MOTA, A. G. M. Avaliação dos níveis de interleucina-8 e ativação do fator de transcrição nuclear NF–KB em pacientes portadores de síndromes mielodisplásicas. 2016. 80 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-20T16:02:06Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_agmmota.pdf: 2291506 bytes, checksum: 85df5283bc0894a9480182650b0198db (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-20T16:02:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_agmmota.pdf: 2291506 bytes, checksum: 85df5283bc0894a9480182650b0198db (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T16:02:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_agmmota.pdf: 2291506 bytes, checksum: 85df5283bc0894a9480182650b0198db (MD5) Previous issue date: 2016-08-30 / The pathogenesis of myelodysplastic syndromes (MDS) is complex and multifactorial and depends on the interaction between hematopoietic cells and their microenvironment. The definite pathogenetic mechanisms are still not fully understood. Objectives: (a) To evaluate CXC chemokine ligand 8 (CXCL8 or IL-8) plasma levels and nuclear transcription factor kappa B activation (NF-kB) in patients with MDS and the possible associations with clinicopathologic variables. (b) To test possible correlation between IL-8 and NF-kB. Patients and methods: A total of 25 adults de novo MDS patients (4 RARS, 16 RCDM, 1 RAEB-I, 4 RAEB-II) were analyzed according to WHO classification and IPSS-R. Sex and age-matched healthy elderly volunteers were included as controls. IL-8 analysis was performed by Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay kit BD OptEIA and DNA binding activity of NF-kB p65 was measured using TransAM NF-kB p65 kits®. Results: MDS patients showed higher level of IL-8 when compared to controls(p=0,0068). Patients aged 75 and above also showed significant higher levels (p=0,0357). No significant associations were found between level of IL-8 and the variables analyzed. NF-kB activity was significantly elevated in MDS patients when compared to controls (p<0,0001) and higher in patients older than 75 years(p=0,0475). NF-kB activity was significantly associated with higher serum ferritin (p=0,042) and higher percentage of blasts (p=0,0282). The study of correlation between IL8 and NF-kB showed a significant positive correlation (r=0.480; p=0.015). Discussion and conclusions: Many unraveled specific pathways involved in the complex pathophysiology of MDS have been recently described, including aberrations in cytokines and their signaling pathways. In this study elevated levels of IL-8 and NF-kB were demonstrated and an elevated NF-kB activity was significantly associated with higher serum ferritin and with blast excess, two markers of bad prognosis. A significant positive correlation between IL-8 and NF-kB was detected, corroborating the emerging concept of the important role of the niche and deregulated inflammatory signaling in MDS phenotype. The best comprehension of these mechanisms favors defining new targets for therapy. / A patogênese da síndrome mielodisplásica (SMD) é complexa e multifatorial e depende da interação entre células hematopoéticas e seu microambiente. Os mecanismos patogênicos envolvidos ainda não são totalmente compreendidos. Objetivos: (a) Avaliar níveis plasmáticos de interleucina-8 (CXCL8 ou IL-8) e a ativação do Fator Nuclear de Transcrição kappa B (NF-kB) em pacientes com SMD e as possíveis associações com variáveis clínico-patológicas. (b) Analisar possível correlação entre a IL-8 e NF-kB. Pacientes e métodos: Um total de 25 pacientes adultos portadores de SMD de novo (4 ARSA, 16 CRDM, 1 AREB-I, 4 AREB-II) foram analisados de acordo com a classificação da OMS e IPSS-R. Voluntários idosos saudáveis pareados por sexo e idade foram incluídos como controles. A análise da IL-8 foi realizada por reação imunoenzimática de acordo com o kit BD OptEIA e a ativação do NF-kB foi medida por quimioluminescência utilizando kit TransAM NF-kB p65. Resultados: Os pacientes com SMD apresentaram maior nível de IL-8 quando comparados aos controles (p=0,0068) e, dentre os pacientes, aqueles com 75 anos ou mais apresentaram níveis significativamente maiores (p=0,0357). Não foram encontradas associações significativas entre o nível de IL-8 e as variáveis analisadas. Nos pacientes com SMD, a ativação do NF-kB foi significativamente maior quando comparada aos controles (p<0,0001) e maior em pacientes com 75 anos ou mais (p=0,0475). Foi encontrada associação significativa entre a atividade de NF-kB e níveis elevados de ferritina sérica (p=0,042) e maior percentual de blastos (p=0,0282). O estudo da correlação entre IL8 e NF-kB mostrou uma correlação moderada, positiva e significativa (r = 0,480; p = 0,015). Discussão e conclusões: Estudos recentes sobre a fisiopatologia complexa da SMD incluem a desregulação de citocinas e suas vias de sinalização. Neste estudo, níveis significantemente elevados de IL-8 e NF-kB foram demonstrados e uma associação de maior ativação de NF-kB foi detectada em pacientes com sobrecarga de ferro e excesso de blastos, dois marcadores de pior prognóstico na doença. Uma correlação positiva entre IL-8 e NF-kB foi observada, corroborando o conceito emergente do papel relevante do microambiente e da sinalização inflamatória aberrante na patogênese da doença. A melhor compreensão desses mecanismos favorece a identificação de novos alvos terapêuticos.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria de tamanho diminuto, caracterizada por um genoma pequeno, com baixo conteúdo GC. Está associada com doenças respiratórias de suínos, resultando em prejuízos produtivos e econômicos na indústria animal. A presença de sequências de DNA repetitivas, que ocorrem em grandes quantidades em células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificadas em genomas de procariotos, sendo também associadas a um potencial papel regulador. Uma vez que a regulação da transcrição nesses organismos ainda é pouco entendida, o objetivo do presente estudo foi realizar uma busca in silico por elementos repetitivos nas regiões intergênicas do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Dois tipos de repetições foram selecionados para a busca inicial: tandem e palindromes. Regiões intergênicas de até 500 pb a montante do sítio de início da tradução de todas as CDSs do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foram