Craniofacial development is a tightly regulated event that requires expression of many genes at a precise space-temporal specificity. Interference in the regulation of such genes and their pathways is known to lead to abnormal phenotypes affecting the face and cranium. In this manner, regulation of these pathways is further complicated by interaction between genetic and environmental factors such that disturbance to either may result in craniofacial malformation, as orofacial clefts. Despite several at-risk loci have been identified, they do not completely explain the high heritability observed for the orofacial clefts and many questions remain open. For example, concerning the orofacial clefts transcriptome, the gene pathways which may be dysregulated and the affected cellular processes are still poorly understood. Further, if there is gene expression dysregulation in orofacial clefts, the causes leading to that need to be elucidated, such as the investigation of epigenetic factors. Also, since the multifactorial contribution makes environment relevant to this malformation, epigenetic and epigenomic differences in orofacial clefts should clarified. At last, rare syndromic forms of orofacial clefts with still unknown molecular cause and mechanisms should be elucidated in order to better understand craniofacial development and their impact in non-syndromic forms. Therefore, the main objective of this study was to investigate the molecular mechanisms involved in the aetiology of orofacial clefts, which was focused in gene expression and epigenetic analysis in non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P) as well as genetic, gene expression, animal modelling and epigenetics in Richieri-Costa-Pereira Syndrome (RCPS), a rare autosomal recessive syndromic form of orofacial cleft. We found significant transcriptome differences in NSCL/P in comparison to controls, revealing the BRCA1-dependent DNA damage repair pathway as compromised in NSCL/P cells leading to DNA damage accumulation. Next, we studied the potential of DNA methylation in those cells and found a slight but significant increase of BRCA1 promoter DNA methylation in NSCL/P cells and a distinct DNA methylation distribution, point to a possible epigenetic contribution in this phenomenon. We also evaluated the contribution of DNA methylation in 8q24.21 region, one of the most replicated regions in NSCL/P Genome-wide association studies and found no significant differences in our sample. Attempting to investigate DNA methylation in NSCL/P in an epigenomic level, we analysed methylomes and found 578 methylation variable positions in NSCL/P, highly enriched in regulatory regions and in relevant gene pathways for craniofacial development as Epithelial-Mesenchymal Transition pathway. We also studied effect of DNA methylation in familial NSCL/P displaying incomplete penentrance and found a significant increase of CDH1 promoter hypermethylation in penetrant cases in comparison to non-penetrants. Finally, by the use of different sequencing strategies and identity-by-descent analysis we mapped the mutation region of RCPS to EIF4A3 5\'UTR/promoter and found a complex structure of expanded repeats in RCPS patients leading to EIF4A3 downregulation. We were also able to validate the phenotypes using an animal modelling strategy in zebrafish. Because those repeats are CG rich, we investigated whether they were submitted to DNA hypermethylation in RCPS patients as a cause for EIF4A3 hypomorphism, however we found no evidence of methylation increase in RCPS. In conclusion, we were able to associate dysregulated pathways to NSCL/P susceptibility and DNA methylation differences to both non-familial and familial NSCLP. Besides, we were able to identify the genetic cause of RCPS, which now can be molecularly diagnosed. Altogether, our results add to the understanding of craniofacial development and the aetiology of orofacial clefts / O desenvolvimento craniofacial é um evento finamente regulado que requer a expressão de muitos genes em uma precisão espaço-temporal específica. A interferência na regulação de tais genes e suas respectivas vias é sabidamente causadora de fenótipos que afetam a face e o crânio. Neste sentido, a regulação destas vias é decorrente da interação entre fatores genéticos e ambientais, de tal forma que a perturbação de quaisquer destes fatores pode resultar em malformações craniofaciais, como as fissuras orofaciais. Apesar dos muitos loci de risco já identificados, estes não explicam completamente a alta herdabilidade observadas nas fissuras orofaciais e muitas questões permanecem em aberto. Por exemplo, em relação ao transcriptoma em fissuras orofaciais, as vias genéticas que podem estar desreguladas, assim como processos celulares afetados em decorrência, são ainda pouco compreendidos. Além disso, se há desregulação na expressão de genes em fissuras orofaciais, as causas que levam a essas diferenças necessitam ser elucidadas, como, por exemplo, por meio da investigação de fatores epigenéticos. Também, uma vez que o componente multifatorial torna a influência do ambiente relevante para esta malformação, diferenças epigenéticas e epigenômicas nas fissuras orofaciais devem ser melhor compreendidas. Por fim, formas raras e sindrômicas de fissuras orofaciais sem elucidação de causa moleculares devem ser estudadas para que melhor se compreenda o desenvolvimento craniofacial e o impacto destes mecanismos moleculares em formas