A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 usada por séculos como a principal fonte de açúcar e mais recentemente para obtenção de etanol. Devido a sua grande importância no cenário econômico mundial, estudos em cana-de-açúcar são cada vez mais importantes no sentido de prover informações que possam levar ao aumento de produtividade para suprir tanto a demanda interna quanto externa. No entanto, a quantidade de dados moleculares e biotecnológicos disponíveis está muito aquém do necessário, e investimentos na obtenção de novos conhecimentos serão necessários se quisermos evoluir neste campo, assim como manter o nosso país como líder na produção de etanol. Neste trabalho, conduzimos experimentos em campo para comparar variedades contrastantes para a tolerância ao déficit hídrico e realizamos diagnósticos fisiológicos e moleculares para diferenciar as variedades. O estresse hídrico levou à diminuição do crescimento e desenvolvimento de todas as três variedades analisadas. A variedade RB855536 foi identificada como a menos produtiva das três, visto que em condições de déficit hídrico ela diminui mais seu crescimento, sofre mais efeitos do estresse oxidativo, acumula mais osmólitos e tem o ciclo de Calvin menos ativo. A variedade RB867515 teve um melhor desempenho, não acumulou osmólitos, não teve aumento na concentração de prolina, teve sinais menores de estresse oxidativo e um melhor funcionamento do ciclo de Calvin. Além disto, nós observamos a indução de transcritos na via de resposta do ABA e proteínas relacionadas com a fotossíntese, transporte de água e dobramento protéico. A variedade RB92579 teve um padrão similar ao encontrado para a RB867515, mas teve uma maior fotossíntese, um menor estresse oxidativo e uma menor perda de pigmentos. Nossos dados avançaram na identificação de genes envolvidos na resposta ao déficit hídrico em cana-de-açúcar assim como permitiram distinguir as variedades utilizadas no estudo. A partir de uma prospecção inicial de dados de transcriptoma previamente obtidos pelo grupo, foram selecionados fatores de transcrição associados a características agronômicas de interesse. Produzimos anticorpos para 5 TFs de cana-de-açúcar e padronizamos a metodologia de ChIP-Seq utilizando a plataforma de sequenciamento Roche 454. Uma análise dos dados de ChIP-Seq usando anticorpos para a RNA Polimerase II nos permitiu detectar contaminações com DNA humano, provavelmente pela utilização de gDNA como controle das reamplificações, assim como a detecção de mapeamento de muitas regiões repetitivas, o que pode ser normal, podendo indicar locais de ligação da Polimerase II ou então background. O mapeamento de praticamente todos os dados de sorgo em cana evidenciou a similaridade entre estes organismos, mas a maior quantidade de mapeamento em cana evidencia uma maior complexidade de seu genoma. Os resultados foram importantes por permitir o estabelecimento de uma metodologia de mapeamento de regiões regulatórias no genoma da cana-de-açúcar e significa um importante passo no estabelecimento de redes regulatórias associadas a características agronômicas de interesse / Sugarcane is a C4 grass used for centuries as the main source of sugar and more recently for ethanol production. We have seen an increasing interest in recent years to understand sugarcane to improve yield and supply the increasing world demand. However, the amount of molecular data available is far from ideal, and investments in acquiring new knowledge will be necessary to progress in this field if we want to maintain our country as a pioneer in ethanol production. In this work, we conducted field experiments to compare varieties contrasting to drought tolerance and performed physiological and molecular analysis. The stress condition led to reduced growth and development of all three varieties. The variety RB855536 was identified as the least productive, suffered more effects of oxidative stress, has accumulated more osmolytes and has the Calvin cycle less active. The variety RB867515 had a better performance, did not accumulate osmolytes, had no increase in the concentration of proline, had minor signs of oxidative stress and a better functioning of the Calvin cycle. In addition, we observed an induction of transcripts in the ABA response pathway and proteins related to photosynthesis, water transport and protein folding. The variety RB92579 had a pattern similar to that found in RB867515, but presented increased photosynthesis, lower oxidative stress and a lower loss of pigment. We succeded in identifying genes involved in the response to water stress in sugarcane as well as in distinguishing the varieties used in the study. We selected transcription factors associated with agronomical traits from the transcriptome data previously obtained by the group. We produced antibodies for 5 sugarcane TFs and standardized the methodology of ChIP-Seq using the 454 sequencing platform. Data analysis of ChIP-Seq using RNA Pol II antibody allowed us to detect contamination with the human genome, probably due to the use of gDNA in the reamplification control, as well as to map the detection repetitive regions, which may be binding sites of Pol II or background. The data reveals that sorghum and the sugarcane genome are similar despite the complexity of sugarcane. The results were important since they allow the beggining of studies to map regulatory regions in the sugarcane genome, as well as the uncovery of regulatory networks associated with agronomic traits of interest