utilizadas para a predição. Para cada tipo de elemento dois programas computacionais independentes foram utilizados. As predições in silico resultaram em 144 repetições em tandem e 1.171 palindromes. O DNA repetitivo se encontra distribuído a montante de 86% das unidades transcricionais de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Análises comparativas entre genomas de micoplasmas demonstraram diferentes níveis de conservação dos elementos repetitivos entre linhagens patogênicas e não-patogênicas. Linhagens patogênicas revelaram uma conservação de 59%, enquanto que a não patogênica, somente de 46%. Através de ensaios de amplificação quantitativa de DNA, foi observado diferentes níveis de expressão em genes codificantes para importantes proteínas, como glicina hidroximetiltransferase, lipoproteína, adesinas e proteína ligadora de GTP. Os genes codificantes para essas proteínas divergiam no número de repetições palindromes e tandens na sua respectiva região intergênica. Além disso, repetições encontradas em 206 genes já descritos como regulados em diferentes condições em M. hyopneumoniae linhagem 232 mostraram aproximadamente 80% de conservação em relação à linhagem M. hyopneumoniae linhagem 7448. Todos esses resultados sugerem um potencial papel regulador das repetições de DNA em tandem e palindromes em Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae is a diminutive bacterium, characterized by a small genome with a low GC content. It is commonly associated with swine respiratory diseases, resulting in productivity and economic losses in the animal industry. Repetitive DNA, which occurs in large quantities in eukaryotic cells, has been increasingly identified in prokaryotic genomes, and has been associated with a potential regulatory function. Once transcription regulation in these organisms is still poorly understood, the aim of the current study was to perform an in silico search of repeat elements in the genomic intergenic regions of M. hyopneumoniae strain 7448. Two types of repeats were selected for initial search: Tandem and Palindromic. Intergenic regions up to 500 bp upstream from start codon of M. hyopneumoniae strain 7448 CDSs were used as input for the software’s prediction. For each type of repeat sequence, two independent software packages were used. Computational analysis results in 144 tandem repeats and 1,171 palindrome elements. The repeats were distributed in the upstream region of 86% of transcriptional units of M. hyopneumoniae strain 7448. Comparative analysis between distinct mycoplasmas, demonstrate different indices of repeat conservation among pathogenic and non-pathogenic strains. Pathogenic strains revealed 59% conservation, while non-pathogenic only 46%. Through assays of quantitative amplification of DNA, different levels of expression in genes coding important proteins have been demonstrated, as glycine hydroxymethyltransferase, lipoprotein, adhesins and GTP-binding protein. These protein coding genes differ in number of palindromes or tandem repeats in respective upstream regions. In addition, repeats found in 206 genes already described to be regulated in different grow conditions in M. hyopneumoniae strain 232 showed almost 80% of conservation in relation to M. hyopneumoniae strain 7448. All these findings, suggests a potential regulatory role of tandem and palindrome DNA repeats.

A síndrome dos ovários policísticos (PCOS) representa uma das endocrinopatias mais frequentes em mulheres em idade reprodutiva, cujas principais características clínicas são anovulação crônica e manifestações de hiperandrogenismo. Em conjunto com os distúrbios reprodutivos, as pacientes com PCOS apresentam, frequentemente, obesidade e resistência insulínica (RI). Além disso, mulheres com PCOS apresentam maior risco para diabetes tipo 2, dislipidemia e hipertensão arterial e a presença da obesidade pode exacerbar os distúrbios metabólicos associados com a síndrome. A patogênese da PCOS está ligada a maior susceptibilidade ambiental bem como fatores genéticos e esses fatores podem influenciar a apresentação clínica da doença. Variantes genéticas, como polimorfismos de troca de um único nucleotídeo (SNP) vem sendo associadas com alterações metabólicas e clínicas. SNPs no gene TCF7L2 já foram descritos associados ao DM2 2 e RI. Estudos até o presente momento apresentam resultados controversos em relação a variáveis metabólicas e sua associação com os SNPs deste gene em pacientes com PCOS. Outros genes também vem sendo estudados e sabendo que a resistência à insulina e obesidade são característica frequentes de pacientes com a PCOS, o gene FTO surgiu como um possível locus a ser estudado, já que diversos estudos mostram uma associação com esses fatores em outras populações. Até o presente momento estudos mostram dados controversos, possivelmente associados a diferenças entre etnias. Além disso, estudos em uma população latino americana de mulheres com PCOS ainda não foram relatados na literatura. No presente estudo, observamos que os polimorfismos do gene do TCF7L2 rs7903146 e rs11196236 bem como seus haplótipos, não estão associados com a PCOS, mas que a paciente ser portadora de pelo menos um alelo de risco mostra uma variação positiva de 5,87 cm na cintura, 10,7 mg/dl no colesterol total e 10,3mg/dL no LDL-c. Além disso, para verificar a associação do polimorfismo rs7903146 com PCOS realizamos um meta análise, incluindo 1892 mulheres com PCOS e 2695 controles. Os resultados sugerem que o polimorfismo no gene do TCF7L2 não está associado com o risco aumentando de desenvolver PCOS em difefentes etnias (Asiáticas e não Asiáticas). No que se refere ao gene do FTO, os polimorfismos estudados também não foram associados com PCOS, mas os resultados mostram um aumento nos níveis de glicose nas pacientes que possuíam pelo menos um alelo de risco tanto para o polimorfismo rs9939609 quanto para o rs8050136. Estes resultados em conjunto sugerem que a PCOS por ser uma doença multifatorial e multigênica é difícil encontrar um único SNP responsável pelo fenótipo completo da PCOS, mas os estudos de associação em diferentes genes podem contribuir com o melhor entendimento dos diferentes fenótipos, principalmente nas características metabólicas destas pacientes. / The polycystic ovary syndrome (PCOS) is one of the most common endocrine disorders