não-sindrômicas. Portanto, nosso objetivo principal neste estudo foi investigar os mecanismos moleculares envolvidos na etiologia das fissuras orofaciais, com o foco na análise de expressão gênica e epigenètica em fissuras de lábio-palatinas não-sindrômicas (FL/P NS) e também o estudo genético, de expressão gênica, modelagem animal e epigenética na Síndrome de Richieri-Costa-Pereira (RCPS), uma forma sindrômica e autossômica recessiva de fissura orofacial. Nós encontramos diferenças significantes no transcriptoma de FL/P NS em comparação com controles, que revelaram o comprometimento da via do BRCA1 no reparo ao dano de DNA e o acúmulo de dano de DNA em células FL/P NS. Em seguida, nós estudamos o potencial da metilação de DNA nestas células e encontramos um pequeno, porém significante, aumento de metilação de DNA no promotor do BRCA1 e uma distribuição diferente de metilação, apontando para uma possível contribuição epigenética na desregulação do gene. Nós também avaliamos a contribuição da metilação de DNA na região 8q24.21, uma das mais associadas às FL/P NS por meio de Genome-wide association studies, porém não encontramos diferenças significantes na nossa amostra. Com o intuito de investigar a metilação de DNA em FL/P NS em uma escala epigenômica, nós analisamos o perfil de metilomas e encontramos 578 sítios diferencialmente metilados nas FL/P NS, altamente enriquecidos em regiões regulatórias e em vias relevantes para o desenvolvimento craniofacial como a via de Transição Epitélio-Mesenquimal. Nós também estudamos o efeito da metilação de DNA em casos famílias de FL/P NS com penetrância incompleta e encontramos um aumento significativo de metilação do promotor do CDH1 nos casos penetrantes em comparação aos não-penetrantes. Por último, por meio de diferentes estratégias de sequenciamento e análise de segregação de haplótipos nós mapeamos a mutação de RCPS na região 5\'UTR/promotor do EIF4A3 e encontramos uma estrutura complexa de expansão de repetições nos pacientes RCPS, ocasionando a diminuição da expressão do EIF4A3. Nós também reproduzimos fenótipos comparáveis aos da RCPS por meio de modelo animal em zebrafish. Uma vez que tais repetições são ricas em CG, nós investigamos se estas poderiam ser submetidas à metilação de DNA em pacientes RCPS como uma causa para a redução dos transcritos do EIF4A3, porém não encontramos evidências de aumento de metilação em RCPS. Em conclusão, nós conseguimos associar vias gênicas desreguladas à susceptibilidade para as FL/P NS e diferenças de metilação de DNA tanto em casos familiais como não-familiais de FL/P NS. Além disso, identificamos a causa genética de RCPS, sendo que a síndrome pode ser agora diagnosticada molecularmente. Em conjunto, nossos resultados adicionam ao conhecimento do desenvolvimento craniofacial e na etiologia das fissuras orofaciais

Dentre as manifestações clínicas observadas em pacientes sépticos, as disfunções neurológicas são, provavelmente, as de fisiopatologia mais obscura e pobremente explorada, o que consequentemente as torna de difícil entendimento e tratamento médico. Adicionalmente, estudos epidemiológicos indicam que a síndrome séptica é mais frequente e mais letal em pacientes idosos. Nesse contexto, este trabalho objetivou comparar os efeitos da sepse, induzida pelo modelo de ligadura e perfuração cecal, no encéfalo de ratos jovens e idosos por meio da análise da expressão gênica de larga escala (transcriptoma), a fim de averiguar como as alterações no padrão de expressão podem estar relacionadas a disfunções neurológicas. Os resultados deste estudo indicaram a diminuição da expressão dos genes Bcl-3, S100A8 e uridina fosforilase 1, bem como o aumento da expressão de Stefin A3, sendo tais efeitos característicos das manifestações comuns da sepse no sistema nervoso central, independentemente da idade dos animais; por outro lado, a diminuição da expressão do gene da haptoglobina foi observada apenas nos animais idosos com sepse. De forma geral, na comparação entre animais idosos e jovens, os resultados desta pesquisa apontaram que animais idosos apresentam uma quantidade menor de genes modificados pela sepse, o que sugere menor capacidade de ativar mecanismos neuroprotetores / Among the clinical manifestations observed in septic patients, the neurological dysfunctions are probably the most obscure and poorly explored pathophysiology, which consequently makes them difficult to understand and to treat. Additionally, epidemiological studies indicate that septic syndrome is more frequent and more lethal in elderly patients. In this context, this article is aimed at comparing the effects of sepsis, induced by the ligature model and cecal perforation, on the brain of young and elderly rats by means of the analysis of the large scale gene expression (transcriptome), in order to investigate how the changes in this expression may be related to neurological dysfunctions. The results of this study indicated decreased expression of the Bcl-3, S100A8 and uridine phosphorylase 1 genes, as well as increased expression of Stefin A3, these effects being characteristic of the common manifestations of central nervous system sepsis regardless of the age of the animals; on the other hand, decreased haptoglobin gene expression was observed only in the elderly animals with sepsis. In general, in the comparison between old and young animals, the results of this research indicated that elderly animals present a smaller amount of genes modified by sepsis, which suggests a smaller capacity to activate neuroprotective mechanisms