Ecossistemas marinhos e estuarinos são o destino final de muitos contaminantes, e a ecotoxicologia ainda enfrenta a falta de organismos modelo para esses ambientes. Para desenvolver e apresentar um organismo teste adequado para ser utilizado em estudos de laboratório e campo, métodos para o cultivo, endpoints e biomarcadores devem ser avaliados. O anfípode marinho Parhyale hawaiensis é um modelo para estudos de biologia evolutiva e embrionária, é mundialmente distribuído e fácil de manipular em laboratório e consequentemente um modelo interessante para estudos ecotoxicológicos. O objetivo desse trabalho é padronizar condições de cultivo, teste de toxicidade, e desenvolver biomarcadores no anfípode P. hawaiensis e aplicá-los para avaliar os efeitos de nanopartículas metálicas na exposição via alimentação. As condições de cultivo foram estabelecidas em água salina reconstituída (salinidade 30 ± 2), temperatura de 24 ± 2 oC, fotoperíodo de 12-12h luz/escuro, coral triturado como substrato, alimentação diária com ração de peixe, troca de água parcial e aeração constante. As condições de teste compreendem a utilização de microplaca de 96-poços, organismos <7 dias, um organismo por poço com 200 &#181;L de solução por 96 h. Zinco, cobre, prata, cádmio e amônia foram selecionados como substância teste e a sensibilidade de P. hawaiensis foi similar e dentro da faixa de outros anfípodes marinhos. As condições para expressão gênica em P. hawaiensis foram desenvolvidas para o gene de referência 18S, dois genes de metalotioneínas (MT) e dois genes de glutationa S-transferase (GST). Entretanto, os genes selecionados não foram diferencialmente expressos nas condições testadas. Sendo assim, a análise da expressão gênica global, RNA-seq, foi realizada com organismos adultos alimentados por 7 dias com alimento contaminado com nanopartículas de prata (Ag-NPs), AgCl e controle. A análise da expressão gênica global (RNA-seq) foi conduzida com sucesso e destacou diferenças na resposta entre machos e fêmeas, bem como nos tratamentos com AgCl e Ag-NP. A análise comparativa revelou genes comuns entre as duas formas de Ag estudadas, e mostrou respostas diferentes no tratamento com Ag-NP, portanto, efeitos adversos diferentes são esperados após a exposição à alimentação, e os genes diferencialmente expressos podem ser usados como potenciais biomarcadores. Os resultados demonstraram que P. hawaiensis é um bom modelo para testes de toxicidade com um protocolo miniaturizado e o RNA-seq foi aplicado com sucesso para investigar as diferenças entre a exposição via alimentação com AgCl e Ag-NP e pode revelar potenciais biomarcadores. Além disso, este estudo desenvolveu protocolos e fornece informações moleculares que podem ser usadas em estudos futuros com P. hawaiensis. / Marine and estuarine ecosystems are the final destinations of many contaminants and ecotoxicology still faces the lack of model organisms for these environments. To develop and present a suitable test organism to be used in laboratory and field studies, methods for husbandry, ecotoxicity endpoints and biomarkers should be evaluated. The marine amphipod Parhyale hawaiensis is already a model for development and evolutionary studies, it is worldwide spread and easy to handle in the laboratory and so on an interesting model for ecotoxicology. The aim of this work is to standardize husbandry conditions, toxicity testing, and to develop molecular biomarkers in P. hawaiensis and apply them to evaluate the effect of metal nanoparticles in dietary exposure. The conditions for culturing were established in reconstituted seawater (30 ± 2 salinity), 24 ± 2 oC temperature, photoperiod 12-12 h light/dark, crushed coral as substrate, daily feeding with fish food, partial water exchange and constant aeration. Testing conditions comprised 96-well microplate, <7 days age organisms, one organism in each well containing 200 &#181;L of exposure media for 96 h. Zinc, copper, silver, cadmium and ammonia were selected as toxicants and sensitivity of P. hawaiensis were within the range of other marine amphipods. Gene expression conditions for P. hawaiensis were develop for the reference gene 18S, two metallothioneins (MT) and two glutathione-S-transferase (GST). However, selected target genes, analyzed by RT-qPCR, were not successful to detect differences in our treatment conditions. Thus, global gene expression analysis, RNA-seq, was conducted with adult organisms fed for 7 days to a contaminated food with silver nanoparticles (Ag-NPs), AgCl and control. Results highlighted differences between males and female\'s toxicity responses as well as AgCl and Ag-NP treatments. Comparison analysis revealed common genes expressed in both Ag forms, but also showed differences in Ag-NP treatment with both up and down regulated genes. Analysis are underway to better understand toxicity responses pathways. These results anticipate different responses to both Ag forms investigated, therefore different adverse effects are expected after feeding exposure to AgCl and Ag-NP and significative genes can be used as potential biomarkers. Our results demonstrated that P. hawaiensis is a good model for ecotoxicity tests with a miniaturized protocol and RNA-seq were successful applied to investigate the differences between AgCl and Ag-NP feeding exposure and could reveal promising biomarkers. Moreover, this study developed protocols and provide molecular information that can be used in future studies with P. hawaiensis.

