Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346415.pdf: 1490832 bytes, checksum: 7cfa2ebb03527d549295fed4e02c78de (MD5) Previous issue date: 2017 / Exossoma de RNA é um complexo multiproteico composto por 12 subunidades, que possui atividade catalítica no sentido 3 ? 5 e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs. As subunidades RRP6 (Ribossomal RNA Processing 6) e RRP44 (Ribossomal RNA Processing 44) são responsáveis pela atividade catalítica e as demais subunidades envolvidas no direcionamento e seleção de transcritos para processamento ou degradação. O Trypanosoma rangeli, juntamente com outros tripanosomatídeos, apresentam deficiência no sistema de regulação de fatores de transcrição, portanto o mecanismo de regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre predominantemente a níveis pós-transcricionais através da regulação dos níveis de RNA, sendo esses níveis regulados a partir da degradação dos transcritos. No presente estudo realizamos a caracterização de três subunidades do complexo exossoma de T. rangeli. A subunidade RRP6 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 2.133 pares de base que codifica para um polipeptídio de 710 aminoácidos (± 78,7 kDa). Foram identificados os domínios conservados PMC2NT, DEDD-Y e HRDC, que também se encontram presentes em outros organismos em que o complexo exossoma de RNA está caracterizado. Foi realizado teste de expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém sem sucesso de isolamento. A subunidade RRP44 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 3012 pares de base que codifica para um polipeptídio de 1003 aminoácidos (± 113,2 kDa). Os domínios conservados presentes nesta proteína são PIN, Exoribonuclease R e RNB. Foi realizada a expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém não tivemos sucesso do rendimento da proteína para o posterior etapa de purificação. A subunidade EAP3 (Exosome Associated Protein 3) possui uma janela aberta de leitura de 547 pares de base que codifica para um polipeptídio de 181 aminoácidos (± 20 kDa) e está descrita como uma proteína associada ao exossoma de RNA formando um heterodímero com a subunidade RRP6. Em ensaios de Western blot utilizando o antissoro produzido essa interação in vivo foi comprovada, uma vez que a ligação do anticorpo ocorreu na banda de ±150 kDa. As sequências do complexo exossoma de RNA apresentam porcentagens de identidade altas, demonstrando ser uma maquinaria conservada entre os tripanosomatídeos, porém com sua funcionalidade ainda desconhecida.<br> / Abstract : RNA exosome complex is a multiprotein complex composed of 12 subunits, which has 3 '? 5' catalytic activity and is involved in the processing and degradation of several types of RNAs. The subunits RRP6 (Ribosomal RNA Processing 6) and RRP44 (Ribosomal RNA Processing 44) are responsible for the catalytic activity, and the other subunits are involved in the targeting and selection of transcripts for processing or degradation. Trypanosoma rangeli, together with other trypanosomatids, are deficient in the regulation system of transcription factors, so the regulation mechanism of gene expression in these organisms occurs exclusively at post-transcriptional levels through of RNA levels regulation, these levels being regulated from the degradation of the transcripts. In the present study we performed the characterization of subunits of the T. rangeli exosome complex. The RRP6 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 2,133 base pairs coding for a polypeptide of 710 amino acids (± 78.7 kDa). The conserved domains identified was PMC2NT, DEDD-Y and HRDC, which are also present in other organisms in which the RNA exosome complex is characterized, have been identified. A heterologous expression test of this protein was performed in E. coli BL21 CodonPlus, but with no success of isolation. The RRP44 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 3012 base pairs encoding a polypeptide of 1003 amino acids (± 113.2 kDa). The conserved domains present in this protein are PIN, Exoribonuclease R and RNB. The heterologous expression of this protein was performed in E. coli BL21 Codon Plus, but we did not have a success of protein yield for the subsequent protein purification process. The EAP3 (Exosome Associated Protein 3) subunit has an open reading frame of 547 base pairs encoding a polypeptide of 181 amino acid (± 20 kDa) and is described as a protein associated with the RNA exosome forming a heterodimer with the subunit RRP6. In Western Blotting assays using the antiserum produced from purified protein this in vivo interaction was proven, since antibody binding occurred in the ~ 150 kDa band, which corresponds to the sum of the proteins. The sequences of the RNA exosome complex have high identity percentages, demonstrating that it is a conserved machinery among the trypanosomatids, but with its still unknown functionality.