in reproductive age women, whose main clinical features are chronic anovulation and hyperandrogenism. Together with reproductive disorders, patients with PCOS frequently have obesity and insulin resistance (IR). In addition, women with PCOS have a higher risk for type 2 diabetes, dyslipidemia and hypertension and the presence of obesity may exacerbate the metabolic disturbances associated to the syndrome. The pathogenesis of PCOS is linked to greater environmental susceptibility and genetic factors and these aspects may influence the clinical presentation of the disease. Genetic variants as single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been associated to metabolic and clinical changes. SNPs in the TCF7L2 gene have been described in association with DM2 2 and IR. Studies to date are controversial in relation to metabolic variables and their association with the SNPs of this gene in patients with PCOS. Other genes have also been studied and knowing that insulin resistance and obesity are common characteristic in patients with PCOS, the FTO gene has emerged as a possible locus to be studied. Several studies show an association with these factors in other populations. So far studies show controversial data, possibly associated to differences among ethnic groups. In addition, studies in a Latin American women population with PCOS have not been reported in the literature. We have found out that the gene TCF7L2, polymorphisms rs7903146 and rs11196236 and their haplotypes show no differences between genotypes and haplotypes for clinical and metabolic variables. However, for each T (rs7903146) and T (rs11196236) allele added to the haplotypes, a variation of 5.87 cm in waist (P trend=0.01), 10.7 mg/dl in total cholesterol (P trend=0.03), and 10.3 mg/dl in LDL-C (P trend=0.01) was recorded. Also, to verify the association of rs7903146 polymorphism with PCOS we conducted a metaanalysis including 1892 women with PCOS and 2695 controls. The results suggest that polymorphism in the gene TCF7L2 is not associated to the increased risk of developing PCOS in different ethnicities (Asian and non- Asian). As regards the FTO gene, the studied polymorphisms were not associated to PCOS, but the results show an increase in glucose levels in patients who had at least one risk allele for the polymorphism rs8050136 and rs9939609. These results together, suggest that PCOS being a multifactorial and multigenic disease is difficult to find a single SNP responsible for the complete phenotype of PCOS, but association studies in different genes can contribute to a better understanding of the different phenotypes, especially in metabolic characteristics of these patients.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-10T18:44:42Z No. of bitstreams: 1 2017_BrunoCoutoK¨ummel.pdf: 3746010 bytes, checksum: fb3e186abc2f80bf5a5302719a1aa78b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-12T19:37:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BrunoCoutoK¨ummel.pdf: 3746010 bytes, checksum: fb3e186abc2f80bf5a5302719a1aa78b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-12T19:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BrunoCoutoK¨ummel.pdf: 3746010 bytes, checksum: fb3e186abc2f80bf5a5302719a1aa78b (MD5) Previous issue date: 2018-04-12 / RNAs não-codificadores longos (long non-coding RNA - lncRNAs) constitui uma classe heterogênea de RNAs que agrega transcritos com pouca capacidade de codificar proteínas e que possuem mais de 200 nucleotídeos em sua composição. Estudos recentes apontam que essas moléculas possuem funções de regulação de processos biológicos importantes dentro das células. Sabe-se também que o nível de expressão dos lncRNAs está correlacionado com diversas doenças genéticas, tais como câncer e doenças neuro-degenerativas. Este trabalho apresenta um método para seleção das características mais relevantes para modelos de aprendizado de máquina aplicados ao problema de distinguir lncRNAs de transcritos codificadores de proteínas. O método proposto, denominadoSingle Score Feature Selection (S2FS), utilizou como características as frequências de 2-mers, 3-mers e 4-mers dos transcritos, para detectar aquelas mais relevantes para distinguir lncRNAs de transcritos codificadores de proteínas. As características identificadas pelo S2FS foram avaliadas nos datasets obtidos de repositórios públicos de transcritos RNAs codicadores de proteínas e de lncRNAs de Homo sapiens, Mus musculus e Danio rerio. Para o dataset de H. sapiens, também foi utilizada a característica da ORF mais longa de cada transcrito. Os resultados obtidos indicam que o S2FS identificou boas características para os modelos de predição de lncRNAs baseados em Random Forest. Nos modelos de classificação testados, as características selecionadas pelo S2FS possibilitaram resultados melhores do que as características selecionadas por um método de seleção univariada de características baseado no escore da função χ2. / Long non-coding RNA(lncRNAs) constitutes a heterogeneous class of RNAs that includes RNAs with more than 200 nucleotides and poor capacity for coding proteins. Recent studies have indicated that these molecules act on critical biological processes inside the cells. However, their expression levels are also correlated with a number of complex human diseases, such as cancer, neuro-degenerative diseases and others. This work proposes a method for feature selection for machine learning methods applied to the task of distinguishing lncRNAs from protein coding transcripts. The proposed method, called Single Score Feature Selection (S2FS), used as features the 2-mer, 3-mer and 4-mer frequencies of the transcripts, in order to detect those more relevant to distinguish lncRNAs from protein coding transcripts. The features identified by S2FS were evaluated on datasets obtained from public repositories of protein coding transcripts and lncRNAs of Homo Sapiens, Mus musculus and Danio rerio. For the H. sapiens dataset, the longest ORF of each transcript was also used as a feature. The obtained results show that the S2FS identified good features for the lncRNA prediction models based on Random Forest. In the tested classification models, the selected features from S2FS enabled better performance results than the features selected by an univariate selection method based on the scores of a χ2 function.