Nutrição, regulação da expressão gênica e estresse oxidativo são características corresponsáveis pelo desenvolvimento e tempo de vida. Muitos animais apresentam uma relação clara entre o aumento da longevidade e a diminuição da reprodução quando submetidos a restrições alimentares. Contudo, a relação nutrição-longevidade não está completamente elucidada em organismos prioritariamente inférteis e cuja alimentação varia durante a vida adulta, tais como abelhas operárias da espécie A. mellifera. Para explorar tais questões, operárias recém-emergidas foram confinadas em gaiolas e alimentadas com uma dieta isenta de proteína (DNP), ou uma dieta rica em proteínas (DP) por sete dias. Investigamos a influência das dietas sobre: a morfologia das glândulas hipofaringeanas, o transcriptoma do corpo gorduroso, o acúmulo de dano oxidativo, a composição de hidrocarbonetos cuticulares (CHC) e a sobrevivência. Operárias do grupo DNP apresentaram menor sobrevivência e menor grau de ativação das glândulas hipofaringeanas do que operárias do grupo DP. A anotação funcional do transcriptoma de operárias do grupo DNP revelou ainda a ativação da resposta a estímulos, diferenciação, migração e desenvolvimento celular e de projeções neuronais. Todas essas são características compatíveis ao que se observa em operárias naturalmente mais velhas, como é o caso das forrageiras. A anotação funcional do transcriptoma de operárias do grupo DP revelou a ativação do metabolismo de proteínas, lipídios e carboidratos e regulação do sistema imunológico, características ligadas a operárias naturalmente jovens, como as nutridoras. Um total de 436 genes codificadores de proteínas foi apontado pelo sequenciamento em larga escala como dieta-responsivos (fold change > 2). O sequenciamento de RNAs curtos revelou três miRNAs dieta-responsivos (fold change > 2), miR-31a, miR-100 e miR-125, todos superexpressos no grupo DNP. Dentre esses 439 genes codificadores (mRNAs) e não codificadores de proteínas (miRNAs), dez foram experimentalmente validados em corpos gordurosos por RT-qPCR e quatro dos dez revelaram um perfil de expressão semelhante em cérebros frente às dietas. Juntos, nossos achados sustentam a existência de um circuito biológico integrado entre cabeça e corpo gorduroso capaz de regular os diferentes aspectos do controle da longevidade e do comportamento social. O ensaio de estresse oxidativo revelou não haver diferença entre o acúmulo de danos em cabeças nos dois grupos alimentares, talvez sinalizando a existência de uma resistência ou defesa antioxidante mais acentuada no sistema nervoso, protegendo-o. Por outro lado, observamos um nível maior de estresse oxidativo em corpos gordurosos de operárias do grupo DNP, sugerindo um déficit da resposta antioxidante, característica atrelada ao envelhecimento. Referente aos perfis de CHC, esses são similares entre operárias do grupo DP e operárias jovens (maior proporção de n-alcanos), bem como entre operárias do grupo DNP e operárias velhas (maior proporção de alcenos). Em conjunto, nossos resultados indicaram que uma dieta livre de proteínas antecipa o envelhecimento e sugerimos alguns novos marcadores do status nutricional e da progressão do desenvolvimento adulto em operárias: XP_624408.2, XP_393528.3 e XP_006561863.1, os órtólogos de CG9986, CG6058, CG2852, CG32031, CG5848 e CG9331, CG11138, CG10160, CG2674, CG5178, CG15884 e CG1322, além dos três microRNAs já citados. As alterações relacionadas ao status nutricional e envelhecimento, observadas nesse trabalho, suportam o uso de A. mellifera como um excelente organismo modelo no campo da nutrigenômica, bem como contribuem para o entendimento das modulações promovidas pela dieta no desenvolvimento adulto desse organismo. / Nutrition, oxidative stress and gene expression regulation are features responsible for development and lifespan. Many animals have a well-established relationship between an increase in longevity and a decrease in reproduction when subjected to dietary restrictions. However, the biological circuit nutrition-longevity is not fully elucidated in organisms primarily infertile and whose food consumption varies during adulthood, such as honey bee workers A. mellifera. To explore such questions, newly-emerged A. mellifera workers were confined in cages and fed a high protein diet (DP) or a protein free diet (DNP) for seven days. We analyzed the morphology of hypopharingeal glands, mRNAs and miRNAs global expression, oxidative damage, cuticular hydrocarbons profiles (CHC), and workers survival. Workers from DNP group had lower survival and lower activation of hypopharingeal glands than workers from DNP group. The functional annotation of DNP group transcriptome revealed activation of response to stimuli, cell differentiation, cell migration, cell growth and development of neuronal projections. All these biological processes are consistent with naturally older workers, such the foragers. The functional annotation of DP group transcriptome revealed activation of protein, lipid and carbohydrate metabolism and regulation of the immune system, features linked to younger workers, such nurses. Large-scale sequencing revealed that 436 protein-coding genes are diet-responsive (fold change > 2). Small RNAs sequencing revealed that three miRNAs are diet-responsive (fold change > 2), miR-31a, miR-100 and miR-125, all of them overexpressed in DNP group. Among these 439 coding (mRNA) and non-coding (miRNA) genes, 10 were validated in fatty bodies by RT-qPCR, and four of them showed a similar expression profile in brains in response to diets. Altogether, our results support the existence of an integrated biological circuit between head and fat body, which regulates different aspects of lifespan control and social behavior. Oxidative stress assay showed no difference between damage accumulation in honeybees heads from DP and DNP groups; maybe supporting the existence of a sharp resistance or antioxidant defense in the nervous system, protecting it. On the other hand, we observed a greater accumulation of oxidative stress markers in fat bodies of DNP, suggesting a deficit of antioxidant response, an aging feature. The CHC profiles are similar between DP group workers and young workers (high proportion of n-alkanes), and also similar between DNP group workers and old workers (high proportion of alkenes).Taken together, our results suggest that protein-free diet anticipates aging process and provides new markers of nutritional status and progression of workers adult development: XP_624408.2, XP_393528.3, XP_006561863.1, the orthologs of CG9986, CG6058, CG2852, CG32031, CG5848 e CG9331, CG11138, CG10160, CG2674, CG5178, CG15884 and CG1322, besides the three microRNAs already mentioned. The genetic changes related to nutritional status and aging observed in this work support the use of A. mellifera as an excellent model organism in the field of nutrigenomics and also contribute to the understanding of modulations promoted by diet on the adult development of this organism.