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura agrícola, sendo hospedeira de vários patógenos, incluindo o fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, agente causal do carvão. A doença reduz a produtividade das lavouras de cana e a qualidade de seus produtos, sendo reconhecida pelo desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote, onde os teliósporos são produzidos. O objetivo deste estudo foi analisar o transcritoma da interação cana-de-açúcar - S. scitamineum, visando a identificação de genes do hospedeiro diferencialmente expressos em resposta à infecção fúngica. Gemas da variedade tolerante \'RB92-5345\' foram inoculadas com S. scitamineum e mantidas em casa de vegetação para a coleta das amostras, em dois momentos: 120 h após a inoculação, e no momento da emissão do chicote, aos 200 dias após a inoculação. Foram construídas 12 bibliotecas com base na abordagem RNAseq. Três estratégias computacionais foram utilizadas nas etapas de mapeamento e análise da expressão diferencial de genes da cana: (i) STAR e DESeq, tomando como referência o genoma do sorgo; (ii) Bowtie 2 e DESeq, e (iii) CLC Genomics Workbench, tomando como referência as sequências codificadoras (CDS) do sorgo. Diagramas de Venn foram construídos para identificar genes diferencialmente expressos comuns às três estratégias computacionais, aumentando a acurácia das análises. Para a anotação, foi usada a ferramenta BLAST2GO. Foram obtidos 225 milhões de reads; dentre os 185 milhões usados no mapeamento, 66% foram mapeados em genes e 51% nas CDS. Aproximadamente 77% dos genes e 87% das CDS mapeados apresentaram atividade transcricional (pelo menos um read mapeado), sob as condições do experimento, em ambos os momentos da interação. Um total de 596 e 2.148 genes diferencialmente expressos foram identificados nas respostas iniciais e tardias à infecção, respectivamente; para 79% deles foi possível atribuir uma função. Pelas intersecções, 41 (resposta inicial) e 206 (resposta tardia) genes foram comuns às três estratégias. Sugere-se que a planta percebe o patógeno no início da interação, porém o fungo é capaz de suprimir a resposta de defesa vegetal. Propõe-se que há uma reprogramação da expressão gênica defesa-orientada, favorecendo o desenvolvimento da planta, mesmo com a doença instalada. A expressão de genes relacionados à resistência, às vias de hormônios e com a formação da parede celular (além de inibidores de proteínas fúngicas) sugerem que a planta se empenha drasticamente para sobreviver após 200 dias de interação. Decifrando os perfis do transcritoma da cana na interação com S. scitamineum, este trabalho deve contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ao carvão. / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop, and hosts several pathogens, including the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut. The disease reduces the sugarcane crop yield and the quality of its products, and is recognized by the development of a whip-like structure, where teliospores are produced. The objective of this study was to analyze the transcriptome of sugarcane - S. scitamineum interaction and to identify differentially expressed genes from the host in response to fungal infection. Buds of the tolerant variety \'RB92-5345\' were inoculated with S. scitamineum and maintained in a greenhouse for two sampling interaction moments: 120 h after inoculation, and at the moment of the whip emission, 200 days after inoculation. Twelve libraries were constructed based on RNAseq approach. Three computational strategies were used in the mapping step and differential expression analysis of sugarcane genes: (i) STAR and DESeq, using as reference the sorghum genome; (ii) Bowtie 2 and DESeq, and (iii) CLC Genomics Workbench, using as reference the coding sequences (CDS) from sorghum. Venn diagrams were created to identify differential expressed genes that were common to the three computational strategies, thus increasing the analysis accuracy. For annotation, the BLAST2GO tool was used. We have obtained 225 million reads; out of the 185 million reads used for mapping, 66% were mapped to genes and 51% to CDS. Approximately 77% and 87% of the mapped genes and CDS respectively showed transcriptional activity (at least one read was mapped) under the experimental conditions at both interaction moments. A total of 596 and 2,148 differentially expressed genes were identified at early and late responses to the infection, respectively; it was possible to attribute function to 79% of them. Through intersectioning, 41 (early response) and 206 (late response) genes were found to be common to the three strategies. It is suggested that the plant recognizes the pathogen at the beginning of interaction period, though the fungal is able to suppress the host defense response. It is also proposed that a defense-oriented transcriptional reprogramming takes place, supporting plant development even with the disease setting. The expression of genes related to resistance, hormone pathways, and cell wall formation (as well as inhibitors of fungal proteins) suggests that the plant makes exceptional efforts to survive after 200 days of interaction. Deciphering the sugarcane transcriptome profile during the interaction with S. scitamineum, this study should contribute to a better understanding of the resistance mechanisms to the smut.

