Orientadores: Telma Teixeira Franco, Ana Carolina Deckmann / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coradini_AlessandroLuisVenega_M.pdf: 2904811 bytes, checksum: 79be0b1291d380e8c86253645ed455d8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A crise energética mundial aliada aos problemas ambientais tem despertado grande preocupação mundial, aumentando assim a busca por combustíveis mais "limpos" que possam substituir os já existentes. Dentre estes substitutos podemos destacar os chamados biocombustíveis, como o etanol e o biodiesel. No caso da produção de biodiesel, diversas fontes de lipídios são consideradas, incluindo óleos vegetais, gorduras animais e óleos reciclados. O uso de microrganismos oleaginosos foi apresentado como uma fonte alternativa de óleos e gorduras de baixo custo (Meng et al., 2009). O óleo produzido por microrganismos pode ter como substrato qualquer fonte de carbono, incluindo bagaços e resíduos agrícolas em geral, evitando tanto a competição por áreas de plantio como agregando valor a dejetos de outros setores agrícolas. A esta abordagem dá-se o nome de "biocombustíveis de segunda geração". Neste contexto, as leveduras surgem como fortes candidatas à produção de biodiesel, uma vez que diversas ferramentas de cultivo e manipulação já foram implantadas especialmente para o uso de leveduras em processos industriais e biotecnológicos. Entretanto, nem todas as espécies de leveduras são adequadas para a produção de óleo, uma vez que a capacidade de acumular grandes quantidades de lipídeos varia significativamente entre as espécies. As leveduras do gênero Saccharomyces, por exemplo, apresentam de 8-15 de lipídeos totais em relação à massa seca. Outras, como as espécies Rhodotorula graminis, Rhodotorula gracilis e Lipomyces starkeyi, apresentam cerca de 30%, 60% e 65% de lipídeos totais, respectivamente. Entretanto, o emprego de microrganismos selvagens (i.e., não domesticados) limita o controle dos parâmetros que afetam o processo produtivo, uma vez que as bioconversões de interesse dependem de ajustes metabólicos desconhecidos, e a falta de conhecimento genético destes microrganismos dificulta a aplicação de técnicas de manipulação genética. Assim, o presente estudo teve como objetivo "domesticar" a linhagem DSM70826 da levedura Lipomyces starkeyi tornando-a de fácil manipulação genética e tornando-a uma plataforma para posterior introdução de características que possam melhorar o seu desempenho quanto ao acúmulo de lipídeos para produção de biodiesel. Uma vez que foi realizado o sequenciamento do genoma desta levedura durante trabalho anterior conduzido em nosso laboratório, também objetivamos utilizar este banco de dados para identificar e estudar alguns genes considerados relevantes aos processos fermentativos de xilose e também ao acúmulo de lipídeos, auxiliando a elucidar as principais rotas metabólicas envolvidas nestes processos / Abstract: The global energy crisis combined with environmental problems has aroused great worldwide concern, increasing the search for "cleaner" fuels that can replace existing ones. Among these substitutes the so-called biofuels, such as ethanol and biodiesel can be highlighted. In the case of biodiesel, different fat sources are considered, including vegetable oils, animal fats and recycled oils. The use of oleaginous microorganisms was presented as an alternative source of low cost oils and fat (Meng et al., 2009). The oil produced by microorganisms can use any substrate as carbon source, including bagasse and agricultural waste in general, avoiding the competition for growing areas and adding value to waste of other agricultural sectors. This approach is called "second generation biofuels". In this context, yeasts appear as strong candidates for biodiesel production, since many manipulation and cultivation tools have been implemented especially for the use of yeast in industrial and biotechnological processes. However, not all species of yeasts are suitable for the production of oil, since the ability to accumulate large amounts of lipids varies significantly between species. Yeasts of the genus Saccharomyces, for example, show 8-15% of total lipids in the dry mass. Others, such as the species Rhodotorula graminis, Rhodotorula gracilis and Lipomyces starkeyi, have about 30 %, 60% and 65% of total lipids, respectively. However, the use of wild microorganisms (i.e., non-domesticated) limits the control parameters that affect the production process, since bioconversions of interest depend of unknown metabolic adjustments, and lack of genetic knowledge of these microorganisms hinders the application of genetic manipulation techniques. Therefore, the present study aimed to "domesticate" the yeast strain Lipomyces starkeyi DSM70826 making it easy genetic manipulation and making it a platform for subsequent introduction of features that can improve your performance on lipid accumulation for production of biodiesel. Since the genome sequencing of this yeast was performed during previous work conducted in our laboratory, we also aim to use this database to identify and study some genes considered relevant to xylose fermentation processes and also to lipid accumulation, helping to elucidate the main metabolic pathways involved in these processes / Mestrado / Engenharia de Processos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T01:57:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_EduardoLealOliveira_D.pdf: 