O sistema colinérgico muscarínico desempenha uma função central na memória, mas o papel de cada subtipo de receptor é pouco compreendido separadamente. As toxinas muscarínica (MTs) extraídas da peçonha das serpentes Dendroaspis sp são ferramentas farmacológicas seletivas aos diferentes subtipos de receptores muscarínicos. O subsistema M4 muscarínico modula os processos de consolidação e evocação. Recentemente, tem se dado atenção aos processos subseqüentes à evocação e vários trabalhos demonstraram que a reconsolidação e a extinção da memória compreendem etapas importantes na formação do processo. O objetivo desse trabalho é investigar o envolvimento do subsistema M4 colinérgico muscarínico hipocampal na consolidação, evocação, reconsolidação e extinção da memória, além de investigar os receptores M4 da amígdala basolateral na consolidação e reconsolidação. Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que os receptores M4 mudavam seu papel modulatório entre a consolidação e evocação, portanto, neste trabalho investigamos, também, em que momento do processo de consolidação ocorre essa mudança e se essa alteração é dependente de transcrição gênica. A toxina MT3, antagonista seletiva ao receptor M4, e a escopolamina, antagonista inespecífico, foram as ferramentas farmacológicas utilizadas e seus efeitos foram estudados na tarefa de condicionamento aversivo contextual (CAC) e esquiva inibitória (EI). Quando infundidos no hipocampo antes do treino CAC, ambos os fármacos foram amnésicos sobre a consolidação, entretanto, somente MT3 foi efetiva quando infundida antes do teste, sendo o efeito oposto, facilitatório. Além disso, somente a MT3 intra-hipocampal foi facilitatória sobre a reconsolidação e bloqueou a extinção da tarefa de CAC. Infundidas na amígdala basolateral os antagonistas foram amnésicos sobre a consolidação e a reconsolidação de CAC. Os experimentos com a esquiva inibitória demonstraram que a MT3 intra-hipocampal é amnésica somente quando infundida imediatamente após o treino. Porém, modifica seu efeito quando administrada 90 e 180 minutos após o treino, passando a ser facilitatória. A administração de um inibidor de transcrição gênica (DRB) imediatamente após o treino de EI reverte o efeito facilitatório da MT3 pré-teste. Os resultados sugerem uma modulação positiva do sistema colinérgico muscarínico hipocampal durante a consolidação e a extinção da memória de CAC, porém, uma ação contrária é observada durante a evocação e reconsolidação. Os resultados em conjunto sugerem que os receptores M4 hipocampais sofram alterações plásticas durante o processo de consolidação passando a controlar negativamente a atividade excitatória dos neurônios glutamatérgicos, fenômeno que parece não ocorrer na amígdala basolateral. / The cholinergic muscarinic system plays a central role in learning and memory, yet little is known about the specific roles of each receptor subtype. Muscarinic toxins (MTs) from Dendroaspis snakes venom are selective for muscarinic receptor subtypes. The hippocampus M4 subsystem, for instance, was shown to take part in the modulation of memory consolidation and retrieval. The memory phenomenon, by its turn, is being recently unveiled as a much more complex set of processes than previously thought, encompassing post-retrieval situations such as reconsolidation and extinction, each with its particular mechanisms. The scope of this study is to explore the involvement of the hippocampal cholinergic M4 muscarinic subsystem on the consolidation, retrieval, reconsolidation and extinction of memories, moreover to investigate the role of M4 subsystem of basoalteral amygdala on the consolidation and reconsolidation. Last works shown a different modulatory role of hippocampal M4 receptors about consolidation and retrieval processes, therefore This work aims to investigate the muscarinic cholinergic modulation at hippocampal circuits by M4 receptors, along different periods of memory consolidation for an inhibitory avoidance task, and verify if the change effect of pre-test MT3 are dependent of mRNA synthesis. MT3, a very selective M4 antagonist, and the less selective antagonist scopolamine were infused bilaterally into the rat CA1 area, and their effects studied in a contextual fear conditioning task (CFC) and inhibitory avoidance task (IA). When infused immediately after training, both treatments caused disruption of the memory consolidation, however, only MT3 was effective when infused before the test session, and the effect, was the opposite, i.e., memory facilitation. Moreover, only MT3 enhanced the reconsolidation of CFC following its infusion into the hippocampus or blocked its extinction. Infused into the basolateral amygdala, muscarínic antagonists shown an amnestic effect about the consolidation and reconsolidation of CFC memory. In the IA experiments, MT3 infused immediately after training was amnestic upon the consolidation process, while an “opposite effect” –memory facilitation– was observed in the 90-180min time window. The DRB was amnestic too upon the consolidation, showing that the transcriptional process is essential to the memory. Moreover, the DRB reverted the facilitatory effect of pre-test MT3. These results suggest an endogenous positive modulation of the cholinergic muscarinic system present during the consolidation or the extinction of an aversive memory, but an opposite action during memory retrieval or memory reconsolidation. Moreover, these results suggest that M4 receptors are likely expressed at different hippocampal localizations where they underlie different processes and plasticity events, may be over expressed upon glutamatergic excitatory cells.