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Transferência vertical de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi no modelo Gallus gallusRose, Ester Cardoso Paes 01 October 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Doença de Chagas, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-03-31T15:01:18Z
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2013_EsterCardosoPaesRose.pdf: 9350602 bytes, checksum: cd045c2ef0d73b166b6b35a39b41c5ac (MD5) / A transferência de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o genoma do hospedeiro tem repercussão na biologia evolutiva e na medicina. A este respeito, a integração de minicírculos de kDNA em vários loci do genoma de aves e mamíferos implica em modificações genotípicas que estariam associadas com a patogênese da doença de Chagas. Nesse estudo, tal associação foi comprovada no modelo Gallus gallus, refratário ao T. cruzi. A inoculação de formas tripomastigotas do T. cruzi via orifício sobre a bolha de ar do ovo fértil de aves congênicas de Praga resultou na eclosão de pintos sem a infecção ativa, mas o kDNA do protozoário ficou retido no genoma. A reprodução das aves adultas kDNA-positivas gerou progênies com as mutações. O mapeamento dos sítios de integração dos minicírculos de kDNA feitos com a técnica tpTAIL-PCR revelou as mutações quimeras em múltiplos loci em vários cromossomos de células germinativas, no sêmen e nos ovócitos das aves. As integrações de kDNA ocorreram em loci preferenciais (hotspots), tais como genes constitutivos e do metabolismo celular, e em elementos transponíveis. A hipervariabilidade da sequência de nucleotídeos dos minicírculos explica a imensa diversidade das mutações de parentais e de progênies, porque gametas com integrações de kDNA diferentes geraram progênies com mutações diferentes no mesmo locus do genoma. Este tipo de herança não-Mendeliana favorece a diversidade genética e contribui para a especiação. A mobilização dos minicírculos e a recombinação das quimeras em outros sítios secundários do genoma também foi documentada. A topologia das integrações do kDNA foi analisada nas quimeras formadas nos genes da distrofina (NW_001471534.2) e da enzima málica (NW_003763650.1). Verificou-se que na maioria desses casos a região variável da sequência era diferente ou se achava recombinada. Especificamente, o estudo sugere que as integrações frequentes do kDNA do T. cruzi nos genes da distrofina e da enzima málica, modificando a fisiologia celular, podem ter um papel na patogênese da doença. / The transfer of the Trypanosoma cruzi kDNA minicircle sequences to the host’s genome is considered important to the evolutionary biology and medicine. It has been hypothesized that the integration of the minicircle sequences induces the host´s genotype modifications that may be associated with the pathogenesis of Chagas disease. In this study, the Gallus gallus chicken model system refractory to the T. cruzi infections was used. The inoculation of T. cruzi trypomastigotes through small orifice on the egg shell above the air chamber generated infection-free chicks, which retained the protozoan kDNA minicircle in the genome. The vertical transfer of the kDNA mutations was obtained by breeding kDNA-positive aves. The kDNA chimeras were documented by the tpTAIL-PCR, and the minicircle integrations were shown in several loci of germ line cells. The minicircle sequences integrated at several hotspots in coding regions and in transposable elements. The highly diverse minicircle sequences may explain the unlimited differences in the chimeras documented in parental and progeny. The gametes harboring diverse kDNA chimeras translated progeny with different patterns of mutation at single locus. This non-Mendelian heritage favors the unbridled diversity that contributes to speciation. The minicircle mobilization and chimera recombination was also documented. The topology of the kDNA mutations were examined in the dystrophin (NW_001471534.2) and in the malic enzyme (NW_003763650.1) genes. In these hotspots, the differences among the minicircle variable regions may be the result of hitchhiking and recombination at the secondary site. This study suggests that multiple kDNA integrations in the dystrophin and in the malic enzyme genes, introducing modification in the cell physiology, may be associated to the pathogenesis of Chagas disease.
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Caracterização de uma arsenato redutase de Trypanosoma cruzi e inibição de uma fosfotirosina fosfatase de Yersinia enterocolitica por chalconas sintéticasMartins, Priscila Graziela Alves 26 October 2012 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biologicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:32:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1
290250.pdf: 1651252 bytes, checksum: 16dd2b4c210960ba463863c566109f87 (MD5) / Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esta doença afeta de 15 a 16 milhões de pessoas na América Latina e, mesmo após um centenário de sua descoberta, ainda não se conseguiu desenvolver uma vacina e nem tratamentos totalmente eficazes. O presente trabalho apresenta a caracterização de uma arsenato redutase de T. cruzi. Esta enzima, apesar de ter significante homologia com fosfatases de dupla-especificidade, apresenta uma baixa capacidade de defosforilar o substrato p-nitrofenilfosfato. Quando testada em um sistema de oxi-redução, a PTP putativa de T. cruzi é capaz de reduzir o arsenato [As(V)] à arsenito [As(III)] e esta redução requer a presença da enzima glutaredoxina. Este é o primeiro trabalho que descreve uma arsenato redutase de T. cruzi. A fosfotirosina fosfatase YopH é um fator de virulência relevante na patogenicidade das bactérias Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. A YopH tem a capacidade de modular a resposta inflamatória à bactéria através de processos que envolvem a quebra de adesões focais, liberação de fator de necrose, inibição da fagocitose, além de também impedir a função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. Devido à sua importância, a YopH emerge como um potencial alvo terapêutico. Neste trabalho foram analisados 265 compostos sintéticos, dos quais 4 apresentaram valores de IC50 inferiores a 50 µM, sendo eles L46 (38,55 µM), P4 (15,08 µM), P11(9,92 µM) e R28 (20,29 µM). Estes compostos são chalconas e atuam como inibidores competitivos da YopH com Ki de 11,01 µM (L46), 3,13 µM (P4), 2,41 µM (P11) e 14,93 µM (R28). / Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. This illness affects 15 to 16 million people in Latin America and even after a century of its discovery,it has not managed to