O presente trabalho investigou se a exposição em períodos precoces da vida à ração com alto teor de gordura animal altera o risco de câncer de mama na vida adulta em ratas. Ratas mães foram expostas à ração com alto teor de gordura (ATG) à base de banha de porco (60 % de energia proveniente de gordura) ou uma dieta controle AIN93G (16 % de energia proveniente de gordura) durante a gestação ou gestação e lactação. A prole feminina com 7 semanas de idade foi induzida a carcinogênese mamária com o carcinógeno 7,12-dimeti-benz[a]antraceno. Comparado à prole do grupo controle, observou-se menor suscetibilidade à carcinogênese mamária na prole do grupo de ratas prenhas submetidas à ração ATG durante a gestação (menor incidência de neoplasias, multiplicidade e peso das neoplasias) ou gestação e lactação (menor multiplicidade). Prole feminina de ratas exposta à ração ATG durante a gestação apresentou menor crescimento da árvore epitelial mamária, proliferação celular (Ki67) e expressão de NFkB p65 e maior expressão de p21 e níveis globais de H3K9me3 na glândula mamária. Além disso, esta apresentou uma tendência na redução da razão Rank/Rankl (p=0,09) e níveis de progesterona sérica (p=0,07). Glândula mamária da prole feminina do grupo exposto à ração ATG durante a gestação e lactação apresentou menor número de TEBs, crescimento da árvore epitelial e razão BCL-2/BAX e maiores níveis de leptina em comparação à prole do grupo controle. Análise de lipidômica das glândulas mamárias revelou que exposição à ração ATG especificamente durante a gestação apresentou pequenos efeitos no perfil de ácidos graxos na prole feminina, enquanto que a exposição à essa ração durante a gestação e lactação promoveu menor concentração de ácidos graxos saturados (exceto ácido esteárico) e maior concentração de ácidos graxos polinsaturados da série n-6, monoinsaturados e ácido linoleico conjugado (CLA). De acordo com análise de dependência de redes diferencial (DDN) dos genes diferentemente expressos pela análise de \"microarray\" exposição à ração ATG em períodos precoces da vida altera a rede transcricional da glândula mamária na vida adulta. Especificamente, ratas expostas à ração ATG somente durante o período fetal apresentou aumento da expressão de Hrh1 e Repin1 em comparação ao controle. A prole exposta à ração durante o período fetal e lactacional apresentou maior e menor expressão de Stra6 e Tlr1 em comparação ao contole, respectivamente e menor expressão de Crkrs em comparação à prole exposta à ração somente durante o período fetal. Nossos dados confirmam que o risco de câncer de mama da prole pode ser programado pela alimentação materna. No entanto, ao contrário do que se esperava, exposição a altos níveis de gordura animal no início da vida diminuiu a suscetibilidade ao câncer de mama na vida adulta. Dentre os possíveis mecanismos envolvidos nessa proteção encontram-se a modulação da morfologia e perfil lipídico da glândula mamária, redução da proliferação celular e aumento dos níveis proteicos de reguladores do ciclo celular, modulação de marcas epigenéticas como H3K9me3, modulação da expressão gênica global com alteração de redes de sinalização, bem como regulação de vias de sinalização específicas como RANK/RANKL/NFκB. Porém esses mecanismos são dependentes do tempo e período de exposição. / The present study investigated whether early life exposure to high levels of animal fat changes breast cancer risk in adulthood in rats. Dams consumed a lard-based high-fat (HF) diet (60% fat-derived energy) or an AIN93G control diet (16% fat-derived energy) during gestation or gestation and lactation. Their 7-week-old female offspring were exposed to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene to induce mammary tumors. Compared to the control offspring, significantly lower susceptibility to mammary cancer development was observed in the offspring of dams fed on HF diet during gestation (lower tumor incidence, multiplicity and weight), or gestation and lactation (lower tumor multiplicity only). Mammary epithelial elongation, cell proliferation (Ki67), and expression of NFkB p65 were significantly lower, and p21 expression and global H3K9me3 levels were higher in the mammary glands of rats exposed to HF lard diet in utero. They also tended to have lower Rank/Rankl ratios (p=0.09) and serum progesterone levels (p=0.07) than control offspring. In the mammary glands of offspring of dams consuming the HF diet during both gestation and lactation, the number of terminal end buds, epithelial elongation and the BCL-2/BAX ratio were significantly lower, and serum leptin levels were higher than in the controls. Lipidomic analysis on mammary glands showed that exposure to a lard-based HF diet only during gestation had little effects on fatty acids profile on offspring, whereas this exposure during gestation and lactation promoted significant changes on the offspring\'s mammary glands. In general, it decreased SFA (except for stearic acid) and increased n-6 PUFA, MUFA and CLA concentrations in mammary gland. According to Differential dependency network (DDN), analysis of genes differently expressed by microarray, exposure to HF diet during early life changes the transcriptional network of the mammary gland in adulthood. Specifically, rats exposed to HF diet only during the fetal period showed increased expression of Hrh1 e Repin1 compared to the control. The offspring exposed to the HF diet in utero and nursing had higher and lower expression of Stra6 and Tlr1, respectively, compared to the control and lower expression of Crkrs compared to the offspring exposed only in utero. Our data confirm that the breast cancer risk of offspring can be programmed by maternal dietary intake. However, contrary to our expectation, exposure to high levels of lard during early life decreased later susceptibility to breast cancer. The mechanisms involve modulation of mammary gland\'s morphology and lipid profile, decrease of cell proliferation and increase of cell cycle regulators, modulation of epigenetics marks as H3K9me3, modulation of global gene expression with alteration of transcriptional network and RANK/RANKL/NFκB pathway. However, these mechanisms are dependent on the duration and period of exposure.