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura agrícola, sendo hospedeira de vários patógenos, incluindo o fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, agente causal do carvão. A doença reduz a produtividade das lavouras de cana e a qualidade de seus produtos, sendo reconhecida pelo desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote, onde os teliósporos são produzidos. O objetivo deste estudo foi analisar o transcritoma da interação cana-de-açúcar - S. scitamineum, visando a identificação de genes do hospedeiro diferencialmente expressos em resposta à infecção fúngica. Gemas da variedade tolerante \'RB92-5345\' foram inoculadas com S. scitamineum e mantidas em casa de vegetação para a coleta das amostras, em dois momentos: 120 h após a inoculação, e no momento da emissão do chicote, aos 200 dias após a inoculação. Foram construídas 12 bibliotecas com base na abordagem RNAseq. Três estratégias computacionais foram utilizadas nas etapas de mapeamento e análise da expressão diferencial de genes da cana: (i) STAR e DESeq, tomando como referência o genoma do sorgo; (ii) Bowtie 2 e DESeq, e (iii) CLC Genomics Workbench, tomando como referência as sequências codificadoras (CDS) do sorgo. Diagramas de Venn foram construídos para identificar genes diferencialmente expressos comuns às três estratégias computacionais, aumentando a acurácia das análises. Para a anotação, foi usada a ferramenta BLAST2GO. Foram obtidos 225 milhões de reads; dentre os 185 milhões usados no mapeamento, 66% foram mapeados em genes e 51% nas CDS. Aproximadamente 77% dos genes e 87% das CDS mapeados apresentaram atividade transcricional (pelo menos um read mapeado), sob as condições do experimento, em ambos os momentos da interação. Um total de 596 e 2.148 genes diferencialmente expressos foram identificados nas respostas iniciais e tardias à infecção, respectivamente; para 79% deles foi possível atribuir uma função. Pelas intersecções, 41 (resposta inicial) e 206 (resposta tardia) genes foram comuns às três estratégias. Sugere-se que a planta percebe o patógeno no início da interação, porém o fungo é capaz de suprimir a resposta de defesa vegetal. Propõe-se que há uma reprogramação da expressão gênica defesa-orientada, favorecendo o desenvolvimento da planta, mesmo com a doença instalada. A expressão de genes relacionados à resistência, às vias de hormônios e com a formação da parede celular (além de inibidores de proteínas fúngicas) sugerem que a planta se empenha drasticamente para sobreviver após 200 dias de interação. Decifrando os perfis do transcritoma da cana na interação com S. scitamineum, este trabalho deve contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ao carvão. / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop, and hosts several pathogens, including the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut. The disease reduces the sugarcane crop yield and the quality of its products, and is recognized by the development of a whip-like structure, where teliospores are produced. The objective of this study was to analyze the transcriptome of sugarcane - S. scitamineum interaction and to identify differentially expressed genes from the host in response to fungal infection. Buds of the tolerant variety \'RB92-5345\' were inoculated with S. scitamineum and maintained in a greenhouse for two sampling interaction moments: 120 h after inoculation, and at the moment of the whip emission, 200 days after inoculation. Twelve libraries were constructed based on RNAseq approach. Three computational strategies were used in the mapping step and differential expression analysis of sugarcane genes: (i) STAR and DESeq, using as reference the sorghum genome; (ii) Bowtie 2 and DESeq, and (iii) CLC Genomics Workbench, using as reference the coding sequences (CDS) from sorghum. Venn diagrams were created to identify differential expressed genes that were common to the three computational strategies, thus increasing the analysis accuracy. For annotation, the BLAST2GO tool was used. We have obtained 225 million reads; out of the 185 million reads used for mapping, 66% were mapped to genes and 51% to CDS. Approximately 77% and 87% of the mapped genes and CDS respectively showed transcriptional activity (at least one read was mapped) under the experimental conditions at both interaction moments. A total of 596 and 2,148 differentially expressed genes were identified at early and late responses to the infection, respectively; it was possible to attribute function to 79% of them. Through intersectioning, 41 (early response) and 206 (late response) genes were found to be common to the three strategies. It is suggested that the plant recognizes the pathogen at the beginning of interaction period, though the fungal is able to suppress the host defense response. It is also proposed that a defense-oriented transcriptional reprogramming takes place, supporting plant development even with the disease setting. The expression of genes related to resistance, hormone pathways, and cell wall formation (as well as inhibitors of fungal proteins) suggests that the plant makes exceptional efforts to survive after 200 days of interaction. Deciphering the sugarcane transcriptome profile during the interaction with S. scitamineum, this study should contribute to a better understanding of the resistance mechanisms to the smut.