Ecossistemas marinhos e estuarinos são o destino final de muitos contaminantes, e a ecotoxicologia ainda enfrenta a falta de organismos modelo para esses ambientes. Para desenvolver e apresentar um organismo teste adequado para ser utilizado em estudos de laboratório e campo, métodos para o cultivo, endpoints e biomarcadores devem ser avaliados. O anfípode marinho Parhyale hawaiensis é um modelo para estudos de biologia evolutiva e embrionária, é mundialmente distribuído e fácil de manipular em laboratório e consequentemente um modelo interessante para estudos ecotoxicológicos. O objetivo desse trabalho é padronizar condições de cultivo, teste de toxicidade, e desenvolver biomarcadores no anfípode P. hawaiensis e aplicá-los para avaliar os efeitos de nanopartículas metálicas na exposição via alimentação. As condições de cultivo foram estabelecidas em água salina reconstituída (salinidade 30 ± 2), temperatura de 24 ± 2 oC, fotoperíodo de 12-12h luz/escuro, coral triturado como substrato, alimentação diária com ração de peixe, troca de água parcial e aeração constante. As condições de teste compreendem a utilização de microplaca de 96-poços, organismos <7 dias, um organismo por poço com 200 &#181;L de solução por 96 h. Zinco, cobre, prata, cádmio e amônia foram selecionados como substância teste e a sensibilidade de P. hawaiensis foi similar e dentro da faixa de outros anfípodes marinhos. As condições para expressão gênica em P. hawaiensis foram desenvolvidas para o gene de referência 18S, dois genes de metalotioneínas (MT) e dois genes de glutationa S-transferase (GST). Entretanto, os genes selecionados não foram diferencialmente expressos nas condições testadas. Sendo assim, a análise da expressão gênica global, RNA-seq, foi realizada com organismos adultos alimentados por 7 dias com alimento contaminado com nanopartículas de prata (Ag-NPs), AgCl e controle. A análise da expressão gênica global (RNA-seq) foi conduzida com sucesso e destacou diferenças na resposta entre machos e fêmeas, bem como nos tratamentos com AgCl e Ag-NP. A análise comparativa revelou genes comuns entre as duas formas de Ag estudadas, e mostrou respostas diferentes no tratamento com Ag-NP, portanto, efeitos adversos diferentes são esperados após a exposição à alimentação, e os genes diferencialmente expressos podem ser usados como potenciais biomarcadores. Os resultados demonstraram que P. hawaiensis é um bom modelo para testes de toxicidade com um protocolo miniaturizado e o RNA-seq foi aplicado com sucesso para investigar as diferenças entre a exposição via alimentação com AgCl e Ag-NP e pode revelar potenciais biomarcadores. Além disso, este estudo desenvolveu protocolos e fornece informações moleculares que podem ser usadas em estudos futuros com P. hawaiensis. / Marine and estuarine ecosystems are the final destinations of many contaminants and ecotoxicology still faces the lack of model organisms for these environments. To develop and present a suitable test organism to be used in laboratory and field studies, methods for husbandry, ecotoxicity endpoints and biomarkers should be evaluated. The marine amphipod Parhyale hawaiensis is already a model for development and evolutionary studies, it is worldwide spread and easy to handle in the laboratory and so on an interesting model for ecotoxicology. The aim of this work is to standardize husbandry conditions, toxicity testing, and to develop molecular biomarkers in P. hawaiensis and apply them to evaluate the effect of metal nanoparticles in dietary exposure. The conditions for culturing were established in reconstituted seawater (30 ± 2 salinity), 24 ± 2 oC temperature, photoperiod 12-12 h light/dark, crushed coral as substrate, daily feeding with fish food, partial water exchange and constant aeration. Testing conditions comprised 96-well microplate, <7 days age organisms, one organism in each well containing 200 &#181;L of exposure media for 96 h. Zinc, copper, silver, cadmium and ammonia were selected as toxicants and sensitivity of P. hawaiensis were within the range of other marine amphipods. Gene expression conditions for P. hawaiensis were develop for the reference gene 18S, two metallothioneins (MT) and two glutathione-S-transferase (GST). However, selected target genes, analyzed by RT-qPCR, were not successful to detect differences in our treatment conditions. Thus, global gene expression analysis, RNA-seq, was conducted with adult organisms fed for 7 days to a contaminated food with silver nanoparticles (Ag-NPs), AgCl and control. Results highlighted differences between males and female\'s toxicity responses as well as AgCl and Ag-NP treatments. Comparison analysis revealed common genes expressed in both Ag forms, but also showed differences in Ag-NP treatment with both up and down regulated genes. Analysis are underway to better understand toxicity responses pathways. These results anticipate different responses to both Ag forms investigated, therefore different adverse effects are expected after feeding exposure to AgCl and Ag-NP and significative genes can be used as potential biomarkers. Our results demonstrated that P. hawaiensis is a good model for ecotoxicity tests with a miniaturized protocol and RNA-seq were successful applied to investigate the differences between AgCl and Ag-NP feeding exposure and could reveal promising biomarkers. Moreover, this study developed protocols and provide molecular information that can be used in future studies with P. hawaiensis.