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:58:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313851.pdf: 12194664 bytes, checksum: a49f2818198bdc12a810d2d30de9730b (MD5) / A distribuição simpátrica e o compartilhamento de hospedeiros e antígenos entre o Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas podem levar a erros nos diagnósticos e inferências epidemiológicas destes parasitos. Neste sentido, apresentamos o primeiro estudo proteômico comparativo em grande escala das proteínas solúveis e de superfície da forma tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi, objetivando a identificação de proteínas com potencial aplicação no diagnóstico diferencial destes parasitos. Neste estudo foram identificadas 137 distintas proteínas solúveis da forma tripomastigota de T. rangeli resolvidas no perfil 2-D por espectrometria de massas (LC-ESI-MS/MS). Destas, 76% localizadas no citosol ou mitocôndrias e 26% envolvidas no metabolismo energético ou na resposta ao estresse. Além disto, através de ensaios de immunoblotting 1-D com estas proteínas solúveis e antissoros de animais experimentalmente infectados com estes parasitos, foi verificado que a reatividade sorológica cruzada existente entre estes dois parasitos não é recíproca, pois o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli é menos intensa do que o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. cruzi pelos antissoros heterólogos. Também observamos que proteínas das formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi na faixa de 70-80kDa são reconhecidas exclusivamente pelos antissoros homólogos. Nos ensaios de immunoblotting 2-D foi observado um forte reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli pelo antissoro homólogo na faixa entre 60-100kDa. Apesar disto, não foi possível identificar marcadores específicos destes parasitos com estes ensaios. Porém, a análise proteômica comparativa das proteínas de superfície das formas epimastigota e tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi permitiu a identificação de potenciais marcadores específicos de T. rangeli. Esta análise foi realizada utilizando duas abordagens, sem (LC-MS-MS/MS) e com o uso de gel (GeLC-ESI-MS/MS), além de ensaios de immunoblotting 1-D, que revelaram um padrão de reconhecimento das proteínas de superfície distinto para cada espécie. Com isto foi possível identificar 138 proteínas de T. rangeli e 343 proteínas de T. cruzi, das quais 42 e 157 proteínas exclusivamente nas formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi, respectivamente. Em particular, as análises de MS/MS revelaram pelo menos duas proteínas de T. rangeli, GP63-relacionada (~70kDa) e FCaBP (~25kDa), como potenciais alvos para o diagnóstico diferencial com T. cruzi. Desta forma, esta análise proteômica em larga escala das proteínas de superfície de T. rangeli, revelou diferenças e semelhanças entre as proteínas de superfície destes parasitos, além de permitir a identificação de novas proteínas de T. rangeli com potencial aplicação no diagnóstico diferencial com T. cruzi.<br> / Abstract : Sympatric distribution and sharing of hosts and antigens by Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi the etiological agent of Chagas' disease, often incur in misdiagnosis and improper epidemiological inferences. In order to identify differential antigens with potential application in serological diagnosis we performed the first high-throughput proteomic analysis of soluble and surface proteins (SP) of T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes. In this work, 137 non-redundant T. rangeli trypomastigote soluble proteins resolved in 2-D profile were identified by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Within these 137 non-redundant proteins, 76% are cytosolic or mitochondrial and 26% are involved in energy metabolism or response to stress. Furthermore, 1-D immunoblotting assays with soluble proteins and antisera from animals experimentally infected showed a less intense recognition of T. rangeli trypomastigotes soluble proteins than T. cruzi trypomastigotes proteins by heterologous antisera indicating that serological cross-reactivity between these parasites is not reciprocal. In addition, T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes soluble proteins between ~70-80 kDa were exclusively recognized by homologous antisera suggesting specie-specific antigens among the trypomastigote proteins. We also observed a strong recognition of T. rangeli trypomastigotes proteins by homologous antiserum between ~60- 100kDa in 2-D immunoblotting tests. Unfortunately, we were not able to identify specific markers of these parasites through these trials. On the other hand, the comparative proteomic analysis of T. rangeli and T. cruzi epimastigote and trypomastigote SP pointed out potential T. rangeli specific-markers, using gel-free (LC-ESI-MS/MS) and gel-based (GeLC-ESI-MS/MS) proteomic approaches. Besides, immunoblotting revealed distinct recognition profiles of SP for each species. A total of 138 T. rangeli proteins and 343 T. cruzi proteins were identified, of which, 42 and 157 proteins were exclusively identified in T. rangeli or T. cruzi trypomastigotes, respectively. MS/MS analysis of T. rangeli exclusive bands revealed two unique proteins, GP63-related (~70kDa) and flagellar calcium-binding protein (FCaBP) (~25kDa), as potential markers. This highly sensitive proteomic assessment of surface proteins characterized the T. rangeli surfaceome, revealing several differences and similarities between these two parasites and new T. rangeli-specific proteins with promising use in differential diagnosis from