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Muito usada pela medicina popular para o tratamento de problemas gastrointestinais e respiratórios, a folha desta espécie produz um óleo essencial rico em terpenos, principalmente mono e sesquiterpenos. Estes compostos não são apenas de interesse farmacológico, como também industrial. A composição deste óleo pode variar em função de fatores abióticos e também de variações genotípicas. Diante da complexidade da síntese destes compostos a proposta deste trabalho foi uma ampla caracterização do transcriptoma de folha de Lippia alba, além da identificação de prováveis enzimas envolvidas na síntese de terpenos. Para isso, foi feito um sequenciamento deste transcriptoma usando a plataforma 454 (Roche) seguido de uma montagem de novo. Esta plataforma tem sido cada vez mais utilizada para o sequenciamento de transcriptomas numa abordagem conhecida como RNA-Seq. O sequenciamento de biblioteca preparada a partir de RNA total em 1/8 de placa gerou 104.631 leituras com comprimento médio de 184,48bp num total de 19.302.161 bases. Foram feitas montagens das leituras usando 2 diferentes assemblers a fim de compará-las. Com o Newbler 2.5 foi possível montar 2.686 contigs com comprimento médio de 349bp, enquanto o SeqMan2.2 gerou 13.448 contigs com média de 284bp. Em seguida, foi feita a anotação funcional com o Blast2GO para os contigs obtidos nas duas montagens, tendo sido anotados 51,49% e 30,88%, respectivamente, dos contigs do Newbler e do SeqMan. Por fim, a análise das sequências anotadas revelou algumas enzimas potencialmente envolvidas com a síntese de terpenos. Os resultados obtidos neste estudo pioneiro sobre a espécie comprovam que as tecnologias NGS podem ser uma ferramenta bastante eficiente para o sequenciamento de transcriptomas e servirão como referência para o preparo mais específico de novas bibliotecas. Futuros sequenciamentos devem contribuir para uma melhor cobertura do transcriptoma permitindo a descoberta inclusive de transcritos raros. / Lippia alba, popularly known as erva cidreira, is widely distributed throughout the Americas and can be found through almost whole Brazil. This species is largely used in folk medicine to treat gastrointestinal and respiratory problems, especially leaves, which produce an essential oil rich in terpenes, mainly mono-and sesquiterpenes. These compounds are not only of pharmacological interest, as well as industrial. Composition of essencial oil can vary depending on the developmental stage, the plant part and other abiotic factors. However, genotypic variations also contribute to oil composition variation. Given the complexity of terpenes synthesis, including diversity of enzymes involved in these metabolic pathways, the purpose of this work was a L. alba leaf transcriptome characterization, in addition to identifying some enzymes probably involved in terpene synthesis. For that, it was made a transcriptome sequencing using 454 platform (Roche) followed by a de novo assembly. This platform, along with other NGS technologies, has been increasingly used for transcriptome sequencing in an approach known as RNA-Seq. Sequencing of a library prepared from total RNA in 1/8 plate generated 104,631 reads with average length of 184.48 bp and a total of 19,302,161 bases. Read assemblies were made using two different assemblers in order to compare them. While Newbler 2.5, proprietary software platform, assembled 2686 contigs with average length of 349bp, SeqMan2.2 generated 13,448 contigs with an average of 284bp. Then, functional annotation was performed with Blast2GO for all contigs from both assemblies; 51.49% and 30.88% of contigs, respectively, from Newbler and SeqMan were annotated. Finally, analysis of annotated sequences revealed some enzymes potentially involved in terpene synthesis. Results obtained from this pioneering study on the species show that NGS technology can be a very efficient tool for transcriptome sequencing and they will serve as reference for preparation of other more specific libraries. New sequencings should contribute to a better coverage of this transcriptome, allowing discovery of even rare transcripts.

Craniofacial development is a tightly regulated event that requires expression of many genes at a precise space-temporal specificity. Interference in the regulation of such genes and their pathways is known to lead to abnormal phenotypes affecting the face and cranium. In this manner, regulation of these pathways is further complicated by interaction between genetic and environmental factors such that disturbance to either may result in craniofacial malformation, as orofacial clefts. Despite several at-risk loci have been identified, they do not completely explain the high heritability observed for the orofacial clefts and many questions remain open. For example, concerning the orofacial clefts transcriptome, the gene pathways which may be dysregulated and the affected cellular processes are still poorly understood. Further, if there is gene expression dysregulation in orofacial clefts, the causes leading to that need to be elucidated, such as the investigation of epigenetic factors. Also, since the multifactorial contribution makes environment relevant to this malformation, epigenetic and epigenomic differences in orofacial clefts should clarified. At last, rare syndromic forms of orofacial clefts with still unknown molecular cause and mechanisms should be elucidated in order to better understand craniofacial development and their impact in non-syndromic forms. Therefore, the main objective of this study was to investigate the molecular mechanisms involved in the aetiology