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Clonagem e expressão da Oligopeptidase Bsímile, da X-Prolil dipeptidil aminopeptidase e da Glutationa sintetase de Trypanosoma cruziAlmeida, Keyla Caroline de January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-04-01T20:30:22Z
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Previous issue date: 2009 / Após um século da descoberta da Doença de Chagas, ainda não existe medicamento efetivo para o seu tratamento, e os chagásicos continuam sucumbindo às manifestações crônicas dessa grave enfermidade. A possibilidade de descobrir uma enzima ou uma via metabólica crucial para o ciclo de vida do parasita não se resume apenas à satisfação da curiosidade humana, mas também é fundamental para o desenvolvimento de fármacos que sirvam para combater as mais diferentes doenças, entre elas, a Doença de Chagas. Essa dissertação de mestrado descreve o estudo de três proteínas de Trypanosoma cruzi: duas proteases classificadas como serino-protease com domínio α/β hidrolase, pertencente ao clan SC e família S9 e S15, respectivamente - Oligopeptidase B símile (OPBsTc) e X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) e uma proteína da via metabólica redox - a Glutationa sintetase (GSTc). A OPBsTc é uma enzima putativa de 903 aminoácidos com massa molecular esperada de 103,4 kDa sendo altamente conservada entre os cinetoplastídeos e ausente em humanos. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. Os soros foram utilizados em técnicas de Immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da protease. Infelizmente, não foi possível confirmar a expressão da OPBsTc em nenhuma das três formas do parasita: epimastigota, tripomastigota e amastigosta. Também realizamos uma RT-PCR a partir do RNA da forma epimastigota, mas o resultado foi negativo. A segunda protease foi a X-PDAPTc, esta serino-protease é largamente estudada em Lactococcus lactis e parece ser um fator de virulência em Streptococci. Análises em bancos de dados mostraram que a distribuição da X-PDAPTc é restrita e não apresenta ortólogos em mamífero, além disso, a enzima tem 677 aminoácidos com massa molecular esperada de 76,8 kDa. A enzima foi produzida em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. X-PDAPTc é expressa na forma epimatigosta do parasito. A GSTc tem importante participação na biossíntese da glutationa para manutenção do ambiente redox no parasito. Em relação ao seu ortólogo em humanos, foi observada homologia reduzida, o que pode torná-la um alvo promissor para desenvolvimento de drogas, assim como as duas proteases citadas acima. Essa enzima tem 535 resíduos de aminoácidos e massa molecular predita de 58,6 kDa. A GSTc foi expressa e utilizada para testes de imunização. / After a century of the discovery of Chagas’ disease, there is still no effective medicine for its treatment, and patients still succumb to severe manifestations of the chronic disease. The possibility of discovering an enzyme or metabolic pathway crucial to the parasite life cycle is not only to satisfy the human curiosity, but it is also fundamental to the development of drugs used to combat many different diseases, including Chagas’ disease. This master's thesis describes the study of three proteins of Trypanosoma cruzi: two proteases classified as serine-protease with α / β hydrolase domain that belong to SC clan and family S9 and S15, respectively - Oligopeptidase B like (OPBsTc) and X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) and a redox metabolic pathway enzyme - Glutathione synthetase (GSTc). The OPBsTc is a putative enzyme of 903 amino acids and molecular mass of 103.4 kDa. It is highly conserved among kinetoplastids and it is absent in humans. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. The sera were used in immunoblotting and immunocytology techniques in an attempt to confirm the expression of the protease. Unfortunately, we could not confirm the expression of OPBsTc in any of the three forms of the parasite: epimastigote, trypomastigote and amastigoste. We also performed a RT-PCR from total epimastigote RNA, but the result was negative. The second protease was X-PDAPTc, this serine-protease is extensively studied in Lactococcus lactis and it seems to be a factor of virulence in Streptococci. Analysis in databases showed that the distribution of X-PDAPTc is limited and it does not have any orthologs in mammalian. In addition, the enzyme has 677 amino acids with molecular mass of 76.8 kDa. The enzyme was produced in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. X-PDAPTc is expressed in the epimastigote form of the parasite. The GSTc has an important participation in the biosynthesis of glutathione in order to maintain redox environment of the parasite. The human ortholog shows low homology which may make it a promising target for drug development like the two proteases mentioned above. This enzyme has 535 amino acid residues and a predicted molecular mass of 58.6 kDa. The GSTc was expressed and used for immunization tests.