T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:00:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339552.pdf: 1776510 bytes, checksum: da1705c78b546bdd9cc227ab480ba339 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) é um parasito hemoflagelado que compartilha reservatórios e vetores com o Trypanosoma cruzi, sendo capaz de infectar mamíferos silvestres e domésticos, assim como o ser humano. Dentre as proteínas envolvidas na regulação do metabolismo energético do T. rangeli, avaliamos neste trabalho a expressão e a atividade enzimática da arginina quinase (AK), enzima que possui atividade de fosfotransferase e cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ADP, assim como arginina e ATP, sendo essencial para diferentes processos celulares em tripanosomatídeos, como por exemplo, infecção, multiplicação celular e diferenciação celular. O crescimento dos parasitos em meio LIT foi acompanhado durante nove dias, sendo observada uma menor expressão da AK somente no dia 1, aumentando no dia 2 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK aumentou progressivamente até o 5º dia de cultivo, decaindo gradativamente nos dias subsequentes. Durante a diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas realizada ao longo de oito dias em meio DMEM, a maior expressão da AK foi detectada nas formas epimastigotas (dia 0) e a maior atividade enzimática nas formas de transição (dia 4). Durante a diferenciação de tripomastigotas em epimastigotas foi observada uma menor expressão da AK somente nos dias 3 e 4, sendo aumentada no dia 5 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK se manteve constante nos tripomastigotas recém isolados e no primeiro dia de cultivo, aumentando no segundo dia e se mantendo constante até o sexto dia, quando teve um aumento da atividade, que novamente se manteve constante até o nono dia e então decaindo nos últimos dias. Embora estudo prévio tenha demonstrado uma localização flagelar da TrAK a maior parte da atividade da AK foi encontrada na fração citosólica após purificação do citoesqueleto e flagelo. Na comparação entre diferentes espécies e cepas de tripanosomatídeos, a cepa SC 58 de T. rangeli apresentou uma atividade quase duas vezes maior do que a cepa Choachí. A atividade nas cepas de T. cruzi foi praticamente constante quando comparadas entre si e também com a cepa Choachí. Através destes resultados é possível inferir que a atividade da AK parece estar relacionada à multiplicação celular e a adaptação à condições metabólicas adversas (ex. diferenciação celular), sendo influenciada pela demanda energética do parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as humans, sharing reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi. In this work we evaluate the expression and the enzymatic activity of the T. rangeli arginine kinase (AK), an enzyme with phosphotransferase activity that catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP¸ as the arginine and ATP. AK is essential in trypanosomatids for diferent cellular processes, like infection, cellular multiplication and cellular diferentiation. The AK expression was monitored during the T. rangeli epimastigotes growth in LIT medium for nine days, revealing an increasing expression of AK during the first couple of days and then stabilizing. The enzymatic AK activity have increased up to the fifth day of in vitro culture and then gradually decreased during the subsequent days. During the cellular differentiation in vitro, higher AK expression levels were observed for the epimastigote forms (day 0) but the higher enzymatic activity was detected for the transition forms (day 4). During the in vitro differentiation of bloodstream forms to replicative forms the AK expression have increased up to the fifth day and remained stable up to the ninth day. During this process the AK enzymatic activity revealed a slight increase up to the second day and the stabilised up to the sixth day when a second peak of activity was observed followed by decay up to the ninth day. Although previous studies have demonstrated a flagellar localization for the TrAK, higher AK activity was found on the cytosolic fraction. The AK activity revealed to be distinct among T. rangeli strains, being two times higher for the SC58 strain when compared to the Choachí strain, which revealed similar AK activity as observed for T. cruzi. We conclude that AK activity might be related to the T. rangeli cellular multiplication, differentiation and metabolic adaptation to adverse conditions, being influenced by the parasite?s energetic demands.