As malformações craniofaciais (MCFs) compreendem uma vasta e heterogênea gama de doenças que envolvem o acometimento de tecidos do crânio e da face, sendo que indivíduos afetados enfrentam morbidade e deficiências funcionais relevantes. O entendimento da etiologia das MCFs é de extrema importância, pois poderá levar ao desenvolvimento ou melhoria de estratégias preventivas e terapêuticas. As MCFs são oriundas principalmente de distúrbios no desenvolvimento da crista neural cranial e seus derivados mesenquimais. Neste contexto, modelos baseados em células derivadas de crista neural são de grande potencial para o entendimento das MCFs, já que estudos funcionais podem ser realizados nestas células para averiguar fenótipos diretamente relacionados às doenças. Neste trabalho, nós empregamos esta estratégia na investigação de três tipos de MCFs: fissuras labiopalatinas não sindrômicas (FLP NS), síndrome de Richieri-Costa-Pereira (SRCP) e síndrome de Treacher Collins (STC). As FLP NS foram investigadas por meio de ensaios transcriptômicos e funcionais em células-tronco de polpa de dente decíduo, que são células mesenquimais adultas derivadas de crista neural cranial. Identificamos uma assinatura de expressão gênica específica às FLP NS, com desregulação de uma rede gênica responsável pelo reparo de quebras duplas no DNA, resultando no acúmulo deste tipo de lesão em células de indivíduos afetados pela doença. Estes achados revelam um novo mecanismo patogênico para as FLP NS e corroboram observações prévias que sugeriam sobreposição de etiologias entre esta doença e o câncer. A SRCP e a STC foram investigadas com o uso de uma nova metodologia para a geração de células de crista neural a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (induced pluripotent stem cells; iPSCs) para recapitular o desenvolvimento craniofacial. Realizamos triagem de fenótipos celulares e identificamos desregulação de diferenciação osteogênica em células mesenquimais derivadas de crista neural de pacientes com SRCP, o que foi corroborado por ensaios de RNA de interferência. Além disso, mostramos que células mesenquimais de crista neural de pacientes com STC apresentam apoptose elevada aliada a alterações durante diferenciação osteogênica e condrogênica. Estes resultados revelam que células mesenquimais de crista neural estão alteradas na SRCP e STC, colaborando para o esclarecimento dos mecanismos patogênicos responsáveis por estas síndromes. Assim sendo, nós evidenciamos a aplicabilidade da modelagem de MCFs por meio de células oriundas da crista neural, e esses achados inéditos contribuirão para um melhor entendimento da etiologia das MCFs, e servem de base para futuras estratégias de pesquisa na área de doenças craniofaciais / Craniofacial malformations (CFMs) comprise a large and heterogeneous group of disorders in which tissues of the skull and face are affected. Affected subjects suffer from significant functional impairment and morbidity, and understanding the aetiology of these disorders is of great importance, as it may lead to the development or improvement of preventive and therapeutic strategies in the future. CFMs are largely considered to arise from developmental disturbances in the cranial neural crest and its cranioskeletal and cartilaginous mesenchymal derivatives. Neural crest-derived cell models have the potential to provide invaluable insight into the pathogenesis of CFMs, as functional studies can be to assess phenotypes in disease-relevant cell lineages. In this work, we applied this strategy to investigate three craniofacial disorders: non-syndromic cleft lip/palate (NSCL/P), Richieri-Costa-Pereira syndrome (RCPS), and Treacher Collins syndrome (TCS). NSCL/P was investigated through transcriptomic and functional assays on stem cells from human exfoliated deciduous teeth, which are neural crest-derived, adult mesenchymal cells. We identified a NSCL/P-specific dysregulated transcriptional signature involving a gene network responsible for DNA double-strand break repair that results in accumulation of DNA damage in patients\' cells. These findings revealed a novel pathogenetic mechanism for NSCL/P and support previous observations pointing towards an aetiological overlap between this disease and cancer. RCPS and TCS were investigated with the use of a novel approach to generate neural crest cells from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) as a means to recapitulate craniofacial development. We demonstrated that RCPS and TCS somatic cells can be successfully used to generate iPSCs and iPSC-derived neural crest cells and their mesenchymal derivatives. Phenotype screening showed that RCPS neural crest-derived mesenchymal cells display dysregulation of osteogenic differentiation, which was supported by confirmatory knockdown assays. Further, we report elevated apoptosis in TCS neural crest-derived mesenchymal cells, which was allied to alterations in chondrogenic and osteogenic differentiation. These results will aid in clarifying the pathogenic mechanism determining RCPS and TCS, revealing that neural crest mesenchymal cells are altered in these syndromes. In conclusion, we attested the applicability of NC-derived cell types to provide clues regarding the pathogenetic mechanisms leading to CFMs, and these novel findings will aid in dissecting the aetiology of CFMs by providing grounds to direct future efforts in craniofacial research