Análises de dados gerados em larga escala revelaram que os transcriptomas são mais extensos e complexos do que inferido previamente. Hoje é evidente que a maioria dos genomas de eucariotos são quase inteiramente transcritos e sob regulação atrelada a estágios de desenvolvimento. O controle da expressão gênica envolve RNAs não codificadores (ncRNAs) regulatórios, inclusive em processos pós-transcricionais. A regulação de expressão gênica em nível pós-transcricional é crucial em diferentes organismos, mas é particularmente central nos tripanossomatídeos. Os parasitos do gênero Leishmania (Ordem Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae) provocam doenças infecto-parasitárias conhecidas como leishmanioses e em seu ciclo de vida apresenta-se sob três formas principais de desenvolvimento: promastigotas procíclicos, promastigotas metacíclicos e os amastigotas. Este trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar computacionalmente ncRNAs putativos de Leishmania em diferentes estágios de desenvolvimento. A associação de abordagens em larga escala e ferramentas de bioinformática possibilitaram a identificação de 11.376 ncRNAs putativos em L. braziliensis e, em um estudo preliminar, de 37 ncRNAs putativos em L. donovani. Adicionalmente, o transcriptoma de L. braziliensis foi analisado comparativamente entre os três estágios de desenvolvimento do parasito. Em L. donovani, dos 37 ncRNAs putativos identificados, 34 estavam em UTRs (Untranslated Regions) e 3 em regiões intergênicas. Preditores de características específicas de ncRNAs foram utilizados e 32 ncRNAs putativos tiveram pelo menos uma predição positiva. Todos os candidatos estão conservados inteira ou parcialmente em pelo menos 3 espécies de Leishmania. Cinco ncRNAs de L. donovani foram confirmados por experimentos de Northern blotting. A análise do transcriptoma de L. braziliensis revelou uma diferença de expressão gênica entre os estágios de desenvolvimento que variou entre 52% e 71%, dependendo dos estágios comparados. Também foram definidos os limites das 5UTRs e 3UTRs de 81% e 38% das CDSs anotadas, respectivamente. Propusemos uma metodologia para identificação de ncRNAs putativos utilizando dados de sequenciamento de RNA-total. Essa metodologia identificou 11.376 ncRNAs putativos em L. braziliensis, sendo que todos os candidatos foram analisados por programas preditores de características específicas de ncRNAs e apresentaram pelo menos uma predição positiva, além de não possuírem semelhança com domínios proteicos conhecidos. A análise de conservação demonstrou que de 27% a 41% dos ncRNAs putativos identificados são conservados em outras espécies de Leishmania. Foram encontrados de 27% a 38% de ncRNAs putativos com regulação atrelada ao estágio de desenvolvimento, dependendo dos estágios comparados. Assim, além da identificação e descrição de ncRNAs em Leishmania foram encontrados candidatos com regulação atrelada ao desenvolvimento e padrões foram descortinados com o processo de análise proposto e executado. Portanto, esse trabalho contribui significativamente para ampliar a compreensão dos processos de regulação de expressão gênica em Leishmania e oferecerá à comunidade um conjunto grande e importante de informações sobre a organização genética do parasito, diferenças genéticas e regulatórias ao longo do desenvolvimento, além de informações do transcriptoma de forma global. / High-throughput data analyses indicated that transcriptomes are more extensive and complex than previously supposed. Currently, it is evident that most eukaryotic genomes are almost entirely transcribed and under regulation tied to developmental stages. Control of gene expression involves regulatory non-coding RNAs (ncRNAs), including post-transcriptional processes. Post-transcriptional regulation is particularly relevant for the regulation of gene expression in trypanosomatids, as compared to other organisms. Parasites of the