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria de tamanho diminuto, caracterizada por um genoma pequeno, com baixo conteúdo GC. Está associada com doenças respiratórias de suínos, resultando em prejuízos produtivos e econômicos na indústria animal. A presença de sequências de DNA repetitivas, que ocorrem em grandes quantidades em células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificadas em genomas de procariotos, sendo também associadas a um potencial papel regulador. Uma vez que a regulação da transcrição nesses organismos ainda é pouco entendida, o objetivo do presente estudo foi realizar uma busca in silico por elementos repetitivos nas regiões intergênicas do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Dois tipos de repetições foram selecionados para a busca inicial: tandem e palindromes. Regiões intergênicas de até 500 pb a montante do sítio de início da tradução de todas as CDSs do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foram utilizadas para a predição. Para cada tipo de elemento dois programas computacionais independentes foram utilizados. As predições in silico resultaram em 144 repetições em tandem e 1.171 palindromes. O DNA repetitivo se encontra distribuído a montante de 86% das unidades transcricionais de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Análises comparativas entre genomas de micoplasmas demonstraram diferentes níveis de conservação dos elementos repetitivos entre linhagens patogênicas e não-patogênicas. Linhagens patogênicas revelaram uma conservação de 59%, enquanto que a não patogênica, somente de 46%. Através de ensaios de amplificação quantitativa de DNA, foi observado diferentes níveis de expressão em genes codificantes para importantes proteínas, como glicina hidroximetiltransferase, lipoproteína, adesinas e proteína ligadora de GTP. Os genes codificantes para essas proteínas divergiam no número de repetições palindromes e tandens na sua respectiva região intergênica. Além disso, repetições encontradas em 206 genes já descritos como regulados em diferentes condições em M. hyopneumoniae linhagem 232 mostraram aproximadamente 80% de conservação em relação à linhagem M. hyopneumoniae linhagem 7448. Todos esses resultados sugerem um potencial papel regulador das repetições de DNA em tandem e palindromes em Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae is a diminutive bacterium, characterized by a small genome with a low GC content. It is commonly associated with swine respiratory diseases, resulting in productivity and economic losses in the animal industry. Repetitive DNA, which occurs in large quantities in eukaryotic cells, has been increasingly identified in prokaryotic genomes, and has been associated with a potential regulatory function. Once transcription regulation in these organisms is still poorly understood, the aim of the current study was to perform an in silico search of repeat elements in the genomic intergenic regions of M. hyopneumoniae strain 7448. Two types of repeats were selected for initial search: Tandem and Palindromic. Intergenic regions up to 500 bp upstream from start codon of M. hyopneumoniae strain 7448 CDSs were used as input for the software’s prediction. For each type of repeat sequence, two independent software packages were used. Computational analysis results in 144 tandem repeats and 1,171 palindrome elements. The repeats were distributed in the upstream region of 86% of transcriptional units of M. hyopneumoniae strain 7448. Comparative analysis between distinct mycoplasmas, demonstrate different indices of repeat conservation among pathogenic and non-pathogenic strains. Pathogenic strains revealed 59% conservation, while non-pathogenic only 46%. Through assays of quantitative amplification of DNA, different levels of expression in genes coding important proteins have been demonstrated, as glycine hydroxymethyltransferase, lipoprotein, adhesins and GTP-binding protein. These protein coding genes differ in number of palindromes or tandem repeats in respective upstream regions. In addition, repeats found in 206 genes already described to be regulated in different grow conditions in M. hyopneumoniae strain 232 showed almost 80% of conservation in relation to M. hyopneumoniae strain 7448. All these findings, suggests a potential regulatory role of tandem and palindrome DNA repeats.

A síndrome dos ovários policísticos (PCOS) representa uma das endocrinopatias mais frequentes em mulheres em idade reprodutiva, cujas principais características clínicas são anovulação crônica e manifestações de hiperandrogenismo. Em conjunto com os distúrbios reprodutivos, as pacientes com PCOS apresentam, frequentemente, obesidade e resistência insulínica (RI). Além disso, mulheres com PCOS apresentam maior risco para diabetes tipo 2, dislipidemia e hipertensão arterial e a presença da obesidade pode exacerbar os distúrbios metabólicos associados com a síndrome. A patogênese da PCOS está ligada a maior susceptibilidade ambiental bem como fatores genéticos e esses fatores podem influenciar a apresentação clínica da doença. Variantes genéticas, como polimorfismos de troca de um único nucleotídeo (SNP) vem sendo associadas com alterações metabólicas e clínicas. SNPs no gene TCF7L2 já foram descritos associados ao DM2 2 e RI. Estudos até o presente momento apresentam resultados controversos em relação a variáveis metabólicas e sua associação com os SNPs deste gene em pacientes com PCOS. Outros genes também vem sendo estudados e sabendo que a resistência à insulina e obesidade são característica frequentes de pacientes com a PCOS, o gene FTO surgiu como um possível locus a ser estudado, já que diversos estudos mostram uma associação com esses fatores em outras populações. Até o presente momento estudos mostram dados controversos, possivelmente associados a diferenças entre etnias. Além disso, estudos em uma população latino americana de mulheres com PCOS ainda não foram relatados na literatura. No presente estudo, observamos que os polimorfismos do gene do TCF7L2 rs7903146 e rs11196236 bem como seus haplótipos, não estão associados com a PCOS, mas que a paciente ser portadora de pelo menos um alelo de risco mostra uma variação positiva de 5,87 cm na cintura, 10,7 mg/dl no colesterol total e 10,3mg/dL no LDL-c. Além disso, para verificar a associação do polimorfismo rs7903146 com PCOS realizamos um meta análise, incluindo 1892 mulheres com PCOS e 2695 controles. Os resultados sugerem que o polimorfismo no gene do TCF7L2 não está associado com o risco aumentando de desenvolver PCOS em difefentes etnias (Asiáticas e não Asiáticas). No que se refere ao gene do FTO, os polimorfismos estudados também não foram associados com PCOS, mas os resultados mostram um aumento nos níveis de glicose nas pacientes que possuíam pelo menos um alelo de risco tanto para o polimorfismo rs9939609 quanto para o rs8050136. Estes resultados em conjunto sugerem que a PCOS por ser uma doença multifatorial e multigênica é difícil encontrar um único SNP responsável pelo fenótipo completo da PCOS, mas os estudos de associação