Dentre as manifestações clínicas observadas em pacientes sépticos, as disfunções neurológicas são, provavelmente, as de fisiopatologia mais obscura e pobremente explorada, o que consequentemente as torna de difícil entendimento e tratamento médico. Adicionalmente, estudos epidemiológicos indicam que a síndrome séptica é mais frequente e mais letal em pacientes idosos. Nesse contexto, este trabalho objetivou comparar os efeitos da sepse, induzida pelo modelo de ligadura e perfuração cecal, no encéfalo de ratos jovens e idosos por meio da análise da expressão gênica de larga escala (transcriptoma), a fim de averiguar como as alterações no padrão de expressão podem estar relacionadas a disfunções neurológicas. Os resultados deste estudo indicaram a diminuição da expressão dos genes Bcl-3, S100A8 e uridina fosforilase 1, bem como o aumento da expressão de Stefin A3, sendo tais efeitos característicos das manifestações comuns da sepse no sistema nervoso central, independentemente da idade dos animais; por outro lado, a diminuição da expressão do gene da haptoglobina foi observada apenas nos animais idosos com sepse. De forma geral, na comparação entre animais idosos e jovens, os resultados desta pesquisa apontaram que animais idosos apresentam uma quantidade menor de genes modificados pela sepse, o que sugere menor capacidade de ativar mecanismos neuroprotetores / Among the clinical manifestations observed in septic patients, the neurological dysfunctions are probably the most obscure and poorly explored pathophysiology, which consequently makes them difficult to understand and to treat. Additionally, epidemiological studies indicate that septic syndrome is more frequent and more lethal in elderly patients. In this context, this article is aimed at comparing the effects of sepsis, induced by the ligature model and cecal perforation, on the brain of young and elderly rats by means of the analysis of the large scale gene expression (transcriptome), in order to investigate how the changes in this expression may be related to neurological dysfunctions. The results of this study indicated decreased expression of the Bcl-3, S100A8 and uridine phosphorylase 1 genes, as well as increased expression of Stefin A3, these effects being characteristic of the common manifestations of central nervous system sepsis regardless of the age of the animals; on the other hand, decreased haptoglobin gene expression was observed only in the elderly animals with sepsis. In general, in the comparison between old and young animals, the results of this research indicated that elderly animals present a smaller amount of genes modified by sepsis, which suggests a smaller capacity to activate neuroprotective mechanisms

O transtorno obsessivo compulsivo (TOC) é um transtorno psiquiátrico, caracterizado pela presença de obsessões e / ou compulsões. Estudos de neuroimagem funcional indicam que o TOC é um distúrbio heterogêneo relacionado ao circuito talâmico cortico-estriatal (CSTC) e as áreas que compõem este circuito incluem o nucleus accumbens (NAC), putâmen (PT), núcleo caudado (CN), córtex orbitofrontal (OFC) e o córtex cingulado anterior (ACC). As principais características do CSTC são a inervação do córtex frontal em direção ao estriado e cada pequeno circuito possui características específicas: afetiva/límbica, cognitivo e associativo dorsal e cognitivo ventral e motor. Neste trabalho comparamos o transcriptoma de casos e controles das três áreas estriatais (CN, NAC e PT) separadamente de tecido cerebral post mortem e as redes de co-expressão do striatum e de dois circuitos envolvidos no transtorno. Os resultados mostraram que diferentes processos biológicos, bem como a desregulação da conectividade de rede, são específicos para cada região do estriado e estão de acordo com o modelo tripartido do estriado e contribuem de diferentes formas para a fisiopatologia do TOC. Especificamente, a regulação dos níveis de neurotransmissores, processo pré-sináptico envolvido na transmissão sináptica química foram compartilhados entre NAC e PT. A resposta celular ao estímulo químico, resposta ao estímulo externo, resposta à substância orgânica, regulação da plasticidade sináptica e modulação da transmissão sináptica foram compartilhadas entre CN e PT. A maioria dos genes que possuem variantes comuns e / ou raras previamente associadas ao TOC que são diferencialmente expressas ou que fazem parte de módulos de co-expressão menos preservados em nosso estudo também sugerem especificidade de cada região estriatal. Os módulos de co-expressão preservados e menos preservados nos circuitos afetivo e cognitivo ventral corroboram com as assinaturas transcricionais de cada área e de cada circuito no TOC e nos controles. Este é o primeiro trabalho com a proposta de avaliar a expressão gênica em áreas estriatais, analisadas individualmente, envolvidas com o TOC, bem como as redes de co-expressão do estriado e dos circuitos individualmente / Obsessive compulsive disorder (OCD) is a psychiatric disorder, characterized by the presence of obsessions and/or compulsions. Functional neuroimaging studies indicate that OCD is a heterogeneous disorder related the cortical-striatal thalamic circuitry (CSTC) and the areas that compose this circuitry include the nucleus accumbens (NAC), putamen (PT), caudate nucleus (CN), orbitofrontal cortex (OFC) and subgenual cingulate gyri (ACC). The main characteristics of CSTC is the innervation of the frontal cortex in direction of the striatum and each small circuitries have specific characteristics in the affective, dorsal cognitive and ventral cognitive motor. In this work we compared the cases and controls transcriptome of the three striatal areas (CN, NAC and PT) separately from post mortem brain tissue and the co-expression networks of the striatum and of two circuits involved in the disorder. Results showed that different biological process as well as networks connectivity deregulation were specific for each striatum region according to the striatum tripartite model and contribute in different ways to OCD pathophysiology. Specifically, regulation of neurotransmitter levels, presynaptic process involved in chemical synaptic transmission were shared between NAC and PT. Cellular response to chemical stimulus, response to external stimulus, response to organic substance, regulation of synaptic plasticity, and modulation of synaptic transmission were shared between CN and PT. Most genes harboring common and/or rare variants previously associated with OCD that are differentially expressed or part of a least preserved co-expression modules in our study also suggest striatum sub regions specificity. The co-expression modules preserved and least preserved in affective and ventral cognitive circuitry corroborate with transcriptional signatures of each area and each circuitry in OCD and controls. This is the first work with the proposal to evaluate the gene expression in striatum areas individually, involved with OCD as well evaluate the coexpression networks in striatum and each circuitry