genus Leishmania (Order Kinetoplastidae, family Trypanosomatidae) causes infectious-parasitic diseases known as leishmaniasis, and their life cycle comprises three development stages: procyclic promastigotes, metacyclic promastigotes and amastigotes. This study aimed to computationally identify and characterize Leishmania putative ncRNAs at different stages of development. Large-scale approaches combined with bioinformatics tools allowed the identification of 11,376 putative ncRNAs in L. braziliensis and, in a preliminary study, of 37 putative ncRNAs in L. donovani. In addition, the L. braziliensis the complete transcriptome was analyzed comparatively between the parasite development stages. In L. donovani, of the 37 putative ncRNAs identified, 34 were in UTRs (Untranslated Regions) and 3 in intergenic regions. Predictors of ncRNAs specific characteristics were used and 32 putative ncRNAs had at least one positive prediction. All candidates are conserved, partially or entirely, in at least three Leishmania species. Five L. donovani ncRNAs were confirmed by Northern blotting experiments. Analysis of the L. braziliensis transcriptome revealed differences in gene expression levels between developmental stages, ranging from 52% to 71%, depending on the compared stages. The boundaries of the 5\'UTRs and 3\'UTRs were also defined for 81% and 38% of the annotated CDSs, respectively. We developed a methodology for the identification of putative ncRNAs using total RNA sequencing data. This methodology allowed the identification of 11,376 putative ncRNAs in L. braziliensis, and all candidates were analyzed by predictive programs of ncRNAs specific characteristics and presented at least one positive prediction, in addition to bearing no similarity to known protein domains. The analysis showed that from 27% to 41% of the putative ncRNAs identified are conserved in other Leishmania species. We found 27% to 38% of putative ncRNAs with regulation associated to the developmental stage, depending on the compared stages. Consequently, besides identification and characterization of ncRNAs in Leishmania, candidates with developmental-related regulation were found and patterns were uncovered with the proposed and implemented analysis. Thus, this work contributes significantly to improve understanding of gene expression regulation processes in Leishmania and will offer to the community important information about the parasite genetics and regulatory differences along the development, besides of L. braziliensis transcriptome information.

A função e a arquitetura dos genes está começando a ser elucidada a partir do estudo de genomas completos tanto de procariotos como de eucariotos. Diversos estudos foram ultimamente realizados a respeito de exon shuffling do ponto de vista evolutivo, fenômeno relacionado à origem de novos genes através de recombinações de DNA mediadas por introns. Apesar de eventos de exon shuffling serem responsáveis pelo aumento da modularidade gênica, outros processos foram desenvolvidos ao longo da evolução para que houvesse o aumento da diversidade do proteoma sem a conseqüente expansão dos genomas, sendo splicing alternativo um dos mais freqüentes. Apresentamos nesta dissertação duas extensivas análises: 1) a análise de uma base de dados de genes eucarióticos contendo pelo menos um intron que apresentou excesso de introns de fase 0 e exons simétricos, dados que suportam exon shuffling como um importante mecanismo de evolução gênica. Avaliamos também a confiabilidade de introns preditos por programas de computador através de alinhamento de ESTs; e 2) a análise do uso alternativo de exons (UAE), um tipo de splicing alternativo, em transcritos humanos detectando que cerca de 51% dos genes humanos possuem mais de uma variante de splicing e que este tipo de processamento pós-transcricional parece ser mais freqüentemente encontrado em tecidos tumorais. / Abstract not available.