em diferentes genes podem contribuir com o melhor entendimento dos diferentes fenótipos, principalmente nas características metabólicas destas pacientes. / The polycystic ovary syndrome (PCOS) is one of the most common endocrine disorders in reproductive age women, whose main clinical features are chronic anovulation and hyperandrogenism. Together with reproductive disorders, patients with PCOS frequently have obesity and insulin resistance (IR). In addition, women with PCOS have a higher risk for type 2 diabetes, dyslipidemia and hypertension and the presence of obesity may exacerbate the metabolic disturbances associated to the syndrome. The pathogenesis of PCOS is linked to greater environmental susceptibility and genetic factors and these aspects may influence the clinical presentation of the disease. Genetic variants as single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been associated to metabolic and clinical changes. SNPs in the TCF7L2 gene have been described in association with DM2 2 and IR. Studies to date are controversial in relation to metabolic variables and their association with the SNPs of this gene in patients with PCOS. Other genes have also been studied and knowing that insulin resistance and obesity are common characteristic in patients with PCOS, the FTO gene has emerged as a possible locus to be studied. Several studies show an association with these factors in other populations. So far studies show controversial data, possibly associated to differences among ethnic groups. In addition, studies in a Latin American women population with PCOS have not been reported in the literature. We have found out that the gene TCF7L2, polymorphisms rs7903146 and rs11196236 and their haplotypes show no differences between genotypes and haplotypes for clinical and metabolic variables. However, for each T (rs7903146) and T (rs11196236) allele added to the haplotypes, a variation of 5.87 cm in waist (P trend=0.01), 10.7 mg/dl in total cholesterol (P trend=0.03), and 10.3 mg/dl in LDL-C (P trend=0.01) was recorded. Also, to verify the association of rs7903146 polymorphism with PCOS we conducted a metaanalysis including 1892 women with PCOS and 2695 controls. The results suggest that polymorphism in the gene TCF7L2 is not associated to the increased risk of developing PCOS in different ethnicities (Asian and non- Asian). As regards the FTO gene, the studied polymorphisms were not associated to PCOS, but the results show an increase in glucose levels in patients who had at least one risk allele for the polymorphism rs8050136 and rs9939609. These results together, suggest that PCOS being a multifactorial and multigenic disease is difficult to find a single SNP responsible for the complete phenotype of PCOS, but association studies in different genes can contribute to a better understanding of the different phenotypes, especially in metabolic characteristics of these patients.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T12:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monte-Mor_BarbaradaCostaReis_D.pdf: 7171978 bytes, checksum: 5c73cb6c7edd6138186b17d972fce769 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Policitemia vera (PV) é uma síndrome mieloproliferativa (SMP) crônica que ocorre por proliferação clonal de progenitores hematopoéticos multipotenciais. Pacientes com PV apresentam expansão das três principais linhagens mielóides na medula óssea, levando à produção aumentada de hemácias, granulócitos e plaquetas. Características importantes de PV incluem elevação de hematócrito em presença de níveis normais ou diminuídos de eritropoetina (EPO) e a formação de colônias eritróides endógenas (CEE). A mutação JAK2 V617F, presente na maioria dos pacientes com PV, causa ativação constitutiva de JAK2 e parece ser responsável pelo fenótipo observado. Apesar disso, as mudanças transcricionais desencadeadas pela mutação ainda não foram completamente caracterizadas. Neste trabalho, utilizou-se Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) para realizar um estudo de expressão gênica global em células da medula óssea de um paciente com PV portador da mutação, ao diagnóstico e em células normais de doadores saudáveis. Genes com expressão aumentada em PV estão envolvidos em processos biológicos importantes, como transdução de sinal, diferenciação e proliferação celular, ciclo celular, apoptose, resposta imune e regulação da transcrição. JUNB foi um dos genes identificados e, usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), detectou-se expressão aumentada de JUNB em dois outros pacientes com PV JAK2 V617F-positivos. Por meio de linhagens murinas Ba/F3-REPO e culturas primárias de eritroblastos humanos, observou-se que JUNB é expresso após adição de EPO e que a proteína JunB é constitutivamente induzida por JAK2 V617F. Além disso, interferência na expressão de JUNB diminuiu o potencial clonogênico e proliferativo de progenitores eritróides humanos Ainda, em PV, a eritropoese causada por JAK2 V617F mostrou-se mais sensível à diminuição de expressão de JunB do que a eritropoese normal. Assim, esses resultados sugerem que JunB tenha um papel fundamental no desenvolvimento de SMPs causadas por JAK2 V617F / Abstract: Polycythemia vera (PV) is a chronic myeloproliferative disorder that arises through clonal proliferation of multipotent hematopoietic progenitors. PV patients present bone marrow trilineage expansion, leading to increased production of mature red cells, granulocytes and platelets. Important PV features are elevated red cell mass, despite normal or subnormal erythropoietin (EPO) levels, and endogenous erythroid colony (EEC) formation. The JAK2 V617F mutation, present in the majority of polycythemia vera (PV) patients, causes a JAK2 constitutive activation and seems to be responsible for the PV phenotype. However, the transcriptional changes triggered by the mutation have not yet been totally characterized. Serial analysis of gene expression (SAGE) was used to perform a large scale gene expression study in bone marrow cells of a newly-diagnosed PV patient harboring the JAK2 V617F mutation and in normal bone marrow cells from healthy donors. Genes overexpressed in PV are involved in important biological processes, such as signal transduction, cellular differentiation, cellular proliferation, cell cycle, apoptosis, immune response and transcriptional regulation. JUNB was one of the genes up-regulated in PV and overexpression of JUNB was also detected by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in hematopoietic cells of another two JAK2 V617F PV patients. Using Ba/F3-EPOR cell lines and primary human erythroblast cultures, JUNB was found to be expressed after Epo addition and JunB protein was shown to be constitutively induced by JAK2 V617F. In addition, JUNB knock down reduced the clonogenic and proliferative potential of human erythroid progenitors. Furthermore, in PV, the JAK2 V617F driven erythropoisis was more sensitive to JunB downregulation than normal erythropoiesis. Hence, these results demonstrate that JunB may play a major role in the development of JAK2 V617F myeloproliferative disorders / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