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-30T11:53:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ReconstrucaoModelagemSilico.pdf: 1615944 bytes, checksum: fd70334c4cf9d3608beb1b9294e63cdf (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-30T16:33:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ReconstrucaoModelagemSilico.pdf: 1615944 bytes, checksum: fd70334c4cf9d3608beb1b9294e63cdf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T16:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ReconstrucaoModelagemSilico.pdf: 1615944 bytes, checksum: fd70334c4cf9d3608beb1b9294e63cdf (MD5) Previous issue date: 2016-04-04 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A modelagem matemática in silico baseada em restrições é uma abordagem adotada pela Biologia de Sistemas para analisar redes metabólicas. A bactéria Gram-positiva Exiguobacterium antarticum B7 é um extremófilo capaz de sobreviver em ambientes frios como gelo glacial e permafrost. A capacidade de adaptação ao frio desses micro-organismos vem despertando grande interesse biotecnológico. Um fator importante para o entendimento do processo de adaptação ao frio está relacionado à modificação química de ácidos graxos que constituem a membrana celular das bactérias psicotróficas. A finalidade é manter a fluidez da membrana para evitar o congelamento da bactéria. Neste trabalho, a via metabólica de biossíntese de ácidos graxos da bactéria E. antarticum B7 foi reconstruída a partir do genoma anotado disponível. As ferramentas de software KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) e RAST (The Rapid Annotation Server) foram utilizadas para gerar o modelo preliminar da rede. O passo seguinte foi a etapa de cura manual baseada na combinação de informações genômicas, bioquímicas e fisiológicas disponíveis em diversos bancos de dados e literatura especializada. Durante este processo, as enzimas FabZ e DesK, responsáveis por adicionar insaturações na cadeia carbono-carbono ao longo da síntese de ácidos graxos, foram identificadas no genoma, entretanto de forma truncada. O fluxoma da via metabólica foi definido com a descrição das rotas das principais reações, desde o metabólito de entrada, o Acetil-CoA, até o produto final, o ácido Hexadecenóico. A modelagem computacional foi feita com o uso do software MATLAB® juntamente com toolboxes e funções específicos para biologia de sistemas. A quantificação de metabólitos produzidos pela via foi realizada por meio do método baseado em restrições Análise de Balanço de Fluxos (ABF). Para avaliar a influência da expressão gênica na análise do fluxoma, o método ABF foi calculado usando os valores de log2FC obtidos na análise transcriptoma a 0ºC e 37ºC. A via de biossíntese de ácido graxos possui um total de 13 rotas identificadas pelo método Modo Elementar, quatro das quais apresentam caminhos para a produção de ácido hexadecenóico. A via reconstruída demonstrou a capacidade da E. antarcticum B7 em produzir moléculas de ácidos graxos. Sob a influência do transcriptoma, o fluxoma foi alterado, estimulando a produção de cadeia curta em ácidos graxos. Os modelos obtidos contribuem para um melhor entendimento da adaptação bacteriana a ambientes frios. / Mathematical modeling in silico based restrictions is an approach adopted by systems biology to analyze metabolic networks. The Gram-positive bacterium Exiguobacterium antarticum B7 is an extremophile organism able to survive in cold environments as glacial ice and permafrost. The ability of these microorganisms of adaptation to cold attracts great biotechnological interest. An important factor for the understanding of cold adaptation process is related to the chemical modification of fatty acids constituting the cell membrane of psicotrophic bacteria in order to maintain membrane fluidity to avoid freezing ofthe bacteria. In this work, the metabolic pathway of fatty acid biosynthesis of the bacterium E. antarticum B7 was rebuilt from its annotated genome. The software tools KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) and RAST (The Rapid Annotation Server) were used to generate a preliminary network model. The next step was to cure manually the genomic, biochemical and physiological informations available in different databases and specific literature. During this process, the FabZ and DesK enzymes responsible for adding carbon-carbon unsaturations in the fatty acid chain during synthesis have been identified in the genome, though in a truncated form. The fluxome metabolic pathway was defined, describing the routes of the main reactions since the first monomer, Acetyl-CoA, to the final product, the Hexadecenoic acid. A computational modeling was done using the software MATLAB® with toolboxes and specific tools for systems biology. The quantification of metabolites produced via was performed by the method constraint-based Flux Balance Analysis (FBA). To evaluate the influence of the gene expression in the fluxome analysis, the FBA method was also calculated using the log2FC values obtained in the transcriptome analysis at 0ºC and 37ºC. The fatty acid biosynthesis pathway showed a total of 13 elementary flux modes, four of which showed routes for the production of hexadecenoic acid. The reconstructed pathway demonstrated the capacity of E. antarcticum B7 to produce fatty acid molecules. Under the influence of the transcriptome, the fluxome was altered, promoting the production of short-chain fatty acids. The calculated models contributes to better understand the bacterial adaptation at cold environments.