A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 cuja principal característica é o acúmulo de altas concentrações de sacarose no colmo. As variedades comerciais são derivadas de cruzamentos de S. officinarum, que possui colmos grossos com alto teor de açúcar, e S. spontaneum, que apresenta colmos finos, fibrosos, com baixo teor de açúcar, mas com maior perfilhamento e resistência a estresses. O desenvolvimento da tecnologia do bioetanol celulósico, no qual o bagaço é utilizado para produção de bioetanol, tem gerado o interesse no desenvolvimento da cana energia, que possui mais fibra e biomassa, porém menos sacarose. Para isso, é importante o entendimento das vias regulatórias de biossíntese de parede celular, principal constituinte da biomassa vegetal. Ainda, as variedades comerciais possuem uma base genética estreita, que pode ser um dos fatores responsáveis pela diminuição dos ganhos de produtividade que vem sendo observada a cada variedade lançada. Isso mostra a importância de se voltar aos genótipos ancestrais para identificar genes que possam ser importantes para o melhoramento da cana-de-açúcar, incluindo o desenvolvimento da cana energia. Assim, o presente trabalho analisou o transcriptoma de três genótipos ancestrais e dois híbridos comerciais, juntamente com a caracterização de dados morfo-fisiológicos. Essa abordagem permitiu ligar padrões de expressão gênica aos fenótipos e identificar genes e vias regulatórias que estão possivelmente relacionadas aos mecanismos que determinam características como produtividade, acúmulo de sacarose e lignina, principalmente genes de regulação da estrutura da cromatina, metabolismo de parede celular e algumas famílias de fatores de transcrição. A expressão desses genes apresentou maior correlação com acúmulo de sacarose do que a expressão dos próprios genes do metabolismo de sacarose. S. spontaneum foi o genótipo que apresentou perfil de expressão e fenótipos mais distintos, mostrando um potencial biotecnológico para produção de biomassa. A integração dos resultados sugere que o acúmulo de sacarose compete com o de lignina e que o controle do crescimento em entrenós mais jovens pode ser importante para a maior produtividade. Também foram construídas bibliotecas de cDNA full length e estas apresentaram 90% de insertos completos. O sequenciamento dessas bibliotecas revelou uma grande quantidade de transcritos novos e específicos do gênero Saccharum, juntamente com um número significativo de transcritos antissense e milhares de genes diferencialmente expressos que podem estar associados, principalmente, às diferenças de resistência a estresses de S. officinarum e S. spontaneum. Essas bibliotecas fornecem uma grande plataforma para estudos posteriores para descoberta de polimorfismos, splicing alternativo e alelos que possam ser importantes nas características dos genótipos. Ainda, foram identificadas sequências promotoras de genes do metabolismo de parede celular e de alguns candidatos a estarem envolvidos nesse processo; vários apresentaram sítios de ligação conservados responsivos a fatores de transcrição da biossíntese de parede celular, mas algumas diferenças importantes foram identificadas, evidenciando divergências evolutivas entre cana-de-açúcar e outras espécies. Nossos dados mostram-se importantes por avançar no entendimento das vias envolvidas no metabolismo de parede celular em cana-de-açúcar assim como por caracterizar parte da variabilidade dos genótipos ancestrais. / Sugarcane is C4 grass whose main characteristic is the accumulation of high concentrations of sucrose in its stem. Commercial varieties are derived from crosses between S. officinarum, which has thick culms with high sugar content, and S. spontaneum, which has thin fibrous culms, with low sugar content, but presents high tillering and stress tolerance. The development of cellulosic bioethanol technology, on which the bagasse is used to produce bioethanol, has raised the interest to produce the energy cane, which has high fiber content and biomass yield instead of sucrose. For this purpose, it is important to obtain knowledge on the regulatory pathways of the biosynthesis of the cell wall, the main component of plant biomass. Still, commercial varieties have a narrow genetic basis and this could be one of the reasons for the reduction on yield gains that has been noticed for new varieties released. This shows the importance to return to ancestor genotypes to identify genes that might be important for sugarcane improvement, as well as for energy cane development. The present work analyzed the transcriptome of three ancestor genotypes and two commercial hybrids, together with the characterization of morphophysiological traits. This approach allowed us to link gene expression pattern and phenotypes to identify genes and regulatory pathways that might be related to the mechanisms determining traits, such as yield, sugar and lignin content, especially genes related to chromatin structure regulation, cell wall metabolism and some transcription factors families. The expression of those genes showed a greater correlation to sucrose content than expression of sucrose metabolism genes itself. S. spontaneum is the genotype with the most distinct expression profile and phenotype, showing a biotechnological potential for biomass production. The integration of the results suggests that sucrose accumulation competes with lignin and the control of growth in younger internodes might be important in determining higher yield. In addition, full length cDNA library has been constructed and they showed 90% full length inserts confirmed. High-throughput sequencing revealed a large number of new and specific Saccharum transcripts, as well as a significant number of antisense transcripts and thousands of differentially expressed genes that might be related to, especially, the differences of stress tolerance of S. officinarum and S. spontaneum. These libraries provide a large platform for future studies to discover polymorphisms, splicing variants and alleles that might be important to genotype\'s traits. We also identify promoter sequences from cell wall-related genes and some candidates to be involved in this process; several of them showed conserved binding sites responsive to cell wall-related transcription factors, however, some differences were also identified, showing an evolutionary divergence among sugarcane and other species. Our data are important for advancing knowledge on cell wall-related pathways in sugarcane as well as for the characterization of genetic variability of ancestor genotypes.