In nature, biofilm is a complex structure resulted of multicellular bacterial communities that provide important nutritional functions and the acquisition of protective traits such as antibiotics resistance and horizontal gene transfer. The development from the planktonic, lonely bacteria, to the mature multilayered biofilm structure consists of three main phases: motility, attachment and biofilm maturation. At cellular level, the process is controlled by several genes such as flhD, fliA, rpoS, csgD, adrA, cpxR all acting as master regulators. Additionally, the global regulators CRP, IHF, Fis, and others in less frequency, have been related to biofilm formation, although blurry information has been provided. In this thesis we used synthetic, molecular and cellular biology approaches to understand the effect of CRP, IHF and Fis in the transcriptional regulatory network in the bacterium Escherichia coli. In the first chapter, we employed network analysis to reconstruct and analyze part of the entire regulatory network described to modulate the flagella-biofilm program. With this analysis we identified some critical interactions responsible for the planktonic-biofilm transition. Next, we selected the top ten effectors nodes of the network and cloned the promoter region of those genes in a reporter system. As extensively explained in chapter II, this system allowed us to validate as well as suggest new interactions in the network. Additionally, the measurement of the promoter activity during bacterial development show that CRP, IHF and Fis differentially modulate most of the surveyed genes suggesting that those Global Regulators participate to modulate gene expression in different phases of the planktonic-biofilm development. At chapter three, to get a better overview of the entire process, we performed motility, adherence/early biofilm and mature biofilm assays. We describe the intrinsic ability of E. coli to perform motility, adherence and mature biofilm at 37?C. In contrast, the absence of ihf, fis as well as Carbon Catabolite Repression (CCR), lead to altered phenotypes at both motility and biofilm development. At the end, we discussed how the changes of promoter activity of target genes, together with our network analysis, could explain part of the altered phenotypes observed. For instance, we observed changes at the main stress responders rpoS and rpoE that, in combination with alterations at specific genes such as fliA, can explain the enhanced motility in the E. coli ?ihf strain. Altogether, in this thesis, we provided evidence that CRP, IHF and Fis control the activity of the promoter regions of genes involved in the planktonic-biofilm development. / Na natureza, o biofilme é uma estrutura complexa resultante de comunidades bacterianas multicelulares que fornece importantes funções nutricionais e a aquisição de traços de proteção como resistência a antibióticos e transferência horizontal de genes. O desenvolvimento das bactérias planctônicas solitárias para uma estrutura de biofilme maduro consiste em três fases principais: motilidade, fixação e maturação do biofilme. Ao nível celular, o processo é controlado por vários genes tais como flhD, fliA, rpoS, csgD, adrA, cpxR, todos agindo como reguladores mestre. Além disso, os reguladores globais CRP, IHF, Fis e outros em menor freqüência, têm sido relacionados à formação de biofilme, embora tenham sido fornecidas informações nao conclusivas sobre esse processo. Nesta tese foram utilizadas abordagens de bioinformática, assim como de biologia molecular e celular para entender o efeito de CRP, IHF e Fis na rede reguladora da transição de motilidade para biofilme na bactéria Escherichia coli. No primeiro capítulo, utilizamos a análise de rede para reconstruir e analisar parte da rede regulatória descrita para modular o programa flagelo-biofilme. Com esta análise identificamos algumas interações críticas responsáveis pela transição planctônica-biofilme. Em seguida, selecionamos os dez principais nós efetores da rede e clonamos a região promotora desses genes em um sistema repórter. Conforme explicado amplamente no capítulo II, este sistema nos permitiu validar e sugerir novas interações na rede. Adicionalmente, a medição da atividade do promotor durante o desenvolvimento bacteriano mostra que a CRP, a IHF e a Fis modulam diferencialmente a maioria dos genes analisados sugerindo que estes Reguladores Globais participam para modular a expressão génica em diferentes fases do desenvolvimento de estado planctónico para biofilme. No capítulo três, para obter uma melhor visão geral de todo o processo, realizamos ensaios de motilidade, aderência / biofilme precoce e biofilmes maduros. Descrevemos a capacidade intrínseca de E. coli para realizar motilidade, adesão e biofilme maduro a 37 °C. Em contraste, a ausência de ihf, fis, bem como o fenômeno de Repressão de Catabolite de Carbono (CCR), levam a fenótipos alterados, tanto na motilidade como no desenvolvimento do biofilme. No final, discutimos como as mudanças da atividade do promotor de genes alvo, juntamente com a nossa análise de rede, poderia !xi explicar parte dos fenótipos alterados observados. Por exemplo, observamos mudanças nos principais respondedores de estresse rpoS e rpoE que, em combinação com alterações em genes específicos como fliA, podem explicar a motilidade aumentada na estirpe de E. coli ?ihf. Em conjunto, nesta tese, apresentamos evidências de que CRP, IHF e Fis controlam a atividade das regiões promotoras de genes envolvidos no desenvolvimento planctônico-biofilme.

O sistema colinérgico muscarínico desempenha uma função central na memória, mas o papel de cada subtipo de receptor é pouco compreendido separadamente. As toxinas muscarínica (MTs) extraídas da peçonha das serpentes Dendroaspis sp são ferramentas farmacológicas seletivas aos diferentes subtipos de receptores muscarínicos. O subsistema M4 muscarínico modula os processos de consolidação e evocação. Recentemente, tem se dado atenção aos processos subseqüentes à evocação e vários trabalhos demonstraram que a reconsolidação e a extinção da memória compreendem etapas importantes na formação do processo. O objetivo desse trabalho é investigar o envolvimento do subsistema M4 colinérgico muscarínico hipocampal na consolidação, evocação, reconsolidação e extinção da memória, além de investigar os receptores M4 da amígdala basolateral na consolidação e reconsolidação. Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que os receptores M4 mudavam seu papel modulatório entre a consolidação e evocação, portanto, neste trabalho investigamos, também, em que momento do processo de consolidação ocorre essa mudança e se essa alteração é dependente de transcrição gênica. A toxina MT3, antagonista seletiva ao receptor M4, e a escopolamina, antagonista inespecífico, foram as ferramentas farmacológicas utilizadas e seus efeitos foram estudados na tarefa de condicionamento aversivo contextual (CAC) e esquiva inibitória (EI). Quando infundidos no hipocampo antes do treino CAC, ambos os fármacos foram amnésicos sobre a consolidação, entretanto, somente MT3 foi efetiva quando infundida antes do teste, sendo o efeito oposto, facilitatório. Além disso, somente a MT3 intra-hipocampal foi facilitatória sobre a reconsolidação e bloqueou a extinção da tarefa de CAC. Infundidas na amígdala basolateral os antagonistas foram amnésicos sobre a consolidação e a reconsolidação de CAC. Os experimentos com a esquiva inibitória demonstraram que a MT3 intra-hipocampal é amnésica somente quando infundida imediatamente após o treino. Porém, modifica seu efeito quando administrada 90 e 180 minutos após o treino, passando a ser facilitatória. A administração de um inibidor de transcrição gênica (DRB) imediatamente após o treino de EI reverte o efeito facilitatório da MT3 pré-teste. Os resultados sugerem uma modulação positiva do sistema colinérgico muscarínico hipocampal durante a consolidação e a extinção da memória de CAC, porém, uma ação contrária é observada durante a evocação e reconsolidação. Os resultados em conjunto sugerem que os receptores M4 hipocampais sofram alterações plásticas durante o processo de consolidação passando a controlar negativamente a atividade excitatória dos neurônios glutamatérgicos, fenômeno que parece não ocorrer na amígdala basolateral. / The cholinergic muscarinic system plays a central role in learning and memory, yet little is known about the specific roles of each receptor subtype. Muscarinic toxins (MTs) from Dendroaspis snakes venom are selective for muscarinic receptor subtypes. The hippocampus M4 subsystem, for instance, was shown to take part in the modulation of memory consolidation and retrieval. The memory phenomenon, by its turn, is being recently unveiled as a much more complex set of processes than previously thought, encompassing post-retrieval situations such as reconsolidation and extinction, each with its particular mechanisms. The scope of this study is to explore the involvement of the hippocampal cholinergic M4 muscarinic subsystem on the consolidation, retrieval, reconsolidation and extinction of memories, moreover to investigate the role of M4 subsystem of basoalteral amygdala on the consolidation and reconsolidation. Last works shown a different modulatory role of hippocampal M4 receptors about consolidation and retrieval processes, therefore This work aims to investigate the muscarinic cholinergic modulation at hippocampal circuits by M4 receptors, along different periods of memory consolidation for an inhibitory avoidance task, and verify if the change effect of pre-test MT3 are dependent of mRNA synthesis. MT3, a very selective M4 antagonist, and the less selective antagonist scopolamine were infused bilaterally into the rat CA1 area, and their effects studied in a contextual fear conditioning task (CFC) and inhibitory avoidance task (IA). When infused immediately after training, both treatments caused disruption of the memory consolidation, however, only MT3 was effective when infused before the test session, and the effect, was the opposite, i.e., memory facilitation. Moreover, only MT3 enhanced the reconsolidation of CFC following its infusion into the hippocampus or blocked its extinction. Infused into the basolateral amygdala, muscarínic antagonists shown an amnestic effect about the consolidation and reconsolidation of CFC memory. In the IA experiments, MT3 infused immediately after training was amnestic upon the consolidation process, while an “opposite effect” –memory facilitation– was observed in the 90-180min time window. The DRB was amnestic too upon the consolidation, showing that the transcriptional process is essential to the memory. Moreover, the DRB reverted the facilitatory effect of pre-test MT3. These results suggest an endogenous positive modulation of the cholinergic muscarinic system present during the consolidation or the extinction of an aversive memory, but an opposite action during memory retrieval or memory reconsolidation. Moreover, these results suggest that M4 receptors are likely expressed at different hippocampal localizations where they underlie different processes and plasticity events, may be over expressed upon glutamatergic excitatory cells.