of orofacial clefts, which was focused in gene expression and epigenetic analysis in non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P) as well as genetic, gene expression, animal modelling and epigenetics in Richieri-Costa-Pereira Syndrome (RCPS), a rare autosomal recessive syndromic form of orofacial cleft. We found significant transcriptome differences in NSCL/P in comparison to controls, revealing the BRCA1-dependent DNA damage repair pathway as compromised in NSCL/P cells leading to DNA damage accumulation. Next, we studied the potential of DNA methylation in those cells and found a slight but significant increase of BRCA1 promoter DNA methylation in NSCL/P cells and a distinct DNA methylation distribution, point to a possible epigenetic contribution in this phenomenon. We also evaluated the contribution of DNA methylation in 8q24.21 region, one of the most replicated regions in NSCL/P Genome-wide association studies and found no significant differences in our sample. Attempting to investigate DNA methylation in NSCL/P in an epigenomic level, we analysed methylomes and found 578 methylation variable positions in NSCL/P, highly enriched in regulatory regions and in relevant gene pathways for craniofacial development as Epithelial-Mesenchymal Transition pathway. We also studied effect of DNA methylation in familial NSCL/P displaying incomplete penentrance and found a significant increase of CDH1 promoter hypermethylation in penetrant cases in comparison to non-penetrants. Finally, by the use of different sequencing strategies and identity-by-descent analysis we mapped the mutation region of RCPS to EIF4A3 5\'UTR/promoter and found a complex structure of expanded repeats in RCPS patients leading to EIF4A3 downregulation. We were also able to validate the phenotypes using an animal modelling strategy in zebrafish. Because those repeats are CG rich, we investigated whether they were submitted to DNA hypermethylation in RCPS patients as a cause for EIF4A3 hypomorphism, however we found no evidence of methylation increase in RCPS. In conclusion, we were able to associate dysregulated pathways to NSCL/P susceptibility and DNA methylation differences to both non-familial and familial NSCLP. Besides, we were able to identify the genetic cause of RCPS, which now can be molecularly diagnosed. Altogether, our results add to the understanding of craniofacial development and the aetiology of orofacial clefts / O desenvolvimento craniofacial é um evento finamente regulado que requer a expressão de muitos genes em uma precisão espaço-temporal específica. A interferência na regulação de tais genes e suas respectivas vias é sabidamente causadora de fenótipos que afetam a face e o crânio. Neste sentido, a regulação destas vias é decorrente da interação entre fatores genéticos e ambientais, de tal forma que a perturbação de quaisquer destes fatores pode resultar em malformações craniofaciais, como as fissuras orofaciais. Apesar dos muitos loci de risco já identificados, estes não explicam completamente a alta herdabilidade observadas nas fissuras orofaciais e muitas questões permanecem em aberto. Por exemplo, em relação ao transcriptoma em fissuras orofaciais, as vias genéticas que podem estar desreguladas, assim como processos celulares afetados em decorrência, são ainda pouco compreendidos. Além disso, se há desregulação na expressão de genes em fissuras orofaciais, as causas que levam a essas diferenças necessitam ser elucidadas, como, por exemplo, por meio da investigação de fatores epigenéticos. Também, uma vez que o componente multifatorial torna a influência do ambiente relevante para esta malformação, diferenças epigenéticas e epigenômicas nas fissuras orofaciais devem ser melhor compreendidas. Por fim, formas raras e sindrômicas de fissuras orofaciais sem elucidação de causa moleculares devem ser estudadas para que melhor se compreenda o desenvolvimento craniofacial e o impacto destes mecanismos moleculares em formas não-sindrômicas. Portanto, nosso objetivo principal neste estudo foi investigar os mecanismos moleculares envolvidos na etiologia das fissuras orofaciais, com o foco na análise de expressão gênica e epigenètica em fissuras de lábio-palatinas não-sindrômicas (FL/P NS) e também o estudo genético, de expressão gênica, modelagem animal e epigenética na Síndrome de Richieri-Costa-Pereira (RCPS), uma forma sindrômica e autossômica recessiva de fissura orofacial. Nós encontramos diferenças significantes no transcriptoma de FL/P NS em comparação com controles, que revelaram o comprometimento da via do BRCA1 no reparo ao dano de DNA e o acúmulo de dano de DNA em células FL/P NS. Em seguida, nós estudamos o potencial da metilação de DNA nestas células e encontramos um pequeno, porém significante, aumento de metilação de DNA no promotor do BRCA1 e uma distribuição diferente de metilação, apontando para uma possível contribuição epigenética na desregulação do gene. Nós também avaliamos a contribuição da metilação de DNA na região 8q24.21, uma das mais associadas às FL/P NS por meio de Genome-wide association studies, porém não encontramos diferenças significantes na nossa amostra. Com o intuito de investigar a metilação de DNA em FL/P NS em uma escala epigenômica, nós analisamos o perfil de metilomas e encontramos 578 sítios diferencialmente metilados nas FL/P NS, altamente enriquecidos em regiões regulatórias e em vias relevantes para o desenvolvimento craniofacial como a via de Transição Epitélio-Mesenquimal. Nós também estudamos o efeito da metilação de DNA em casos famílias de FL/P NS com penetrância incompleta e encontramos um aumento significativo de metilação do promotor do