Rickettsia rickettsii é o agente etiológico da febre maculosa das Montanhas Rochosas, a mais letal dentre as riquetsioses que acometem o homem. A principal espécie de carrapato-vetor de R. rickettsii na área metropolitana da cidade de São Paulo é Amblyomma aureolatum. Quando um carrapato em jejum no solo encontra um hospedeiro vertebrado e inicia a alimentação sanguínea, R. rickettsii é exposta a uma elevação da temperatura e aos componentes da refeição sanguínea. Ambos os estímulos foram previamente associados à reativação da virulência da bactéria em carrapatos, porém, os fatores responsáveis por essa conversão do fenótipo avirulento em virulento não foram completamente elucidados até o momento. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar os efeitos desses dois estímulos ambientais sobre o perfil de expressão gênica dessa bactéria durante a infecção de A. aureolatum. Inicialmente, estabelecemos um sistema de propagação de riquétsias para obter material genético suficiente para a padronização dos procedimentos de preparação de amostras para os experimentos de microarranjos. Para tal, estabelecemos, pela primeira vez, a infecção de uma cepa patogênica brasileira de R. rickettsii em células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (BME26). Através da utilização de microarranjos de oligonucleotídeos customizados, analisamos os efeitos da elevação da temperatura em 10°C e da alimentação sanguínea sobre o perfil transcricional da bactéria infectando o conjunto de órgãos de fêmeas de A. aureolatum. Esse é o primeiro estudo da expressão gênica global de uma bactéria do gênero Rickettsia infectando um carrapato-vetor natural. Apesar de ambos os estímulos terem promovido um aumento da carga bacteriana, a alimentação sanguínea teve um efeito maior, também modulando cinco vezes mais genes que a elevação da temperatura. Dentre os genes induzidos, alguns codificam fatores de virulência, tais como componentes do sistema de secreção do tipo IV (T4SS), sugerindo que esse importante sistema de secreção bacteriano seja utilizado para secretar efetores durante a ingestão de sangue pelo carrapato. Através de análises in silico de domínios conservados das proteínas hipotéticas, identificamos outros componentes do T4SS de R. rickettsii ainda não descritos na literatura. A alimentação sanguínea também induziu a expressão de genes codificadores de enzimas antioxidantes, o que pode corresponder a uma tentativa de R. rickettsii de se proteger contra os efeitos deletérios de radicais livres produzidos pelos carrapatos alimentados. Por fim, analisamos a transcrição de uma seleção de genes de R. rickettsii em glândulas salivares e intestinos de carrapatos machos e fêmeas através de RT-qPCR microfluídica. Os resultados mostraram que a elevação da temperatura e a alimentação modulam um conjunto específico de genes em cada tecido analisado, tendo sido possível definirem-se assinaturas transcricionais tecido-específicas. Os genes diferencialmente expressos identificados neste estudo devem ser caracterizados funcionalmente, podendo ser considerados como futuros alvos para o desenvolvimento de vacinas. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of Rocky Mountain Spotted Fever, which is the most lethal spotted fever rickettsiosis that affects humans. The main tick species that transmits R. rickettsii in the metropolitan area of São Paulos city is Amblyomma aureolatum. When an infected and starving tick begins blood feeding from a vertebrate host, R. rickettsii is exposed to a temperature elevation and to components in the blood meal. These two environmental stimuli have been previously associated with the reactivation of rickettsial virulence in ticks, but the factors responsible for this phenotype conversion have not been completely elucidated. The main aim of the present work was to determine the effects of these two environmental stimuli on the R. rickettsii transcriptional profile during A. aureolatum infection. We initially established an effective system for rickettsia propagation to generate a substantial quantity of genetic material for microarray standardization. For that, for the first time, we established an in vitro infection of the virulent Brazilian R. rickettsii strain in the BME26 tick embryonic cell line from Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Using customized oligonucleotide microarrays, we analyzed the effects of a 10°C temperature elevation and a blood meal on the transcriptional profile of R. rickettsii infecting whole organs of Amblyomma aureolatum female ticks. This is the first bacterial transcriptome study of the Rickettsia genus when infecting a natural tick vector. Although both stimuli significantly increased the bacterial load, blood feeding had a greater effect, also modulating five-fold more genes than the temperature upshift. Among the genes induced by blood-feeding, some encode virulence factors, such as Type IV Secretion System (T4SS) components, suggesting that this important bacterial transport system is used to secrete effectors during the acquisition of the blood meal by the tick. Using an in silico conserved domain analysis of hypothetical proteins, we identified additional T4SS components of R. rickettsii that were never previously described. Blood-feeding also up-regulated the expression of antioxidant enzymes, which might correspond to an attempt by R. rickettsii to protect itself against the deleterious effects of free radicals produced by fed ticks. Finally, we studied the transcriptional profile of selected genes of R. rickettsii on the salivary glands and midguts of male and female ticks by microfluidic RT-qPCR. Results showed that temperature upshift and blood feeding modulate specific sets of genes in each tissue, allowing for the establishment of a tissue-specific transcriptional signature. The modulated genes identified in this study require further functional analysis and may have potential as future targets for vaccine development.

