O infarto do miocárdio (IM) é definido como um processo de necrose dos cardiomiócitos por inadequado suprimento sanguíneo às suas demandas. Visando a manutenção das funções cardiovasculares, devido à perda de massa ventricular contrátil, modificações estruturais, elétricas e bioquímicas têm sido observadas com o passar do tempo pós-IM. Quando estas se associam com a preservação da função cardíaca, são definidas como remodelamento cardíaco (RC) bem adaptado. Por outro lado, quando associadas com a disfunção ventricular e insuficiência cardíaca, define-se como RC mal adaptado. Apesar destes RC já estarem bem caracterizados, maiores investigações são necessárias para o entendimento de seus mecanismos. Neste sentido, este trabalho tem como objetivo principal avaliar o perfil da concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e o estado redox celular, além de suas associações com algumas vias de sinalização no RC após o IM. Para isso, ratos Wistar machos com aproximadamente 60 dias de vida, sob anestesia profunda, foram submetidos à oclusão da artéria coronária descendente anterior para indução do IM ou simulação deste. Feito isso, estes animais foram divididos em 6 grupos experimentais: 3 sham-operated (Sham) e 3 infartados (MI), subdivididos de acordo com o tempo em que foram eutanaziados: 2 dias, 7 dias e 28 dias após o procedimento cirúrgico. A função cardíaca foi avaliada pela ecocardiografia e pelo cateterismo do ventrículo esquerdo. Em seguida, ainda sob plano anestésico, os animais foram eutanaziados e o coração preparado para análise da concentração de H2O2, da razão GSH/GSSG e do imunoconteúdo das proteínas Akt, mTOR, GSK3 , ERK, JNK, AngII, AT1, AT2, AIF, Trx-1 e GAPDH. Confirmamos uma disfunção cardíaca associada ao desbalanço redox 28 dias pós-IM. Junto a isso, observamos uma correlação positiva entre a concentração de H2O2 e proteínas pro-apoptóticas neste tempo. Uma vez caracterizadas estas associações 28 dias pós-IM, período em que conhecidamente são observados sinais de disfunção ventricular em ratos com moderados e grandes infartos, passamos para a avaliação do perfil temporal. Neste caso, observamos um aumento da Trx-1, associado com baixas concentrações de H2O2 e menor ativação da JNK, uma conhecida proteína próapoptótica, no homogeneizado cardíaco de ratos eutanaziados 2 dias após o procedimento cirúrgico. Além do mais, demonstramos um pronunciado aumento na concentração de H2O2, assim como na ativação da JNK, nos animais infartados, entre o segundo e o sétimo dia. Justamente nesta janela temporal, pudemos observar uma queda brusca na função cardíaca e um pico do imunoconteúdo de angiotensina II. Em conjunto, estes achados sugerem uma incapacidade da Trx-1 em neutralizar a formação adicional de espécies ativas de oxigênio promovida pela maior ativação do sistema renina angiotensina. Este cenário parece ser propício para a transição do remodelamento cardíaco bem adaptado para o mal adaptado após o IM. Portanto, com o entendimento deste perfil temporal, novas estratégias terapêuticas podem ser sugeridas. / Myocardial infarction (MI) is defined as a process of cardiomyocyte necrosis due to inadequate blood supply to their demands. For the maintenance of cardiovascular function after to loss of ventricular contractile mass, structural, electrical and biochemical changes have been observed over time after MI. When these are associated with the preservation of cardiac function, are defined as adaptative cardiac remodeling (CR). Moreover, when associated with ventricular dysfunction and heart failure is defined as maladaptative CR. Despite these CR are already well characterized, further investigations are necessary to understand its mechanisms. Thus, in the present study, we investigated the profile of the concentration of hydrogen peroxide (H2O2) and cellular redox state, as well as their associations with some signaling pathways in CR post-MI. For this purpose, male Wistar rats (±60 days), under deep anesthesia, were submitted to occlusion of the left anterior descending coronary artery to induce MI or sham-operation. The animals were divided into six groups: three sham-operated (Sham) and 3 infarcted (MI), subdivided in 2 days, 7 days and 28 days after surgery. Cardiac function was assessed by echocardiography and catheterization of the left ventricle. Then, still under anesthesia, the animals were euthanized and the heart prepared for analysis of the concentration of H2O2, the GSH/GSSG and immunocontent protein Akt, mTOR, GSK-3 , ERK, JNK, AngII, AT1, AT2, AIF, Trx-1 and GAPDH. We confirm a cardiac dysfunction associated with redox imbalance 28 days post-MI. Moreover, we observed a positive correlation between the concentration of H2O2 and pro-apoptotic proteins at this time. Once characterized these associations 28 days post-MI, period which notoriously are observed signs of ventricular dysfunction in rats with moderate and large infarcts, we to evaluate the temporal profile. In this case, we observed an increase of Trx-1 that was associated with low concentrations of H2O2 as well as with a decreased activation of JNK, a known pro-apoptotic protein, in heart homogenates of rats euthanized 2 days after surgery. Furthermore, we demonstrate a pronounced increase in the concentration of H2O2, as well as in the activation of JNK in infarcted animals, between the second and seventh days. In this period, we also could see a sharp decline in cardiac function and a peak immunocontent of angiotensin II. Taken together, our results suggest an inability of Trx-1 in counterregulated the formation of additional reactive oxygen species promoted by increased activation of the renin angiotensin system. This scenario seems to be favorable to the transition of adaptative to maladaptative CR post-MI. Therefore, with the understanding of this temporal profile, new therapeutic strategies can be suggested.

O Cor pulmonale induzido pela administração intraperitoneal de monocrotalina é um dos modelos mais utilizados para estudar os efeitos dessa síndrome sobre o sistema cardiovascular. Essa síndrome é caracterizada por um desequilíbrio no estado redox celular e uma consequente alteração no imunoconteúdo de proteínas sinalizadoras para a hipertrofia e insuficiência cardíaca. Normalmente, o peróxido de hidrogênio caracteriza-se como a espécie reativa do oxigênio mais estável, e por isso, a molécula mais envolvida com a modulação dessa sinalização. O exercício físico aeróbio tem sido extensamente estudado devido ao fato de ser uma prática que altera o estado redox celular e, consequentemente, a sinalização nos cardiomiócitos. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que o exercício físico poderia modular o estado redox no ventrículo direito em animais tratados com monocrotalina e, ao mesmo tempo, provocar alterações na sinalização celular, estrutura e função cardíaca. Ratos Wistar machos com aproximadamente 180 gramas de massa corporal foram treinados por quatro semanas após a injeção de monocrotalina ou solução salina. Os grupos experimentais (n=6-9 animais/grupo) foram: controle sedentário (CS) – ratos sedentários que receberam uma dose única de solução salina (i.p), monocrotalina sedentário (MS) – ratos sedentários que receberam uma dose única de monocrotalina (i.p), controle treinado (CT) - ratos treinados que receberam uma dose única de solução salina (i.p) e monocrotalina treinado (MT) - ratos treinados que receberam uma dose única de monocrotalina (i.p). As medidas hemodinâmicas foram realizadas após 24 horas da última sessão de exercício físico aeróbio. Os dados de pressão diastólica final do ventrículo direito (PDFVD), pressão sistólica do ventrículo direito (PSVD), derivada pressão/tempo máxima (dP/dtmax) e derivada pressão/tempo mínima (dP/dtmin) foram analisados. Após a análise hemodinâmica, os ratos foram mortos por deslocamento cervical e seus órgãos (coração, pulmão e fígado) foram coletados para análises morfométricas, bioquímicas e moleculares. As concentrações de peróxido de hidrogênio e a relação GSH/GSSG foram medidas obtidas com o objetivo de verificar o estado redox nos diferentes grupos experimentais. A massa dos órgãos foi utilizada para analisar a hipertrofia cardíaca, congestão pulmonar e hepática. A massa ventricular direita foi utlizada em cortes histológicos e para a análise de proteínas relacionadas com o remodelamento cardíaco pela técnica de Western Blot. A administração de monocrotalina provocou hipertrofia do ventrículo direito, congestão pulmonar, aumento da PDFVD, da PSVD, da dP/dtmax e da dP/dtmin nos animais MS e MT. Além disso, nos animais MS e CT, notamos uma redução nas concentrações de peróxido de hidrogênio, sugerindo uma modificação do sistema de defesa antioxidante provocada pela monocrotalina e pelo exercício físico. Já quanto ao volume de vasos, no grupo MS tivemos uma diminuição dessa variável em relação ao seu controle (CS), sendo que, o exercício físico preveniu este efeito nos animais MT em relação ao grupo MS. O exercício físico aeróbio promoveu uma redução no volume intersticial e na espessura da túnica média da artéria pulmonar nos animais MT. A monocrotalina provocou uma redução na relação p-GSK-3β/GSK-3β no grupo MT, sendo que que o exercício físico foi capaz de provocar um aumento nessa relação. Dessa forma, acreditamos que o exercício físico aeróbio possa alterar a função de proteínas redox-sensíveis e, dessa forma, modular a hipertrofia cardíaca nos animais que receberam a monocrotalina. / The Cor pulmonale induced by monocrotaline intraperitoneal administration is one of the most widel used models to study the effects of this syndrome on the cardiovascular system. This syndrome is characterized by an imbalance in cellular redox state and a consequent change in immunocontent of signaling proteins for hypertrophy and heart failure. Mostly, hydrogen peroxide is characterized as the most stable reactive oxygen species, and therefore the most involved molecule in the modulation of these signaling pathways. The aerobic exercise has been extensively studied due to the fact that it is a practice that alters the cellular redox state and thus signaling in cardiomyocytes. Thus, the aim of this study was to test the hypothesis that exercise could modulate the redox state of the right ventricle in animals treated with monocrotaline and, at the same time, cause changes in cell signaling, structure and cardiac function. Male Wistar rats approximately 180 grams of body mass were trained for four weeks after injection of monocrotaline or saline. The experimental groups (n = 6-9 animals / group) were: sedentary control (SC) - sedentary rats that received a single dose of saline (ip), sedentary monocrotaline (SM) - sedentary rats that received a single dose of monocrotaline (ip), trained control (TC) - trained rats that received a single dose of saline (ip) and trained monocrotaline (TM) - trained rats that received a single dose of monocrotaline (ip). Hemodynamic measurements were performed 24 hours after the last session of aerobic exercise. Data for end-diastolic pressure of the right ventricle (EDPRV), right ventricular systolic pressure (RVSP), maximum derived from pressure/time (dP/ dtmax) and minimum derived pressure/time (dP/dtmin) were analyzed. After hemodynamic analysis, mice were killed by cervical dislocation and their organs (heart, lung and liver) were colected. The hydrogen peroxide concentrations and GSH/GSSG are measurements with the aim of verifying the redox state in different experimental groups. The organ weights was used to analyze cardiac hypertrophy, pulmonary and hepatic congestion. A portion of the right ventricular mass was utilized for histological examination and other part fot analyze proteins related to cardiac remodeling, by Western blot. Morphometric analysis were performed after the removal of organs. Administration of monocrotaline caused right ventricular hypertrophy, pulmonary congestion, increased EDPRV, RVSP, dP/dtmax and dP/dtmin in SM and TM animals. Furthermore, in animals and SM and TC, we visualized a reduction in the concentrations of hydrogen peroxide, suggesting a change in the antioxidant defense system caused by monocrotaline and by exercise. Already for the volume of vessels in the SM group, we note a decrease of this variable in relation to its control (SC). At the same time, TM animals had an increase in the volume of vessels in relation to the SM group, showing that exercise promotes an increase in this item. The aerobic exercise promoted a decrease in interstitial volume and thickness of the muscle layer of the pulmonary artery in animals TM. The monocrotaline caused a decrease in the p-GSK-3β/GSK-3β in the TM group, showed that exercise was able to cause an increase in this ratio. Thus, we believe that aerobic exercise can alter the function of signaling proteins and thereby modulate cardiac hypertrophy in animals that received monocrotaline.

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.

Orientador: Otávio Rizzi Coelho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T21:29:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tornatore_ThaisFranchini_D.pdf: 5344920 bytes, checksum: 13bb7f4ae7264a0aca117131579c9b8e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudamos o gene da FAK (focal adhesion kinase) na mitocondriogênese cardíaca induzida por estresse mecânico. O estresse prolongado (2-12 hs) de miócitos do ventrículo esquerdo de ratos neonatos(NRVM) aumentou a expressão do regulador transcricional mitocondrial PGC-1? (peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1), NRF-1 (nuclear respiratory factor) e o Tfam (mitochondrial transcription factor A). A ativação da cascata transcricional mitocondrial em cardiomiócitos estirados foi acompanhada pelo aumento da mitocondriogênese (aumento da densidade mitocondrial e número de cópias do DNA - mtDNA) e hipertrofia(tamanho da célula e transcrição do ANP). Estresse mecânico também aumentou a fosforilação da FAK, a localização nuclear e associação com PGC1-?. FAK C-terminal Recombinante, mas não a N-terminal ou domínio kinase, precipitaram PGC-1? em extratos nucleares de NRVMs. Além disso, a inibição da expressão da FAK por RNA de interferência suprimiu a hiper regulação do PGC-1? e NRF-1, e atenuou o aumento da mitocondriogênese e hipertrofia em cardiomiócitos. Ao mesmo tempo, a inibição da FAK reduziu os níveis de ATP em cardiomiócitos estirados. Estudos complementares em ventrículos esquerdo de camundongos adultos revelaram aumento da expressão de PGC-1?, NRF-1 e mtDNA em resposta à sobrecarga pressórica. In vivo o silenciamento da FAK atenuou a hiper regulação do PGC-1?, NRF-1, mtDNA e a hipertrofia do ventrículo esquerdo induzida por sobrecarga pressórica. A ativação da sinalização da FAK parece ter importante relação no aumento da mitocondriogênese paralelamente à resposta do aumento hipertrófico relacionado ao estresse mecânico dos cardiomiócitos / Abstract: We studied the implication of FAK (focal adhesion kinase) in cardiac mitochondriogenesis induced by mechanical stress. Prolonged stretching (2-12 hs) of neonatal rat ventricular myocytes (NRVM) enhanced the expression of mitochondria transcriptional regulator PGC-1? (peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1), NRF-1 (nuclear respiratory factor) and transcripts of Tfam (mitochondrial transcription factor A). The activation of the mitochondria transcriptional cascade in stretched NRVM was accompanied by enhanced mitochondriogenesis (increases in mitochondrial density and DNA copy number - mtDNA) and hypertrophy (cell size and ANP transcripts). Cell stretching also enhanced FAK phosphorylation, nuclear localization and association with PGC1?. Recombinant FAK C-terminal, but not the N-terminal or kinase domain, precipitated PGC-1? from NRVM nuclear extracts. Moreover, depletion of FAK by RNA interference suppressed the upregulation of PGC-1? and NRF-1, and markedly attenuated the enhanced mitochondriogenesis and hypertrophy of stretched NRVMs. Concomitantly, FAK depletion induced a marked reduction of ATP levels of stretched NRVM. Complementary studies in adult mice left ventricle revealed enhanced expression of PGC-1?, NRF-1 and mtDNA in response to pressure overload. In vivo FAK silencing attenuated the upregulation of PGC-1?, NRF-1, mtDNA and left ventricular hypertrophy induced by pressure overload. Activation of FAK signaling seems to be important for conferring enhanced mitochondriogenesis coupled to the hypertrophying growth response to mechanical stress in cardiomyocytes / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Eugenio Cesar Ulian. / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T07:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felix_JulianadeMaria_D.pdf: 2208995 bytes, checksum: 381046fcda413b39719db5fa437f223e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os processos associados ao acúmulo de sacarose e o metabolismo envolvido durante o crescimento e a maturação da cana-de-açúcar tem sido objeto de estudo intensivo. Uma estratégia para associar expressão gênica com uma característica desejada é comparar o perfil de expressão entre indivíduos pertencentes a uma população segregante para aquela determinada característica. Essa estratégia, denominada 'genetical genomics¿ foi utilizada nesse presente trabalho ao avaliar o perfil de expressão gênica de uma população de cana-de-açúcar que segrega para teor de sacarose. Para tal nós utilizamos cDNA microarrays que contém 1,280 elementos envolvidos em transdução de sinal, transcrição, desenvolvimento, ciclo celular, resposta à estresse e interação com patógenos, designado chip SUCAST (Sugarcane Signal Transduction). Com o objetivo de desvendar o envolvimento desses elementos no metabolismo de sacarose, foram comparados os perfis de expressão entre amostras de indivíduos de cana-de-açúcar de uma população segregante para teor de sacarose. Foram analisadas amostras de folha madura, sendo que 24 genes foram identificados como diferencialmente expressos. Também foram analisadas amostras de entrenós em desenvolvimento, sendo que 88 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma amostra de entrenó analisada. Dada a complexidade genética da cana-de-açúcar, esta estratégia nos permitiu identificar genes candidatos que podem controlar vias metabólicas sinalizadas por açúcar envolvida na síntese e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. E finalmente, no trabalho descrito no capítulo 4 nós procuramos por genes codificantes para proteínas tranportadoras de açúcar no banco de dados do SUCEST. A análise de seus diferentes padrões de expressão observado nesse trabalho sugerem seu possível envolvimento tanto em tecidos fonte quanto dreno, e também em diferentes estágios de desenvolvimento / Abstract: Due to the capacity of sugarcane for storing high concentrations of sucrose in the culm, the processes associated with sucrose accumulation and metabolism during sugarcane growth and maturation have been the subject of intensive study. A strategy for associating gene expression with a trait is described in which individuals exhibiting particular traits are selected from segregating populations of sugarcane and their gene expression profiles compared. In this current work we used the 'genetical genomics¿ strategy on a sugarcane population segregating for sugar content. For this purpose we used cDNA microarrays that contains 1,280 components involved in several aspects of signal transduction, transcription, development, cell cycle, stress responses and pathogen interaction, that was designed Sugarcane Signal Transduction (SUCAST) chip. In order to assess the involvement of these elements in sucrose metabolism, the expression profiles of individuals from a sugarcane population segregated for sugar content were compared. In the work described at chapter 2 we analyzed mature leaf samples, and twenty-four genes were identified as differentially expressed. We also analyzed maturing internodes samples, and 88 genes were identified as differentially expressed at least in one internode sample. Given the complex genetics of sugarcane, this strategy could identify candidate genes that may control sugar-signaling pathways involved in sucrose synthesis and accumulation in sugarcane. And finally, in the last chapter we searched for genes encoding sugar transport proteins in the SUCEST database. The differential expression patterns of these putative transporter genes in sugarcane plants observed in this work suggest that they have many roles in both source and sink tissues, and at different developmental stages / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Silvia Mika Shishido / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T19:46:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_Daisy_M.pdf: 1450123 bytes, checksum: e8dc961f855a7ea88daa10bb8ee00685 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A riboflavina (RF) é uma vitamina hidrossolúvel pertencente ao complexo vitamínico B2 e precursora das coenzimas FMN e FAD. Além da função biológica como componente de coenzimas, a RF apresenta atividade antitumoral e fotossensibilizante. A proposta principal desse estudo se baseou na avaliação da fototoxicidade da RF, bem como na determinação de marcadores moleculares da inflamação, senescência e morte celular, ações deletérias normalmente desencadeadas pela radiação UVA. Os resultados obtidos indicam que a RF tem potencial aplicação na terapia fotodinâmica, levando se em conta os modelos celulares utilizados, fibroblastos (BALB/c 3T3) e queratinócitos humanos (HaCaT). As células BALB/c 3T3 tratadas com RF 6,0 mM e dose de 5 J/cm² de radiação UVA, apresentaram indução de apoptose principalmente pela via intrínseca. A indução de senescência foi evidenciada pelo aumento da p-caveolina e aumento da atividade da MMP-2 (principal protease responsável pela degradação de colágeno). De acordo com os níveis de NFkB e p- IKKa/b, a RF não alterou significativamente o processo de inflamação desencadeado pela radiação UVA. Nas células HaCaT, o tratamento com 5,0 mM de RF e dose de 5 J/cm² de radiação UVA levou a ativação da apoptose induzida tanto pela via extrínseca como pela intrínseca. O aumento nos níveis de p-caveolina, p21 e da atividade das MMPs-2 e -9 sugerem à indução de processo de senescência precoce também nos queratinócitos. Além disto, a diminuição da expressão do NF?B indica que o mesmo esteja se translocando para o núcleo e, portanto, regulando a resposta inflamatória. Outro aspecto avaliado foi a influência do copolímero F-127 na fototoxicidade da RF. A irradiação do hidrogel contendo F-127 e riboflavina manteve a propriedade fototóxica da mesma. Nossos dados sugerem que a RF apresenta potencial para uso em terapia fotodinâmica, uma vez que a mesma se mostrou fototóxica quando irradiada com doses subtóxicas de radiação UVA. / Abstract: Riboflavin (RF) is a water soluble vitamin which belongs to vitamin B2 complex, an essential precursor of FMN and FAD coenzymes. Besides being a component of coenzymes, RF displays antitumoral and photossensitizing activities. The main proposal of this study was to evaluate the RF phototoxicity, as well as to determine molecular markers of inflammation, senescence and cellular death, deleterious actions normally triggered by the UVA radiation. Taking into consideration both cell lines used as models, fibroblasts (BALB/c 3T3) and human keratinocytes (HaCaT), the results obtained indicate that RF has potential application in photodynamic therapy. BALB/c 3T3 cells treated with 6.0 µM RF associate with UVA radiation (5 J/cm²) showed apoptosis induction mainly via intrinsic pathway. An increase of p-caveolin and MMP-2 activity (major protease responsible for degradating collagen) evidenced senescence induction. According to NF?B and p-IKKa/ß levels, RF did not significantly change the process of inflammation triggered by UVA radiation, in fibroblast cells. In HaCaT cells 5.0 µM RF associated with UVA radiation (5 J/cm ²) was observed apoptosis induction thorough extrinsic and intrinsic pathways. Senescence process was also observed in keratinocytes as indicated by an increase of pcaveolin, p21 and MMPs-2 and -9 activities. Besides, the decrease of NF?B expression indicates that this transcription factor translocates into the nucleus and in turn, regulates inflammatory response. Other aspect evaluated in this work was the influence of the F-127 in the RF phototoxicity. The irradiation of hydrogel containing F-127 and RF remained RF phototoxicity property. Our findings suggest that RF displays potential for use in photodynamic therapy, once it was phototoxic when irradiated with subtoxic UVA dose / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AnaCarolinaSantosde_D.pdf: 3901394 bytes, checksum: ef9ac69de23f7f2b15590ee29a931c8f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Produtos naturais têm originado muitos dos compostos biologicamente ativos usados clinicamente, destacando-se como importantes fontes de novos agentes terapêuticos utilizados no tratamento das mais variadas patologias incluindo câncer, HIV/AIDS, Alzheimer e malária. O desenvolvimento de novos fármacos a partir de produtos naturais, especialmente os derivados de plantas, tem desempenhado importante papel na prevenção e tratamento do câncer sendo que, de todos os antitumorais disponíveis entre 1940 e 2002, aproximadamente 40% eram caracterizados como produtos naturais ou derivados destes, com outros 8% sendo considerados agentes mimetizantes de produtos naturais. No presente trabalho, fisetin (flavonóide de origem vegetal) e a vitamina riboflavina foram avaliados como potenciais agentes antitumorais. Para este propósito, as linhagens de células leucêmicas HL60 e de câncer prostático PC3 foram tratadas com riboflavina irradiada ou fisetin por 24 horas e seus efeitos sobre vias de transdução de sinais responsáveis pela sobrevivência e morte celular foram avaliados. Os resultados obtidos demonstram que riboflavina e fisetin apresentam expressiva atividade antiproliferativa, induzindo a morte das células tumorais em concentrações na ordem de µM. A investigação do mecanismo molecular da ação citotóxica da riboflavina demonstrou que o tratamento de HL60 e PC3 com a vitamina irradiada induz morte celular através da via extrínseca de indução de apoptose, mediada pela ativação do sistema Fas/FasL e aumento na síntese de ceramida. Como conseqüência da ativação do receptor de morte Fas, uma seqüência ordenada de eventos leva à modulação de cascatas de sinalização através da alteração da atividade/expressão de moléculas-chave associadas a proliferação, sobrevivência, migração e morte celular. Assim como a riboflavina, fisetin também mostra-se eficiente indutor de morte por apoptose em células HL60, modulando cascatas de proteínas quinases e fosfatases e levando a alterações na expressão de NF?B, atividade de MAPKs, níveis de fosfoproteínas e, também, à inibição de enzimas envolvidas na manutenção do estado redox. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para um maior conhecimento sobre a atividade/função biológica de algumas moléculas envolvidas na sobrevivência e morte de células leucêmicas e prostáticas, sugerindo potenciais alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no combate a doenças neoplásicas. Além disso, os resultados obtidos demonstram que a riboflavina irradiada e fisetin são potentes indutores de apoptose e promissores agentes antitumorais, capazes de modular importantes vias de sinalização intracelular através de ação específica sobre moléculas-chaves relacionadas a proliferação, resistência e invasividade de células tumorais / Abstract: Natural products have been providing numerous clinically used medicines and remain as essential components in the search for new drugs against various pharmacological targets including cancer, HIV/AIDS, Alzheimer¿s, malaria, and pain. Drug discovery from natural products, especially from medicinal plants, has played an important role in the chemoprevention and treatment of cancer and, off all available anticancer drugs between 1940 and 2002, about 40% were natural products per se or natural product-derived, with another 8% considered natural product mimics. In the present work, the plant flavonoid fisetin and the vitamin riboflavin are evaluated as potential anticancer agents. For this purpose, the leukemic cell line HL60 and the human prostate cancer cell PC3 were treated for 24h with irradiated riboflavin or fisetin and their effects on signal transduction pathways related to the cell survival and proliferation were evaluated. The results obtained demonstrated that riboflavin and fisetin have strong anti-proliferative activity, inducing tumoral cell death at µM concentrations. The investigation of the molecular death mechanism triggered by riboflavin demonstrated that the treatment of HL60 and PC3 with the irradiated vitamin induces apoptotic cell death through induction of the extrinsic pathway mediated by the activation of Fas/FasL system via a ceramide-dependent pathway. As a consequence of the activation of the death receptor Fas, an orderly sequence of signaling events leads to the modulation of signaling cascades through alterations in the activity/expression of key targets molecules related to proliferation, survival, migration and cell death. As well as riboflavin, fisetin also showed strong apoptotic activity, inducing HL60 cell death through modulation of protein kinase and phosphatase signaling cascades, leading to alterations in the NF?B expression, MAPKs activities, phosphoprotein levels and also inhibition of enzymes involved in the redox status maintenance. The results obtained in this work bring out information about the biologic activity of some molecules involved in the survival and death of leukemic and prostate cancer cells, indicating among then potential targets for the development of rational therapeutic strategies. Moreover, the data obtained demonstrated that irradiated riboflavin and fisetin have potential proapoptotic activity, pointing out these bioactive compounds as promising antitumoral agents, since they can affect important molecular targets related to proliferation, resistance and invasibility of cancer cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carmen Verissima Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:16:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ChavesNeto_AntonioHernandes_D.pdf: 8240508 bytes, checksum: 293949f75ca619cdc0fa61d29d1703ba (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Riboflavina (Rb - Vitamina B2) é o precursor das flavocoenzimas essenciais flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD). Estas coenzimas participam de processos enzimáticos dependentes das reações de transferências de elétrons, que ocorrem nas vias de produção de energia, biossíntese, desintoxicação e sequestro de elétrons. O aumento dietético da riboflavina e piridoxina foi associado com maiores densidades minerais em mulheres e homens idosos. Fotoderivados da riboflavina demonstraram efeitos citotóxicos em células cancerosas de próstata e leucemias, entretanto, o efeito direto da Rb e seus fotoderivados em osteoblastos não foram examinados. Neste trabalho os efeitos biológicos da Rb e riboflavina irradiada (IRb) foram investigados na linhagem de pré-osteoblastos MC3T3-E1, um modelo bem aceito de osteogênese in vitro caracterizado pela indução de genes específicos associados com o fenótipo osteoblástico quando tratados com ácido ascórbico e ß-glicerofosfato. A viabilidade celular foi avaliada através da redução do MTT, da incorporação do corante vermelho neutro e do conteúdo de ácidos nucléicos. Marcadores de diferenciação osteoblástica foram analisados através do RT-PCR semi-quantitativo (osteopontina e osteocalcina) e através de análises colorimétricas de atividade da fosfatase alcalina (FAL) e síntese de colágeno pela coloração de picrosirius. As atividades das metaloproteinases (MMP) -9 e -2 foram avaliadas pela zimografia de gelatina. Microarranjos de peptídeos com subtratos específicos para quinases e imunoblotting foram usados para identificar os efeitos na sinalização celular. As atividades de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e glutationa S-transferase) foram determinadas em lisados celulares usando métodos espectrofotométricos. As atividades das caspases-8, -9 e -3 foram analisadas através de métodos colorimétricos. Na primeira análise Rb e IRb causaram a parada do ciclo celular na fase G0/G1 e também a inibição da quinase AKT, um mediador da proliferação. Flavinas causaram a diferenciação de pré-osteoblastos, evidenciada pelo aumento da expressão de osteocalcina, osteopontina e BMP-2. Atividades mais elevadas de MMP-9 e MMP-2 também foram observadas. A capacidade das flavinas em engatilhar a diferenciação de osteoblastos foi reforçada pelo aumento da conexina 43, diminuição da caveolina-1 e repressão da sinalização Notch. Na segunda análise, nós encontramos que as interações entre Rb, em sua forma irradiada e não-irradiada, e indutores osteogênicos (ácido ascórbico e ß-glicerofosfato) afetaram significativamente a proliferação de osteoblastos, a atividade de FAL, biossíntese de colágeno, expressão de osteocalcina e osteopontina, a atividade das MMP-2 e MMP-9 e a expressão de fatores osteoclastogênicos (RANKL e osteoprotegerina). Nós também encontramos que os efeitos das flavinas em osteoblastos nesta segunda etapa foram independentes das suas propriedades antioxidantes. A atividade biológica da combinação de indutores osteogênicas com Rb e seus fotoprodutos foi associada com a ativação de diferentes vias de sinalização (AKT, FAK, CaMKII), caspases -8, -9 e -3 e aumento da expressão e/ou estabilização de fatores de transcrição osteoblásticos (Runx2 e ß-catenin). Este estudo nos trouxe fortes evidências que altas concentrações de Rb e IRb geraram um microambiente osteogênico através da modulação de diferentes vias de sinalização, além de promover um efeitos aditivo durante a diferenciação das células pré-osteoblasticas MC3T3 induzida por ácido ascórbico e ß- glicerofosfato. Em resumo, este estudo aponta para uma potencial aplicação da Rb e seus fotoprodutos no desenvolvimento do fenótipo osteoblástico e, consequentemente, uma alternativa terapêutica coadjuvante para osteoporose. / Abstract: Riboflavin (Rb-Vitamin B2) is the precursor of essential flavocoenzymes, flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD). These coenzymes participate in numerous enzymatic processes dependent on electron transfer reactions that occur in energyproducing, biosynthetic, and detoxifying and electron-scavenging pathways. Increase dietary riboflavin and pyridoxine intake has been associated with higher bone mineral density in elderly men and women. Photoderivatives of riboflavin have been shown strong activity in haematological malignancy and prostate cancer cells, however, the direct effect of Rb and its photoderivatives on osteoblast has not been examined. In this work, the biologic effects of Rb and irradiated riboflavin (IRb) were investigated in the MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line, a well-accepted model of osteogenesis in vitro characterized for the induction of specific genes associated with the osteoblastic phenotype when treated with ascorbic acid and ß-glycerophosphate. Cell viability was assessed by MTT reduction, neutral red uptake and nucleic acids content. Osteoblastic differentiation markers were analyzed by semiquantitative RT-PCR (osteopontin and osteocalcin), alkaline phosphatase (ALP) activity measured colorimetrically and collagen synthesis by Sirius red staining. Metalloproteinases (MMP) -9 and -2 activities were assayed by gelatin zymography. Peptide microarray of substrate specificity to kinases and immunoblotting were used to identify the effects on signal transduction pathways. Antioxidant enzyme activities (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione Stransferase) were determined in cellular lysate using spectrophotometric methods. Caspase-8, -9 and -3 activation were measured by a colorimetric assay. In the first analysis Rb and IRb caused cell cycle arrest at G0/G1 phase and accordingly inhibited AKT kinase, a proliferation mediator. Flavins caused differentiation of preosteoblast cells as evidenced by increase of osteocalcin, osteopontin and BMP2 expressions. In addition, higher MMP-9 and -2 activities were observed. Importantly, the capacity of flavins to trigger osteoblasts differentiation was also reinforced by upregulation of connexin 43, down regulation of caveolin-1 and negative modulation of Notch cascade. In the second analysis, we found that the interaction between Rb and IRb and osteogenic inductors (ascorbic acid and ß-glycerophosphate) significantly affected the osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity, collagen biosynthesis, osteopontin and osteocalcin mRNA expression, MMP-2 and MMP-9 activities and the expression of osteoclastogenesis factors (RANKL and OPG). We also showed that the effects of flavins in osteoblasts cells were independent on flavins antioxidant property. The biological activity of the combination of osteogenic medium with riboflavin and its photoderivatives was associated with the activation of different signaling pathways (AKT, FAK, CaMKII), caspases -8, -9 and -3, and up-regulation and/or stabilization of osteoblastic transcription factors (Runx2 and ß-catenin). This study brought out strong evidences that high concentration of Rb and IRb generates an osteogenic microenvironment through modulating different mediators of signaling pathways, besides of the additive effect of riboflavin and its photoproducts during the ascorbate and ß-glycerophosphateinduced osteoblast differentiation of MC3T3-E1 cells. In summary, this study pointed out the potential application of Rb and its photoproducts in osteoblasts phenotype development and, consequently, it is possible use as an alternative therapeutic adjuvant of osteoporosis. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Jose Mauro Granjeiro, Maikel Peppelenbosch / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zambuzzi_WillianFernando_D.pdf: 4779822 bytes, checksum: 33696a8be638dbe16ec5d944f0e3b0d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este trabalho teve como principal objetivo investigar os mecanismos de transdução de sinal disparados durante a diferenciação de células ósseas. Desta forma, vários aspectos moleculares desse processo foram analisados. A modulação da Src kinase pela proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular (LMWPTP) é essencial para a diferenciação dos pré-osteoblastos induzida pelo ácido ascórbico/glicerofosfato. Outro enfoque dado nesse trabalho foi a avaliação, sob o aspecto molecular e morfológico, da diferenciação de pré-osteoblastos em ¿osteocyte-like cells¿, processo esse induzido quando o Matrigel foi utilizado como substrato. De forma inédita demonstramos que nessa condição as células produziram a proteína sonic hedgehog (Shh), a qual também foi essencial para o processo de diferenciação. A análise do perfil quinômico dessas células apontou uma prevalência das quinases envolvidas com a comunicação celular. Este fato é coerente com a super-expressão de conexina 43 observada. Além disso, observamos que RECK e TIMP-1 modulam a atividade do rearranjo da matriz extracelular durante a diferenciação de osteoblastos, bem como o requerimento das proteínas PP2A e p38 MAPK durante a adesão de osteoblastos. Adicionalmente observamos uma modulação refinada das PTPs (LMWPTP, SHP2 e PTPa) bem como do status redox celular. Os resultados em conjunto demonstram que o estudo de transdução de sinal pode fornecer informações importantes para o entendimento do funcionamento celular bem como definir alvos moleculares que podem servir como ferramentas para diferentes aplicações / Abstract: The main goal of this work was to investigate the signal transduction pathways triggered during the bone cells differentiation. In this way, several molecular aspects of this process were analyzed. Src kinase modulation by the low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMWPTP) was essential for the occurrence of the differentiation induced by ascorbic acid and glycerophosphate. We also evaluated, under molecular and morphological patterns, the differentiation of pre-osteoblasts into osteocyte-like cells induced by 3D scaffold (matrigel as substrate). Interestingly, under this condition, the cells produced sonic hedgehog (Shh), which also was essential for stimulating the differentiation signaling pathway. Kinomic profiling of these cells revealed a prevalence of kinases involved in cellular communication, which is in agreement with the overexpression of connexin 43 observed. Besides we observed that RECK and TIMP-1 modulated the extracellular matrix rearrangement and that PP2A and p38 MAPK are required for osteoblasts adhesion. In addition, we observed that during pre-osteoblasts differentiation both PTPs and cellular redox are tightly regulated. Our findings demonstrated that the signal transduction evaluation can provide important information for understanding the cell biology as well as defining molecular targets that can be useful for different applications / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O parasita da malária Plasmodium falciparum percebe o ambiente em que se encontra, elaborando respostas celulares adequadas, que envolvem secreção de proteínas, crescimento e diferenciação celular. Fatores relacionados com a geração de segundos-mensageiros e proteínas efetoras da sinalização celular estão descritos na literatura. Porém, a função de receptores responsáveis pela percepção de estímulos extracelulares no parasita é um tema pouco explorado. A identificação in silico de receptores de sete domínios transmembrânicos putativos no genoma de P. falciparum possibilitou a exploração da função dos mesmos. A tese caracteriza funcionalmente dois receptores, PFSR10 e PFSR25. A expressão proteica dos receptores foi demonstrada em fases eritrocíticas de P. falciparum. Os receptores possuem candidatos a parceiros moleculares que executam diversas funções celulares, entre elas invasão do eritrócito, endocitose e exocitose. Os receptores foram transfectados em células de mamíferos e, através de ensaios de dinâmica de cálcio de high-throughput, sugere-se que PFSR10 codifique um receptor que participa na percepção de ATP extracelular e que PFSR25 codifique um sensor de KCl. O trabalho também sugere que KCl modula cálcio citosólico em P. falciparum e que parasitas nocaute para PFSR25 são incapazes de modular cálcio citosólico em resposta a KCl. / The malaria parasite P. falciparum perceives its milieu and elaborates adequate intracellular responses, that involve protein secretion, growth and cell differentiation. Factors related to second messengers generation and effectors of cell signaling are described in the literature. However, the function of receptors responsible for stimulus perception remains elusive. The in silico identification of putative seven transmembrane receptors in the Plasmodium falciparum genome allowed the exploration of their function. In the thesis, two putative receptors were characterized, PFSR10 and PFSR25. The proteic expression of the receptors was demonstrated in erythrocytic stages of P. falciparum. The receptors have putative interaction partners that participate in cellular functions such as invasion, exocytosis and endocytosis.The receptors were transfected in mammalian cells and, through high-throughput calcium dynamics assays, it is suggested that PFSR10 codes for a receptor that participates in extracellular ATP perception and that PFSR25 codes for a KCl sensor. It is also suggested that KCl modulates cytosolic calcium in response to KCl and that knockout parasites for PFSR25 are incapable of modulating cytosolic calcium in response to KCl.