develop a vaccine and effective treatment. This work presents the characterization of an harsenate reductase from T. cruzi. This enzyme, despite having a significant homology with dual specificity phosphatases, has a low capacity to dephosphorylate the substrate p-nitrophenyl phosphate. When tested in an oxi-reduction system, the putative PTP from T. cruzi is able to reduce arsenate to arsenite and this reduction requires the presence of glutaredoxin. This is the first study that describes an arsenate reductase from T. cruzi. The phosphotyrosine phosphatase YopH is a relevant virulence factor in the pathogenicity of the bacteria Yersinia pestis; Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. YopH is able to modulate the inflammatory response to the bacteria through processes that involves the disruption of focal adhesion, release of tumor necrosis factor , inhibition of phagocytosis and also block the fuction of T and B lymphocyte preventing the adaptive immune response. Due to its importance, YopH emerges as a potencial therapeutic target. In this work, it was analysed 265 synthetic compounds, among these 4 presented IC50 values below 50 ìM which are L46 (38.55 ìM), P4 (15.08 ìM), P11(9.92 ìM) and R28 (20.29 ìM). These four compounds are chalcones and act as competitive inhibitors. They present the following Ki values: 11.01 ìM (L46), 3.13 ìM (P4), 2.41 ìM (P11) and 14.93 ìM (R28).
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Estudo da dinâmica da co-infecção por Trypanosoma cruzi e trypanosoma rangeli no hospedeiro invertebrado e no hospedeiro mamíferoNascimento, Ana Paula Machado do January 2015 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-04-19T04:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0
Previous issue date: 2015Bitstream added on 2016-05-24T17:34:34Z : No. of bitstreams: 1
337986.pdf: 2799017 bytes, checksum: 4aeae083fbd264b859e7eeb1e831db5b (MD5) / O Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli são duas espécies de protozoários de ocorrência simpátrica entre as Américas do Sul e Central e que compartilham os mesmos hospedeiros invertebrados, hospedeiros mamíferos silvestres e domésticos, incluindo seres humanos. Uma vez que infecções mistas T. rangeli/T. cruzi já foram relatadas para diversos hospedeiros, buscamos gerar ferramentas para analisar a dinâmica da co-infecção, tendo gerado cepas de ambas as espécies que expressassem marcadores fluorescentes diferentes. Após a obtenção das cepas transfectadas, as mesmas foram clonadas e ensaios de PFGE confirmaram a integração dos plasmídeos pTREXmRFP/pTREXnGFP-Neo, pTREXmRFP-Hygro e pROCKGFP-Neo no genoma dos parasitos. Com estas ferramentas foi possível realizar um estudo quantitativo da cinética da infecção mista e das variações populacionais dos parasitos em ambos os hospedeiros mamífero e invertebrado. A avaliação do crescimento em diferentes proporções das duas espécies em co-cultivo axênico em meio LIT não revelou diferenças significativas se comparado ao cultivo isolado de cada cepa. Infecções de células THP-1 com os parasitos transfectados revelou uma diferença significativa no que diz respeito às cepas selvagens e transfectadas de T. cruzi, sendo caracterizada por um número menor de formas amastigotas por célula infectada em relação à cepa parental nos tempos de 2, 4, 8 e 24 h de infecção, porém ao comparar as taxas e tempos de multiplicação de cada uma das cepas, as diferenças não foram significativas. Ensaios preliminares in vitro da interação de hemócitos extraídos de Rhodnius prolixus com uma cepa de T. rangeli transfectada com o plasmídeo pTREXnGFP-Neo permitiram evidenciar uma rápida interação do parasito com estes tipos celulares, sendo registrada a internalização em várias situações, não sendo evidenciados sinais de multiplicação do T. rangeli nestes tipos celulares. Foram também realizados ensaios preliminares in vivo de co-infecção de Rhodnius prolixus por T. cruzi e T. rangeli, revelando uma resposta diferencial frente à infecção exclusiva pelo T. cruzi e T. rangeli em relação à co- infecção neste vetor. Em camundongos Balb/C a infecção prévia pelo T. rangeli não foi capaz de gerar uma proteção significativa contra a infecção subsequente pelo T. cruzi, porém é capaz de gerar uma redução da parasitemia causada pelo T. cruzi além de aumentar a sobrevida dos animais infectados.<br. / Abstract : Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli are two species of sympatric occurrence of protozoa between South and Central America that share the same invertebrates hosts, wild and domestic mammalian hosts, including humans. Once mixed infections T. rangeli / T. cruzi have been reported for various hosts, we seek to generate tools for analyzing the dynamics of co-infection, having generated strains of both species that expressed different fluorescent markers. After obtaining the transfected strains, they were cloned and PFGE assays confirmed the integration of the plasmids pTREXmRFP / pTREXnGFP-Neo, and pROCKGFP pTREXmRFP-Hygro-Neo into the genome of parasites. With these tools it was possible to perform a quantitative kinetic study of mixed infection and population variations of the parasites in both mammal and invertebrate hosts. The evaluation of different growth ratios of the two species in axenic co-cultivation in LIT medium revealed no significant differences when compared to the isolated culture of each strain. THP-1 cells infections with transfected parasites revealed a significant difference in respect to the wild and transfected T. cruzi strains, characterized by a smaller number of amastigotes per infected cell In relation to parental strain on times 2, 4, 8 and 24 h of infection. However, when comparing propagation rates and times of each of the strains, the differences were not significant. Preliminary assays in vitro of the interaction of hemocytes extracted from Rhodnius prolixus with T. rangeli strain transfected with the pTREXnGFP-Neo plasmid showed a rapid interaction of the parasite with these cell types, internalization being recorded in various situations, not being evidenced signals of multiplication of T. rangeli in these cell types. It was also carried out preliminary tests in vivo of co-infection of Rhodnius prolixus by T. cruzi and T. rangeli, showing a differential response against exclusive infection by T. cruzi and T. rangeli regarding co-infection in this vector. In mice BALB / C, prior infection with T. rangeli was not able to generate a significant protection against subsequent infection by T. cruzi, but it is able to generate a reduction in parasitemia caused by T. cruzi, in addition to increasing the survival of infected animals.