CDH1 nos casos penetrantes em comparação aos não-penetrantes. Por último, por meio de diferentes estratégias de sequenciamento e análise de segregação de haplótipos nós mapeamos a mutação de RCPS na região 5\'UTR/promotor do EIF4A3 e encontramos uma estrutura complexa de expansão de repetições nos pacientes RCPS, ocasionando a diminuição da expressão do EIF4A3. Nós também reproduzimos fenótipos comparáveis aos da RCPS por meio de modelo animal em zebrafish. Uma vez que tais repetições são ricas em CG, nós investigamos se estas poderiam ser submetidas à metilação de DNA em pacientes RCPS como uma causa para a redução dos transcritos do EIF4A3, porém não encontramos evidências de aumento de metilação em RCPS. Em conclusão, nós conseguimos associar vias gênicas desreguladas à susceptibilidade para as FL/P NS e diferenças de metilação de DNA tanto em casos familiais como não-familiais de FL/P NS. Além disso, identificamos a causa genética de RCPS, sendo que a síndrome pode ser agora diagnosticada molecularmente. Em conjunto, nossos resultados adicionam ao conhecimento do desenvolvimento craniofacial e na etiologia das fissuras orofaciais

A identificação de genes alvos, vias de sinalização e vias metabólicas para melhoramento de cana-de-açúcar associados a características de interesse, ainda são pouco conhecidos e estudados. Alguns estudos do transcriptoma através de plataformas de microarranjo têm buscado identificar listas de genes, para experimentos tecido- específico ou submetidos a condições de estresse bióticos e abióticos. Estudos pontuais destes dados tem sido associados a vias metabólicas ou vias de sinalização já descritas na literatura, de forma a identificar alterações relacionadas a padrões de expressão gênica. Porém, estas relações em cana-de-açúcar são pouco conhecidas e estudadas. O estudo e entendimento de cana-de-açúcar por meio da diversidade genética e de sua adaptação ao ambiente é um grande desafio, principalmente pela ausência de um genoma sequenciado e por possuir um genoma complexo. Apresentamos nossos resultados para tentar superar tais limitações e desafios para estudos de expressão gênica. Foram desenvolvidas metodologias para anotação funcional do transcriptoma, centradas na transferência de anotação, identificação de vias metabólicas e enzimas pelo método de similaridade bi-direcional, predição de genes full-length, análises de ortologia e desenho de oligonucleotídeos para microarranjos customizados, resultando no ORFeoma de cana-de-açúcar, na identificação e classificação de famílias de fatores de transcrição e identificação de genes ortólogos entre gramíneas. Além disso, desenvolvemos uma plataforma para processamento e análise automatizada de experimentos por microarranjo, para armazenamento, recuperação e integração com a anotação funcional. Adicionalmente desenvolvemos e implementamos métodos para seleção de genes diferencialmente e significativamente expressos, e abordagens para análise de enriquecimento de categorias, e escores de atividade de vias metabólicas. De forma a integrar a anotação funcional do transcriptoma aos estudos por expressão gênica, desenvolvemos a plataforma CaneRegNet e uma interface para integração desta rede de dados biológicos e conhecimentos, composta por aplicativos para consulta e prospecção de dados por análises de agrupamento e correlação entre experimentos de microarranjo, possibilitando a geração de novas hipóteses e predições dentro da organização da regulação celular. / The identification of target genes, metabolic and signaling pathways associated with characteristics of interest to the sugarcane improvement are still poorly known and studied. Some transcritptome studies through microarray platforms has tried to identify lists of genes, for tissue-specific experiments or subjected to conditions of biotic and abiotic stress. In the literature specific studies of these data has already been associated with metabolic or signaling pathway, in order to identify changes in these tracks related to patterns of gene expression. However, these relations are still little know and generally defined slightly. The study and understanding of sugarcane by means of genetic diversity and its adaptation to the environment is a major challenge, mainly due to the absence of a sequenced genome and by your complex genome. We present our results to surpass this barrier e challenges for the study of gene expression. Methodologies were developed for the transcriptome functional annotation, focused on the annotation transfer, identification of metabolic pathways and enzymes by the bi- directional method; prediction of full-length genes; ortology analysis and probe design for customized microarrays, resulting in the sugarcane ORFeome, the identification and classification of transcription factor families and identification of ortholog genes between grasses. Besides that, we have developed a plataform for automated processing and analysis for microarray experiments, to store, retrieve and integration with the functional annotation. Additionally, we have developed and implemented methods for identification of differentially and significantly expressed genes, and approaches for over-represented analysis and functional class scoring (FCS). To integrate the functional annotation and the studies by gene expression profile, we have developed the CaneRegNet platform and an interface to integrate this network of biological data and knowledge, composed by searching and data mining tools for clustering and correlations between microarray experiments, enabling the generation of new hypothesis and predictions around the organization of cellular regulation.