O presente estudo teve como objetivo investigar a influência da incorporação da dieta com óleo de peixe (OP), rico em 22:6n3 (DHA) e 20:5n3 (EPA); óleo de linhaça (OL), rico em 18:3n3 (LNA); e óleo de coco (OC), rico em ácidos graxos saturados, no metabolismo lipídico de fêmeas adultas de Epinhephelus marginatus (garoupa verdadeira). Adicionalmente foi realizado o sequenciamento e montagem de novo do transcriptoma do tecido hepático de E. marginatus por Next Generation Sequence, e as sequências obtidas foram utilizadas como ferramenta para validar genes relacionados com o metabolismo lipídico. Os resultados mostraram que, após 5 meses de experimento, a concentração de lipídios no tecido muscular foi superior nos animais do grupo controle (alimentado apenas com sardinha) devido possivelmente a uma menor digestibilidade dos ácidos graxos incorporados na dieta dos demais grupos experimentais. Em geral os triglicerídios (TG) refletiram mais a dieta do que os fosfolipídios (PL), e foram marcados pelo alto percentual de 18:3n3 nos animais do grupo OL em todos os tecidos, e DHA na musculatura dos animais do grupo OP. Aparentemente os resultados observados para os ácidos graxos saturados e monoinstaruados sugerem um potencial autorregulatório para processos de retenção e oxidação de ácidos graxos para esta espécie, já que em geral os tecidos não refletiram diretamente a composição da dieta. A suplementação da dieta com diferentes óleos interferiu de forma direta na expressão dos genes relacionados com a síntese e β-oxidação de ácidos graxos. A expressão do gene ELOVL5 presumivelmente influenciou na deposição de ácidos graxos intermediários nos tecidos dos animais de todos os grupos experimentais, que não foram observados, ou foram pouco representativos nas dietas experimentais. O sequenciamento dos transcritos do tecido hepático de E. marginatus gerou 92.887 contigs de alta qualidade, e foi observado maior número de anotações funcionais contra o banco de proteínas de zebrafish (Danio rerio), comparado ao banco de proteínas de fugu (Takifugu rubripes) . Foram selecionadas as sequências dos genes de interesse no banco de dados local de E. marginatus, e todas as sequências utilizadas apresentaram alto grau de similaridade e foram consideradas adequadas para a realização das análises de PCR em tempo real / This study aimed to investigate the influence of dietary supplementation with fish oil (OP), rich in 22:6n3 (DHA) and 20:5n3 (EPA); linseed oil (OL), rich in 18:3n3 (LNA); and coconut oil (OC), rich in saturated fatty acids in the lipid metabolism of Epinephelus marginatus (dusky grouper) adult female. Additionally it was performed sequencing and de novo assembly of the E. marginatus liver transcriptome by Next Generation Sequence, and sequences obtained were used as a tool to validate lipid-relevant genes. The results showed that the lipid concentration in the liver was higher in the control group (fed only with sardine) possibly due to a reduced digestibility of the incorporated fatty acids in the diet from the other experimental groups. In general the triglycerides (TG) of tissues reflected more the diet profile than phospholipids (PL), and were characterized by the high percentages of 18:3n3 in the OL group in all tissues, and DHA in the muscles of the OP group. Apparently the results for the saturated and monounsaturated fatty acids suggest a self-regulatory potential for retention and oxidation processes for this species, since in general the tissues did not directly reflect the fatty acid diet composition. The ELOVL5 expression presumably influenced in the fatty acids intermediate deposition in the animal tissue from all experimental groups, which were not seen or not representative in the experimental diets. The sequencing of the transcripts from E. marginatus liver generated 92,887 high quality contigs, and it was observed a higher number of functional annotations against zebrafish (Danio rerio) proteins database, compared to the fugu Takifugu rubripes) proteins database. It was selected sequences of interest genes in the local database of E. marginatus, and all sequences used showed a high similarity degree with another teleosteo species, and were considered adequate to run the real time PCR analyze

Neste trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfis de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüências revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nós identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim. Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria ?Regulação da transcrição?. A inibição da RNA Polimerase II resultou num aumento de expressão de uma fração dos RNAs intrônicos em células em cultura, sugerindo que outras RNA Polimerases possam estar envolvidas em sua biossíntese. Um subconjunto das assinaturas intrônicas e exônicas localizadas nos mesmos loci genômicos possuíram padrões de expressão correlacionados, sugerindo que RNAs intrônicos regulem a abundância ou o padrão de uso de éxons de mensagens codificadoras de proteína. Nós identificamos diversos padrões de expressão de RNAs intrônicos, indicando que eles possam ter papéis regulatórios. Esta estratégia orientada pelo gene, que combina um microarray intrônico/exônico deve permitir análises comparativas futuras de transcrição intrônica sob várias condições fisiológicas e patológicas, avançando assim em nosso conhecimento sobre as funções biológicas destes RNAs não codificadores. / In this work, we show large-scale studies of antisense noncoding RNAs transcribed from intronic regions of human genes. The correlation of expression levels of some intronic