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Avaliação in vitro da atividade leishmanicida, tripanocida de derivados de diaminasYamanaka, Celina Noriko January 2012 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências. / Made available in DSpace on 2012-10-26T12:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1
303861.pdf: 2650431 bytes, checksum: a9f9899f0d32abf02474782e9c45e6e8 (MD5) / Este estudo teve por objetivo avaliar a atividade antiparasitária intracelular e a citotoxicidade de diaminas sintéticas em macrófagos murinos infectados com L. braziliensis, L. chagasi e T. cruzi. A perda do potencial de membrana mitocondrial (.m) de formas epimastigotas de T. cruzi, a indução de TNFa e
óxido nítrico e a inibição da enzima tripanotiona redutase recombinante de L. braziliensis e T. cruzi foram utilizados para investigar possíveis mecanismos de ação dos compostos ativos. Dentre 17 diaminas estudadas, 13 inibiram a proliferação de formas promastigotas de L. braziliensis e 10 de epimastigotas de T. cruzi (CI50< 20µM). Destas, 12 foram ativas contra amastigotas intracelulares de L. braziliensis e L. chagasi (CI50 de 2,6 a 28,2 µM) e 6 foram ativas contra formas intracelulares de T. cruzi (CI50 de 1,6 a 23,6µM). A diamina DP23 foi a mais ativa contra L. braziliensis e L. chagasi (CI50 2,6 e 3,0 µM e IS de >100 e >115,4, respectivamente). A diamina DP24 foi a mais ativa contra T. cruzi (CI501,6 µM e IS>187,5). A CC50 para macrófagos variou de 149,5 a >300 µM. Diaminas cloridratadas foram mais citotóxicas que seus análogos não cloridratados. Quatro compostos (DP23Cl, DP25, RAG10 e RAG11) mostraram elevada citotoxicidade para macrófagos infectados em concentração >10 µM. A análise da estrutura e da lipofilicidade (logP) das diaminas mostrou que as estruturas com15 a 17 carbonos metilênicos foram mais ativas enquanto que, estruturas com mais de 19 carbonos não apresentaram nenhuma atividade antiparasitária. A melhor atividade leishmanicida foi observada para as diaminas com valor de logP = 5,36, sugerindo que a atividade não depende somente da distribuição de carbonos metilênicos na molécula mas também do logP ideal. Epimastigotas tratados com o composto DP24 na concentração de 6
e 12 µM mostraram despolarização da membrana mitocondrial e morte celular apartir de 6 horas de incubação de forma dose-dependente. O tratamento de células infectadas com os compostos ativos não induziu níveis significantes de produção de TNFa e NO. Com relação a inibição das enzimas tripanotiona redutase recombinante de L. braziliensis e T. cruzi, quatro compostos (DP23Cl, DP25, DP25Cl e RAG10) inibiram a atividade enzimática de LbTR entre 74,2 a 89,4% na concentração do 100 µM, enquanto que para a TcTR apenas o composto DP25Cl ocasionou inibição de 74,5% na concentração de 100 µM, sugerindo diferenças entre a tripanotiona destas duas espécies de tripanosomatídeos. As diaminas avaliadas no presente estudo apresentaram potente efeito in vitro contra formas intracelulares de Leishmania spp e T. cruzi e podem ser consideradas moléculas líder para o desenvolvimento de novos compostos contra Leishmania e T. cruzi. / This study aimed to evaluate the antiparasitic activity and cytotoxicity of synthetic diamines in murine macrophages infected with Leishmania braziliensis, L. chagasi and Trypanosoma cruzi. The loss of mitochondrial membrane potential (øm) of T. cruzi epimastigotes, the induction of TNFá nd nitric oxide and inhibition of the recombinant trypanothione reductase of L. braziliensis and T cruzi were used to investigate possible mechanisms of active compounds. Among 17 evaluated diamines, 13 inhibited the proliferation of L. braziliensis promastigotes and 10 inhibited T. cruzi epimastigotes (IC50<20 ìM). Of these, 12 were active against intracellular amastigotes of L. braziliensis and L. chagasi (IC50 of 2.6 to 28.2 ìM) and 6 were active against T. cruzi (IC50 = 1.6 to 23.6 ìM). The compound DP23 was the most active compound against both L. braziliensis and L. chagasi (IC50 = 2.6 and 3.0 ìM and SI>100 and >115.4) respectively. The compound DP24 was the most active against T. cruzi (IC50 = 1.6 ìM and SI > 187.5). The citotoxicity CC50 for macrophages ranged from 149.5 to > 300 ìM. Chlorinated diamines were more cytotoxic than their non-chlorinated analogs. Four compounds (DP23Cl, DP25, RAG10 and RAG11) showed high cytotoxicity for infected macrophages at a concentration > 10 ìM. The analysis of the structure and lipophilicity (logP) of the diamines showed that structures with 15 to 17 methylenic carbons were more active while structures with more than 19 carbons did not present any antiparasitic activity. The higher leishmanicidal activity was observed for the diamine DP23 with a value of logP = 5.36 and 13-NH-4 distribution of methylenic carbon suggesting that the activity does not depend solely on the distribution of methylenic carbon atoms in the molecule but also depends on ideal logP value. Epimastigotes treated with the compound DP24 at a concentration of 6 and 12 ìM