Thesis (Ph.D.)--Ohio University, November, 2009. / Release of full electronic text on OhioLINK has been delayed until December 1, 2010. Title from PDF t.p. Includes bibliographical references.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:24:52Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_MariaRaquelFelletBelinato.pdf: 5060346 bytes, checksum: e8bef8e25cdc2e123cfed86f1bc3fac5 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:25:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_MariaRaquelFelletBelinato.pdf: 5060346 bytes, checksum: e8bef8e25cdc2e123cfed86f1bc3fac5 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:25:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_MariaRaquelFelletBelinato.pdf: 5060346 bytes, checksum: e8bef8e25cdc2e123cfed86f1bc3fac5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:25:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_MariaRaquelFelletBelinato.pdf: 5060346 bytes, checksum: e8bef8e25cdc2e123cfed86f1bc3fac5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Os triatomíneos são insetos hematófagos capazes de transmitir Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. Existem poucos estudos sobre a virulência do parasito ao inseto vetor e, com isso, o parasito tem sido considerado por diversos autores como não-patogênico nesse sentido. Trypanosoma rangeli, outro protozoário transmitido por triatomíneos, não é patogênico ao homem, mas apesar de vários efeitos negativos ao vetor serem conhecidos, seu papel sobre o comportamento e a biologia reprodutiva do inseto ainda não foi investigado. Essa tese avaliou o efeito da infecção por T. cruzi (em duas temperaturas de criação: 25-25ºC - os insetos foram mantidos em 25ºC durante as fases ninfal e adulta e 30-25ºC - os insetos foram mantidos a 30ºC durante a fase ninfal e transferidos para 25ºC após a muda imaginal) e por T. rangeli - somente em 25-25ºC, em aspectos reprodutivos e no comportamento de cópula e voo de R. prolixus. Inicialmente, foi demonstrado que tanto T. cruzi 30-25ºC quanto T. rangeli causaram uma diminuição na fecundidade e fertilidade dos triatomíneos, sendo os efeitos decorrentes da infecção por T. rangeli mais evidentes. Além disso, foi observado para os mesmos grupos que a presença dos parasitos diminuiu o tamanho, o peso e o conteúdo proteico de ovos postos por pares infectados. O comportamento sexual dos insetos também foi afetado pelas infecções por T. rangeli e T. cruzi (30-25ºC). A frequência e duração da cópula em ensaios sem escolha de parceiro somente foram alteradas na infecção por T. rangeli. Interessantemente, quando foi permitido a insetos não infectados escolherem entre um parceiro infectado e um não infectado, um número significativamente maior escolheu parceiros não infectados, em infecções por T. cruzi e T. rangeli. O comportamento de início de voo também foi alterado em decorrência das infecções. Ambos os parasitos diminuíram a frequência de início de voo dos insetos. Adicionalmente, um maior número de fracassos nas tentativas de início de voo foi visto nos insetos infectados em comparação aos sem infecção. De maneira geral, as infecções por T. cruzi e T. rangeli produziram efeitos negativos no fitness de R. prolixus. No caso de T. cruzi a temperatura de criação dos insetos parece ser relevante para a ocorrência dos efeitos. Será importante investigar ainda se os insetos são capazes de controlar comportamentalmente as populações de parasitos, escolhendo, por exemplo, temperaturas ambientais adequadas ou se os tripanosomas podem manipular ativamente o comportamento dos triatomíneos para seu próprio benefício. / Triatomine bugs are bloodsucking insects capable of transmitting Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. There are few studies on the virulence of this parasite to its vector and thereby, T. cruzi has been considered by several authors as non-pathogenic in this sense. Trypanosoma rangeli, another protozoan transmitted by triatomine bugs, is not pathogenic to humans, but despite several negative effects to the vector being known, their role on the behavior and reproductive biology of this insect has not been investigated yet. This thesis evaluated the effect of T. cruzi (at two rearing temperatures: 25-25ºC – the insects were kept at 25ºC both during ninfal and adult phases and 30-25ºC - the insects were kept at 30°C and transferred to 25°C after the imaginal molt) and T. rangeli (25-25ºC) infections on reproductive, mating and flight behavior of R. prolixus. First we have shown that both T. cruzi 30-25ºC and T. rangeli caused a decrease in fecundity and fertility of triatomines and these effects were more evident on T. rangeli infection. Furthermore, it was observed for the same groups that the presence of parasites decreased size, weight and protein content of eggs laid by infected pairs. The sexual behavior of insects was also affected by both T. rangeli and T. cruzi (30-25ºC) infection. The frequency and duration of matings in assays without mating choice were only altered by T. rangeli infection. Interestingly, when uninfected insects were allowed to choose between uninfected and infected partners, significantly more individuals chose uninfected partners in both T. cruzi and T. rangeli infections. The behavior of flight initiation was also altered as a result of infections. Both parasites decreased the frequency of flight initiation of insects. Additionally, an increased number of failures on flight initiation was observed in infected insects when compared to uninfected ones. Generally, infection by T. cruzi and T. rangeli resulted in negative effects on fitness of R. prolixus. In the case of T. cruzi, the rearing temperature of insects seems to be important for the occurrence of effects. It will be important to further investigate whether triatomines present behavioral responses that may control trypanosome growth through actively choosing, for example, appropriate environmental temperatures or whether trypanosomes actively manipulate the insect behavior to their own benefit.