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Caracterização bioquímica de uma Leucil-aminopeptidase de Trypanosoma cruzi (LAPTc)Gastardelo, Thiago Santana 24 September 2010 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-30T18:43:41Z
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2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-07-06T13:41:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1
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2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Os patógenos dependem de atividades de peptidases para desempenhar muitos processos fisiológicos, tão bem quanto interagir com seus hospedeiros, destacando peptidases de parasitos como fatores de virulência e, então, potenciais alvos de drogas. O sequenciamento do genoma do cinetoplastídeo Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, revelou 28 genes que codificam aminopeptidases putativas, dentre as quais estão três metionina-aminopeptidases, duas aspártico-aminopeptidases, duas aminopeptidases sensíveis a puromicina e três leucil-aminopeptidases da família M17. Neste estudo, uma atividade leucil-aminopeptidolítica principal foi identificada em T. cruzi usando Leu-AMC como substrato. Ela foi isolada de formas epimastigotas do parasito por um procedimento cromatográfico de dois passos e associou-se com uma única proteína hexamérica de 320 kDa como determinado por experimentos de velocidade de sedimentação e de dispersão de luz. Ligações dissulfeto intercadeias não participam da organização oligomérica da peptidase ativa. Espectrometria de massa por Peptide mass fingerprint revelou a identidade molecular da enzima como a aminopeptidase EAN97960 predita de T. cruzi, o produto do gene Tc00.1047053508799.240. Análises enzimáticas e moleculares indicaram que esta leucil-aminopeptidase de T. cruzi (LAPTc) pertence à família M17 de peptidases ou família da leucil-aminopeptidase. LAPTc tem uma forte dependência de pH neutro, é mesofílica e conserva sua forma oligomérica até 80 °C. Ao contrário, sua forma recombinante produzida em E. coli, assim como outras LAPs, é termofílica e requer pH alcalino. A atividade desta metalo-aminopeptidase é inibida por bestatina e quelantes de metais tais como 1,10-fenantrolina, é restabelecida por Zn2+, e potencializada por Mn2+ ou Ca2+. A enzima é expressa por todas as formas do T. cruzi e localiza-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. Uma vez que vias de aminoácidos essenciais, incluindo leucina, estão desprovidas em T. cruzi, a LAPTc poderia ter uma função no suprimento nutricional. Além disso, a atividade da peptidase também poderia ter uma função no processamento de peptídeos e proteínas. Nós postulamos que a LAPTc poderia ser um alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a infecção de T. cruzi. / Pathogens depend on peptidase activities to accomplish many physiological processes, as well as to interact with their hosts, highlighting parasitic peptidases as virulence factors and, thus, potential drug targets. The kinetoplastid Trypanosoma cruzi genome sequencing, the aetiological agent of Chagas disease, has revealed 28 genes encoding putative aminopeptidases, among which there are three methionine, two aspartic, two puramycin-sensitive and three leucyl aminopeptidases of the M17 family. In this study, a major leucyl aminopeptidolytic activity was identified in the T. cruzi by using leu-AMC as substrate. It was isolated from epimastigote forms of the parasite by a two-step chromatographic procedure and associated with a single 320-kDa homohexameric protein as determined by sedimentation velocity and light scattering experiments. Interchain disulfide bonds do not take part in the oligomeric assembly of the active peptidase. Peptide mass fingerprinting revealed the molecular identity of the enzyme as the predicted T. cruzi aminopeptidase EAN97960, the product of the Tc00.1047053508799.240 gene. Molecular and enzymatic analysis indicated that this leucyl aminopeptidase of T. cruzi (LAPTc) belongs to the peptidase family M17 or leucyl aminopeptidase family. LAPTc has a strong dependence on neutral pH, is mesophilic and retains its oligomeric form up to 80 °C. Conversely, its recombinant form produced in E. coli, like other LAPs, is thermophilic and requires alkaline pH. The activity of this metalloaminopeptidase is inhibited by bestatin and metal chelants such as 1,10-phenanthroline, is restored by Zn2+, and potentiated by Mn2+ or Ca2+. The enzyme is expressed by all T. cruzi forms and localizes within vesicles in the cytoplasm of the parasite. Since biosynthetic pathways for essential amino acids, including leucine, are lacking in T. cruzi, LAPTc could have a function in nutritional supply. Furthermore, the peptidase activity could also play a role in peptide and protein processing. We postulate that the LAPTc might be a potential target for the development of new drugs to treat T. cruzi infection.
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Prolil oligopeptidases de tripanossomos : aspectos estruturais e funcionaisMotta, Flávia da Silva Nader 09 April 2010 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-21T14:21:33Z
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2010_FlaviadaSilvaNaderMotta.pdf: 3843006 bytes, checksum: be72ce6d2ae5ec4a5cde40aa3a698258 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-21T14:24:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2010_FlaviadaSilvaNaderMotta.pdf: 3843006 bytes, checksum: be72ce6d2ae5ec4a5cde40aa3a698258 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-09-21T14:24:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2010_FlaviadaSilvaNaderMotta.pdf: 3843006 bytes, checksum: be72ce6d2ae5ec4a5cde40aa3a698258 (MD5) / A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização de alvos potenciais para a quimioterapia da doença de Chagas tendo as proteases como principal enfoque, uma vez que estão envolvidas em processos biológicos fundamentais para a viabilidade e virulência de patógenos. Neste contexto, essa tese aborda alguns aspectos estruturais e funcionais de serino-proteases pertencente à família Prolil Oligopeptidase: a oligopeptidase B (OPBTc) e prolil oligopeptidase (POPTc 80) de Trypanosoma cruzi e a prolil oligopeptidase (POP Tb) de Trypanosoma brucei. A OPBTc participa da invasão celular por meio do recrutamento e fusão de lisossomos da célula hospedeira até o local de ligação do parasito por uma via dependente de Ca2+. Por meio deste trabalho, a OPBTc tornou-se a primeira oligopeptidase B a ter sua estrutura dimérica confirmada por ultracentrifugação analítica. Experimentos de dicroísmo circular mostraram que em altas temperaturas, a enzima conserva sua estrutura secundária, mas não a terciária. A perda da estrutura terciária por tratamento térmico acompanha a diminuição da atividade da enzima e a perda da dimerização, que ocorrem a partir de 50 °C. No entanto, a associação do dímero é resistente a altas concentrações de sal e a tratamento com reagentes redutores, indicando que esta interação não ocorre devido a pontes dissulfeto intermoleculares. Este trabalho também mostra a caracterização funcional da POP de T. brucei, protozoário causador da doença do sono. Esta protease foi capaz de hidrolisar colágeno tipo I semi-purificado in vitro e colágeno nativo em mesentério de rato, além de peptídeos hormonais. Foi observado ainda, que POP Tb é liberada na corrente sanguínea de camundongos