we have highlighted several trafficking pathways involved in the transport of LAT to the immune synapse. We have demonstrated that the recruitment of LAT to TCR activation sites requires a secretion pathway dependent on the vesicular SNARE protein VAMP7. Further analysis of the transport of LAT showed that LAT is present in recycling compartments whereas VAMP7 is mainly located in the Golgi apparatus. The study of the small GTPase Rab6 and the t-SNARE syntaxin-16 protein that are involved in the retrograde transport pathways between the recycling endosomes and the Golgi apparatus, demonstrated that this route of transport is required for the recruitment of LAT to the immunological synapse and for T lymphocyte response in vitro, ex vivo and in vivo as well. Finally, the role of intraflagellar transport protein IFT20, which has already been implicated in the transport of TCR, was analyzed in mice and also showed defects in LAT recruitment to synapse and T lymphocyte activation ex vivo and in vivo. Our results thus show that the regulation of intracellular transport plays a crucial role in T lymphocyte activation. We thus propose a model in which LAT is constitutively internalized from the plasma membrane and pursues a Golgi-dependent recycling pathway that contains the secretion machinery associated with VAMP7. This intracellular transport pathway would thus allow the polarized LAT re-secretion to the immunological synapse under activation conditions and a robust T lymphocyte response.

Le transport intracellulaire du cholestérol et sa distribution correcte au niveau des différentes membranes sont essentiels pour assurer de nombreuses fonctions cellulaires. Malgré l’importance de ce transport les mécanismes de sa régulation restent encore mal connus. L’objectif de cette thèse était de mieux caractériser les acteurs du transport intracellulaire du cholestérol. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à deux acteurs de ce transport : la dynamine et les Rab GTPases. Dans la première partie de la thèse nous avons utilisé le dynasore, un inhibiteur pharmacologique de la dynamine pour étudier le rôle de la dynamine dans le contrôle du transport endolysosomal dans les cellules HeLa et les macrophages humains. Nous avons ainsi confirmé le rôle de la dynamine dans la sortie du compartiment endolysosomal et la régulation de l’homéostasie du cholestérol. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié le rôle de Rab7 et de Rab9 dans le transport du cholestérol en utilisant la technique d’ARN interférence ainsi que l’expression de mutants dominant négatifs. Nous avons montré qu’en plus de son rôle classique dans les étapes tardives du transport du cholestérol, Rab7 contrôle les étapes précoces du transport endosomal. Enfin, nous avons évalué le rôle de Rab7 dans notre modèle de macrophages humains surchargés. Nous avons mis en évidence un effet limité de l’inactivation de Rab7 sur le contrôle de l’homéostasie du cholestérol mais à l’inverse un effet majeur pour l’efflux du cholestérol vers l’apo AI. En conclusion, notre étude a permis de mieux caractériser le transport vésiculaire du cholestérol et de démontrer son importance dans la régulation de l’homéostasie intracellulaire en cholestérol. Nos résultats permettent également d’établir le rôle critique de Rab7 dans le trafic des LDL au niveau des endosomes précoces. / Intracellular transport of cholesterol and its distribution within cellular membranes are essential to maintain correct cellular functions. Despite the importance of this transport, mechanisms that regulate cholesterol transport still poorly defined. The objectives of this thesis were to better characterize the actors of intracellular cholesterol trafficking. In this context, we focused our interest on two known actors of intracellular transport : dynamin and Rab GTPases. In the first part of this thesis, we used dynasore, a pharmacological dynamin inhibitor, to study the role of dynamin in the control of endolysosomal transport in HeLa cells and human macrophages. We confirmed the role of dynamin in endolysosomal sorting and cholesterol homeostasis regulation. In the second part of this thesis, we studied the role of Rab7 and Rab9 in the regulation of cholesterol transport using RNA interference and dominant negative mutants. We showed that in addition to it classical role in late steps of cholesterol transport, Rab7 controls also early steps of endosomal trafficking. Finally, we evaluated the role of Rab7 in our model of loaded human macrophages. We showed a weak impact of Rab7 inactivation on cholesterol homeostasis but a major effect on cholesterol efflux to apo AI. In conclusion, in this study we have better characterized the vesicular transport of cholesterol and demonstrated its importance in cholesterol intracellular homeostasis. Our results also establish that Rab7 plays a critical role in the sorting of LDL at the early endosome.