demonstrated dose-dependent membrane depolarization and cell death starting at 6 hours of incubation. Treatment of cells infected with the active compounds did not induce significant levels of TNFá and NO production. Concerning the inhibition of the recombinant trypanothione reductase enzymes of L braziliensis and T. cruzi, four compounds (DP23Cl, DP25, DP25Cl and RAG10) inhibited the enzymatic activity of LbTR between 74.2 to 89.4% at a concentration of 100 ìM, whereas for TcTR, only the compound DP25Cl caused inhibition of 74.5% at the same concentration, suggesting differences between the trypanothione of these two species of trypanosomatids. The diamines evaluated in the study presented potent in vitro effect against intracellular forms of Leishmania spp and T. cruzi and therefore may be considered as leader molecules for developing new compounds against Leishmania and T. cruzi.
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Estudo da interação celular parasito-hospedeiro a partir da expressão heteróloga de trans-sialidase de Trypanosoma cruzi por Trypanosoma rangeli em ensaios in vitro e in vivoGranucci, Ninna January 2013 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2013 / As trans-sialidades de Trypanosoma cruzi (TcTS) são capazes de clivar resíduos de ácidos siálicos da célula hospedeira e transferí-los à superfície do parasito, e portanto, fundamentais nessa interação. Já o Trypanosoma rangeli, considerado não patogênico para mamíferos e com ciclo desconhecido nestes hospedeiros, possui no seu genoma genes similares aos membros da família das Trans-sialidase (TS), embora sem nenhuma atividade catalítica. Uma vez que essa atividade está relacionada a pontos cruciais do ciclo do parasito patogênico e que, a ausência de atividade TS em T. rangeli é apontada como um dos motivos de sua incapacidade de infectar e sobreviver em células de mamíferos, o objetivo do presente trabalho foi estudar o envolvimento da TS a partir daexpressão heteróloga de uma TcTS ativa pelo T. rangeli. Após a transfecção e a confirmação da atividade de TS em T. rangeli transfectado (T. rangeli TcTS), ninfas de 4° e 5° estágio de Rhodnius prolixus (R. prolixus) foram infectadas por inoculação intracelômica com formas epimastigotas de T. rangeli selvagem e T. rangeli TcTS. Observamos uma diferença estatística no número de glândulas infectadas para T. rangeli selvagem (92%), e T. rangeli TcTS (16%), seis semanas p.i.. A infecção em camundongos BALB/c e C57BL/6 não revelou diferenças na de parasitemia entre parasitos selvagens e transfectados. Já nos ensaios de infecção in vitro utilizando-se células Vero, observou-se que o T.rangeli TcTS apresentou maior capacidade de infecção quando comparados ao T. rangeli selvagem, não sendo observado nenhum indício de divisão celular para esses parasitos após 120 horas de interação. Os resultados apontam que a expressão heteróloga da TcTS por T. rangeli embora não altere o tempo e o padrão da parasitemia experimental in vivo em camundongos, promoveu mudanças no comportamento da interação parasito-vetor e parasito-célula, reduzindo sua capacidade de penetração nas glândulas salivares de R. prolixus e facilitando a entrada do parasito em células in vitro. <br> / Abstract: The Trypanosoma cruzi trans-sialidases (TcTS) are able to cut and transfer sialic acid from the host cell to the parasite surface and are important molecules on this interaction. Trypanosoma rangeli is a non-pathogenic parasite to mammal, that posses an unknown life cicle in this host, and it has similar genes to TS family members in the genome, however, with no catalytic activity. Once TS are crucial molecules involved in parasite-host cell interaction in the pathogenic parasite, and the absence of TS activity is pointed as one of the reasons of its inability capacity of infecting and surviving in mammals cells, the aim of this work was to study the roll of TS in the host-parasite interaction using T. rangeli expressing an active TcTS (T. rangeli TcTS). After transfection and assessment of protein activity, 4° and 5° instar nymphs of Rhodnius prolixus were infected by intracelomic inoculation of T. rangeli wild type and T. rangeli TcTS epimastigote forms. A statistically significant difference was observed in the number of salivary gland infected for T. rangeli wild type (92%) and for T. rangeli TcTS (16%) at six weeks p.i.. Parasitemia of BALB/c mice and C57BL/6 infected by T. rangeli TcTS showed no difference from mice infected with non-transfected parasites. For in vitro infection assays with Vero cells, T. rangeli TcTS presented higher infection rates when compared with T. rangeli wild type, but no indication of intracellular division was detected for these parasites up to 120 hours. Despite not altering the parasitemia in mice, our results indicate that TcTS expressed by T. rangeli may be responsible for changes on the interaction between vector-parasite and cell-parasite by reducing the ability to penetrate on R. prolixus salivary glands and facilitating cell entry in vitro.