infectados pelo T. brucei, onde permanece ativa, sugerindo sua contribuição para a patogênese da doença do sono. Como já proposto em estudos prévios, a POP Tc80 está envolvida na entrada do T. cruzi em célula hospedeiras não fagocíticas e alguns de seus substratos naturais foram caracterizados mostrando que a mesmo hidrolisa colágenos do tipo I e IV e fibronectina. O mecanismo desta catálise não é completamente entendido, porém cálculos de interação entre o modelo estrutural teórico da POP Tc80 com o colágeno mostraram que ocorre uma abertura dos domínios da enzima para entrada do substrato. Para verificar essa hipótese, mutações sítios dirigidas na POP Tc80 acarretaram na perda da sua atividade devido à rigidez da enzima, impedindo o acesso do substrato à fenda catalítica. Finalmente, ainda na tentativa de esclarecer o papel da POP Tc80 na infecção do T. cruzi, foi montada uma estratégia para silenciar seu gene. Os resultados preliminares indicam que um alelo do gene poptc80 sofreu recombinação homóloga sendo trocado pelo marcador de seleção, o gene de resistência a neomicina. / The research activities of our group aim the identication and characterization of potential targets for chemotherapy oT Chagas:s disease, and proteases are the main focus since they are involved in biological processes essential for the viability and virulence of pathogens. In this context, this thesis addresses some structural and functional features of seine-proteases that belong to the Prolil Oligopeptidase family: the oligopeptidase B (OPBTc) and prolyl oligopeptidase (POP Tc80) of Trypanosoma cruzi and the prolyl oligopeptidase (POPTb) of Trypanosoma brucei. The OPBTc participates in cell invasion through the recruitment and fusion of the host cell lysosomes to the binding site of the parasite by a Ca2+ dependent pathway. In this work, the OPBTc had a structural approach, being the first oligopeptidase B to have its dimeric structure confirmed by analytical ultracentrifugation. Circular dichroism experiments showed that at high temperatures, the enzyme retains its secondary structure but not the tertiary. The loss of tertiary structure by heat treatment follows the decline of enzyme catalytic ability, which occurs from 50 "C. However, the association of the dimer is resistant to salt high concentration and treatment with reducing reagents, indicating that this interaction is not dueto intermolecular disulfide bonds. This work also shows the functional characterization of the enzyme POP of T. brucei {protozoan that causes sleeping sickness), the POPTb. This protease was able to hydrolyze native and semi-purified collagen type I and peptide hormones. In addition, POPTb is released into the bloodstream of T. brucei infected mice, where it remains active, suggesting their contribution to the pathogenesis of sleeping sickness. As shown in previous studies, the POP Tc80 is involved in the entry of the parasite in the non-phagocytic host cell and some of its natural substrates were characterized showing that the enzyme hydrolyzes collagen type I and IV and fibronectin. The mechanism of this catalysis is not completely understood, but docking analysis of the theoretical structural model of POP Tc80 with collagen, showed that the enzyme domains open to substrate entry. To investigate this hypothesis, site directed mutations in POP Tc80 resulted in loss of its activity due to the rigidity of the enzyme, preventing the substrate access to the catalytic pocket. In a attempt to clarify the role of POP Tc80 in T. cruzi infection, it was set up a strategy to silence its gene. Preliminary results indicate that one allele of the poptc80 gene has been replaced by the selection marquee, the gene for resistance to neomycin, through homologous recombination.
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Proteômica de Trypanosoma cruzi : variações em subproteomas durante a amastigogêneseQueiroz, Rayner Myr Lauterjung 03 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-30T12:35:16Z
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2013_RaynerMyrLauterjungQueiroz.pdf: 2749536 bytes, checksum: 919b0cd19524ed0a125aae72c5a61ed3 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T12:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2013_RaynerMyrLauterjungQueiroz.pdf: 2749536 bytes, checksum: 919b0cd19524ed0a125aae72c5a61ed3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T12:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2013_RaynerMyrLauterjungQueiroz.pdf: 2749536 bytes, checksum: 919b0cd19524ed0a125aae72c5a61ed3 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma enfermidade que afeta milhões de pessoas especialmente na América latina onde é endêmica. O parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro dos seus hospedeiros mamíferos e triatomíneos. A respeito
especialmente do hospedeiro mamífero, os tripomastigotas, a forma sanguínea infectiva
do T. cruzi, diferencia-se intracelularmente em amastigotas replicativos após um
período de incubação dentro de fagolisossomos ácidos, em um processo denominado amastigogênese. Aqui buscamos encontrar novas informações concernentes a esse processo através da análise do subproteoma de superfície celular dos estágios de vida presentes no homem e do repertório protéico secretado/excretado por tripomastigotas em pH fisiológico e também nas primeiras 3 horas de amastigogênese axênica. Também realizamos uma análise quantitativa do proteoma total e do fosfoproteoma durante a amastigogênese. Todos os subproteomas foram aqui analisados por LC-MS/MS com um espectrômetro de massas Orbitrap Velos. Primeiro utilizamos epimastigotas, o estágio do parasito encontrado no inseto vetor, para padronizar e avaliar o enriquecimento de proteínas da superfície celular por duas técnicas distintas: uma baseada na tripsinização
da superfície de células intactas e a outra baseada na biotinilação de proteínas expostas
na superfície e seu enriquecimento por cromatografia de afinidade a estreptoavidina. Os resultados mostraram que essas abordagens ofereceram informações abrangentes e complementares sobre o subproteoma da membrana plasmática do parasito e, então, foram aplicadas na análise desse subproteoma nas formas amastigota e tripomastigota. A análise quantitativa do proteoma e fosfoproteoma usou parasitos diferenciados de forma axênica em quatro pontos do processo (0 min, 30 min, 2 h e 9 h) e os fosfopeptídeos foram enriquecidos com resina de TiO2. Finalmente, o secretoma de tripomastigotas foi obtido de uma maneira similar ao protocolo de aquisição de antígenos secretados/excretados, mas com cuidados adicionais para evitarmos lise mecânica das células. As análises renderam milhares de proteínas identificadas que eram comprovadamente ou preditas como associadas à membrana plasmática ou secretadas e são envolvidas na interação parasito-hospedeiro. Da mesma forma, várias proteínas e fosfopeptídeos relevantes possuíram expressão regulada durante a amastigogênese. / Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas' disease, a neglected infectious illness that affects millions of people, mostly in the Latin America. The parasite undergoes several differentiation processes in order to adapt to different conditions inside both mammalian and triatomine hosts. Specially regarding mammalian hosts, the trypomastigote, an infective bloodstream life-form of the T. cruzi, differentiates intracellularly to the replicative amastigote stage after a period of incubation