transcripts to the degree of tumor differentiation in prostate cancer points to the biological relevance of these messages in complex diseases such as cancer. We also evaluated the existence of a common mechanism of regulation of transcription shared by protein-coding mRNAs and intronic RNAs by measuring the effect of androgen on the transcriptional profile of a prostate cancer cell line. Survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 Totally Intronic Noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,520 randomly-selected TIN transcripts plus probes for the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of proteincoding genes enriched in the \"Regulation of transcription\" class. RNA Polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of the intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. A subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci has correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. We have identified diverse intronic RNA expression patterns, indicating that they may have regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intronic/exonic microarray should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.

Beef quality in Brazil is important for both consumers and the food industry due to high demand and competitiveness in the domestic and international markets. Therefore, it is necessary to develop research to improve beef quality of Nellore cattle (Bos indicus), mainly tenderness, one of the main features to add value to meat. New-generation technologies provide accurate, rapid and inexpensive information on the entire genome, showing great advantage over conventional methods for sequencing and gene expression. However, these new technologies generate large database, which require the use of bioinformatics tools for data analyses of sequencing and for a better understanding of biological regulation mechanisms , cellular control, gene interactions, among other applications. In a previous study, samples were collected from the Longissimus dorsi muscle of 790 animals from Nellore cattle and shear force assessments were made 24 hours after slaughter, with seven and 14 days of aging. Aiming to identify differentially expressed (DE) genes, 34 samples from Nellore animals with extreme levels of estimated breeding value (EBV) for shear force (SF) were selected, sequenced by the method of RNA sequencing (RNA-Seq) (Illumina HiScanSQ). This study performed the processing of data generated by RNA-Seq using software QuasiSeq and Cuffdiff. In the QuasiSeq analysis, 22 DE genes were found, while in the Cuffdiff analysis, 113 DE genes were found. To better understand the biological process involved in meat tenderness, integrative analysis identified possible regulators that can explain the activity of transcriptional regulation in this process using partial correlation coefficient with information theory (PCIT), phenotypic impact factor (PIF) and regulatory impact factor (RIF) methods. The genes found in the PCIT analysis USP2, GBR10, ANO1 and TMBIM4; microRNAs found in RIF analysis bta-mir-133a-2 and bta-mir-22, and the genes with high PIF value MB, ENO3, CA3 could be fundamental to unravel the complex molecular mechanisms that control the meat tenderness in Nellore cattle. / A qualidade da carne bovina no Brasil é importante tanto para o consumidor, como para a indústria alimentícia devido à alta competitividade e exigência do mercado nacional e internacional. Portanto, é necessário o desenvolvimento de pesquisas para melhorar a qualidade da carne bovina da raça Nelore (Bos indicus), principalmente a maciez, que é considerada uma das principais responsáveis por agregar valor à carne. Tecnologias de nova geração proporcionam informações precisas, rápidas e baratas de todo genoma, mostrando grande vantagem em relação aos métodos convencionais de sequenciamento e de estudos de expressão gênica. Essas novas tecnologias geram um grande volume de dados, sendo necessário o uso de ferramentas de bioinformática para realizar as análises de sequenciamento e ter uma maior compreensão de mecanismos biológicos de regulação, controle celular, interações gênicas, entre outras aplicações. Em um estudo prévio, foram coletadas amostras do músculo Longissimus dorsi de 790 animais da raça Nelore e foram realizadas avaliações da força de cisalhamento 24 horas após abate, e com sete e 14 dias de maturação. Com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos (DE), foram selecionadas no total 34 amostras de animais da raça Nelore com valores extremos de valor genético estimado (EBV) para força de cisalhamento (SF), e sequenciados pelo método de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) (Illumina HiScanSQ). Neste estudo foi realizado o processamento dos dados gerados pelo RNA-Seq através dos softwares QuasiSeq e Cuffdiff. Foram encontrados 22 genes DE para as análises do QuasiSeq e 113 genes DE para as análises do Cuffdiff. Para melhor compreensão dos processos biológicos envolvidos na maciez da carne, análises integrativas identificaram possíveis reguladores que podem explicar a atividade de regulação transcricional neste processo utilizando os métodos do Coeficiente de Correlação Parcial com Teoria da Informação (PCIT), Fator de Impacto Fenotípico (PIF) e Fator de Impacto Regulatório (RIF). Os genes encontrados nas análises análises do PCIT USP2, GBR10, ANO1 e TMBIM4, assim como os microRNAs encontrados nas análises do RIF, bta-mir-133a-2 e bta-mir-22 e os genes de maior valor de PIF MB, ENO3, CA3 podem ser fundamentais para desvendar os complexos mecanismos moleculares que controlam a maciez da carne na raça Nelore.