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 debora_mattos_ioc_mest_2014.pdf: 25027935 bytes, checksum: 36794f8df745a06c2879690ef1660179 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A susceptibilidade de Rhodnius prolixus ao T. rangeli depende da cepa do parasita e das interações moleculares no intestino e na hemocele do vetor. T. rangeli pode modular a resposta imune do vetor, preparando o hospedeiro à invasão e a sobrevivência dos parasitas na hemocele, superando assim as adversidades encontradas nos diferentes órgãos do inseto. Neste trabalho, são discutidos os mecanismos destas interações, destacando também o papel da microbiota intestinal e outros mecanismos importantes para o desenvolvimento do parasita. Inicialmente nossas investigações foram realizadas para comparar aspectos da imunidade celular e humoral de ninfas de 4º e 5º estádio de R. prolixus em resposta a uma infecção oral com a cepa Macias de T. rangeli. Na infecção oral em 4º estádio (acompanhamento em longo prazo), não foi observada diferença na mortalidade e muda ao comparar com os insetos controle não infectados. Constatou-se um número aumentado de flagelados no intestino das ninfas de 5º estádio durante o curso da infecção. Também, não houve alteração significativa na contagem de microagregados hemocitários (nódulos) em infecções de 4º estádio, enquanto em ninfas infectadas em 5º estádio houve um aumento no número de nódulos. Por outro lado, não houve diferença no número de hemócitos em ambas as infecções Demonstramos nos dois tipos de infecção oral com T. rangeli em R. prolixus, em comparação com os insetos controle não infectados, que o intestino médio atenuou a atividade de fenoloxidase, aumentou as atividades antibacterianas testadas in vitro contra Serratia marcescens, e alterou a expressão relativa de genes que codificam para defensinas (DefA, DefB, DefC), prolixicina e lisozimas (LisAe LisB). Isto sugere a influência destas atividades sobre a contagem de unidades formadoras de colônias, encontradas diminuídas no trato digestivo do inseto. Em uma segunda etapa do estudo, foram comparadas as respostas de defesa em ninfas de 5º estádio de R. prolixus inoculadas com T. rangeli, cepas Macias e H14. A cepa Macias de T. rangeli não aumentou a mortalidade desses insetos, apresentou capacidade de sobreviver e se multiplicar na hemolinfa, aumentou o número de hemócitos, e induziu alta atividade de fenoloxidase. Em contraste, estes mesmos parâmetros medidos em insetos inoculados com a cepa H14 de T. rangeli foram diferentes daqueles encontrados com inoculação de insetos usando a cepa Macias. Conclui-se que R. prolixus responde de forma distinta frente a vias de infecção oral ou por inoculação com T. rangeli, sugerindo que a capacidade infectiva deste protozoário, pode ser alterada por modulação do sistema imune do vetor

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-23T12:39:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_DIP_NewmarPintoMarliere.pdf: 955219 bytes, checksum: 062701a2ea1b04c3ce8ef829141cb40f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-23T12:39:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_DIP_NewmarPintoMarliere.pdf: 955219 bytes, checksum: 062701a2ea1b04c3ce8ef829141cb40f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T12:39:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_DIP_NewmarPintoMarliere.pdf: 955219 bytes, checksum: 062701a2ea1b04c3ce8ef829141cb40f (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Rhodnius prolixus é um inseto hematófago considerado principal transmissor do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, na Colômbia e Venezuela. Além do T. cruzi, ele pode transmitir o Trypanosoma rangeli a várias espécies de mamíferos, incluindo o homem. Durante o dia, estes insetos são encontrados no interior de abrigos, agregados com seus co-específicos em um estado de imobilidade denominado acinese. Durante a noite, estes insetos apresentam um perfil de atividade locomotora com dois picos característicos: um na primeira metade da escotofase, relacionado com a procura por hospedeiros e parceiros sexuais, e outro, na interfase entre o fim da fase escura e a fotofase, direcionado à procura de refúgios. Como seus hospedeiros são comumente vertebrados predadores de insetos, os triatomíneos podem ser mortos durante sua busca e o subsequente processo de alimentação. Desta maneira, o presente estudo avaliou se a infecção pelos tripanosomas acima citados altera o nível de atividade locomotora, os padrões de uso de abrigos e as taxas de predação sofridas por ninfas de R. prolixus. Além disso, avaliou-se a possibilidade de camundongos se infectarem ao ingerir ninfas infectadas com T. rangeli. Inicialmente, demonstrou-se que insetos infectados com T. cruzi apresentam uma diminuição nos níveis de atividade locomotora durante as primeiras horas da escotofase. Em contraste, a infecção por T. rangeli induziu a um aumento no nível de atividade locomotora durante praticamente todo o ciclo diário. Os padrões de uso de abrigos por ninfas infectadas com T. cruzi praticamente não foram alterados, porém esses insetos foram significativamente mais predados que insetos sadios. Trypanosoma rangeli modificou todos os parâmetros avaliados relacionados com o uso de abrigo. A infecção por este parasito aumentou a porcentagem de insetos que permaneceram fora dos abrigos, a exposição ao hospedeiro e consequentemente suas taxas de predação. Por fim, demonstrou-se que camundongos não se infectam com T. rangeli pela via oral. As alterações observadas, principalmente aquelas das taxas de predação, podem ter importantes implicações na transmissão de ambos os tripanosomatídeos na natureza, e são discutidas no presente trabalho. / The hematophagous insect Rhodnius prolixus is considered the main vector of Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, in Colombia and Venezuela. In addition to T. cruzi, these insects can transmit Trypanosoma rangeli to different mammals, including humans. During daylight hours, triatomines remain hidden in shelters, aggregated with co-specifics in an immobility state called akinesis. During night time, these insects become active, presenting two locomotory peaks: cone during the first half of the scotophase, related to host and sexual partner search, and another at the scotophase/photophase transition, when they return to their refuges. Triatomines can be eaten during host seeking and feeding because triatomine hosts are frequently insect predators. In this study, we evaluated whether infection by T. cruzi or T. rangeli influences the locomotor activity, the use of shelters and the predation rates suffered by R. prolixus nymphs. In addition, we evaluated whether mice can become infected with T. rangeli by ingestion of infected R. prolixus nymphs. T. cruzi infected insects exhibited a decreased locomotor activity level during the first hours of the scotophase. In contrast, T. rangeli infected insects showed increased locomotor activity during most daylight hours. T. cruzi infected nymphs did not show alterations in their patterns of shelter use. However, they suffered a significantly higher predation rate than healthy bugs. On the other hand, T. rangeli infected insects presented an altered pattern of shelter use. Specifically, these insects tended to remain out of their shelters, being exposed to their hosts and suffering higher predation rates. Finally, mice did not become infected by predating on T. rangeli infected insects. These behavioral changes, and especially the higher predation rates observed for infected insects, may have important implications for the transmission of both trypanosomatids in nature.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:16:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 cecilia_vieira_ioc_dout_2015.pdf: 5478933 bytes, checksum: 82e22f21a3f655c7a35e09359316e42f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Rhodnius prolixus é um dos principais insetos vetores de Trypanosoma cruzi e de Trypanosoma rangeli na América Latina. A produção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) no trato digestivo ou corpo gorduroso do inseto é vital para evitar a proliferação de microrganismos patogênicos além de manter a homeostasia da microbiota nativa. O presente trabalho focou na modulação da imunidade humoral do intestino médio de R. prolixus desafiados oralmente com a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e Gram-negativa Escherichia coli, além de seus tripanosomatídeos naturais T. rangeli e T. cruzi, considerando a influência do desenvolvimento dos parasitas sobre a microbiota intestinal. Em condições normais, a região anterior do intestino médio houve maior abundância de transcritos de genes de lisozimas (lis) e defensinas (def), enquanto na posterior, do gene da prolixicina (prol). Insetos alimentados com bactérias Gramnegativas apresentaram maior quantidade de transcritos de defC e prol, enquanto a ingestão de bactérias Gram-positivas induziu a expressão de defA e defB no intestino médio A infecção por T. rangeli cepa Macias diminuiu a atividade fenoloxidásica, os níveis de expressão de lisozimas e prolixicina, ao mesmo tempo em que induziu aumento de atividade antibacteriana e dos níveis de defensina C no tubo digestivo do inseto, também modificando a composição de bactérias nativas. Além disso, foi verificado que as diferentes cepas de T. cruzi Dm 28c e Y modulam a resposta imune e a microbiota no intestino médio de R. prolixus de forma variável. T. cruzi Dm 28c induziu um aumento na expressão de genes de defensina C e uma diminuição da expressão de genes de prolixicina, reduzindo drasticamente a população bacteriana cultivável. Em contraste, T. cruzi Y não foi capaz de induzir a expressão de AMPs no intestino médio nem de reduzir consideravelmente a microbiota neste mesmo órgão. Nossos resultados sugerem que R. prolixus em resposta a ingestão de microrganismos, modula diferencialmente a expressão de AMPs pelas células epiteliais do intestino que acarreta a redução da microbiota e um favorecimento do desenvolvimento de T. rangeli e T. cruzi, dependendo do genótipo do parasita / Rhodnius prolixus is a major vector of Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi , in Latin America. T he production of antimicrobial peptides (AMPs) in the midgut of the insect is vital to control possible infection, and to maintain the microbiota already present in the digestive tract. This work focuses on the modulation of the humoral im mune responses of the midgut of R. prolixus orally challenged with Gram positive and Gram negative bacteria as well with T. rangeli Macias strain, T. cruzi Dm 28c and Y strain, considering the influence of the parasite s on the intestinal microbiota . Our re sults showed that the anterior midgut contents of control insects contain a higher inducible antibacterial activity and AMPs transcript abundance than those of the posterior midgut. Insects orally fed with Gram - negative bacteria presented higher amount of defC and prol transcripts, while the ingestion of Gram - positive induced defA and defB expression in the midgut. T. rangeli Macias strain successfully colonized R. prolixus midgut through a decreasing in PO activities , prolixicin and lysozyme levels, while at the same time in duc ed an increase in antibacterial activity and upregulated defC levels in the insect anterior midgut. T. rangeli infection also diminishes the amount of cultivable gut bacteria as well modif ied the composition of indigenous microo rganisms. Furthermore, different T. cruzi strains present distinct profile s of immune system and microbiota modulation in R. prolixus midgut, where T. cruzi Dm 28c was able to induce an increase in defensin C genes and a depression in prolixicin genes, whi le drastically reduce the cultivable bacteria population. In the other hand T. cruzi Y was not competent to induce AMPs expression in the gut or considerably reduce the microbiota in the anterior midgut. Our findings suggest that R. prolixus modulates AMP gene expression upon ingestion of bacteria and tripanosomatids with patterns that are distinct and dependent upon the species of the invading pathogen. Besides, t he trypanosome ability to induce immune peptides in epithelial cells seems to favor its development in the insect digestive tract by decreasing intestinal microbiota , depending on the parasite genotype

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-04-19T04:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015Bitstream added on 2016-05-24T17:34:34Z : No. of bitstreams: 1 337986.pdf: 2799017 bytes, checksum: 4aeae083fbd264b859e7eeb1e831db5b (MD5) / O Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli são duas espécies de protozoários de ocorrência simpátrica entre as Américas do Sul e Central e que compartilham os mesmos hospedeiros invertebrados, hospedeiros mamíferos silvestres e domésticos, incluindo seres humanos. Uma vez que infecções mistas T. rangeli/T. cruzi já foram relatadas para diversos hospedeiros, buscamos gerar ferramentas para analisar a dinâmica da co-infecção, tendo gerado cepas de ambas as espécies que expressassem marcadores fluorescentes diferentes. Após a obtenção das cepas transfectadas, as mesmas foram clonadas e ensaios de PFGE confirmaram a integração dos plasmídeos pTREXmRFP/pTREXnGFP-Neo, pTREXmRFP-Hygro e pROCKGFP-Neo no genoma dos parasitos. Com estas ferramentas foi possível realizar um estudo quantitativo da cinética da infecção mista e das variações populacionais dos parasitos em ambos os hospedeiros mamífero e invertebrado. A avaliação do crescimento em diferentes proporções das duas espécies em co-cultivo axênico em meio LIT não revelou diferenças significativas se comparado ao cultivo isolado de cada cepa. Infecções de células THP-1 com os parasitos transfectados revelou uma diferença significativa no que diz respeito às cepas selvagens e transfectadas de T. cruzi, sendo caracterizada por um número menor de formas amastigotas por célula infectada em relação à cepa parental nos tempos de 2, 4, 8 e 24 h de infecção, porém ao comparar as taxas e tempos de multiplicação de cada uma das cepas, as diferenças não foram significativas. Ensaios preliminares in vitro da interação de hemócitos extraídos de Rhodnius prolixus com uma cepa de T. rangeli transfectada com o plasmídeo pTREXnGFP-Neo permitiram evidenciar uma rápida interação do parasito com estes tipos celulares, sendo registrada a internalização em várias situações, não sendo evidenciados sinais de multiplicação do T. rangeli nestes tipos celulares. Foram também realizados ensaios preliminares in vivo de co-infecção de Rhodnius prolixus por T. cruzi e T. rangeli, revelando uma resposta diferencial frente à infecção exclusiva pelo T. cruzi e T. rangeli em relação à co- infecção neste vetor. Em camundongos Balb/C a infecção prévia pelo T. rangeli não foi capaz de gerar uma proteção significativa contra a infecção subsequente pelo T. cruzi, porém é capaz de gerar uma redução da parasitemia causada pelo T. cruzi além de aumentar a sobrevida dos animais infectados.<br. / Abstract : Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli are two species of sympatric occurrence of protozoa between South and Central America that share the same invertebrates hosts, wild and domestic mammalian hosts, including humans. Once mixed infections T. rangeli / T. cruzi have been reported for various hosts, we seek to generate tools for analyzing the dynamics of co-infection, having generated strains of both species that expressed different fluorescent markers. After obtaining the transfected strains, they were cloned and PFGE assays confirmed the integration of the plasmids pTREXmRFP / pTREXnGFP-Neo, and pROCKGFP pTREXmRFP-Hygro-Neo into the genome of parasites. With these tools it was possible to perform a quantitative kinetic study of mixed infection and population variations of the parasites in both mammal and invertebrate hosts. The evaluation of different growth ratios of the two species in axenic co-cultivation in LIT medium revealed no significant differences when compared to the isolated culture of each strain. THP-1 cells infections with transfected parasites revealed a significant difference in respect to the wild and transfected T. cruzi strains, characterized by a smaller number of amastigotes per infected cell In relation to parental strain on times 2, 4, 8 and 24 h of infection. However, when comparing propagation rates and times of each of the strains, the differences were not significant. Preliminary assays in vitro of the interaction of hemocytes extracted from Rhodnius prolixus with T. rangeli strain transfected with the pTREXnGFP-Neo plasmid showed a rapid interaction of the parasite with these cell types, internalization being recorded in various situations, not being evidenced signals of multiplication of T. rangeli in these cell types. It was also carried out preliminary tests in vivo of co-infection of Rhodnius prolixus by T. cruzi and T. rangeli, showing a differential response against exclusive infection by T. cruzi and T. rangeli regarding co-infection in this vector. In mice BALB / C, prior infection with T. rangeli was not able to generate a significant protection against subsequent infection by T. cruzi, but it is able to generate a reduction in parasitemia caused by T. cruzi, in addition to increasing the survival of infected animals.