inside acidic phagolisossomes, in a process called amastigogenesis. Here we aim to bring further light to this process by analysing the cell surface subproteome of the mammalian hosted life-forms of the parasite and the secreted/excreted protein repertoire from trypomastigotes in physiological pH and also at the first 3 hours of the acidic pH induced amastigogenesis. Finally, we performed the quantitative proteome and phosphoproteome analysis of the amastigogenesis by iTRAQ labeling. All T. cruzi subproteomes were analysed by LC-MS/MS with Orbitrap Velos mass spectrometer. First we used T. cruzi epimastigotes, the insect hosted life-form, in order to prepare samples enriched in cell surface proteins by two distinct methodologies, which were optimized and evaluated. The first methodology was based on cell surface trypsinization (Shave) of intact living cells while the second approach used biotinylation of cell surface proteins followed by streptavidin affinity chromatography isolation of the labeled proteins. The results showed that the methodologies offered comprehensive and complementary information about the parasite's plasma membrane subproteome, which were applied afterwards in the trypomastigote and amastigote cells. The quantitative proteome and phosphoproteome analysis used the axenicaly differentiated parasites in four time points (0 min, 30 min, 2 h and 9 h) and the phosphopeptides were enriched using TiO2 beads. Finally, the trypomastigote secretome were obtained in a similar way to the protocols of acquisition of secreted/excreted antigens, but with further care to avoid mechanical lysis. The results yielded thousands of protein identifications which were either proved or expected to be associated to the plasma membrane or secreted and are involved in host-parasite interection and, in the same way, we found several proteins and phosphopeptides that have regulated expression during amastigogenesis.
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Expressão de RNAm TLR 2, TLR 4 e citocinas em infecção experiemental por cepas Trypanosoma cruzi de diferentes origens /Picka, Mariele Cristina Modolo. January 2011 (has links)
Orientador: Jussara Marcondes Machado / Banca: Paulo Camara Marques Pereira / Banca: Simoni Badini Lucheis / Banca: Sonia Maria Usó Ruiz Silva / Banca: Fátima Regina Vilani Moreno / Resumo: Receptores Toll-like (TLRs), em células apresentadoras de antígenos, têm importante papel no reconhecimento microbiano e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Na infecção por T. cruzi, a imunidade celular, medida pela atividade de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12 e IFN-γ, do perfil Th1, associadas ao TNF-α, reduz a carga parasitária na fase crônica. Simultaneamente, a IL-4 e a IL-10, do perfil Th2, são responsáveis por amortecer os fortes efeitos da ação pró-inflamatória. Características do parasita, como variação antigênica e diversidade genética das linhagens de T. cruzi, também têm influência na resposta imune do hospedeiro. Assim, este estudo teve como objetivos, em infecção experimental com cepas de diferentes origens de T. cruzi: fazer a caracterização molecular das cepas; determinar os momentos evolutivos da infecção (curva de parasitemia e sobrevida) e verificar a expressão gênica relativa de TLR 2, TLR 4, IL-12p40, IFN-γ,TNF-α, IL-10 e IL-4 em cada momento da infecção. Para isso, foram utilizadas duas cepas de T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos, ZMC e JLP, e a cepa Y de T. cruzi. Camundongos machos Balb/C foram infectados com 104 tripomastigotas/animal e distribuídos em: G1, infectados com a cepa Y; G2, infectados com a cepa ZMC; e G3, infectados com a cepa JLP de T. cruzi. Os momentos para a determinação da expressão gênica das variáveis estudadas foram definidos segundo curva de parasitemia e de sobrevida previamente realizadas: M1: 24 h p.i.; M2: início da fase aguda; M3: fase aguda; M4:momento da queda importante e de manutenção da parasitemia e M5: momento final, determinado pela curva de sobrevida. Todas as cepas foram classificadas no grupo TCII, apesar de apresentarem comportamentos distintos em relação ao número de parasitas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Toll-like receptors (TLRs), in antigen-presenting cells, play an important role in microbial recognition and adaptive immune response development. In T. cruzi infection, cellular immunity, mediated by the activity of proinflammatory cytokines such as IL-12 and IFN-γ, of the Th1 profile, associated with TNF-α, reduces parasite load in the chronic phase. Simultaneously, IL-4 and IL-10, of the Th2 profile, are responsible for controlling the strong proinflammatory effects of Th1 profile. Parasite characteristics, such as antigen variation and genetic diversity of T. cruzi strains, also influence host immune response. Hence, by using experimental infection with T. cruzi strains of different origins, this study aimed at: performing the molecular characterization of the strains; determining the evolutive moments of the infection (parasitemia and survival curve) and analyzing the relative gene expression of TLR 2, TLR 4, IL-12p40, IFN-γ,TNF-α, IL-10 and IL-4 at each moment of infection. To that end, two T. cruzi strains, ZMC and JLP, isolated from chronic chagasic patients, and the Y strain of T. cruzi were used. Male Balb/C mice were infected with 104 trypomastigotes/animal and distributed into: G1, infected with the Y strain; G2, infected with the ZMC strain; and G3, infected with the JLP of T. cruzi. The moments for determination of gene expression of the studied variables were defined according to the curve of parasitemia and survival that was previously performed: M1: 24 h p.i.; M2: beginning of the acute phase; M3: acute phase; M4: moment of important decrease and maintenance of parasitemia and M5: final moment, determined by the survival curve. All the strains were classified in the TCII group although they showed different behaviors in relation to the number of circulating parasites, day of the acute phase peak and... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Ultraestrutura e capacidade vetorial de esp?cies do ?subcomplexo rubrovaria? (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae)OLIVEIRA, Maria Luiza Ribeiro de 26 September 2014 (has links)
Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2016-10-11T19:43:22Z
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Previous issue date: 2014-09-26 / CAPES / The aim of this study was to morphologically characterize the external appendages (buccula, rostrum; stridulatory groove; scutellum of male legs and genitalia of females) Triatoma carcavalloi, Triatoma circummaculata and Triatoma rubrovaria compare the morphology and morphometry of exoc?rios bodies and opercula of eggs through optical and scanning electron microscopy, besides examining the bionomic characteristics of T. carcavalloi in laboratory conditions, providing subsidies to assess the vectorial capacity of this species. Morphostructural the differences of adults were illustrated in scutellar region where only one species, T. circummaculata, presented in the harth form median depression. In the analyzes of the cephalic region, stridulatory groove is in the form of "U" shaped and T. circummaculata "V" T. carcavalloi and T. rubrovaria the buccula and T. carcavalloi described how to T. rubrovaria "U" and T. circummaculata "V". Already the rostrum of T. carcavalloi, T.
circummaculata and T. rubrovaria presented two side slits 1 + 1 at the apex. Were analyzed and highlighted significant differences in the length, width and diameter of the body and lid of the eggs of T. rubrovaria, T. carcavalloi and T. circummaculata. In the femurs of the legs of the three species, in both sexes a pair of subapical denticles were found. The spongy pits were found only in males, tibia of fore and middle legs. Regarding the biology of T. carcavalloi, the average incubation period of the eggs in T. carcavalloi was 22.7 days. The largest number of eggs / female / week was observed during the warmer months and the eggs that failed to hatch were fertile. The first day of blood meal was 3.13 days after hatching, on average. The intermoult period N1-N2 averaged de18,52 days; N2-N3 was 62.77 days; N3-N4 was 86.93 days; N4-N5 and N5 was 119.05 days, adult was 193.43 days. The overall average of feeds throughout the nymphal development was 13.4. The results achieved for starvation resistance indicated that the nymphs of 3rd, 4th and 5th stages have
higher resistance than adults, and in this case the males were less resistant than females. The highest mortality rate was recorded in N3 (22.2%). The median survival was 25.6 weeks for adultos.O total life cycle was long, averaging 503.4 dias. A general evaluation of the results showed that in all studied morphological characters there were significant differences in all three species, putting each species in its specific status. However, the species that differs in the largest number of features, particularly the size of the structures is T. circummaculata. The data obtained in addition to expanding the knowledge of T. carcavalloi bion?mico contribute to the assessment of the possible role of this species in the transmission of T. cruzi. / O objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente os ap?ndices externos (b?cula, rostro; sulco estridulat?rio; escutelo de machos, patas e genit?lia de f?meas) deTriatoma carcavalloi, Triatoma circummaculata e Triatoma rubrovaria, comparar a morfologia e a morfometria dos exoc?rios dos corpos e op?rculos dos ovos atrav?s da microscopia ?tica e eletr?nica de varredura, al?m de examinar as caracter?sticas bion?micas de Triatoma carcavalloi em condi??es de laborat?rio, fornecendo subs?dios para avaliar a capacidade vetorial dessa esp?cie. Foram ilustradas as diferen?as morfoestruturais dos adultos na regi?o escutelar onde apenas uma esp?cie, T. circummaculata, apresentou a forma codiforme na depress?o mediana. Nas an?lises da regi?o cef?lica, o sulco estridulat?rio ? em forma de ?U? em T. circummaculata e em
forma de "V" em T. carcavalloi e T. rubrovaria, as b?culas de T. carcavalloi e T. rubrovaria apresentaram a forma de ?U? e T. circummaculata de ?V?. J? o rostro de T. carcavalloi, T. circummaculata e T. rubrovaria apresentaram duas fendas laterais 1+1 no ?pice. Foram analisadas e evidenciadas diferen?as significativas no comprimento, largura e di?metro do corpo e do op?rculo dos ovos de T. rubrovaria, T. carcavalloi e T.
circummaculata. Nos f?mures das patas das tr?s esp?cies, em ambos os sexos foram encontrados um par de dent?culos subapicais. As fossetas esponjosas foram encontradas somente nos machos, nas t?bias das patas anteriores e medianas. Em rela??o a biologia de Triatoma carcavalloi, o per?odo m?dio de incuba??o dos ovos em T. carcavalloi foi de 22,7 dias. O maior n?mero de ovos / f?mea /semana foi observado durante os meses
mais quentes e os ovos que n?o eclodiram eram f?rteis. O primeiro dia de repasto sangu?neo foi de 3,13 dias ap?s a eclos?o, em m?dia. O per?odo de intermuda N1-N2 foi em m?dia de18,52 dias; N2-N3 foi 62,77 dias; N3-N4 foi 86,93 dias; N4-N5 foi 119,05 dias e N5-adulto foi 193,43 dias. A m?dia geral de alimenta??es durante todo o desenvolvimento ninfal foi de 13,4. Os resultados logrados para resist?ncia ao jejum
indicaram que as ninfas de 3?, 4? e 5? est?dios apresentam maior resist?ncia do que os adultos, e neste caso os machos foram menos resistentes do que as f?meas. A taxa de mortalidade mais alta foi registrada em N3(22,2%). A sobreviv?ncia m?dia foi de 25,6 semanas para os adultos.O ciclo de vida total foi longo, com m?dia de 503,4 dias.Uma avalia??o geral dos resultados apontou que em todos os caracteres morfol?gicos
estudados houveram diferen?as significantes nas tr?s esp?cies, colocando cada esp?cie em seu status espec?fico. Entretanto, a esp?cie que difere em maior n?mero de caracter?sticas, principalmente no tamanho das estruturas ? Triatoma circummaculata. Os dados obtidos al?m de ampliar o conhecimento bion?mico de Triatoma carcavalloi contribuem para a avalia??o de uma poss?vel participa??o desta esp?cie na transmiss?o
do T. cruzi.
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Herança vertical de seqüências de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi integradas no genoma de células germinativas humanasAraújo, Perla Fabíola de 07 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, 2008. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-09-28T18:12:51Z
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Previous issue date: 2008-07 / O presente trabalho é o primeiro relato de integração de seqüências provenientes de um protozoário para o genoma de células germinativas humanas. Neste estudo, nós documentamos a integração de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi no genoma de células germinativas e a transferência vertical dessas mutações para os descendentes. Foram analisadas amostras de esperma de 34 voluntários. Desses, 22 doadores foram agrupados em cinco famílias, cujos progenitores (F0) eram portadores da doença de Chagas. Doze amostras de esperma foram obtidas de indivíduos isolados. Foi possível observar a integração de kDNA de T. cruzi no genoma de todos os 17 chagásicos estudados. A transferência vertical apenas das seqüências de kDNA para as progênies F1 e F2 pôde ser observada em 6 descendentes de chagásicos. As análises das regiões do genoma humano que flanqueavam as seqüências de kDNA mostraram a integração de minicírculos de kDNA preferencialmente em elementos retrotransponíveis do tipo LINE-1, em 72,5% das seqüências quimeras. O encontro do mesmo locus em indivíduos chagásicos e seus descendentes é mais uma evidência mostrando a herança das mutações. Verificamos, também, que as seqüências de minicírculos de kDNA ligaram-se a outros elementos transponíveis (4%), tais como Alu, ERV e MER, e, também, em alguns genes (9%). Nos demais clones (14%), não foi possível determinar os loci de integração do kDNA no genoma devido á ausência de informação em bancos de dados. Os achados deste estudo sugerem que as mutações decorrentes da inserção do kDNA poderiam causar alterações genotípicas e fenotípicas implicadas na auto-imunidade descrita na doença de Chagas. De fato, a incorporação de DNA exógeno na célula humana nos mostra a complexidade das interações do parasito com o hospedeiro humano. A descrição de mutação, recombinação e deriva genética, alterando genótipo e fenótipo do hospedeiro, poderão sugerir a base da auto-imunidade que se associa à patogênese da doença de Chagas. / The present work shows by the first time the integration of Trypanosoma cruzi kDNA minicircle sequences into the human genome. This eukaryote-to-eukaryote lateral transfer of DNA is constantly seen in each patient harbouring the infections. The kDNA mutations are inherited by F1 and F2 progeny and undergo genetic drifts, recombination hitchhiking from primary to secondary chromosomes. We analysed 22 samples of sperm of volunteers from five families whose founders have the active infections. Independently, we further analysed haploid cells DNA from 12 individuals. The vertical transfer of kDNA minicircle sequences was detected in 17 family members. Among these there were 11 with active T. cruzi infections, showing nDNA and kDNA signatures. The remaining six F1 and F2 progenie had the kDNA signatures only. In each of these 17 individuals we showed sequences of minicircles of kDNA from T. cruzi integrated into germ line cells. The main hotspot for the kDNA integration was retrotransposons LINE-1 (72.5%). In 9% of cases the integreations entered coding regions of genes. Besides, kDNA minicircles sequences integrated nonautonomous transposable elements (4%) Alu, ERV and MER, Finally, in (14%), the kDNA mutations entered undetermined sites into the human genome. The presence of the kDNA mutations are in agreement with the findings of lateral transfer of kDNA in somatic cells of same individuals (Hecht, M.M, Thesis, University of Brasilia, 2008). Furthermore, the demonstration of kDNA mutations in haploid cells is brought here in the absence of active T. cruzi infections. Actually, the vertical inheritance could be appreciated in two marriages to which the marriages generated offsprings with kDNA mutations showing sequence alignments similar to the father. In fact, an exogenous DNA incorporation by the human cell let us to see more complex process of parasite-host`s interaction. The evolution of living creatures suggests that lateral transfer of exogenous DNA, mutations and hitchhiking, genetic drifts and social heterosis could be considered ongoin forces leading to genetic diversity and evolution.