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Fabiana Pacheco Girardi ; orientador, Edmundo Carlos Grisard, co-orientador, Mário SteindelGirardi, Fabiana Pacheco January 2004 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T00:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1
200115.pdf: 451474 bytes, checksum: 7c058f0d3adc5d1afb032739528296a9 (MD5) / O Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 agente etiológico da doença de Chagas e o T. rangeli Tejera, 1920 são parasitas hemoflagelados pertencentes à Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae, que infectam animais domésticos, silvestres e seres humanos nas Américas Central e do Sul. A presença simultânea desses parasitas em uma mesma região geográfica possibilita a ocorrência de infecções únicas ou mistas, tanto em hospedeiros invertebrados como em vertebrados. Embora o T. rangeli não seja considerado patogênico para seres humanos, a infecção por este parasita induz uma resposta imune humoral com elevados títulos de anticorpos, determinando reações sorológicas cruzadas com o T. cruzi e dificultando, desta maneira, o diagnóstico da doença de Chagas, especialmente em sua fase crônica. Nesse sentido, o presente trabalho avaliou comparativamente esta imunoreatividade cruzada, através da análise por Imunofluorescência Indireta, utilizando amostras de soros de pacientes chagásicos crônicos apresentando as formas cardíaca e indeterminada da doença frente a formas epimastigotas e tripomastigotas de cultura de ambos os parasitas. Os resultados de reatividade sorológica cruzada obtidos com a utilização de formas epimastigotas de T. cruzi e T. rangeli corroboram os dados da literatura. Entretanto, com a utilização das formas tripomastigotas ocorreu uma redução significativa da reatividade cruzada. Estas diferenças na reatividade podem ser decorrentes da constituição antigênica distinta nestas formas evolutivas do parasita.
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Constituintes químicos da espécie vegetal Polygala sabulosa A. W. Bennett (Polygalaceae)Cunha Junior, Anildo January 2002 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T04:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1
223423.pdf: 1296115 bytes, checksum: 1f41fe12fbd84f7e72f15de9661d5c3e (MD5) / Este trabalho apresenta o estudo fitoquímico sistemático da espécie vegetal Polygala sabulosa A. W. Bennett (Polygalaceae), uma pequena erva comumente chamada de "timuto-pinheirinho" que se desenvolve no Planalto Meridional Sul e que têm sido utilizada na medicina popular como anestésico local e expectorante.
A aplicação de métodos convencionais de separação às frações do extrato bruto de P. sabulosa solúveis em diclorometano, acetato de etila e etanol conduziu ao isolamento de treze compostos, identificados como 24-etil-5a-colesta-7,22-dien-3b-ol (1), 7-(3',3'-dimetilaliloxi)-6-metoxicumarina (2), 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-dihidroestiril)-2H-piran-2-ona (3), 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-14-metoxi-dihidroestiril)-2H-piran-2-ona (4), 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-10,14-dimetoxi-dihidroestiril)-2H-piran-2-ona (5), 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-estiril)-2H-piran-2-ona (6), 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-14-metoxi-estiril)-2H-piran-2-ona (7), 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-10,14-dimetoxi-estiril)-2H-piran-2-ona (8), 4-metoxi-6-(11,12-dimetoxi-estiril)-2H-piran-2-ona (9), protohipericina (10), 5,7,4'-trihidroxiflavona (11), 3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavona (12) e 3-O-(b-D-glicopiranosil)-5,7,3',4'-tetrahidroxiflavona (13). A determinação estrutural destas substâncias, realizada a partir dos seus dados espectrais de infravermelho, massas e ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono-13, é discutida. A estiril-lactona 8, previamente caracterizada por CGAR-EM, foi identificada em mistura com o composto 7 e está sendo descrita como um novo produto natural. O esterol 1 e os flavonóides 11, 12 e 13 são descritos pela primeira vez como constituintes químicos de Polygala sabulosa.