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: A irradiação pelo laser de baixa intensidade (LBI) tem sido utilizada como um método nãoinvasivo para promover ou acelerar a capacidade de regeneração muscular. No entanto, os mecanismos moleculares regulatórios pelos quais o LBI exerce esses efeitos, permanecem em grande parte desconhecidos. Nosso objetivo foi realizar uma análise de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) em mioblastos C2C12 após LBI. Foram realizadas as taxas de viabilidade, migração, proliferação e os dados de RNA-Seq dos mioblastos C2C12, identificando 514 genes diferencialmente expressos após LBI. Em seguida, uma análise de ontologia genética e das vias dos genes diferencialmente expressos revelaram transcritos relacionadas ao ciclo celular, biogênese ribossômica, resposta ao estresse, migração celular, estrutura morfológica e proliferação de células musculares. Após, cruzamos nossos dados de RNA-Seq com dados de transcriptomas disponíveis em base de dados públicas, com dados de diferenciação miogênica que mostraram um total de 42 transcritos sobrepostos (mioblastos vs miotubos). Este conjunto de transcritos compartilhados mostrou que os mioblastos irradiados pelo LBI, possuem um perfil transcricional semelhante ao de miotubo, agrupando-se distante do perfil transcricional dos mioblastos. Concluíndo, revelamos pela primeira vez que LBI, induz a uma expressão de um grande conjunto de RNAm, que codificam proteínas reguladoras do ciclo celular que podem controlar a proliferação e diferenciação de mioblastos em mio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Low-level laser irradiation (LLLT) has been used as a non-invasive method to promote or accelerate muscular regeneration capability. However, the regulatory molecular mechanisms by which LLLT exerts these effects remain largely unknown. Our goal was to perform a RNAsequencing (RNA-Seq) analysis in C2C12 myoblasts after LLLT. C2C12 myoblasts viability, migration, proliferation and RNA-Seq were performed, identifying 514 differentially expressed genes after LLLT. Next, gene ontology and pathway analysis of the differentially expressed genes revealed transcripts among categories related to cell cycle, ribosome biogenesis, response to stress, cell migration, morphological structure and muscle cell proliferation. After, we intersected our RNA-Seq data with transcriptomes publicly available myogenic differentiation data that showed a total of 42 overlapping transcripts (myoblasts vs myotube). This set of shared transcripts showed that the LLLT-myoblasts have a myotube-like profile, clustering away from the myoblast profile. In conclusion, we revealed for the first time that LLLT induces the expression a large set of mRNAs encoding for cell cycle regulatory proteins that may control myoblasts proliferation and differentiation into myotubes. Importantly, these set of mRNA revealed a myotube-like transcriptional profile and provided new insights to the understanding of the specific molecular changes underlying the effects of LLLT irradiation on skeletal muscle cells. / Doutor

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2016-10-04T12:02:05Z No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-04T17:30:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-04T17:30:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T17:47:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissVBR.pdf: 1898665 bytes, checksum: 77cd0f5baccb8a694beb9e7f230bab15 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / We studied patterns of gene expression in two closely related species of fruit flies of the genus Anastrepha (Diptera: Tephritidea), A. fraterculus and A. obliqua, with the goal of finding candidate genes related to the recent differentiation process between these species. In order to do this, we used the Next-generation sequencing (NGS) with RNA-Seq methodology in head tissues of the two species of flies at different stages of the reproductive life for both sexes. After processing and removal of low quality reads we retained over 140 million paired-end reads. These sequences were assembled into individual transcriptomes for each species and a pooled transcriptome, with 154,787 contigs, representing both species. Based on the results of the assemblies, annotation and mapping we prepared two separate manuscripts, one describing the libraries for each species and a combined analysis and a second that investigate the contigs involved with species differences and their patterns of expression. These data reveal 1991 genes with differential expression in at least one comparison among different reproductive stages. It is noteworthy that we observed twice as many genes with differential expression when contrasting males than with females. Several of these genes were associated to odour, such as Odorant Binding proteins and visgum, suggesting that behavioral changes in food sources, mating choice, or breeding and oviposition sites might be involved with species differences.We also identified two large sets of genes that are differentially expressed between the species, one being underexpressed in A. obliqua and overexpressed in A. fraterculus and the other that had a reverse pattern. We used a differentiation index of SNPs per contig () and pairwise tests of positive selection between the sequences, and analysis of the substitution amino acid type caused by SNPs to identify 7 genes there are candidates to be related to the speciation process between A. fraterculus and A. obliqua. / Investigamos os padrões de expressão gênica em tecidos cefálicos de duas espécies de moscas-das- frutas do gênero Anastrepha (Diptera: Tephritidea), A. fraterculus e A. obliqua, proximamente relacionadas, identificando SNPs com alto grau de diferenciação entre as espécies e realizando análises evolutivas com o objetivo de encontrar genes candidatos relacionados ao recente processo de separação dessas espécies. Para isso, utilizamos as novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (NGS) com a metodologia de RNA-Seq em tecidos cefálicos das duas espécies de moscas em diferentes fases da vida reprodutiva dos dois sexos. Após processamento e retirada das sequências com baixa qualidade utilizamos mais de 140 milhões de sequências paired-end para montarmos um transcriptoma conjunto das espécies, com mais de 154 mil contigs, e outros dois separados por espécie. Estes resultados estão apresentados em dois manuscritos distintos, um primeiro que descreve as bibliotecas produzidas para as diferentes espécies e um segundo que investiga padrões de expressão e genes envolvidos na diferenciação das espécies. Estes dados revelaram 1991 genes com expressão diferencial em pelo menos uma comparação de fase de vida reprodutiva entre as espécies, sendo que encontramos duas vezes mais genes com diferença na expressão entre as espécies em machos do que em fêmeas. Diversos destes genes foram associados a genes relacionados ao olfato, como a família gênica das Obps (odorant-binding protein) e o gene visgun, o que pode indicar uma mudança comportamental na preferência por alimento, parceiros ou sítios para cópula e oviposição. Encontramos também dois conjuntos de genes que são diferencialmente expressos entre as espécies, sendo um conjunto super-expresso em A. obliqua e sub-expresso em A. fraterculus e outro conjunto com um padrão revertido. Análises de padrão de seleção nestes genes sugerem sete que apresentam indícios de seleção positiva e ao menos um SNP com altos índices de diferenciação entre as espécies.