Les microtubules (MTs) sont importants pour des processus cellulaires majeurs comme la polarisation, le trafic membranaire, la division cellulaire ainsi que pour l'architecture intracellulaire. En retour, les organites influencent l'organisation et la dynamique des MTs. Mon projet de thèse vise à élucider les interactions fonctionnelles existantes entre les MTs et la sécrétion en adoptant une approche quantitative et systématique. En synchronisant le trafic de différents cargos grâce au système RUSH (Retention Using Selective Hooks) et à une dépolymérisation complète des MTs, nous avons montré que les MTs ne sont pas strictement nécessaires à la sécrétion des cargos. D'une manière générale nous avons observé que le trafic intracellulaire est ralenti mais toujours possible en présence d'un appareil de Golgi dispersé. Nous avons caractérisé deux populations d'éléments golgiens. Elles sont présentes peu après la dépolymérisation des MTs et sont différentes en terme de composition et de capacité de sécrétion. Nos résultats montrent qu'une maturation fonctionnelle des éléments golgiens est nécessaire pour le trafic post-golgien, basée sur l'acquisition de certains facteurs golgiens non identifiés à ce jour. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à l'exocytose au niveau de la membrane plasmique. Nous avons observé une sécrétion préférentielle des protéines à proximité des adhésions focales. Différentes techniques de biologie cellulaire nous ont permis de caractériser cet adressage préférentiel vers les sites d'adhésion de la cellule. Nous avons également corrélé les forces exercées par la cellule sur le substrat avec la direction du transport antérograde. / Microtubules (MTs) are important for major cellular processes like cell polarization, intracellular trafficking, cell division, intracellular architecture. Organelles influence back the MTs organization and dynamics. The goal of my project was to study the involvement of MTs in the intracellular trafficking. Thanks to the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system to synchronize the trafficking of cargos and with an efficient way to depolymerize MTs, we showed that MTs were not strictly essential to secretion of cargos. More generally, we showed that intracellular trafficking is slowed down but still possible in the presence of a dispersed Golgi apparatus. Moreover, we characterized two populations of Golgi elements in cells without MTs that are different in terms of secretion ability and composition. Our results demonstrated that functional maturation of Golgi elements is needed to ensure post-Golgi trafficking and that MTs driven post-Golgi transport is not strictly required. Besides working on intracellular trafficking without MTs, we conducted a study on the exocytosis at the plasma membrane. By using an antibody coating on coverslips to immobilize secreted cargos, we visualized the first step of arrival at the plasma membrane. We observed a directed and polarized secretion close to focal adhesions that we characterized by different cell biology technics and microscopy (spinning disk, TIRF…). We highlighted a close relationship between forces exerted by the cell on its substrate and the directionality of the anterograde transport by using patterning and Traction Force Microscopy (TFM).

L’hépatite B, causée par le virus de l’hépatite B (VHB), est responsable d’un à deux millions de morts chaque année dans le monde. Le VHB occasionne des lésions importantes au niveau du foie, pouvant amener à la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire. Ce virus, de la famille des hepadnavirus, contient une capside formée de 240 copies d’une même protéine : la protéine core. Des biopsies de patients infectés par le VHB montrent que la protéine de capside se localise soit dans le noyau soit dans le cytoplasme des cellules infectées. On s’accorde à dire qu’une localisation majoritairement cytoplasmique est liée à une aggravation de la maladie. Nous avons observé que, dans des cellules HuH-7, la protéine core seule est nucléaire alors qu’en contexte viral, elle se localise dans le cytoplasme. Après avoir vérifié que nos observations ne sont pas dues aux conditions de culture des cellules, nous avons démontré que la relocalisation de core est due à des facteurs viraux : la polymérase virale grâce à son domaine TP ainsi que la Tige/Boucle  présente sur l’ARN prégénomique. La localisation de core est aussi influencée par l’état de phosphorylation de ses sérines 157, 170 et 172.Ainsi, nous avons pu montrer à quel point le trafic de core était complexe et qu’il était régulé par divers facteurs viraux et cellulaires. Ces travaux permettront une étude plus approfondie des régulations du trafic intracellulaire de la protéine core et ainsi de faire évoluer plus favorablement l’hépatite B chez les patients infectés. / Hepatitis B is a liver inflammation caused by the Hepatitis B virus (HBV). It is responsible of one to two millions deaths per year in the world. HBV is the cause of important liver damages and may lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.HBV is a member of hepadnaviral family. It has a capsid composed of 240 copies of the same protein: the core protein. In literature, patients’ biopsies showed that capsid is found either in the nucleus or in the cytoplasm or both compartments of hepatocytes. In general, a cytoplasmic localization is related to an advanced state of the disease.In our study, we observed that in HuH-7 cells, core protein alone has a nuclear localization, whereas in viral context it is essentially found in the cytoplasm. We verified that these observations were not due to culture conditions. Then, we demonstrated that the cytoplasmic localization of core was due to viral factors. The viral polymerase is implied by its TP domain. The second component is the viral pregenomic RNA, by its Epsilon stem loop structure. At last, core localization is also influenced by the phosphorylation state of its serines 157, 170 and 172.Thus, we demonstrated that the core protein traffic is very complex and regulated by different viral and cellular factors. This work will further study the regulation of intracellular trafficking of the core protein and allow a better outcome for the infected patients.

Le contrôle de la longueur des télomères est une étape critique régissant le potentiel réplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problème de fin de réplication, les chromosomes raccourcissent à chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit dans des séquences particulières appelées télomères. La longueur des télomères est en relation directe avec les capacités prolifératives des cellules et est responsable de la limite de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des cancers, la longueur des télomères va être maintenue par une enzyme spécialisée appelée télomérase. Encore aujourd’hui, comprendre la biogénèse de la télomérase et savoir comment elle est régulée reste un élément clé dans la lutte contre le cancer. Depuis la découverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqués dans sa maturation ont été identifiés. Cependant, comment ces facteurs sont intégrés dans le temps et dans l’espace, afin de produire une forme active de la télomérase, est une question restée sans réponse. Dans ce projet, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiæ comme modèle d’étude des voies de biogénèse et de trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase, en condition endogène. La première étape de mon travail fut d’identifier les facteurs requis pour l’assemblage et la localisation de la télomérase aux télomères en utilisant des techniques d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante ARN de la télomérase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition endogène, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggèrent que ce trafic sert de contrôle qualité puisqu’un défaut d’assemblage de la télomérase conduit à son accumulation cytoplasmique et prévient donc sa localisation aux télomères. De plus, nous avons identifié les voies d’import/export nucléaire de cet ARN. Dans une deuxième approche, nous avons réussi à développer une méthode de détection des particules télomérasiques in vivo en utilisant le système MS2-GFP. Notre iv étude montre que contrairement à ce qui a été précédemment décrit, la télomérase n’est pas associée de façon stable aux télomères au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au moment de la réplication des télomères, la télomérase se regroupe en 1 à 3 foci dont certains colocalisent avec les foci télomériques, suggérant que nous visualisons la télomérase active aux télomères in vivo. La délétion des gènes impliqués dans l’activation et le recrutement de la télomérase aux télomères entraine une forte baisse dans l’accumulation des foci d’ARN au sein de la population cellulaire. Nos résultats montrent donc pour la première fois la localisation endogène de l’ARN TLC1 in situ et in vivo et propose une vue intégrée de la biogenèse et du recrutement de la télomérase aux télomères. / Telomere length control is a critical step that governs the replicative potential of eukaryotic cells. Due to the end replication problem, chromosomes shorten at each round of division. This attrition occurs in specialized sequences at the extremity of chromosomes called telomeres. Telomere size is in direct relationship with proliferative potential and responsible for Hayflick’s division limit. However, in different cell type and in cancers, an end-specialized enzyme called telomerase maintains telomere length. Reactivation of telomerase in somatic cells triggers a pre-tumoral phenotype and more than 90% of cancers highly express this enzyme. Still today, understanding how telomerase is synthesized and reactivated can be a key step for the understanding of cancer arising and progression. Since the discovery of this enzyme in 1985, several factors involved in the regulation of this enzyme have been discovered. However, the spatio-temporal regulation of telomerase biogenesis and regulation has not been determined. We used the yeast S.cerevisiæ to study the biogenesis and recruitment of telomerase to telomeres. The first step in my work was to determine the factors required for the biogenesis and recruitment of telomerase to telomeres using fluorescence in situ hybridization. We have shown that the telomerase RNA component shuttles between the nucleus and the cytoplasm in wild type endogenous conditions. We have shown that this intracellular trafficking is used as a quality control mechanism that prevents the nuclear localization of miss assembled telomerase complexes. Moreover, we have identified the import/export pathways of the telomerase RNA. In a second step, we developed an in vivo localization system to follow the telomerase RNA dynamics. We used the MS2-GFP system to track this RNA in vivo. Our study shows that, contrary to what was previously described, telomerase is not stably associated to telomeres during the cell cycle but freely diffuses in the nucleus of G1 cells. In late S phase, at the moment of telomere replication, telomerase clusters in 1 to 3 big foci vi that colocalizes with telomeres clusters in vivo, suggesting the visualization of active telomerase particles replicating telomeres. Disruption of gene coding for telomerase activators triggers a great reduction of telomerase RNA clusters in a cell population. Altogether, our results shows for the first time the localization of the endogenous form of the telomerase RNA and propose an integrated view of telomerase biogenesis and recruitment to telomeres.

La maladie d’Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente chez l’Homme et constitue un enjeu économique et de santé publique majeur. Les cerveaux de patients atteints présentent une atrophie corticale associée à deux types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires, constituées de protéines Tau agrégées, et les plaques amyloïdes, composées majoritairement de peptides amyloïde beta Aß agrégés. Les peptides Aß et leur agrégation seraient à l’origine de la pathogenèse. Afin d’éclaircir les mécanismes moléculaires à la base de la toxicité d’Aß, nous avons construit un modèle de toxicité d’Aß dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce modèle a permis d’établir que la toxicité d’Aß dans la levure est intimement liée à sa sécrétion et au trafic vésiculaire. Ce modèle nous a également permis de réaliser une étude structure-toxicité du peptide et de mettre en évidence des éléments en cis importants pour la toxicité d’Aß. Une nouvelle voie d’agrégation des peptides toxiques en structure riche en feuillet ß anti-parallèle a pu ainsi être mise en évidence. Le modèle de toxicité d’Aß et l’existence de variants très toxiques d’Aß dans la levure nous a permis de réaliser des cribles génétiques afin de rechercher les éléments modulant la toxicité d’Aß in vivo. Le trafic vésiculaire, en particulier l’endocytose via le remodelage du cytosquelette d’actine, un complexe responsable de la formation de vésicules intraluminales appelé ESCRT, forment autant de pistes à étudier pour améliorer notre compréhension de la toxicité d’Aß. / Alzheimer’s disease is the most common neurodegenerative disease. This pathology is caused by aggregation of Aß peptides. The exact mechanism of neuronal cell dysfunction in Alzheimer’s disease is poorly understood and numerous models have been used to decipher the mechanisms leading to cellular death. In order to clarify the molecular mechanisms underlying the toxicity of Aß, we generated a new model to study Aß toxicity in yeast Saccharomyces cerevisiae. In our model, Aß toxicity is closely related to its secretion and its intracellular traffic. Indeed, when Aß is targeted to the secretory pathway, it is able to produce toxic species. Interestingly, we demonstrated also that even if Aß is addressed to the secretory pathway, it is still able to form cytoplasmic aggregates. Moreover, with this model, we generated new highly toxic mutants of Aß by random mutagenesis. In order to correlate structural conformation ‘signature’ to Aß toxicity, we performed a structure-toxicity study of these new variants. In vitro, we demonstrated that a new anti-parallel aggregation pathway is associated with highly toxic mutants of Aß. Then, using our Aß yeast model and also these harmful variants, we performed genetic screens in order to identify candidate genes able to modulate Aß toxicity in vivo. Given these different screens, we found that vesicular trafficking, endocytosis via actin cytoskeleton remodeling, and ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Tansport) open new avenues to improve our understanding of Aß toxicity.