A avaliação das atividades tripanomicida e antinociceptiva do extrato bruto, frações solúveis e compostos puros de Polygala sabulosa, conduzidas respectivamente por bioensaio em meio de cultura contra as formas epimastigota e tripomastigota de Trypanosoma cruzi e pelo modelo de dor induzida com ácido acético, também é informada
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Investigação de componentes específicos e essenciais para exportação de mRNA de tripanossomatídeosDomingues, Patricia Ferreira January 2017 (has links)
Orientadora : Dra. Andréa Rodrigues Ávila / Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Haruo Inoue / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2017 / Inclui referências : f. 151-158 / Resumo: Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma endemia da América Latina que afeta milhões de pessoas. Este parasita tem um ciclo de vida alternado entre hospedeiros vertebrados e invertebrados, e necessita se adaptar a mudanças em diferentes ambientes que encontra ao longo do ciclo de transmissão. O T. cruzi controla a expressão de genes a partir de eventos majoritariamente pós-transcricionais. Vias que controlam a estabilidade do mRNA ou a tradução de proteínas são bem conhecidas, enquanto que mecanismos moleculares de exportação de mRNA do núcleo para o citoplasma ainda não são bem compreendidos nem em tripanossomatídeos, nem em outros patógenos. Sabe-se, até o momento, que a maioria das proteínas envolvidas com o transporte de mRNA em outros eucariotos não está conservada em diversas espécies de parasitas. Exceto pela proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2), homóloga das proteínas de mamífero e levedura (UAP56/Sub2) e essencial para exportação de mRNA em tripanossomatídeos. Logo, para investigar os componentes desta via, nosso grupo tem investido em identificar proteínas exclusivas e essenciais para a exportação de mRNA em T. cruzi. Abordagens de proteômica, usando como alvo TcSub2, vem permitindo a identificação de fatores com função ainda desconhecida e/ou que são conservados apenas entre espécies de tripanossomatídeos, tornando-os alvos de interesse. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação de proteínas alvo com TcSub2 e seu papel na exportação de mRNA em T.cruzi. Duas proteínas não caracterizadas apresentaram motivos conservados e foram denominadas como TcFOP-like e TcAPI5-like. Interessantemente, estes motivos estão presentes em proteínas de outros organismos que estão envolvidas com a via de exportação de mRNA. Aqui, nós confirmamos que TcFOP-like e TcAPI5-like são proteínas nucleares e parecem interagir com TcSub2. Além disso, silenciamento e supereexpressão de TcFOP-like afeta o crescimento do parasita, e nós confirmamos sua interação com outros componentes da via de exportação de mRNA, tais como TcMex67 e TcHel45. Estas evidências suportam presença de components diveregentes na via de exportação de mRNA em Tripanossomatídeos. Palavras chaves: Trypanosoma cruzi. Exportação de mRNA. TcSub2.TcHel45 / Abstract: Trypanosoma cruzi is the protozoan causative of Chagas disease, an endemic disease in Latin America that affects millions of people. This parasite alternates between vertebrate and invertebrate hosts during his life cycle, and needs to adapt to the changes in different environments along the transmission cycle. T. cruzi controls the gene expression mostly by post-transcriptional events. Pathways that control mRNA stability or protein translation are well known, while the molecular mechanisms for mRNA export from nucleus to cytoplasm are still not well understood nether in trypanosomatids or other pathogens. So far, it's known that the most of the proteins that are involved in mRNA transport of other eukaryotes are not conserved in many species of parasites. One exception is T. cruzi Sub2 (TcSub2), a homologue of the proteins in mammalian and yeast (UAP56 / Sub2) and essential for mRNA export in tripanossomatids. Therefore, to investigate the components of this pathway, our group has invested in identifying unique and essential proteins for the export of mRNA in T. cruzi. Proteomic approaches, using TcSub2 as target, have allowed identification of factors with the unknown function and/or that are conserved only in species of trypanosomatids, turning into interesting targets. Then, the aim of this work was to evaluate the interaction of target proteins with TcSub2 and their role in the mRNA export pathway in T. cruzi. Two uncharacterized proteins presented conserved motifs and were named here as TcFOP-Like and TcAPI5-like. Interestingly, those motifs are present in proteins of other organisms which are involved in mRNA export pathway. Here, we confirmed that TcFOP-like and TcAPI5-like are nuclear proteins and seems to interact with TcSub2. Furthemore, knockdown and overexpression of TcFOP-like affect the growth of parasites and we confirmed its interaction with other components of the mRNA export pathway, such as TcMex67 and TcHel45. Those evidences supporte the presence of divergent components in the mRNA export pathway of Tripanossomatids. Keywords: Trypanosoma cruzi. Export of mRNA. TcSub2. TcHel45.
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Padronização e avaliação da técnica Real Time PCR como ferramenta de deteccção de Trypanosoma cruzi em amostras de sangue e alimentosGodoi, Poliana Alves de Souza January 2015 (has links)
Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz Soccol / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 30/01/2015 / Inclui referências : f.101-137 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: A Doença de Chagas é uma enfermidade causada por Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909) que afeta milhões de pessoas na América Latina. No diagnóstico da doença, testes sorológicos, detecção direta do parasito ou PCR convencional são usados como testes confirmatórios. Porém, estes métodos apresentam restrições quanto à sensibilidade e especificidade. Além disso, microepidemias associadas a alimentos vem demonstrando a importância crescente na via de transmissão oral, a partir do ciclo silvestre. Assim, padronizar metodologias com melhor sensibilidade e especificidade, para detectar o parasito em humanos e em alimentos é necessária. O objetivo desse trabalho foi padronizar a técnica de Real Time PCR para avaliar pacientes chagásicos crônicos e contatos, assim como detectar T. cruzi em alimentos, favorecendo a implantação dessa metodologia em laboratórios, bancos de sangue e como ferramenta no monitoramento do parasito em sangue e alimentos. Para tal, foram desenhados seis iniciadores (Ep1F/Ep1R, Ep2F/Ep2R, Bp1F/Bp1R, Bp2F/Bp2R, Bp3F/Bp3R e Bp4F/Bp4R) usando as sequências das cepas referência de T. cruzi y152 e Esmeraldo obtidas no genebank. Além destes, primers conhecidos e validados pela literatura foram também incluídos a título de comparação (TCZ1/TCZ2 e S35/S36). Para a otimização da técnica (concentração de primers e de DNA e CT de amplificação), foram usadas cepas de T. cruzi, T. rangeli e de Leishmania sp. Após a padronização a melhor especificidade analítica foi observada para o primer Bp1F/Bp1R (detectou apenas T. cruzi). O primer Ep1F/Ep1R permitiu detectar 0,0001 ng/?L do parasito e para TCZ1/TCZ2 a detecção mínima foi de 0,00001 ng/?L de DNA do parasito pela análise da curva padrão. Para validar a metodologia padronizada foram avaliadas 66 amostras de pacientes com doença de Chagas de regiões endêmicas (Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul), 11 amostras de indivíduos com relação de parentesco com os pacientes (contatos), e 30 indivíduos que não possuíam nenhum histórico ou diagnóstico para presença do parasito. Essas amostras foram submetidas à técnica de Real Time PCR aqui padronizada com os primers TCZ1/TCZ2 e Ep1F/Ep1R. A análise da curva ROC usando os primers TCZ1/TCZ2 mostrou uma sensibilidade de 79,2% e especificidade 69,8% (AUC = 69,2%). Para os primers Ep1F/Ep1R a sensibilidade foi 71,7% e especificidade 76,7% (AUC = 77,4%). O teste de McNemar demonstrou que ambos os iniciadores apresentaram maior discordância de resultados com a reação de imunofluorescência (RIFI) em pacientes chagásicos. Em indivíduos contatos o primer Ep1F/Ep1R apresentou maior discordância com a RIFI e ensaio imunoenzimático (ELISA). TCZ1/TCZ2 não apresentou discordância relevante. Ep1F/Ep1R demonstrou maior positividade (72,72%) para esse grupo. Portanto, o primer Ep1F/Ep1R assumiu melhor desempenho quanto à especificidade na determinação de T. cruzi em amostras de sangue que TCZ1/TCZ2. Em amostras de açaí, quando avaliado o açaí in natura (sem tratamento prévio) foi obtido 33% de sensibilidade para cepa de T. cruzi isolada de humanos (HC27) e 76% para a cepa isolada de Panstrongylus megistus (CUR98). Para amostras de açaí autoclavada verificou-se 71% de resultados positivos para ambas as cepas referidas acima. Além disso, em amostras contaminadas artificialmente com T. cruzi (cepa HC27) o limite de detecção foi de 0,75 parasito (p)/mL e com a cepa CUR98 a detecção mínima foi de 0,000019 p/mL. Dentre os primers desenhados Ep1F/Ep1R apresentou bons resultados na determinação de T. cruzi em sangue e açaí, o que encoraja a utilização da técnica de Real Time PCR para o monitoramento de amostras de açaí. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi. Real Time PCR. Sangue. Açaí. Primers. Sensibilidade. Especificidade. / Abstract: Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909, and affects millions of people in Latin America. Diagnostic tests to confirm the disease include indirect tests (antibody in serum), direct detection of the parasite in blood and conventional PCR (DNA detection). However, these methods have limitations because the serological tests detect antibodies and not the parasite, or have low sensitivity (e.g., the parasite is in the internal organs or the chronic phase). In addition, microepidemics associated with foods have shifted the emphasis to the oral route of transmission during the silvatic cycle. Therefore, standardized methodologies with improved sensitivity and specificity are needed to detect the parasite in blood and foods. The aim of this study was to standardize the real-time PCR technique for assessing chronic Chagas patients and contacted individuals, as well as for detecting T. cruzi in foods. To accomplish these objectives, six primers were improved (Ep1F/Ep1R, Ep2F/Ep2R, Bp1F/Bp1R, Bp2F/Bp2R, Bp3F/Bp3R and Bp4F/Bp4R) using the sequences of references strains (T. cruzi y152 and Emerald) obtained from GenBank. Known primers validated in the literature were also included (TCZ1/TCZ2 and S35/S36). Trypanosoma cruzi, T. rangeli and Leishmania sp. strains were employed for optimization (concentration of primers, DNA and CT amplification). The best analytical specificity was observed for the Bp1F/Bp1R primer. The Ep1F/Ep1R primer had minimum detection of 0.0001 ng/?L, while TCZ1/TCZ2 had minimum detection of 0.00001 ng/?L of DNA from the parasite, based on an analysis of the standard curve. To validate the standardized methodology, 66 samples from chronic patients in endemic regions (Paraná, São Paulo and Rio Grande do Sul) were assessed, along with 11 samples from patients' relatives (contacts) and 30 individuals with no history or diagnosis for the presence of the parasite. The samples were submitted to the standardized real-time PCR technique with the TCZ1/TCZ2 and Ep1F/Ep1R primers. On analysis of the ROC curve, Ep1F/Ep1R had 71.7% sensitivity and 76.7% specificity (AUC = 77.4%), while TCZ1/TCZ2 exhibited 79.2% sensitivity and 69.8% specificity (AUC = 69.2%). McNemar's test showed that both primers had greater discordance in their results with the immunofluorescence reaction (IFR) in Chagas patients. Ep1F/Ep1R performed better than the TCZ1/TCZ2 primer, in terms of specificity for the determination of T. cruzi in blood samples. In açaí samples, an assessment of açai in natura (without previous treatment) revealed 33% sensitivity for the T. cruzi when HC27 strain isolated from humans was used and 76% for the CUR98 strain isolated from Panstrongylus megistus. In autoclaved açai samples, 71% positivity was detected for both strains. In addition, for artificially samples infected with HC27 strain, the limit of detection was 0.75 parasites (p)/mL, whereas the minimum detection for the CUR98 strain was 0.000019 p/mL. Ep1F/Ep1R showed good results in determining T. cruzi in blood and açai, favoring the use of the real-time PCR technique for screening blood and açai samples. Key-words: Trypanosoma cruzi. Real Time PCR. Blood. Açaí. Primers. Sensitivity. Specificity.