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

Após o seqüenciamento completo do genoma humano, a busca e caracterização do conjunto completo de genes humanos constitui-se no principal desafio nesta área de investigação, sendo o passo limitante para o progresso na exploração dos dados contidos no seqüenciamento deste genoma. O projeto de transcriptoma denominado \"Transcript Finishing Initiative\" (TFI) surgiu neste contexto, com o objetivo principal de gerar fragmentos parciais de transcritos humanos, que não haviam sido descritos previamente e determinar sua seqüência, para iniciar a caracterização de novos genes humanos. A estratégia utilizada foi q alinhamento de todas as seqüências ORESTES e ESTs disponíveis com a seqüência pública do genoma humano e o agrupamento j c1usterização destas com base nas coordenadas deste genoma. Algumas das regiões que não eram cobertas por estas seqüências foram, então, completadas, por RT-PCR, utilizando-se primers ancorados nos clusters vizinhos. Cada par de clusters de ESTs selecionado para validação experimental foi designado como uma Unidade do \"Transcript Finishing\" (TFU), tendo sido validadas experimentalmente, pelo grupo TFI, Um total de 211 TFUs foram validadas, sendo que 197 seqüências consenso foram submetidas ao Genbank (CF272536-CF272733). Atualmente, apenas um pequeno número destas seqüências ainda são considerados genes novos, sem que haja um cDNA depositado em banco de dados; contudo para um número considerável destas TFUs não existe qualquer caracterização sobre sua função. Na tentativa de contribuir para melhor caracterização dos genes identificados no projeto TFI, e tendo, como base, a linha de pesquisa do laboratório, que busca genes diferencialmente expressos envolvidos em transformação maligna/tumorigênese, o presente trabalho propôs a utilização das seqüências TFUs para estudar sua possível associação com tumores de glia humanos e outros tipos de tumores (de próstata e de mama). Para tanto, as TFUs foram analisadas \"in silico\" para estabelecer seu grau de ineditismo como um novo gene ou um gene sem função conhecida, e, para análise de sua expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais de cérebro, próstata e mama. Para validar estas análises computacionais na bancada, foram gerados macro- e microarranjos de DNA utilizando-se as TFUs disponíveis como clones físicos ou amplicons, para o rastreamento com sondas das linhagens celulares A172 e T98G de glioblastomas. Os resultados das análises destes dados foram confirmados por PCR quantitativo tanto nas linhagens como em amostras clínicas de astrocitomas que apresentam diversos graus de malignidade. Como resultado, foi possível organizar um Banco de Clones Físicos de TFUs, além de identificar e selecionar uma TFU (168), cuja expressão correlaciona diretamente com o grau de malignidade dos tumores de glia. Esta seqüência corresponde a um novo gene, já que não existe a seqüência de cDNA completo nos bancos de dados. Em vista disto, a TFU168 foi selecionada para estudos funcionais posteriores, que já estão em andamento, através da obtenção de suaseqüência completa de cDNA para ensaios de superexpressão e do silenciamento gênico através de RNAi. / Upon complete sequencing of the human genome, identification and characterization of the complete set of human genes constitutes the major challenge in this research field, constituting the limiting step for progress in exploration of the informations contained in the genome sequencing data. The Transcript Finishing Initiative (TFI) transcriptome project arose in this context, aiming at the generation, sequencing and characterization of partial new human transcripts and genes. The strategy adopted was the alignment of the alI the available ORESTES and EST sequences data with the public human genome sequence and their clusterization based on the coordinates of this genome. Thus, some of the regions which were not cover by ESTs and ORESTES (gaps) were then completed by RT-PCR using primers anchored in the neighboring clusters. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was named Transcript Finishing Unit (TFU). A large number (211) of TFU s were validated and 197 -consensus sequences were submitted to the Genbank (CF272536-CF272733). At present, only a few of these sequences are considered as new genes without a full-Iength cDNA sequence deposited in the data bank, however, no functional characterization is yet available for a large number of these sequences. In an attempt to contribute to further characterization of these genes identified in the TFI project and keeping in mind the main interest of our laboratory, which is the identification of differentially expressed genes in tumor versus normal tissue, the present work aims at utilizing these TFUs to find differentially expressed genes associated with human glial tumors and with other kinds of tumors. To this end, these sequences were first subjected to in silico analysis in order to establish their degree of ineditism (new sequences and/or sequences with unknown function) and their expression profile between normal and tumoral tissues of brain, mammary gland and prostate. To validate this computational analysis, DNA macro- and microarrays were generated with the TFU sequences and screened with cDNA probes obtained from the A172 and T98G glioblastomas cell lines. The results of these screenings were confirmed by quantitative PCR both in cell lines and in tumor samples of different degrees of malignancy. The results obtained in this work allowed the organization of a TFUs Physical Clones Bank and the identification and selection of one sequence (TFU 168), whose expression is directly re1ated to the degree of tumor malignancy. This sequence constitutes a new gene, since no complete cDNA sequence is available in the data banks. Therefore, TFU168 was selected for further functional studies by obtaining its full-Iength cDNA sequence to be used for over expression by silencing this gene using RNAi.

Peptídeos antimicrobianos (AMP) são importantes componentes do sistema imune de todos os organismos vivos. No plasma de Acanthoscurria rondoniae isolamos 15 AMP com similaridade com a hemocianina. As sete subunidades da hemocianina foram sequenciadas e sua estrutura tridimensional determinada. A rondonina, processada a partir de uma enzima do plasma em condições ácidas apresentou melhor atividade em pH ácido, sinergismo com gomesina, não citotóxico, não interagiu com membranas artificiais lipídicas, protegeu as células da infecção por vírus humanos de RNA e seu mecanismo de ação em leveduras está associado com material genético. Nossos resultados nos ajudam a entender porque aracnídeos sobreviveram por um longo tempo na escala evolutiva. E como as doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana torna-se vital investir na busca de substâncias naturais ou sintéticas que exibam atividades antimicrobianas específicas e, acima de tudo, que as exerçam através de mecanismos de ação alternativos daqueles dos antibióticos disponíveis. / Antimicrobial peptides (AMP) are important components of the immune system of all living organisms. In the plasma of Acanthoscurria rondoniae we isolated 15 AMP with similarity to hemocyanin. The seven subunits hemocyanin were sequenced and determined its three-dimensional structure. The rondonin, processed from a plasma enzyme under acidic conditions showed best activity at acid pH, synergism with gomesin, non-cytotoxic, does not interacted with lipid artificial membrane, protected the cells from infection by human virus RNA and its mechanism of action in yeast is associated with genetic material. Our results help us understand why arachnids have survived for a long time on the evolutionary scale. And how infectious diseases are among the leading causes of death in human population becomes vital to invest in the search for natural or synthetic substances that exhibit specific antimicrobial activities and, above all, that engage through alternative mechanisms of action of these antibiotics available.