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316869.pdf: 2092143 bytes, checksum: f5600ca660b99748d236b4ce50d7fa8a (MD5) / O Trypanosoma rangeli é um protozoário que, embora estreitamente relacionado ao T. cruzi, não é considerado patogênico para o hospedeiro mamífero, no qual sua capacidade de multiplicação é desconhecida. Uma vez que diversos estudos já abordaram esta questão, sem resultados consensuais, o objetivo deste estudo foi investigar marcadores moleculares e estruturais da divisão celular no T. rangeli, como uma estratégia para detectar a multiplicação celular mesmo sem visualização direta do processo. O ciclo celular in vitro das formas epimastigotas proliferativas da cepa Choachí foi estudado, sendo sua duração total calculada em 26,2 horas, sendo 11,91 horas na fase G1, 6,13 horas na fase S, 3,88 horas na fase G2, 1,13 horas na mitose (M) e, por fim, 3,15 horas na citocinese (C). Esta progressão no ciclo pôde ser acompanhada também por citometria de fluxo, por meio da avaliação do conteúdo de DNA, gerando histogramas com um pico referente a parasitos em G1 e outro a parasitos em G2/M/C. Como potenciais marcadores moleculares, foram escolhidos os transcritos para as proteínas Aurora quinase 1, Polo-like quinase, MOB1 e TRACK, as quais já foram associadas à citocinese de outros tripanosomatídeos. Os níveis de transcritos para essas proteínas foram avaliados em epimastigotas em fase exponencial de crescimento por PCR quantitativa em tempo real (qPCR), sendo comparados a parasitos com taxas de multiplicação sabidamente reduzidas - epimastigotas em fase estacionária ou tratados com hidroxiureia - e a parasitos cuja capacidade de multiplicação é desconhecida - os tripomastigotas. Os transcritos para Aurora quinase 1 e, principalmente, Polo-like quinase estiveram fortemente associados a parasitos com altas taxas de divisão celular, ao passo que os transcritos para MOB1 e TRACK tiveram uma variação independente. Em todos os ensaios, Polo-like quinase demonstrou ser o mais promissor marcador molecular da citocinese, apresentando significantes reduções em sua abundância relativa de transcritos nas formas com baixas taxas de multiplicação celular, além de ser detectada como uma proteína de cerca de 70 kDa apenas nas formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento. Assim, este estudo demonstrou o potencial da metodologia de qPCR utilizando Polo-like quinase como marcador molecular, bem como da citometria de fluxo, para estudar o comportamento do T. rangeli em seu hospedeiro mamífero, abrindo novas perspectivas para a compreensão do ciclo biológico deste parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli is a protozoan parasite closely related to T. cruzi but considered to be non-pathogenic to the mammalian host, in which its ability to proliferate is unknown. Since several studies have addressed this issue without consensual results, the objective of this study was to investigate structural and molecular markers of cell division in T. rangeli, as a strategy to detect cell multiplication even when direct visualization of this process is not possible. The in vitro cell cycle of strain Choachí proliferative epimastigote forms was studied and revealed a duplication time of 26.2 hours, of which 11.91 hours consist in G1 phase, 6.13 hours in S phase, 3.88 hours in G2 phase, 1.13 hours in mitosis (M) and 3.15 hours in cytokinesis (C). This progression in the cell cycle was also followed by flow cytometry through the evaluation of DNA content, generating histograms with two peaks, the first referring to parasites in G1 and the second to parasites in G2/M/C. The transcripts for proteins Aurora kinase 1, Polo-like kinase, MOB1 and TRACK, which have been previously associated with cytokinesis in other trypanosomatids, were chosen as potential molecular markers. The transcript levels for these proteins were evaluated in exponential growth phase epimastigotes through real time quantitative PCR (qPCR) and compared to parasites with known reduced multiplication rates - stationary phase epimastigotes and parasites treated with hydroxyurea - and to parasites whose ability to multiply is unknown - trypomastigotes. The transcripts for Aurora kinase 1 and specially Polo-like kinase were strongly associated with parasites with high cell division rates, whereas the transcripts for MOB1 and TRACK varied independently. Polo-like kinase was the most promising molecular marker for cytokinesis, presenting a significant reduction in its transcripts relative abundance in parasites with low multiplication rates, being also detected as an approximately 70 kDa protein only in exponential growth phase epimastigotes. Therefore, this study has demonstrated the potential of the qPCR methodology using Polo-like kinase as a molecular marker, as well as the flow cytometry methodology, to study the behavior of T. rangeli in its mammal host, opening new perspectives to the comprehension of its biological cycle.