11285446 bytes, checksum: 686698f2a706f1cdd1381fde9bf42836 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O nitrogênio (N) é o principal macronutriente necessário para o desenvolvimento das plantas e acúmulo de biomassa. O gênero Eucalyptus é a principal fonte de biomassa para as indústrias de base florestal, principalmente a de papel e celulose. Suas altas taxas de crescimento, propriedades da madeira e repostas a manejo silviculturais tem grande potencial para utilização na geração de biocombustíveis e químicos. Neste novo cenário, a projeção é de uma crescente demanda de biomassa e, em função disso, é necessário associar novas estratégias aos programas de melhoramento genético, que resultem não somente no aumento da produtividade, como também na adequação de caracteres da qualidade da madeira. A qualidade da madeira depende de diversas propriedades do xilema secundário que são influenciadas por fatores genéticos e ambientais, como a disponibilidade água e nutrientes. Neste estudo foi demonstrado que a fertilização nitrogenada causa alterações na formação e qualidade do xilema secundário de eucalipto. Plantas de um clone comercial de Eucalyptus urophylla x E. grandis foram submetidas a adubações contrastantes de N. Análises histológicas de regiões caulinares demonstraram que a deposição de lignina foi reduzida pela fertilização em excesso de N, enquanto um aumento consistente foi observado nas plantas cultivadas em solução deficiente em N. Esses resultados foram corroborados por análises químicas. Pela análise de sequenciamento de RNA foram identificados 1.469 genes diferencialmente expressos e exibindo um padrão de expressão relacionado à quantidade de N disponível. Dentre esses se destacam genes relacionados ao metabolismo de nitrogênio e fenilpropanóides. Os resultados possibilitaram entender os mecanismos envolvidos na manutenção das altas taxas de lignificação sob deficiência de N, bem como apontar possíveis genes candidatos relacionados com a qualidade da madeira de eucalipto / Abstract: The nitrogen (N) is the main macronutrient required for plants development and biomass accumulation. The genus Eucalyptus is the principal source of biomass to forest industries, mainly to the pulp and paper. Their fast growth, valuable wood properties and ease of management have great potential to generate biofuel and chemicals. In this scenario, the projections lead to a high demand of biomass, resulting in the need to associate new strategies of genetic improvement programs, which results in a higher productivity with a better wood quality. The wood quality depends from many properties of secondary xylem that are influenced by genetics and environment factors, like water and nutrients availability. In this study, we demonstrate in Eucalyptus that N fertilization promotes changes on secondary xylem formation and quality. Plants from a commercial clone of Eucalyptus urophylla x E. grandis were submit to contrasting N fertilizations. The histological analyses from stem regions demonstrate that lignin deposition were reduced by high N fertilization, whereas a consistent increased were observed on those cultivate at N deficient treatment. These results were corroborate by chemical analyses. By the RNA sequencing analyses, it was identified 1,469 differently expressed genes, exhibiting an N-dependent expression pattern. Between those are genes related to N and phenylpropanoid metabolisms. The results allowed us to understand the mechanism involved on the maintenance of the high rates of lignifications under N depletion, and also to point some possible candidates genes involve on Eucalyptus wood quality / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_BrunadeAraujo_D.pdf: 3794605 bytes, checksum: 178a4bf447e5292f789a4713d5500b38 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A violaceína é um pigmento violeta produzido por algumas espécies bacterianas de origem ambiental, tais como Chromobacterium violaceum e Janthinobacterium lividum. Esta molécula apresenta várias propriedades biológicas incluindo antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiprotozoária e antitumoral, apesar de sua função exata na fisiologia dos micro-organismos que a produz, ainda é desconhecido. No presente trabalho, a atividade antimicrobiana da violaceína produzida comercialmente, o extrato semi purificado e nanopartículas de vanadato de prata foram avaliados contra espécies de bacterianas gram-positivas e gram-negativas. A violaceína exibiu efeito antimicrobiano contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e Enterococcus resistente à vancomicina (VRE), que são micro-organismos frequentemente relacionados com infecções adquiridas em hospitais. Os valores de MIC (concentração inibitória mínima) e MBC (concentração bactericida mínima) da violaceína produzida comercialmente foram de 0,625 ?M e 1,25 ?M respectivamente e, análise de curvas de crescimento e tempo-morte revelaram um efeito antibacteriano durante 12 horas contra MRSA. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou os efeitos da violaceína com alterações morfológicas e ultra estruturais, incluindo alterações na parede celular e formação de septos de divisão anormais. Nos resultados obtidos das análises de proteômica e transcriptoma a violaceína afetou a expressão de várias classes funcionais de proteínas e genes em MRSA, incluindo processos biológicos em biossíntese da parede celular e divisão celular que corroboram as alterações ultra estruturais visualizadas. Em conclusão, a violaceína produzida comercialmente demonstrou atividade antimicrobiana para S. aureus MRSA e pela primeira vez, os efeitos da violaceína sobre o metabolismo de S. aureus foram descritos, indicando possíveis alvos e vias metabólicas afetadas por esta droga. No seu conjunto, estes dados indicam a violaceína como uma droga potencial para o tratamento de infecções provocadas por MRSA / Abstract: Violacein is a violet pigment produced by some bacterial species of environmental source, such as Chromobacterium violaceum and Janthinobacterium lividum. This molecule has numerous biological properties including antibacterial, antifungal, antiviral, antiprotozoal and antitumor activity, although the exact role in the physiology of producing microorganisms is still unknown. In this study, the antimicrobial activity of violacein produced commercially, semi purified extract and silver vanadate nanoparticles were evaluated against several species of gram-positive and gram-negative bacteria. Violacein exhibited antimicrobial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant Enterococcus (VRE), microorganisms that are often related to hospital-acquired infections. MIC (minimum inhibitory concentration) and MBC (minimum bactericidal concentration) values of violacein produced commercially were 1.25 ?M mM and 0.625 ?M respectively, and analysis of growth and time-kill curves showed an antibacterial effect against MRSA for 12 hours. The transmission electron microscopy showed the effects of violacein with morphological and ultra-structural changes, including changes in cell wall formation and abnormal division septum. The results obtained from the analysis of proteomic and transcriptomic revealed that violacein affects the expression of several functional classes of proteins and genes in MRSA, including biological processes in cell wall biosynthesis and cell division, supporting ultra-structural changes. In conclusion, violacein produced commercially demonstrated antimicrobial activity against S. aureus MRSA and the effects on the metabolism of S. aureus have been described, indicating possible targets and pathways affected by this drug. These data indicate violacein as a potential drug for the treatment of infections caused by MRSA / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Stephen Hyslop / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T08:32:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_KiaraCarolina_D.pdf: 27750375 bytes, checksum: a1ca027909bfd58421b986e75bfcd515 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O estudo do transcriptoma de bibliotecas de cDNA da glândula venenífera de serpentes, realizado a partir da análise de ESTs (expressed sequence tags), tem se mostrado útil na identificação de genes expressos neste tecido, inclusive no gênero Bothrops, responsável pela maioria dos acidentes ofídicos no Brasil. Neste trabalho utilizamos uma abordagem transcriptômica para analisar a composição gênica da glândula venenífera da serpente Bothrops alternatus, uma espécie encontrada no sudeste e sul do Brasil, Uruguai, norte da Argentina e leste do Paraguai. Também clonamos e caracterizamos parcialmente a enzima dipeptidilpeptidase IV (DPP IV), uma enzima que cliva peptídeos com prolina ou alanina na penúltima posição em sua porção N-terminal e que tem sido detectada em diversas peçonhas ofídicas. A construção de bibliotecas de cDNA usando métodos convencionais de clonagem, sequenciamento e análise bioinformática resultou em 5,350 ESTs que foram reunidas em 838 contigs and 4512 singletons. Pesquisas a partir de bancos de dados relevantes (BLAST) mostraram 30% de hits e 70% no-hits. Os transcritos relacionados a toxinas correspondem a 23% do total de transcritos e 78% dos hits, respectivamente. A análise por ontologia gênica (GO) detectou genes relacionados ao metabolismo geral, transcrição, tradução, processamento, degradação de polipeptídeos, funções estruturais, e regulação celular. Os principais grupos de toxinas identificados foram metaloproteinases (81%), peptídeos potenciadores da bradicinina/peptídeos natriuréticos do tipo C (8,8%), fosfolipases 'A IND. 2' ('PLA IND. 2'; 5,6%), serinoproteinases (1.9%) e lectinas do tipo C (1,5%). As metaloproteinases eram quase queexclusivamente da classe PIII, com poucas da classe PII e nenhuma da classe PI. As 'PLA IND. 2' eram todas ácidas; nenhuma 'PLA IND. 2' básica foi detectada. Outras toxinas encontradas incluíram a L-aminoácido oxidase, proteínas secretadas ricas em cisteína, DPP IV, hialuronidase, toxinas three-finger e ohanina. Foram identificadas duas proteínas não-tóxicas, a tioredoxina e a Dusp6 (fosfatase de dupla especificidade) que mostraram alto grau de similaridade a proteínas semelhantes de outras serpentes. Também foram observados polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs - single-nucleotide polymorphisms), microssatélites, transposons e repetições invertidas, todos os quais podem contribuir de alguma forma para a multiplicidade de toxinas na glândula. Estes resultados mostram que a glândula venenífera de B. alternatus possui as principais classes de toxinas encontradas em estudos transcriptômicos e proteômicos de outras espécies botrópicas. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Transcriptomic studies of snake venom gland cDNA based on the analysis of expressed sequence tags (ESTs) have been useful in identifying the genes expressed in this organ in a variety of species, including the genus Bothrops, which is responsible for most venomous snakebites in Brazil. In this work, we used a transcriptomic approach to analyze the gene composition of the venom gland of Bothrops alternatus (urutu), a species found in southeastern and southern Brazil, Uruguay, northern Argentina e eastern Paraguay. We also cloned and partially characterized dipeptidylpeptidase IV (DPP IV), an enzyme that cleaves peptides with proline or alanine as the penultimate residue in the N-terminal region and has been identified in several snake venoms. A cDNA library constructed using conventional methods of cloning, sequencing and bioinformatic analysis yielded 5,350 ESTs that formed 838 contigs and 4512 singletons. Databank BLAST searches yielded 30% hits and 70% no-hits. Toxin-related transcripts accounted for 23% of the total transcripts and 78% of the hits. Gene ontology analysis detected genes related to general metabolism, transcription, translation, processing, polypeptide degradation, structural functions and cellular regulation. The main toxin groups identified were metalloproteinases (81%), bradykinin-potentiating peptides/C-type natriuretic peptides (8.8%), phospholipases 'A IND. 2' ('PLA IND. 2'; 5.6%), serine proteinases (1.9%) and C-type lectins (1.5%). Metalloproteinases were almost exclusively class PIII, with few class PII and no class PI enzymes. The 'PLA IND. 2' were all acidic; no basic 'PLA IND. 2' were detected. Other toxins identified included L-amino acid oxidase, cysteine-rich secretory proteins, DPP IV, hyaluronidase, three-finger toxins and ohanin. Two non-toxic proteins, thioredoxin and a dual specificity phosphatase (Dusp6), shared high sequence homology with similar proteins from other snakes. Single-nucleotide polymorphisms (SNPs), microsatellites, transposons and inverted repeats were also observed and may contribute to the toxin diversity of the gland. These results show that the venom gland of B. alternatus contains the major toxin classes identified in transcriptomic and proteomic studies of other Bothrops species. The predominance of class PIII metalloproteinases agrees with the hemorrhagic activity of this venom, while the low content of serine proteinases and C-type lectins could account for the less intense coagulopathy observed after envenoming by this species. The lack of basic 'PLA IND. 2' agrees with the lower myotoxicity of this venom compared to other Bothrops species. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salazar_MarcelaMendes_D.pdf: 4370521 bytes, checksum: 99869d0c9655d47c4e3b2c29de58a274 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A celulose é o polímero mais abundante do planeta e está presente principalmente na parede secundária de células vegetais maduras. O conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na sua biossíntese, bem como a regulação deste processo é recente e ainda elementar, apesar da sua grande importância. O Eucalyptus é o gênero florestal mais plantado no mundo, especialmente por ser matéria-prima para fabricação de celulose. Investimentos em pesquisas e desenvolvimento estão sendo realizados pelo setor florestal, no intuito de aumentar os ganhos de produtividade de celulose através da pesquisa na área da biologia molecular. Os dados analisados desmostram que a expressão gênica das espécies estudadas (E. globulus, E. grandis e E. urophylla) difere em genes essenciais para a formação dos compostos da parede celular e por fim da madeira. Os dados moleculares são condizentes com dados diferenciais aqui encontrados em relação à composição dos açúcares da parede. Os resultados gerados pela análise de composição da parede por diferentes técnicas, incluindo a recentemente desenvolvida "Perfil Glicômico" mostram uma grande diversidade e quantidade dos carboidratos da parede celular diferentemente distribuídos no xilema das espécies Eucalyptus globulus, grandis e urophylla, bem como em folha. Tais resultados apresentam um grande avanço para o entendimento da composição das paredes celulares de tais espécies. Assim, o objetivo do presente trabalho foi correlacionar os dados moleculares, com dados highthroughput do Perfil Glicômico para entender a composição e arquitetura da parece celular. Espera-se que esses dados possam contribuir para o entendimento da xilogênese e de como os genes trabalham para gerar árvores com características tão distintas, podendo direcionar o melhoramento das mesmas / Abstract: Cellulose is the most abundant polymer in the world and it is present mainly in secondary cell walls of plant mature cells. The knowledge of molecular mechanisms involved in biosynthesis and regulation of this process is recent despite its great importance. The Eucalyptus is the most planted forest genus in the world, especially for being raw material for pulp production. Investments in research and development, especially in the molecular biology field, are being carried out by the forestry sector in order to increase pulp productivity. The data analyzed showed that gene expression of the species the tree species studied here (E. globulus, E. grandis e E. urophylla) differs in essential genes of cell wall compounds formation. Molecular data are consistent with differential data found here in relation to the composition of cell wall sugars. The results generated by the wall composition analysis by various techniques, including the recently developed "Glycome Profiling", showed a wide diversity of carbohydrate of cell wall differently distributed in the xylem of the the Eucalyptus species. These results are a breakthrough in understanding the cell wall composition of these species. The objective of this study was to correlate molecular data with data highthroughput Glycome Profiling to understand the composition and architecture of the cell walls. It is hoped that these data will contribute to the understanding of wood formation and how genes work to generate trees with such different characteristics / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Felipe Rodrigues da Silva, Francisco Pereira Lobo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_GiovanniMarquesde_M.pdf: 8706589 bytes, checksum: bd5b5d6428a549bafa82854367f811b9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A planta Fevillea cordifolia L. possui um grande potencial para produção de biodiesel. Buscando entender o metabolismo foi realizado um experimento exploratório de RNA-seq com sementes inteiras. No entanto, as análises da qualidade na biblioteca indicaram grande quantidade de sequências virais. Após a reconstrução do transcriptoma usando o programa TRINITY, também foi reconstruído o genoma completo do vírus. O vírus reconstruído possui identidade de 96% com o Papaya ringspot virus (PRSV) em um alinhamento global de nucleotídeos dos genomas completos. Avaliando a abundância dos contigs, o PRSV encontrado representa quase 60% das 24,6 milhões de leituras da biblioteca. Para identificar qual a origem do vírus encontrado, este foi comparado com 29 PRSVs existentes no Genbank através de análise filogenética usando do Algerian watermelon mosaic virus (AWMV) para enraizar a árvore. O vírus encontrado agrupa-se com os dois PRSVs do Brasil, dentro do grupo das Américas estando mais próximo do PRSV-W-C (DQ374152). A existência de recombinações entre os PRSVs foi analisada, porém não foi detectada recombinação recente. Devido à profundidade de sequenciamento maior que 10.000x, foi possível analisar as variações existentes do genoma viral reconstruído. Uma análise das variações dos códons virais foi realizada, mostrando uma tendência para ocorrência de indels para a região do genoma no fim do cístron NIb e início do cístron CP. Essas variações ocorrem devido à existência de haplótipos virais na amostra sequenciada. Para se estimar a diversidade de haplótipos virais da amostra, foi realizada uma reconstrução local da região de 500 nt com mais alta entropia. Foram reconstruídos 58 haplótipos, dos quais dois eram predominantes com frequências de 64,84% e 24,34%. Os haplótipos reconstruídos podem ser usados para o desenvolvimento de resistência mediada por RNAi, evitando que uma variante conhecida e preexistente na população possa quebrar a resistência / Abstract: The plant Fevillea cordifolia L. has a great potential for producing biodiesel. In order to understand its metabolic pathways an exploratory RNA-seq experiment was conducted with its whole-seeds. However the quality analysis of the library revealed a substantial amount of virus sequences. After the reconstruction of the transcriptome using the software TRINITY, the complete viral genome was obtained as well. The reconstructed viral genome had an identity of 96% with Papaya ringspot virus (PRSV) in a global nucleotide alignment using whole genomes. When estimating the abundance of the reconstructed sequences, this PRSV had almost 60% of the 24,6 million reads mapping to it. Aiming to elucidate the origin of this virus, its sequence was compared to 29 PRSVs from Genbank using phylogenetic analysis and the Algerian Watermelon Mosaic Virus (AWMV) as an outgroup. This PRSV clustered with the Brazilian isolates, being closer to PRSV-W-C (DQ374152). A recombination analysis was performed within the PRSVs but no recent recombination was detected. Due to the depth of the coverage sequencing being higher than 10.000x, it was possible to analyze the variations existing in the reconstructed genome. An analysis of the codons variations was performed, revealing a tendency for the occurrence of indels in a region at the end of NIb cistron and at the start of the CP cistron. These variations occur due to the existence of viral haplotypes sequenced in this sample. A local reconstruction of the 500nt region with the highest entropy was performed to estimate the diversity of viral haplotypes in this sample. 58 haplotypes were reconstructed, of which 2 were dominant with frequencies of 64,84% and 24,34%. The reconstructed haplotypes may be used for the development of RNAi-mediated resistance, avoiding the breaking of the resistance by variants that are known to exist in the population / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A popularização dos répteis no mercado pet e no meio científico amplia a necessidade por conhecimentos clínicos e fisiológicos mais adequados a classe o que, consequentemente, irá melhorar a qualidade dos atendimentos e do manejo desses animais. Destaca-se que, como cada espécie de réptil apresenta um comportamento metabólico e fisiológico distinto é necessário a realização de estudos com cada espécie em particular. Assim, buscou-se caracterizar os receptores opioides no sistema nervoso central (SNC) e os efeito sedativo e analgésico da morfina e do butorfanol em Iguana iguana. Na 1ª etapa três iguanas jovens (101 ± 6g) e saudáveis foram submetidas à eutanásia para colheita do SNC. Os tecidos de dois animais foram submetidos à técnica do RNAseq para formação de um transcriptoma de novo, para então obter-se as sequências de nucleotídeos dos receptores opioides. Já o tecido de um animal foi submetido à técnica de imuno-histoquímica (IH). Na 2ª etapa, 10 iguanas jovens (160 ± 46g) receberam cinco tratamentos, por via intramuscular e com intervalo de duas semanas entre eles: solução salina (0,3mL, CON), morfina 5 mg/kg (MOR5) e 10 mg/kg (MOR10), butorfanol 5 mg/kg (BUT5) e 10 mg/kg (BUT10). A sedação foi avaliada por meio da escala comportamental específica para iguanas e pelo teste de natação forçada, sendo este por 120 segundos. A latência do reflexo de retirada do membro (LRRM) frente ao estímulo térmico foi utilizada para avaliação antinociceptiva promovida pelos opioides. Todos os testes foram avaliados antes do tratamento (0) e com 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 6, 12 e 24 horas pós-tratamento. Utilizou-se ANOVA e Dunnett para a comparação com o momento basal (0 minuto) e ANOVA de dois fatores e Tukey entre os grupos. As sequências gênicas compatíveis com os receptores μ (mu), κ (kappa) e δ (delta) foram identificadas, porém o teste de IH não revelou resultados confiáveis para as marcações dos receptores no SNC. Na escala comportamental apesar dos escores de sedação terem sido baixos, foi observado aumento significativo na pontuação entre 30 minutos e 2 horas em MOR5 e entre 30 minutos e 3 horas em MOR10, BUT5 e BUT10. O tempo de natação foi reduzido em MOR10 e BUT5 entre 30 minutos e 2 horas e em BUT10 a redução ocorreu entre 30 minutos e 12 horas. Todos os tratamentos proporcionaram sedação pelos dois testes com 12 horas de avaliação. Por outro lado no teste de termoalgimetria só foi observado aumento no tempo de LRRM em MOR10, entre 2 horas e 4 horas de avaliação. Conclui-se que os receptores opioides estão presentes no SNC, porém apenas κ e δ foram evidenciados na IH. Ademais, as duas doses de butorfanol e a maior dose de morfina promovem sedação, sendo que apenas 10 mg/kg de morfina promoveu antinocicepção em iguanas no presente estudo. / The increasing popularity of reptiles in the pet market and in the scientific studies requires appropriate clinical and physiological knowledge, which will consequently improve the quality of care and management of this classe. It is necessary to have studies with each species in particular because of every specie of reptile has different metabolic and physiological behavior. Therefore, it was aimed localization of opioid receptor in the central nervous system (CNS) and evaluated the sedative and analgesic effect of morphine and butorphanol in Iguana iguana. At the first stage three young (101 ± 6g) and healthy green iguanas were submitted to euthanasia for harvesting the CNS, then the tissues of two animals were submitted to the RNAseq technique for the formation of de Novo transcriptome, so we could get the nucleotide sequences of the opioid receptors obtained. The immunohistochemistry (IH) technique was use to locate the distribution of these receptors in the CNS. In the second stage, 10 young green iguanas (160 ± 46 g) received five treatments, intramuscularly and with an interval of two weeks between them: saline solution (0.3 mL, CON), morphine 5 mg/kg (MOR5) and 10 mg/kg (MOR10), butorphanol 5 mg/kg (BUT5) and 10 mg/kg (BUT10). The sedation was estimate by behavioral scale for iguanas and forced swing test, during 120 seconds. The latency of hind limb withdrawal reflex (LWR) in front of the thermal stimulus was use for antinociceptive evaluation promoted by opioids. All the tests were evaluate before treatment (0) and at 30 minutes, 1, 2, 3, 4, 6, 12 and 24 hours post-treatment. ANOVA and Dunnett were used for comparison with the baseline (0 minute) and two-way ANOVA and Tukey between the groups. We identified sequences compatible with μ (mu), κ (kappa) and δ (delta), but only κ and δ were marked in the IH of the CNS. In the behavior scale despite of low scores of sedation, it was observe a significant increase in the score between 30 minutes and 2 hour MOR5 and between 30 minutes and 3 hours in MOR10, BUT5 and BUT10. The time of swimming test was reduced in MOR10 and BUT5 between 30 minutes and 2 hours and in BUT10 the reduction occurred between 30 minutes and 12 hours. All treatment provided sedation for both tests in 12 hours of evaluation. Otherwise, the thermoalgymetry test showed increased time in LWR in MOR10 between 2 hours and 4 hours of evaluation. It concluded that the opioid receptors are present in the CNS. In addition, the two doses of butorphanol and the highest dose of morphine further sedation and only 10 mg/kg of morphine promoted antinociception in iguanas in this study.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 da família das Poaceae. Sua principal característica é a capacidade de estocar altas concentrações de sacarose no colmo. Devido à sua alta atividade fotossintética, ela consegue converter uma boa parte da radiação solar em biomassa. Assim, ela pode ser considerada um dos melhores modelos para os estudos da relação fonte-dreno. O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de álcool do mundo, e por isso a cana-de-açúcar é considerada uma das principais culturas atuais. A ausência de informações sobre a sua sequência genômica levou à criação do programa SUCEST no final de 1990, onde foram disponibilizadas aproximadamente 240,000 sequências denominadas ESTs (Expression Sequence Tags), uma cobertura de quase 90% do genoma expresso da cana-de-açúcar. Desta forma, foi possível desenvolver uma plataforma de microarranjo Agilent de oligonucleotídeos com componentes do SUCEST. Por meio do programa de melhoramento da RIDESA e a análise por microarranjos, foi possível a identificação de vias metabólicas que podem estar relacionadas com a regulação do acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar, principalmente aquelas que envolvem os fitormônios auxina e etileno. A obtenção de dados agrotecnológicos e de fisiologia permitiu a observação de um trade off metabólico, onde o acúmulo de sacarose parece ocorrer em detrimento do acúmulo de fibra. A obtenção de plantas silenciadas e superexpressando uma quinase da família da SnRK1 levou, através da análise de microrarranjos, a identificação de genes diferencialmente expressos envolvidos no estresse por seca como uma PP2C e deidrina. Nas plantas superexpressando uma SnRK1, há um aumento do conteúdo de sacarose na planta 88, que talvez indique que a superexpressão dessa quinase leve a um aumento do conteúdo de sacarose em cana. Com a obtenção de sequências genômicas acima do sítio de início da transcrição dessa mesma SnRK1, e de uma subunidade regulatória Akinβγ, foi possível identificar por análise computacional sequências conservadas envolvidas na regulação hormonal, resposta à seca e reações de luz, indicando que a transcrição desse gene pode resultar de diferentes respostas da planta. Esse trabalho permitiu novas diretrizes no estudo do acúmulo de sacarose no colmo, indicando que vias de transdução de sinais conservadas, mediadas por hormônios e fosforilação, podem ser as principais responsáveis por esse fenômeno em cana-de-açúcar. / The sugarcane is a C4 grass of the Poaceae family. Its main feature is the ability to store high sucrose concentrations in the culm. Due to the elevated photosynthetic activity, it can convert a great portion of solar radiation into biomass. Thus, it can be considered one of the best models for studies of source-sink relationship. Brazil is one of the largest alcohol producers and exporters in the world, and sugarcane is considered one of the main current cultivars. The absence of information about its genome sequence led to the creation of the SUCEST program in late 1990, from which approximately 240,000 sequences called ESTs (Expression Sequence Tags) were made available, with a coverage of almost 90% of the sugarcane expressed genome. Thus, it was possible to develop a microarray platform with Agilent oligonucleotide with SUCEST components. Through the RIDESA improvement program and microarray analysis, it was possible to identify metabolic pathways that may be related to the regulation of sugarcane sucrose accumulation, especially those involving the plant hormones auxin and ethylene. The agro-technological and physiology data allowed the observation of a metabolic trade-off, where the sucrose accumulation appears to occur at the expense of fiber accumulation. The production of plants that are silenced or overexpressing a kinase from SnRK1 family, led by microrarray analysis, allowed the identification of differentially expressed genes that are involved in drought stress, such as a PP2C and dehydrin. In plants overexpressing a SnRK1, there is an increased sucrose content in the plant 88, which may indicate that overexpression of this kinase leads to an increase in leaf sucrose content. After obtaining the genomic sequence above the transcription start site of the same SnRK1, and a regulatory subunit Akinβγ, it was possible to identify by computer analysis conserved sequences involved in regulating hormonal response to dry and light responses, indicating that the gene transcription may arise from different plant responses. This work allowed new guidelines in the study of sucrose accumulation in the culm, suggesting that conserved signal transduction pathways and hormone mediated phosphorylation may be the main reason for this phenomenon in sugarcane.

Os genes eucarióticos, em sua maioria, são divididos em exons e introns, requerendo processamento do RNAm para remover as sequências intrônicas e juntar os exons (splicing). As bordas exon/intron são definidas por sítios de splice que normalmente são reconhecidos com alta fidelidade, gerando os mesmos RNAms processados a cada vez. Apesar desse reconhecimento preciso, tem sido observada a junção de exons de maneiras alternativas (splicing alternativo), foco de muitos estudos recentes devido à sua importância em vários processos biológicos. Este processamento alternativo do RNAm pode ser principalmente de três tipos: exclusão de exon, no qual um exon pode ser incluído ou não no RNAm maduro; uso alternativo de sítios de splice, resultando em exons mais longos ou mais curtos e retenção de intron, o tipo menos estudado, no qual uma sequência intrônica é mantida no RNAm maduro. Um dos aspectos cruciais no entendimento de splicing alternativo é conhecer os mecanismos que levam à geração de diferentes transcritos. Coerente com a importância dos sítios de splice no splicing de RNAms, a retenção de intron parece ser causada por falha no reconhecimento daqueles que são sub-ótimos. Como os sítios de splice são reconhecidos aos pares ao se estabelecer uma ponte através de exons ou introns, dependendo de qual é mais curto, uma falha no reconhecimento de um exon ou de um intron leva a diferentes tipos de splicing alternativo (exclusão de exon ou retenção de intron, respectivamente). Desta forma, acredita-se que a ocorrência de retenção de intron esteja também associada a uma falha no reconhecimento de introns curtos. Embora estudos de introns retidos individuais tenham abordado estas questões, poucas análises sistemáticas de grandes quantidades de dados foram conduzidas sobre as características gerais que levam à retenção de intron. Para este fim, realizamos uma análise de bioinformática de sequências do genoma e transcriptoma (RNAm) humanos armazenadas em formato de computador. Para realizar as análises computacionais, desenvolvemos um sistema de anotação de splicing alternativo completo. Particionamos os eventos de retenção de intron identificados em sequências expressas pelo nosso sistema de anotação em dois grupos, com base na abundância relativa das duas isoformas (um grupo de eventos com <50% e outro com >50% de transcritos retendo o intron) e comparamos características relevantes. Verificamos que uma maior frequência de retenção de intron em humano está associada a sítios de splice mais fracos, genes com introns mais curtos e maior nível de expressão gênica, e menor densidade de um conjunto de elementos inibitórios exônicos e do promotor de splicing intrônico GGG. Os dois grupos apresentaram eventos conservados em camundongo, nos quais os introns retidos também eram curtos e apresentavam sítios de splice mais fracos. Embora nossos resultados tenham confirmado que sítios de splice mais fracos estão associados à retenção de intron, eles mostram que uma fração não-desprezível dos eventos não pode ser explicada apenas por esta característica. Nossa análise sugere que elementos reguladores em cis provavelmente têm um papel na regulação da retenção de intron e também revelou características previamente desconhecidas que parecem influenciar sua ocorrência. Estes resultados salientam a importância de considerar o compromisso entre estas características na regulação da frequência relativa de retenção de intron. / Most eukaryotic genes are split in exons and introns, requiring mRNA processing to remove intervening sequences and join exons (splicing). Exon/intron borders are defined by splice sites that are normally recognized with high fidelity, yielding the same processed mRNA each time. Notwithstanding such precise recognition, alternative joining of exons has been observed (alternative splicing) and is the focus of many recent studies, due to its importance in several biological processes. This alternative mRNA processing can be mainly of three types: exon skipping, whereby an exon may be included or not in the mature mRNA; alternative use of splice sites, resulting in longer or shorter exons and intron retention, the least studied type whereby an intronic sequence is maintained in the mature mRNA. One of the key aspects in understanding alternative splicing is to know the mechanisms that lead to the generation of different transcripts. Coherent with the importance of splice sites in mRNA splicing, intron retention seems to be caused by failure in the recognition of those that are sub-optimal. As splice sites are recognized in pairs by bridging either exons or introns, depending on which is the shortest, failure to recognize an exon or an intron leads to different types of alternative splicing (exon skipping or intron retention, respectively). This way, the occurrence of intron retention is believed to be associated to failure in recognition of short introns also. Although studies on individual retained introns have addressed such issues, few systematic surveys of large amounts of data have been conducted on the general features leading to intron retention. To this end, we performed a bioinformatics analysis of human genome and transcriptome (mRNA) sequences stored in computer format. To perform the computational analyses we developed a complete alternative splicing annotation system. We partitioned intron retention events identified in expressed sequences by our annotation system in two groups based on the relative abundance of both isoforms (one group of events with <50% and another with >50% of transcripts retaining the intron) and compared relevant features. We found that a higher frequency of intron retention in human is associated to weaker splice sites, genes with shorter intron lengths and higher expression level, and lower density of a set of exonic inhibitory elements and the intronic splicing enhancer GGG. Both groups of events presented conserved events in mouse, in which the retained introns were also short and presented weaker splice sites. Although our results confirmed that weaker splice sites are associated to intron retention, they showed that a non-negligible fraction of events can not be explained by this feature alone. Our analysis suggests that cis-regulatory elements are likely to play a crucial role in regulating intron retention and also revealed previously unknown features that seem to influence its occurrence. These results highlight the importance of considering the interplay among these features in the regulation of the relative frequency of intron retention.