Bothrops jararaca é uma das principais serpentes responsáveis por acidentes ofídicos em São Paulo. O efeito do envenenamento pode ser local ou sistêmico, os quais são mediados por uma variedade de componentes do veneno. Considerando que, em animais vertebrados, o fígado desempenha atividades metabólicas essenciais, além de ser o principal órgão responsável pela síntese de proteínas do plasma, a obtenção do transcriptoma deste é de extrema importância para o estudo destas proteínas. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão de RNA no fígado de B. jararaca. Para isto foram obtidas 1700 sequências nucleotídicas denominadas Expressed Sequences Tags (ESTs). As sequências de nucleotídeos foram reunidas em 260 contigs, que foram submetidos ao banco de dados NCBI GenBank usando os algorítimos Blastx e Blastn. dos transcritos tiveram hit com banco de dados NR enquanto 30,5% das ESTs não tiveram homologia. De acordo com a análise do Gene Ontology (GO), os transcritos foram designados para processo biológico, componente celular e função molecular. A maioria dos transcritos foram agrupados em processo biológico, distribuídos em processo metabólico, processo celular e regulação biológica. No entanto, as atividades de ligação proteica, catalítica e de atividade regulatória enzimática foram as principais categorias relacionadas à função molecular. A análise do componente celular apresentou maior número de transcritos envolvidos com a parte celular, região extracelular e restrito a membrana de organela. O maior grupo de transcritos foi relacionado a inibidores de metaloproteases, inibidores de serinoproteases e inibidores de PLA2. Estudos de expressão gênica de alguns alvos selecionados na biblioteca de cDNA de B. jararaca foram realizados para comparação da expressão entre serpentes jovens e adultas. Esses resultados fornecem dados que poderão auxiliar nos estudos filogenéticos entre as diferentes espécies de serpentes e investigar a diferença no padrão da expressão gênica, fornecendo dados importantes sobre a biologia desses animais, contribuindo assim para a elucidação da fisiologia desses animais. Além disso, será útil na identificação de moléculas que possam ser candidatas a alvos terapêuticos. / Bothrops jararaca is the main responsible for snake bites in São Paulo. There are both local and systemic envenomation effects, which are mediated by a variety of venom components. Considering that in vertebrate animals the liver is an important organ responsible for synthesis of plasma proteins, it would be valuable to get transcriptomic information about it. Thus, the aim of this work was to analyze expression profile at RNA level in B. jararaca liver. For this purpose, we sequenced 1700 Expressed Sequence Tags (ESTs) from a cDNA library of B. jararaca liver. Nucleotide sequences were assembled into 260 contigs, which were submitted to the GenBank NCBI database using BLASTX and BLASTN algorithms. Transcripts showed 43% hits with NR database while 30.5% of ESTs had no homology. According to Gene ontology (GO) analysis, transcripts were assigned for biological process, cellular component and molecular function. Majority of transcripts were classified in biological process category distributed in metabolic process, cellular processes and biological regulation, whereas binding and catalytic activities were the main category in molecular function. Cellular component analysis identified transcripts related to cell part, extracellular region and membrane-bounded organelle. The major group of transcripts was related to metalloproteinase inhibitors, followed by serine proteinase inhibitors and phospholipase A2 inhibitors. Studies of gene expression of some selected targets in the cDNA library of B. jararaca, by real time PCR were performed to compare expression in juvenile and adult snake specimens. Our results will help in studies of phylogenetic relationships between different snake species, and investigate differences in gene expression pattern. In addition, our findings are also helpful in the identification of active compounds for development of improved therapeutics for snake bites.

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools