La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a model of tumor evolution in human cancer. The evolution process of CML from the chronic phase (CP) to the blastic phase (BP) is characterized by a blockade of differentiation and acquisition of uncontrolled self-renewal capacity by hematopoietic stem or progenitor cells. CML-BP is associated with the presence of other genetic abnormalities in addition to the BCR-ABL1 fusion which results from chromosomal translocation t(9;22). Unlike patients in the CP, patients with CML-BP do not achieve a long-term complete molecular response to Imatinib mesylate, an inhibitor targeting the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK). Moreover, second and third generation TK inhibitors are less effective in CML-BP when leukemic cells have acquired a therapeutic resistance independent of BCR-ABL1 mutations. The molecular mechanisms of the signaling pathways responsible for CML progression from CP to BP are poorly understood. The aim of our project is to characterize novel genetic alterations in the BP of CML. We have identified by cytogenetics, four novel chromosomal translocations: t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) and t(2;12)(q31;p13) in leukemic cells of patients with CML-BP resistant to therapy. Using fluorescence in situ hybridization, RT-PCR and sequencing techniques, we have mapped chromosomal translocation breakpoints and identified rearranged genes encoding transcription factors which are key regulators of hematopoiesis, such as RUNX1, ETV6, PRDM16 and HOXA. The disruption of these genes could explain the differentiation blockade and/or uncontrolled self-renewal associated with the CML-BP. We identified RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 and ETV6-HOXD11 fusions created by chromosomal translocations t(1;21), t(7;17), t(8;17) and t(2;12) respectively. These fusions generate different alternative transcripts that both maintain and alter the open reading frame. Sequence analysis of chimeric transcripts identified in this project, including RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 and ETV6-HOXD11, allowed us to predict potential functional domains present in putative chimeric proteins. In-frame fusion transcripts can generate functional domains from both fusion partners. For example, in two RUNX1-PRDM16 transcripts, the RUNX1 DNA binding domain RHD (Runt homology domain) is fused to the majority of PRDM16 domains. Out-of-frame fusion transcripts resulted in truncated forms of RUNX1, MSI2 and ETV6. The juxtaposition of promoter regions of these genes to the 5’ part of their partners resulted in the activation of the oncogenic short form of PRDM16 in the t(1;21) or of different HOXA/D genes in t(7;17) and t(2;12), and in the aberrant expression of a novel alternative SOX17 transcript in the t(8;17). Our study allowed us to identify novel fusion genes and/or activation of genes that potentially cooperate with BCR-ABL1 fusion in the progression of CML and contribute to treatment resistance of this disease. The characterization of genetic events related to the blastic transformation of CML is an important step in the investigation of molecular pathways involved in this stage of the disease. Understanding treatment resistance of these patients might help to identify new therapeutic targets in this leukemia.

Le lymphome de Burkitt (BL) est due dans 80% des cas à une translocation chromosomique t(8;14)(q24;q32). Cette translocation marque l’évènement initial de la transformation maligne d’une cellule B normale, par délocalisation de l’oncogène CMYC à proximité du locus du gène codant pour la chaîne lourde d’immunoglobuline IGH par le mécanisme de réparation de l’ADN NHEJ durant l’hypermutation somatique (SMH). La probabilité de cette translocation est inversement proportionnelle à la distance qui sépare les loci portés par les deux chromosomes. La translocation (8;14) (q24;q32) qui apparaît durant les étapes de différentiation des lymphocytes B est encore plus importante chez les patients infectés par le virus Epstein-Barr (EBV) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). L’objectif de notre étude est de déterminer les origines possibles de la translocation t(8;14) (q24;q32)dans les lymphocytes B normaux humains. Nous nous sommes intéressés tout d’abord à la dynamique de la localisation nucléaire des loci IGH et CMYC dans les lymphocytes B activés. Nous avons particulièrement étudié l’impact des virus EBV et VIH-1 sur l’organisation des gènes IGH et CMYC.Nous avons utilisé la technique d’hybridation in situ à fluorescence FISH pour la détection de CMYC (8q24) et IGH (14q32). Dans les lymphocytes B naïfs, CMYC est localisé du côté de la périphérie nucléaire, en revanche IGH est central, les deux loci sont complétement distants dans le noyau.L’activation des lymphocytes B induisait une augmentation de la colocalisation IGH-CMYC. La proximité physique entre les deux loci augmente la probabilité de leur translocation durant la SHM et favorise la t(8;14) (q24;q32) dans les lymphocytes B. Nous avons montré que les virus EBV et VIH-1ont un effet important sur la délocalisation IGH-CMYC dans les lymphocytes B. Nous avons aussi déterminé une molécule virale VIH-1 qui intervenait aussi dans la dérégulation de la localisation nucléaire des gènes IGH et CMYC. Nous avons déterminé deux mécanismes différents et indépendants impliqués dans la dynamique des loci IGH et CMYC : le premier mécanisme intervient dans le processus de développement normal des lymphocytes B, et le deuxième mécanisme dépend des virus ainsi que des molécules virales (particulièrement la Tat-HIV-1). / Eighty percent of Burkitt's lymphomas (BL) cases bear translocation t(8;14)(q24;q32). Thistranslocation is the initial event in malignant transformation of normal B-cell and derives from nonhomologousend joining of the oncogene CMYC to the immunoglobulin heavy chain locus IGH duringSomatic Hypermutation (SHM) of IGH. The probability of this translocation is inversely proportionalto the distance between the loci of involved chromosomes. The translocation t(8;14)(q24;q32) occursduring normal development of B-lymphocytes and more probable in patients infected with Epstein-Barr virus (EBV) and the human immunodeficiency virus (HIV-1).The subject of this study was to determine the possible origin of the translocation t(8;14)(q24;q32) inhuman normal B-lymphocytes. We followed the dynamics of the nuclear localization of IGH andCMYC genes in activated B-lymphocytes. We payed particular attention to the impact of EBV andHIV-1 viruses on dynamics of both IGH and CMYC. We applied Fluorescence in situ hybridization(FISH) for detection of CMYC (8q24) and IGH (14q32). In naïve B-cells CMYC is mainly localized inthe periphery of nucleus, whereas IGH is preferentially localized in the nuclear centre, i.e. these lociare distanced by a radius of cell nucleus. Activated B-lymphocytes displayed dramatic increase ofnumber of cells with colocalized IGH and CMYC. Close physical proximity of CMYC to IGH duringSHM amplifies the probability of occurance of translocation t(8;14)(q24;q32) in human Blymphocytes.Interestingly, we observed even more pronounced impact of EBVand HIV-1onproximity of IGH and CMYC. Finaly, among the molecules of HIV-1 we revealed those which possessthe most regulative role on dynamics of both IGH and CMYC. Our results suggest about twoindependent mechanisms of IGH and CMYC dynamics: the first is appropriate for normal developmentof B-lymphocytes and the second depends on virus and viral molecules, such as transactivator of viraltranscription HIV Tat.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a model of tumor evolution in human cancer. The evolution process of CML from the chronic phase (CP) to the blastic phase (BP) is characterized by a blockade of differentiation and acquisition of uncontrolled self-renewal capacity by hematopoietic stem or progenitor cells. CML-BP is associated with the presence of other genetic abnormalities in addition to the BCR-ABL1 fusion which results from chromosomal translocation t(9;22). Unlike patients in the CP, patients with CML-BP do not achieve a long-term complete molecular response to Imatinib mesylate, an inhibitor targeting the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK). Moreover, second and third generation TK inhibitors are less effective in CML-BP when leukemic cells have acquired a therapeutic resistance independent of BCR-ABL1 mutations. The molecular mechanisms of the signaling pathways responsible for CML progression from CP to BP are poorly understood. The aim of our project is to characterize novel genetic alterations in the BP of CML. We have identified by cytogenetics, four novel chromosomal translocations: t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) and t(2;12)(q31;p13) in leukemic cells of patients with CML-BP resistant to therapy. Using fluorescence in situ hybridization, RT-PCR and sequencing techniques, we have mapped chromosomal translocation breakpoints and identified rearranged genes encoding transcription factors which are key regulators of hematopoiesis, such as RUNX1, ETV6, PRDM16 and HOXA. The disruption of these genes could explain the differentiation blockade and/or uncontrolled self-renewal associated with the CML-BP. We identified RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 and ETV6-HOXD11 fusions created by chromosomal translocations t(1;21), t(7;17), t(8;17) and t(2;12) respectively. These fusions generate different alternative transcripts that both maintain and alter the open reading frame. Sequence analysis of chimeric transcripts identified in this project, including RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 and ETV6-HOXD11, allowed us to predict potential functional domains present in putative chimeric proteins. In-frame fusion transcripts can generate functional domains from both fusion partners. For example, in two RUNX1-PRDM16 transcripts, the RUNX1 DNA binding domain RHD (Runt homology domain) is fused to the majority of PRDM16 domains. Out-of-frame fusion transcripts resulted in truncated forms of RUNX1, MSI2 and ETV6. The juxtaposition of promoter regions of these genes to the 5’ part of their partners resulted in the activation of the oncogenic short form of PRDM16 in the t(1;21) or of different HOXA/D genes in t(7;17) and t(2;12), and in the aberrant expression of a novel alternative SOX17 transcript in the t(8;17). Our study allowed us to identify novel fusion genes and/or activation of genes that potentially cooperate with BCR-ABL1 fusion in the progression of CML and contribute to treatment resistance of this disease. The characterization of genetic events related to the blastic transformation of CML is an important step in the investigation of molecular pathways involved in this stage of the disease. Understanding treatment resistance of these patients might help to identify new therapeutic targets in this leukemia.

La membrane cellulaire est la barrière qui sépare l'intérieur des cellules de l'environnement extérieur. Elle se compose de lipides et de protéines. Les gènes codant pour les protéines membranaires représentent environ 30% des génomes. Les protéines membranaires sont synthétisées dans le cytosol par les ribosomes, mais suivent des voies spécifiques pour s'intégrer dans la membrane cellulaire. Les ribosomes en cours de traduction de protéines membranaires sont reconnus dans le cytosol et adressés à la membrane. Par la suite, les chaînes naissantes de protéines membranaires sont insérées dans la bicouche lipidique puis repliées de façons appropriées, ce mécanisme s'appelle la translocation. Le processus d'adressage est médiée par la particule de reconnaissance du signal (SRP) et son récepteur, tandis que la translocation est effectuée par un certain nombre de complexes de protéines membranaires.Cette thèse décrit deux des complexes impliqués dans cet adressage et translocation co-traductionnelle chez Escherichia coli : Le complexe ribosome-SRP-FtsY pour l'adressage en conformation «fermé» et le complexe dans lequel le ribosome est lié à l'holo-translocon (HTL) qui se compose de sept protéines membranaires. J'ai utilisé principalement la cryo-microscopie électronique pour caractériser ces complexes. La cryo-EM permet de déterminer la structure des échantillons biologiques à une résolution supérieure au nanomètre dans leur environnement natif, sans avoir à le cristalliser. Dans ce travail, j'ai bénéficié des améliorations récentes dans l'équipementet le traitement d'image.A partir d'un ensemble de données de cryo-EM obtenu par les membres du groupe, j‘ai déterminé la structure du complexe ribosome-SRP-FtsY en conformation «fermé» avec une résolution de 5.7 Å. Différentes stratégies de tri des calculsont été appliquées pour identifier la partie la plus homogène de l'ensemble des données. La structure montre un domaine bien résolu SRP ARN et SRP M avec une séquence signal liée. L'interaction entre les SRP et le ribosome pourrait être modélisée avec une grande fidélité. Cette structure révèle également que les GTPases SRP-ftsY sont détachées de la tétra-boucle de l'ARN et sont flexibles, libérant alors le site de sortie du ribosomepermettant la liaison du translocons.Dans le second projet, différentes approches ont été poursuivis pour résoudre la structure du complexe ribosome-HTL à haute résolution. Une structure initiale à 22 Å a été obtenue en mélangeant HTL solubilisés en détergent avec des ribosomes, démontrantla possibilité de préserver le complexe dans les conditions utilisées pour la préparation des grilles. J'ai ensuite exploré l'utilisation de nanodiscs et un nouveau détergent appelé LMNG pour stabiliser HTL dans des tampons sans détergent. Un deuxième ensemble de données a ensuite été recueilli à partir d'échantillon obtenu par gradient de fixation, la structure a été résolue à 17 Å. La préparation des échantillons a été optimisée utilisant entre autre les amphipoles. On a montré que deux types d'amphipole-HTL peuvent se lier au ribosome, et des structures de plus grande résolution devrait être obtenu à partir de ces échantillons. / The cell membrane is the barrier that separates the interior of cells from the outside environment. It consists of lipids and proteins. Genes encoding membrane proteins make up about 30% of the genome. Membrane proteins are synthesized in the cytosol by ribosomes, but employ special pathways to integrate into the cell membrane. Ribosomes translating membrane proteins are recognized by special factors in the cytosol and targeted to the membrane. Subsequently, nascent chains of the membrane proteins are inserted into the lipid bilayer and are folded into their proper structures, a process termed translocation. The targeting process is mediated by the signal recognition particle (SRP) and its receptor, while the translocation is performed by a number of membrane protein complexes.This thesis describes two of the complexes involved in co-translational targeting and translocation in Escherichia coli: The ribosome-SRP-FtsY targeting complex in the “closed” conformation and the complex of a ribosome with the holo-translocon (HTL) consisting of seven membrane proteins. I mainly used electron cryo-microscopy to characterize these complexes. Cryo-EM allows structural determination of biological samples at sub-nanometer resolution in their native environment, without the need to crystallize the specimen. In this work, I took advantage of the recent advances in both the hardware and the image processing.Starting from a cryo-EM dataset obtained by group members, I have determined the structure of ribosome-SRP-FtsY complex in the “closed” conformation at 5.7 Å resolution. Different computational sorting strategies were applied to identify the most homogeneous sub-pool of the dataset. The structure shows a well-resolved SRP RNA and SRP M domain with a signal sequence bound. The interaction between SRP and ribosome could be modeled with high confidence. This structure also reveals that the SRP-FtsY GTPases are detached from the RNA tetraloop and are flexible, thus liberating the ribosomal exit site for binding of the translocation machinery.In the second project, different approaches were pursued to solve the structure of the ribosome-HTL complex at high resolution. An initial structure at 22 Å was obtained by mixing detergent-solubilized HTL with the ribosome, demonstrating that it is possible to preserve the complex under the conditions used for specimen preparation. I have then explored the use of nanodiscs and a new detergent called LMNG to stabilize HTL in detergent-free buffers. A second dataset was subsequently collected from a sample prepared by gradient-fixation, and the structure was solved at 17 Å. Sample preparation has been optimized further using amphipols. Two types of amphipol-HTL complexes were shown to bind to the ribosome, and higher resolution structures are expected to be obtained from these samples.

Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à Gram négatif responsable d'infections nosocomiales, possède de nombreux facteurs de virulence lui permettant d'infecter ses hôtes. En particulier, le Système de Sécrétion de Type III (SST3) lui permet d'injecter des effecteurs directement dans le cytoplasme de la cellule cible eucaryote. Durant cette thèse, deux protéines du SST3 de P. aeruginosa ont été étudiées : l'ATPase PscN et la protéine ExsB. Plusieurs approches ont été utilisées afin d'étudier l'ATPase PscN, indispensable à l'activité du SST3. Des mutations ponctuelles réalisées dans PscN conduisent à des souches de P. aeruginosa non cytotoxiques, et cet effet est dominant négatif. Une autre approche a permis l'obtention de fractions partiellement purifiées de l'ATPase PscN active, sous forme de grands complexes visualisés en microscopie électronique. Ces fractions contiennent également d'autres protéines du SST3, qui pourraient être des partenaires de PscN. La protéine ExsB a été caractérisée pour la première fois. Après avoir vérifié son expression chez P. aeruginosa, son association à la membrane externe de la bactérie a été démontrée. Son rôle a ensuite été étudié par une analyse du phénotype d'une souche de P. aeruginosa dépourvue du gène exsB. Nous n'avons pas identifié d'activité de ExsB dans la régulation du SST3. Après avoir constaté l'implication de ExsB dans la virulence de la bactérie dans des modèles d'infections aiguës chez les animaux, son rôle dans l'activité du SST3 a été établi. Nous avons enfin pu montrer que ExsB a une activité de pilotine, car elle participe à l'assemblage de la sécrétine, le composant de la membrane externe du SST3. / Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacterium responsible for nosocomial infections, exhibits numerous virulence factors to infect its hosts. In particular, the Type III Secretion System (T3SS) allows the injection of effectors directly into the host cell cytoplasm. This work focuses on the study of two proteins from the T3SS of P. aeruginosa: the ATPase PscN and the ExsB protein. Several approaches were used to study the ATPase PscN, an enzyme essential for T3SS activity. Site-directed mutations, made on PscN, lead to non cytotoxic strains, and this effect is dominant negative. Another approach allowed the partial purification of active PscN, visualized as large complexes by electron microscopy. These partially purified samples also contain other T3SS proteins, which could interact with PscN. The ExsB protein was characterized for the first time. After checking its expression in P. aeruginosa, its association with the outer membrane was shown. The phenotypic analysis of a strain lacking exsB gene gave insights into the role of this protein. We did not identified any function of ExsB in the T3SS regulation. After showing the involvement of ExsB in the bacterial virulence during acute animal infections, ExsB role in T3SS activity was established. Finally, we showed that ExsB has a pilotin activity as it participates in the assembly of the secretin, the outer membrane component of T3SS.

Notre équipe a précédemment rapporté que l'utilisation d'un traitement d'induction lympho-déplétant [les globulines anti-lymphocytaires polyclonales (GALP)], peut entrainer une lymphopénie T CD4 persistante chez certains transplantés rénaux. Celle-ci est associée à certaines anomalies biologiques telles que la présence d'un syndrome inflammatoire chronique. Ce travail de thèse s'intéresse aux facteurs impliqués dans l'induction de ces anomalies puisqu'elles sont associées à une augmentation de l'incidence d'infections, de maladies cardiovasculaires et de décès, habituellement retrouvés chez les personnes âgées. Nous avons montré que les GALP entrainent une diminution de la fonction thymique et une expansion de lymphocytes T à un stade avancé de différenciation pouvant traduire une immunosénescence prématurée. Par ailleurs, une rupture de la barrière intestinale semble favoriser la translocation bactérienne digestive et l'activation d'une inflammation chronique observée en transplantation, via les lipopolysaccharides libérés dans la circulation périphérique. La composition du rnicrobiote intestinal pourrait jouer un rôle dans l'initiation, le maintien et la sévérité de l'inflammation. Nous avons observé des modifications du microbiote après transplantation et après l' antibioprophylaxie utilisée en transplantation. Les mécanismes à l'origine de toutes ces observations restent à élucider mais ce travail permet d'améliorer la compréhension des facteurs impliqués dans le développement de l'immunosénescence et de l'inflammation chronique en transplantation rénale, ouvrant potentiellement la voie à d'intéressantes perspectives thérapeutiques. / We bave previously described that polyclonal anti-lymphocytic globulins (GALP) may contribute to prolonged CD4 T­cell lymphopenia in some renal transplant recipients, associated with some biological abnormalities, such as a chronic inflammatory syndrome. Our work focuses on the factors involved in the induction of tbese abnormalities and susceptible to increase the incidence of infections, cardiovascular diseases and deatb, comparable to the incidence observed in the elderly. We showed that GALP are implicated in the decrease in thymie output and the expansion ofT cells at an advanced stage of differentiation. Both are hallmarks of premature immune senescence. Moreover, the dysfunction of the gut epithelial barrier is responsible for gut bacterial translocation (GBT) and the activation of chronic inflammation observed in chronic kidney disease as well as in renal transplant recipients. The composition of the intestinal microbiota may play a role in the initiation, maintenance and severity of GBT and systernic inflammation. We reported the existence of a dysbiosis a.fier transplantation. The mechanisms involved remain to be elucidated, yet, this work contributes to the understanding of the potential factors involved. in the progression of immune senescence and the persistence of chronic inflammation after kidney transplantation paving the way to new fields of therapeutic research in transplantation

Mitochondrion is an endosymbiotic organelle synthesizing ~1% of its proteome, while remaining ~99% of the proteins are encoded by the nuclear genome and translated on the cytosolic ribosome. Therefore active mitochondrial biogenesis requires efficient protein transport destined for the different sub-compartments. Mitochondrion contains specialized translocation machineries in the outer and in the inner membrane known as TOM40 and TIM23-complex respectively. Import of a majority of mitochondrial proteome is mediated by inner membrane presequence translocase (TIM23 complex). However, the structural organization of Tim23-complex and mechanisms of mitochondrial inner membrane protein translocation is still elusive. Therefore, the present thesis addresses above elusive questions. Chapter 2 highlights the functional significance of different segments of Tim23 in regulating the conformational dynamics of the presequence-translocase- Tim23 is the central channel forming subunit of the presequence-translocase which recruits additional components for the assembly of the core complex. However the functional significance of different segments of Tim23 was not understood due to the lack of suitable conditional mutants. Our study has reported many conditional mutants from different segments of Tim23 which are precisely defective in the organization of the core complex and in the recruitment of the import motor component which enhances our understanding of protein translocation across mitochondrial inner membrane. Chapter 3 highlights the functional cooperativity among mtHsp70 paralogs and orthologs using Saccharomyces cerevisiae as a model organism- mtHsp70s are implicated in a broad spectrum of functions inside the mitochondria. In case of lower eukaryotes gene duplication event has given rise to multiple copies of Hsp70s thereby presenting an opportunity of division of function among these paralogs. The mitochondria of yeast Saccharomyces cerevisiae contains three Hsp70s, including Ssc1, Ssq1 and Ssc3 (Ecm10). The Ssc1 is essential for protein translocation and de novo protein folding functions while Ssq1 is needed for the Fe/S cluster biogenesis inside the mitochondria. Although it has been proposed earlier that, Ssc1 and Ssc3 possesses overlapping functions in protein translocation as a part of import motor in the Tim23-complex. However the physiological relevance and experimental evidences in favor above hypothesis was not established clearly. Our study has reported Ssc3 as an ‘atypical chaperone’ which cannot perform the generalized chaperone functions due to the conformational plasticity associated with both the domains of Ssc3 resulting into weaker client protein affinity, altered interaction with cochaperones and dysfunctional allosteric interface. Additionally, we have also highlighted the role of Nucleotide-binding domain in determining the functional specificity among Hsp70 paralogs and orthologs.

Ce manuscrit traite de la complexation des métaux post-transitionnels de la période 6 par des porphyrines comportant une ou deux anses à acide(s) carboxylique(s) suspendu(s). Celles-ci possèdent des cinétiques rapides d'insertion du Bi permettant d'envisager, de par la complexation et la vectorisation du 213Bi, une application en α-radio-immunothérapie (α-RIT). Dans ce but, trois porphyrines à anse(s) ont été élaborées et le meilleur taux d'insertion du 213Bi a été obtenu avec la porphyrine bis-anse bis-acide grâce à un processus sans précédent de transmétallation Pb«froid»213Bi, il atteint les 80% et est comparable à celui obtenu avec le CHX-DTPA, meilleur chélate du 213Bi. S'agissant de la vectorisation du 213Bi, deux porphyrines bifonctionnelles ont été préparées et les tests de couplage sur anticorps ont montré la formation d'agrégats en raison de leur faible hydrosolubilité. Par ailleurs, une porphyrine hydrosoluble mono-anse monoacide a été synthétisée, mais en absence d'une deuxième anse à acide carboxylique l'insertion du 213Bi reste faible (< 10%). Ce travail permet de conclure que pour atteindre notre objectif d'α-RIT, il faudra élaborer une porphyrine hydrosoluble comportant deux anses à acide carboxylique. Les deux autres parties sont plus fondamentales, d'abord l'accès à un commutateur moléculaire grâce à une double translocation d'ions métalliques au sein de complexes bimétalliques de thallium, déclenchée par un processus d'oxydoréduction TlI↔TlIII. En effet, au sein de nos complexes bimétalliques, deux modes de coordination coexistent, l'un avec un métal M lié à la porphyrine «out of plane» OOP et l'autre avec un métal M' lié à l'anse «hanging atop» HAT. Nous visons un état dans lequel le TlIII serait OOP et le deuxième métal M HAT et un second avec le TlI HAT et M OOP. Les études de coordination du thallium par une porphyrine bis-anse bis-acide ont mis en évidence la formation du 1er exemple de complexe à valence mixte TlIII/TlI par photo-oxydation ou par réduction du HgII. De plus, les deux états du commutateur moléculaire visé ont été obtenus indépendamment : TlIII OOP/PbII HAT et TlI HAT/ PbII OOP. L'utilisation du deuxième phénomène redox pourra permettre le passage de l'un à l'autre constituant un premier pas vers un commutateur moléculaire. Finalement, nous visons de nouveaux complexes supramoléculaires de coordination à partir de sous-unités bimétalliques dont l'assemblage métal-dirigé via l'anse sera modulé par la nature des métaux sur la porphyrine. Trois nouvelles porphyrines ont été synthétisées avec une ou deux anses à acide carboxylique suspendu dont la position α est substituée par une seconde fonction acide carboxylique ou par une fonction cyano. La métallation de celles-ci par le PbII, le HgII ou le CdII a été étudiée et deuxstructures RX de complexes dinucléaires de CdII et de PbII ont été obtenues avec une porphyrine bis-anse bis-cyano. Elles montrent l'influence de la nature du métal sur l'orientation des groupements coordinants. / This manuscript is related to the complexation of the period 6 main group and late transition metals by porphyrins bearing one or two straps with overhanging carboxylic acid. These porphyrins possess fast metal ion insertion rate allowing us to consider, through 213Bi-α-emitter complexation and vectorization, an application in α-radio-immunotherapy (α-RIT). For that purpose, we designed 3 strapped-porphyrins with one or 2 overhanging carboxylic acid. The best 213Bi insertion rate of 80% was obtained with the bis-acid bis-strapped porphyrin thanks to an unprecedented transmetallation “cold” Pb213Bi process; which is close to that of the CHX-DTPA, best known 213Bi chelate. Regarding 213Bi vectorization, 2 BFC porphyrins were synthetized and immunoconjugation experiments proved aggregate formation due to their poor water-solubility. Furthermore, a water-soluble mono-acid and mono-strapped porphyrin was realised but without the 2nd carboxylic acid the 213Bi insertion was very low (<10%). This work provided the conclusion that to achieve the α-RIT objective we have to design a new porphyrin water-soluble with 2 straps bearing one overhanging carboxylic acid. The 2 last chapters are related to fundamental applications, Firstly, a molecular switch through thallium heterobimetallic complexes in which a double translocation of metallic ions will take place thanks to Tl(I)↔Tl(III) redox process. In fact, in our heterobimetallic porphyrin complexes 2 coordination modes can coexist, one M metal is out of the porphyrin plane (OOP) while the other M’ metal is bound to the strap and hanging atop the porphyrin (HAT). So, we considered a state in which the Tl(III) will be OOP while the other metal M will be HAT and in the 2nd the Tl(I) will be HAT and the M metal will be OOP. Thallium coordination studies were implemented with a bis-acid bis-strapped porphyrin and they evidenced the sunlight-driven and redox-driven formation the 1st example of a mixed-valence Tl(III)/Tl(I) porphyrin complex. Moreover, 2 states of the targeted molecular switch have been independently obtained the OOP Tl(III)/HAT Pb(II), and the HAT Tl(I)/OOP Pb(II). Using the 2nd phenomenon, we can consider obtaining transition between those 2 complexes to move towards an eventual molecular switch. Finally, we aim new supramolecular coordination complexes from bimetallic and dynamic porphyrin sous-units of which the metal-directed self-assembly through the strap could be modulated by the nature of metals bound to the porphyrin. 3 new porphyrins were designed with strap(s) bearing overhanging carboxylic acid of which α-position is occupied by either one other carboxylic acid or a cyano group. Metalation studies of those porphyrins was performed with Pb(II), Bi(III), Hg(II) or Cd(II) and 2 Xray structures of binuclear complexes of Cd(II) and Pb(II) was obtained with a bis-cyanoacid bis-strapped porphyrin. They proved the influence of the metallic ion nature on the coordinating group orientation.

Haematological cancers like leukemia and lymphoma are characterized by genetic abnormalities, specifically chromosomal translocations. Analyses of the translocation breakpoint regions in patients have shown that some loci in the genome are more susceptible to breakage than others. However, very little is known about the mechanism of generation of many such chromosomal translocations. In the present study, we have attempted to understand the mechanism of fragility of three regions, which are prone to breaks during translocations in follicular lymphoma (FL) and T-cell leukemia. The t(14;18) translocation in FL is one of the most common chromosomal translocations. Most breaks on chromosome 18 are located at the 3’ UTR of the BCL2 gene and are broadly classified into three clusters, namely major breakpoint region (mbr), minor breakpoint cluster region (mcr) and the intermediate cluster region (icr). The RAG complex has been shown to cleave BCL2 mbr by recognizing an altered DNA structure. In the present study, by using a gel based assay, nature of the non-B DNA structure at BCL2 mbr was identified as parallel intramolecular G-quadruplex. Various studies including circular dichroism (CD), mutagenesis, DMS modification assay and 1H NMR showed the presence of three guanine tetrads in the structure. Further, evidence was also found for the formation of such a G-quadruplex structure within mammalian cells. In an effort to characterize the mechanism of fragility of mcr, a unique pattern of RAG cleavage was observed in a sequence dependent manner. Three independent nicks of equal efficiency were generated by RAGs at the cryptic sequence, “CCACCTCT”, at mcr and at a cytosine upstream of it, unlike a single specific nick at the 5’ of heptamer during V(D)J rearrangement. Interestingly, RAG nicking at mcr occured in the presence of both Mg2+ and Mn2+. Using recombination assay, followed by sequencing of the junctions, we find that mcr can recombine with standard RSS in vivo, albeit at a very low frequency. Mutations to this novel motif abolish recombination at the mcr within the cells. In order to determine the prevalence of t(14;18) translocation in the healthy Indian population, nested PCR approach followed by Southern hybridization was used. Results showed 34% prevalence of t(14;18) translocation in the Indian population. Although, no gender based difference was observed, an age dependent increase was found in adults. Further, presence of the t(14;18) transcripts was also detected. The mechanism underlying the fragility of the t(10;14) translocation involving HOX11 gene in T-cell leukemia is not known. Using primer extension assays on a plasmid DNA containing HOX11 breakpoint region, presence of consistent pause sites corresponding to two G-quadruplex forming regions, flanking the patient breakpoints, were detected. These replication blocks were dependent on K+ ions. Native gel shift assays, mutation analysis, S1 nuclease and CD, further revealed formation of intermolecular G-quadruplexes, unlike the BCL2 mbr. Further, sodium bisulfite modification assay indicated the presence of such structures in the genomic DNA within cells. Hence, we propose that two independent G-quadruplex structures formed in the HOX11 gene could interact with each other, thereby resulting in fragility of the intervening sequences, where majority of the patient breakpoints are mapped. Overall, this study has attempted to understand the role of both sequence and structure of DNA, in generating chromosomal fragility during t(14;18) translocation in FL and t(10;14) translocation in T-cell leukemia. These results may facilitate future studies in unraveling the mechanism leading to genomic instability in other lymphoid cancers.