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Tratamento da cardiopatia autoimune de aves mutadas com o kDNA de Trypanosoma cruzi pela transferência de medula ósseaAlves, Rozeneide Magalhães 18 December 2012 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas, 2012. / Submitted by Liliane Simões (miix007@gmail.com) on 2013-04-08T12:03:48Z
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2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Este estudo foi conduzido em linhagens B12/B12 e B4/B4 de aves congênicas de Praga geneticamente idênticas em todos os loci exceto no MHC relacionado às respostas imunes que conferem resistência ou susceptibilidade à oncogênese induzida pelo vírus (RSV). As linhagens de aves de Praga foram doadas ao LMPDC/UnB pelo Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências de Praga. Ovos férteis de galinha foram inoculados com 100 tripomastigotas de Trypanosoma cruzi e os pintos nasceram sem a infecção, mas eles retiveram sequências de minicírculos de kDNA mitocondrial do parasito em vários cromossomos. As aves com as mutações (kDNA+) desenvolveram cardiomiopatia com os aspectos similares aqueles vistos na doença de Chagas humana. Tendo estabelecido o modelo transfilo refratário ao T. cruzi foi possível investigar a autoimunidade e determinar a patogêneses da rejeição do coração. A transferência passiva das lesões mediante injeções de células mononucleares do sangue de aves mutadas (kDNA+) para aves receptoras controles sadias mostrou pequenos focos inflamatórios no miocárdio. A ausência de tais achados em aves controles (kDNA-) mostrou que apenas linfócitos de aves mutadas (kDNA+) aderiam ao miocárdio. Mas não foi obtida cardiomiopatia mediante transferência de células mononucleares do sangue de aves mutadas para aves sadias. Entretanto, a destruição de células da medula óssea de aves mutadas (kDNA+) com drogas, e sua substituição pelo enxerto de medula óssea sadia de aves controle (kDNA-) inibiu a cardiomiopatia na ave kDNA+. Este experimento foi monitorado pelo enxerto de coração repórter no subcutâneo da ave receptora, cujo estudo histopatológico aos onze dias pós-enxerto revelou ausência de lesão inflamatória. Em experimento reverso, foi feita transferência da patologia de aves mutadas (kDNA+) para aves controle (kDNA-), sadia que tiveram a medula óssea destruída com drogas. Nesse experimento, o enxerto de medula óssea de aves kDNA+ em aves receptoras kDNA- revelou infiltrado inflamatório e lesão no coração repórter enxertado no subcutâneo. O estudo imunocitoquimico revelou no coração repórter patologia similar a lesão no coração da ave adulta, onde a destruição do miocárdio era feita pelos infiltrados de linfócitos T citotóxicos CD8-α, CD8-β, CD8-γδ, CD8-vβ1, e CD8-vβ2 que lisa as células alvo. As aves kDNA+ que sucumbiram a cardiomiopatia e aquelas que foram sacrificadas aos 12 meses de idade revelaram lesões inflamatórias autoimunes no coração adulto e no coração repórter. Os resultados que mostraram inibição da patologia autoimmune no coração das aves kDNA+ pela substituição da medula óssea doente pela medula óssea de ave sadia sugerem a possibilidade de tratamento da cardiomiopatia chagásica pela transferência de medula óssea. / The study was conducted in lineages B12/B12 and B4/B4 of congenic birds of Prague, showing complete genetic identity in all loci but different MHC carrying on the immune responses that afford resistance and/or susceptibility to RSV induced oncogenesis. The congenic birds were donated by the Czech Republic Academy of Sciences Institute of Molecular Genetics our Laboratory at the University of Brasilia. Fertile chicken eggs were inoculated with 100 tripomastigotes of Trypanosoma cruzi and the chicks hatched were parasite-free, but they retained the parasite mitochondrial kDNA minicircle sequences in various chromosomes. The chicken with mutations (kDNA+) developed Chagas-like heart disease with features similar to those seen in the human disease. Having established the transkingdom model system to study the pathogenesis, it was possible to investigate the autoimmune rejection of the kDNA+ chicken heart. The passive transfer of blood mononuclear cells from mutated (kDNA+) birds to naive recipients revealed small inflammatory infiltrates in the myocardium, but the cardiomyopathy was not observed. The absence of lymphocyte infiltrates in the control chicken (kDNA-) heart showed that only kDNA+ lymphocytes adhere to the myocardium. Moreover, the Chagas-like cardiomyopathy was not obtained by injections of blood mononuclear cells from kDNA+ chickens, and, therefore, other experiments of transfer of bone marrow cells were conducted, aiming at production of the heart disease in the recipient chicken. In this regard, kDNA- mutated chicken bone marrow cells, which were destroyed with drugs, were replaced by healthy bone marrow cells from sick (kDNA+) chicken. This experiment was monitored by a reporter heart grafted in the subcutaneous pouch of a recipientbird. Eleven days after grafting, the histopathology study revealed inflammatory cell infiltrates and destruction of the myocardium by cytotoxic T- lymphocytes T CD8-α, CD8-β, CD8-γδ, CD8-vβ1, e CD8-vβ2 that lyse the target cells . The kDNA+ birds that succumbed to natural death and those that did not succumb to heart disease were sacrificed at 12 months of age. The kDNA+ (mutated) birds‟ revealed autoimmune inflammatory lesion similar to that in the reporter heart. The results of these experiments suggested a reverse experiment, aiming at the inhibition of the pathology. The replacement of the sick (kDNA+) bone marrow by healthy bone marrow from a naive (kDNA-) donor inhibited the inflammatory autoimmune lesions in the heart of the kDNA- mutated, sick chicken.The inhibition of the heart pathology in the kDNA+ chicken experiments deciphered a treatment possible for the human Chagas heart disease.
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