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Caracterização biológica e molecular de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas durante o surto de doença de Chagas agudo em Santa CatarinaPena, Darlene Aparecida 25 October 2012 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T09:27:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1
276155.pdf: 1327907 bytes, checksum: c871d158d79651580afbc11a1f0e9dbf (MD5) / Estudos moleculares e de biologia demonstram que o táxon Trypanosoma cruzi é composto por diferentes linhagens. Em 2005, foi descrito um surto de doença de Chagas Agudo (DCA) no município de Navegantes em Santa Catarina associado ao consumo de caldo de cana contaminado com o T. cruzi. Análises moleculares identificaram as linhagens TcI em gambás (cepas SC90 e SC91), TcI/TcII em triatomíneos (cepas SC92 e SC93) e TcII em pacientes (cepas SC94-SC102). Neste sentido, o presente trabalho objetivou estudar possíveis mecanismos envolvidos na seleção de populações do grupo TcII em infecções humanas ocasionadas por cepas mistas TcI/TcII de T. cruzi. Para tanto, as cepas SC90, SC92, SC93, SC94, SC95, SC96 e Y foram utilizadas nos ensaios de lise pelo sistema complemento, interação com macrófagos murino e humano na presença e ausência de soro imune e IFN-?, ensaios de Western blot e cinética da proporção das linhagens TcI e TcII em cepas mistas após diferentes passagens em macrófagos humanos por meio de PCR semiquantitativo e PCR quantitativo. Os ensaios de lise pelo sistema complemento não mostraram diferenças de sensibilidade entre as cepas estudadas. Já nos estudos de interação T. cruzi-macrófagos murinos verificou-se um aumento na taxa de infecção e no número médio de amastigotas quando formas tripomastigotas das diferentes cepas foram previamente incubadas com soro chagásico. Além disso, as cepas do grupo TcII apresentaram uma maior taxa de infecção em macrófagos e após 72 horas de interação, apresentaram valores médios do número de amastigotas duas vezes superiores ao observado para cepas TcI. Contudo, não houve diferença significativa no número médio de amastigotas no tempo inicial de infecção entre TcI e TcII. Ensaios de Western blot confirmaram uma maior expressão da gp82 em formas tripomastigotas das cepas TcII. Macrófagos ativados com IFN-? infectados com as cepas Y, SC90 e SC96 foram capazes de controlar a proliferação dos parasitos independente da cepa utilizada, de forma dependente da NOS2. A análise da proporção de TcI e TcII nas cepas mistas SC92, SC93 e na mistura artificial, SC90+SC96, antes e após a conclusão do ciclo biológico em macrófagos murinos revelou uma alteração no perfil molecular dessas cepas, sendo observado um completo desaparecimento do fragmento de DNA de 200 pb (TcI) na cepa mista artificial (SC90+SC96), enquanto nas cepas SC92 e SC93 verificou-se uma diminuição de cerca de 3 vezes na intensidade do fragmento de 200 pb. Quando os ensaios foram realizados com a cepa SC92 (três passagens seriadas em macrófagos humanos), constatou-se um progressivo aumento na proporção de TcII, uma vez que a proporção inicial era de 77,4% para TcI e 22,6% para TcII e após a terceira passagem foi verificado 93,2% para TcII. Em conjunto, estes resultados sugerem que a manutenção de populações de T. cruzi II em infecções humanas ocasionadas por cepas mistas pode estar relacionada com características intrínsecas do parasito, como a capacidade infectiva e o tempo de duplicação intracelular. Embora seja ainda possível que mecanismos efetores dos macrófagos estejam envolvidos com essa seleção.
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Caracterização de regiões de integração de minicírculos de kDNA de Trypanosoma Cruzi no genoma humanoCosta, Ana Maria 06 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-30T14:27:19Z
No. of bitstreams: 1
2008_AnaMariaCosta.pdf: 3885912 bytes, checksum: e120b16f41fa85a75f30e9c489b804ab (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-03-02T14:25:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2008_AnaMariaCosta.pdf: 3885912 bytes, checksum: e120b16f41fa85a75f30e9c489b804ab (MD5) / Made available in DSpace on 2009-03-02T14:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2008_AnaMariaCosta.pdf: 3885912 bytes, checksum: e120b16f41fa85a75f30e9c489b804ab (MD5) / A integração de minicírculos de kDNA do Trypanossoma cruzi no genoma hospedeiro foi
correlacionada com alterações na expressão gênica. Com a finalidade de caracterizar as regiões híbridas e
ampliar o conhecimento biológico realizou-se os isolamentos e clonagens dos minicírculos integrados no
genoma de macrófagos humanos em cultura e de tecidos de coelhos chagásicos. Observou-se
instabilidade genética dos segmentos que continham as integrações. As clonagens realizadas em
diferentes combinações de vetores e hospedeiras não evitaram os rearranjos. A análise de restrição e o
seqüenciamento dos segmentos recuperados mostraram alterações no tamanho e na estrutura do vetor. A
técnica de captura desenvolvida no presente estudo permitiu confirmar a instabilidade genética dos
minicírculos preferencialmente integrados. A análise de restrição e o seqüenciamento desses fragmentos
mostraram que os minicírculos recuperados apresentaram encurtamentos nas regiões variáveis em relação
ao padrão descrito na literatura. Verificou-se que o encurtamento ocorreu durante ou após a integração no
genoma. As regiões variáveis encurtadas de 50 pb foram recuperadas das linhagens subclonais de
macrófago A11, C4, C6 e coração de coelhos chagásicos. Quando comparadas entre si essas regiões
apresentaram similaridade na ordem de 90%. Em relação à região variável 80 pb, recuperada do
macrófago C6, a similaridade foi em torno de 75%. O resultado sugeriu a existência de classes de
minicírculos que se integram preferencialmente no genoma hospedeiro. Foram obtidos clones híbridos
estáveis contendo o final da região conservada nas extremidades seguidas pela região variável truncada,
fragmento de elemento LINE-1, com ou sem a presença de microssatélite. A origem híbrida foi
confirmada por fragmentação do clone que foi utilizado como sonda na hibridação de macrófagos
humanos normais e DNA de T. cruzi. O segmento B7, obtido por captura, apresentou o minicírculo de
kDNA com 4 regiões variáveis truncadas, intercaladas por regiões conservadas normais seguidas do
microssatélite CA e da região humana com similaridade ao clone murino AC131797.3. A análise “in
silico” do segmento B7 mostrou a presença de seqüências regulatórias da expressão gênica. Foram
identificadas 9 possíveis ORFs, sendo duas compreendo a região híbrida (ORF1 e 2). Verificou-se nas
integrações recuperadas de coração de coelhos chagásicos segmentos similares à região humana
encontrada no clone B7, indicando a recorrência dos sítios recombinativos. A análise “in silico” do clone
B7, G10 e das regiões hospedeiras obtidas dos bancos de dados mostrou a presença de estruturas do tipo
não B nos locais próximos ao ponto de recombinação. A presença da estrutura não B no segmento B7 foi
confirmada pela alteração na mobilidade eletroforética. Em todos os pontos de entrada do minicírculo no
genoma hospedeiro verificou-se a redução da tensão local e aumento da tensão global na região,
sugerindo a possibilidade de ocorrência de novos eventos recombinativos envolvendo o segmento. O
conjunto das informações indica que a integração é mediada por recombinação homologa mediada por
similaridades estruturais presentes no DNA hospedeiro e minicírculo de kDNA. / The integration of Trypanossoma cruzi kDNA minicircle sequences into the host cell’
genomemay result in alterations of genic expression. To achieve the characterization of the hybrid regions
and enhancement of the biological knowledge the isolation and cloning of the integrated minicircles was
made in vitro in the human macrophages and in the chagasic rabbit tissues. Genetic instability of the
segments with the integrations was observed. The cloning made it in different combinations of vectors
and hosts did not avoid deletion and rearrange. The capture technique developed in the present study
showed kDNA integration events with the genetic instability. The sequencing of the kDNA integrated
events and restriction analysis revealed that the minicircle sequences were frequently rearranged; short
minicircle variable regions fragments were constantly found in relationship to the standard size describe
in literature. Possibily, deletions of integrated sequences took place during or after the kDNA integration
into the macrophage genome. Short variable regions (50 pb) was recovered from macrophages cell lines
A11, C4, C6 and from chagasic rabbits. Those integrated kDNA minicircles shared 90% sequences
similarities. The variable region stretches also revealed 75% similarities among them. These results
suggest that classes of minicircles integrate preferentially in the macrophage genome. Somewhat stable
hybrid clones were found with the final conserved region followed by a fragment of the variable region
linked to the LINE-1 sequence, with or without the presence of microsatellites. The hybrid origin of these
sequences was demonstrated by hybridization experiments with segment specific chimera sequence
fragments. A capture procedure revealed a B7 fragment showing the kDNA minicircle with 4 truncated
variable regions interspersed by CA microsatellite with similarity to the AC131797.3 murine clone. The
“in silico” analysis of the B7 fragment showed the presence of genic expression regulatory sequences in
the minicircle region. The identification of nine putative ORFs within hybrid regions (ORFs 1 and 2) was
recorded. The kDNA integration events detected into the heart DNA from chagasic rabbits showed
similar host regions to that of clone B7 clone, indicating that homologous recombination was the
mechanism whereby the kDNA integrated into the vertebrate genome. The presence of B structures in the
DNA sequences at the integration sites has suggested that bends formed in those sites explains the
alterations in the eletrophoretic mobility presented in those clones. At the integration sites in the host
genome bents formed by reduced tension forces forming torsion angles, thus indicating the possibility of
new integration events, deletions and recombinations at the spot. These findings showing sequences
similarities present in the host DNA and kDNA minicircle sequences have suggested that the kDNA
integration might be mediated by homologous recombination.
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Avaliação da atividade tripanocida de compostos fenólicosAlbino, Danielle Bibas Legat January 2005 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, atinge cerca de 18 milhões de indivíduos, principalmente em países da América Latina. O benznidazol (Rochagan), único fármaco comercialmente disponível no Brasil para o tratamento da infecção, apresenta baixa atividade, principalmente na fase crônica da doença. Neste estudo a atividade tripanocida in vitro de 28 compostos fenólicos sintéticos foi avaliadada contra diferentes formas evolutivas da cepa Y do T. cruzi. Os ensaios foram realizados em triplicata, em microplacas de 96 orifícios, adicionando-se 180 µl da suspensão de epimastigotas de cultura (5x106 parasitas/mL), ou de tripomastigotas sanguíneos (1x106 tripomastigotas/ml), com 20 µl dos compostos em diferentes concentrações. Como controles foram utilizados o benznidazol ou o cristal violeta. As formas epimastigotas foram mantidas por 72h a 27°C e a atividade determinada pela contagem em câmara de Neubauer. Tripomastigotas foram mantidos por 48h a 4°C e a atividade avaliada pela técnica de Brener. O sangue de camundongo, adicionado aos compostos ativos (500 e 250 µM) por 72h a 4°C, foi inoculado em camundongos Swiss para comprovar sua esterilidade. A parasitemia dos animais foi acompanhada semanalmente por 30 dias e o sangue dos camundongos negativos submetidos à hemocultura e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-T. cruzi. Foi avaliada também a atividade hemolítica dos compostos pelo método da cianometahemoglobina. A citotoxicidade celular foi ensaiada pelo método do MTT e pela avaliação microscópica da integridade do tapete celular. A atividade contra formas amastigotas intracelulares foi ensaiada em células Vero. Após 24h de infecção as monocamadas foram tratadas com os compostos ativos e com benznidazol em diferentes concentrações por 72h. O porcentual de células infectadas e o número de parasitas por célula foram determinados em 300 células contadas randomicamente, após coloração pelo Giemsa lento. Dos 28 compostos testados, seis galatos (galatos de heptia, de octila, de decila, de undecila, de dodecila e de tetradecila) foram ativos contra epimastigotas (CI50 de 0,47 a 33,9µM). Quatro compostos (galatos de decila, de undecila, de dodecila e de tetradecila) foram também ativos contra tripomastigotas sanguíneos e amastigotas intracelulares CI50 de 23,39 a 74,40 µM e CI50 de 1,80 a 16,30 µM, respectivamente. Efeitos de citotoxicidade celular foram observados acima de 50 µM dos compostos. O composto galato de undecila foi o mais ativo contra todas as formas do parasita e sua capacidade de esterilização do sangue infectado foi semelhante ao do cristal violeta. Estes resultados demonstram que os galatos podem ser compostos promissores para a quimioterapia ou quimioprofilaxia da doença de Chagas.
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