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le lymphome avec phase circulante le plus fréquent chez l’adulte dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par une grand hétérogénéité dans son évolution naturelle avec des formes indolentes ne nécessitant jamais de traitement spécifique et des formes agressives requérant une chimiothérapie rapidement après le diagnostic. Dans ce travail de thèse, nous avons posé la question du rôle des anomalies moléculaires et en particulier des gènes des immunoglobulines dans l’histoire naturelle de la maladie, tant au plan mécanistique que pour le pronostic. Nous avons étudié trois remaniements atypiques impliquant un gène des immunoglobulines et un partenaire inconnu dans la LLC/lymphome lymphocytique. Les points de cassure ont pu être identifiés et nous ont permis de mettre en évidence l’implication dans 2 cas d’ARN longs non codants en 17q25 et 8q24. De plus, deux cas ont des points de cassure dans une région chromosomique restreinte (espacés de 200 kb en 17q25). Il pourrait s’agir d’un locus important dans la lymphomagénèse, de même que pour la région 8q24 contenant MYC et de nombreux gènes non codants jusqu’ici peu explorés. Par ailleurs, dans l’ère du séquençage haut débit, de nombreux marqueurs pronostiques moléculaires sont décrits dans la LLC. Nous avons démontré que l’électrophorèse des protéines sériques normale (immunoglobulines polyclonales sans hypogammaglobulinémie) au diagnostic, un marqueur simple et peu couteux, reste dans l’ère du NGS, un marqueur indépendant de bon pronostic dans la LLC. Sa combinaison avec un statut IGHV muté identifie un groupe de patients qui n’auront probablement jamais besoin de traitement spécifique. Ce travail nous a conduit à mettre au point un outil performant de détection des anomalies de nombre de copies par séquençage haut débit. Celui-ci permet la mise en évidence de disomies uniparentales dont la signification pronostique n’est actuellement pas établie dans la LLC. Ces anomalies pourraient être le reflet d’une instabilité chromosomique et il serait intéressant d’étudier leur impact pronostique dans la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent lymphoma with leukemic phase in the elderly in Western countries. It is characterized by a great heterogeneity in its natural history with indolent forms never requiring any specific treatment and aggressive forms needing chemotherapy rapidly after diagnosis. In this work of thesis, we asked the question of the role of molecular abnormalities, and in particular of the immunoglobulin genes in the natural history of the disease, at mechanistic level and for prognosis. We studied three atypical rearrangements implicating an immunoglobulin gene and an unknown partner in CLL/lymphocytic lymphoma. The breakpoints have been identified and the implication of long non coding RNA was highlighted in two cases in 17q25 and 8q24. Moreover, two cases harboured breakpoints in a restricted chromosomic region (200 kb spaced in 17q25). It could be an important locus in lymphomagenesis, as is 8q24 region containing MYC and numerous other non coding genes poorly characterized by now. Furthermore, in high throughput sequencing (HTS) era, many molecular prognosis markers have been described in CLL. We demonstrated that normal serum protein electrophoresis (polyclonal immunoglobulin without hypogammaglobulinemia) at diagnosis, a simple and unexpensive marker, stays in HTS era an independent good prognosis marker in CLL. Its combination with unmutated IGHV genes status identifies a group of patients who will probably never require any specific treatment. This work led us to develop an efficient tool to detect copy number variations by THS. This tool allows to highlight uniparental disomy whose prognosis signification is not established in CLL. These abnormalities could reflect chromosomal instability and it could be interesting to study their prognosis impact in CLL.