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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-08-24T16:44:02Z No. of bitstreams: 1 2016_PaulaMartinsdeOliveira.pdf: 2291590 bytes, checksum: c3d46ba0c2e653fd8482367d99c7e777 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-27T18:47:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PaulaMartinsdeOliveira.pdf: 2291590 bytes, checksum: c3d46ba0c2e653fd8482367d99c7e777 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-27T18:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PaulaMartinsdeOliveira.pdf: 2291590 bytes, checksum: c3d46ba0c2e653fd8482367d99c7e777 (MD5) / Este trabalho objetivou o desenvolvimento e a caracterização de micropartículas de quitosana para a administração pulmonar da isoniazida (INH) como alternativa não invasiva e mais segura para o tratamento da tuberculose. Um método analítico para quantificação de INH por cromatografia líquida de alta eficiência foi desenvolvido e validado seguindo os parâmetros de seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limites de detecção e quantificação preconizados pelo ICH e pela ANVISA. As micropartículas de quitosana foram preparadas pela técnica de spray drying utilizando-se diferentes proporções de polímero/fármaco (1:0; 1:1, 2:1, 3:1 p/p). Foram também preparadas micropartículas reticuladas com TPP, com e sem INH. O rendimento do processo de obtenção variou de 30,5 a 46,3%. As micropartículas obtidas apresentaram elevados valores de eficiência de encapsulação (entre 89% e 114%) e valores de potencial zeta superiores a +17,7 mV, tendo sido o potencial zeta inversamente proporcional à concentração de fármaco nas partículas e afetado negativamente pela presença do TPP nas amostras. A análise morfológica revelou partículas bastante esféricas, e mostrou que a presença de INH resultou em superfície mais lisa para as micropartículas de quitosana se comparada às micropartículas preparadas sem o fármaco. Todas as micropartículas, em média, apresentaram diâmetro em torno de 3,5 μm, o que deve favorecer sua deposição pulmonar após inalação do pó seco. Os dados de FTIR e DSC demonstraram a estabilidade química da INH com a quitosana e um elevado grau de interação do fármaco com o polímero. Os estudos in vitro de liberação de INH a partir das micropartículas de quitosana revelaram que as micropartículas reticuladas com TPP retardaram melhor a liberação do fármaco que as micropartículas preparadas com o polímero não reticulado. Todas as micropartículas demonstraram potencial mucoadesivo segundo estudos realizados in vitro com mucina. Ensaios de citotoxicidade in vitro mostraram que as formulações produzidas não foram citotóxicas para macrófagos alveolares AMJ2-C11. Além disso, a dosagem de citocinas liberadas após tratamento das células com as micropartículas demonstrou que as micropartículas foram capazes de ativar os macrófagos alveolares, aumentando a produção de TNF-α e IL-10. Conclui-se, portanto, que as micropartículas de quitosana, reticuladas ou não, desenvolvidas neste trabalho apresentam-se como potenciais sistemas de liberação pulmonar do antimicrobiano INH para tratamento local da tuberculose. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed the development and characterization of chitosan microparticles for pulmonary administration of isoniazid (INH) as a non-invasive and safer alternative for the treatment of tuberculosis. An analytical method for quantification of INH by high-performance liquid chromatography was developed and validated according to the parameters of selectivity, linearity, precision, accuracy, limits of detection and quantification, recommended by the ICH and ANVISA. The chitosan microparticles were prepared by spray drying technique using different ratios of polymer/drug (1:0; 1:1; 2:1; 3:1 w/w). Microparticles were also prepared with TPP, with and without INH. The yield of the production process ranged from 30.5 to 46.3%. The obtained microparticles presented high encapsulation efficiency values (between 89% and 114%) and zeta potential values greater than +17.7 mV, being zeta potential inversely proportional to the concentration of drug in the particles and negatively affected by the presence of TPP in the samples. Morphological analysis revealed spherical particles, and showed that the presence of INH resulted in smoother surface to the chitosan microparticles compared to microparticles prepared without drug. All microparticles, on average, had a diameter of about 3.5 μm, which should favor their lung deposition after inhalation of the dry powder. The FTIR and DSC data showed the chemical stability of chitosan and INH to a high degree of drug interaction with the polymer. The in vitro release of INH from chitosan microparticles revealed that the crosslinked microparticles better delayed release of the drug than microparticles prepared without the crosslinking agent. All microparticles demonstrated mucoadhesive potential, according to studies conducted in vitro with mucin. In vitro cytotoxicity assays showed that the formulations produced were not cytotoxic for alveolar macrophages AMJ2-C11. Moreover, the dosage cytokines released after treatment of the cells with microparticles demonstrated that the microparticles were able to activate alveolar macrophages, enhancing TNF-α and IL-10 production. It follows, therefore, that chitosan microparticles, crosslinked or not, developed in this work are presented as potential lung delivery systems for local INH antimicrobial treatment of tuberculosis.

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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-14T18:50:40Z No. of bitstreams: 1 2014_JuliaSouzaVidal.pdf: 914586 bytes, checksum: cdd529fce2b521a476fb170770dbcc2e (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-15T15:02:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JuliaSouzaVidal.pdf: 914586 bytes, checksum: cdd529fce2b521a476fb170770dbcc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T15:02:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JuliaSouzaVidal.pdf: 914586 bytes, checksum: cdd529fce2b521a476fb170770dbcc2e (MD5) / A infecção latente da tuberculose (ILTB) e a coinfecção com HIV são desafios para o controle da tuberculose. O objetivo do presente estudo foi avaliar e sintetizar as informações disponíveis na literatura sobre o tratamento da ILTB na população geral e em pessoas que vivem com HIV/AIDS para subsidiar a decisão do Programa Nacional de Controle da Tuberculose quanto à quimioprofilaxia secundária da ILTB. Foram pesquisadas as bases MEDLINE, Cochrane Library, Centre for Reviews and Dissemination, EMBASE, LILACS, SCIELO, Tripdatabase, National Guideline Clearinghouse e Portal de Teses e Dissertações para identificar revisões sistemáticas, ensaios clínicos randomizados e diretrizes clínicas que avaliassem o tratamento da ILTB. A qualidade das evidências de ensaios clínicos randomizados foi avaliada por meio da escala de Jadad, e a qualidade das recomendações de outras fontes de evidências por meio da abordagem do GRADE – Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation. As evidências disponíveis sugerem que não há diferença entre o tratamento de curta duração com rifapentina e a terapia preconizada, de 6 meses de isoniazida, na redução da incidência de tuberculose ativa ou mortalidade. A adesão foi melhor com a administração de rifapentina diretamente observada em comparação à isoniazida autoadministrada. A qualidade da evidência é moderada ou baixa. Rifapentina é recomendada por uma diretriz com base nessa qualidade da evidência. Os dados disponíveis são escassos e de qualidade moderada ou baixa, e os estudos em andamento também são abertos. As evidências disponíveis podem parecer insuficientes para apoiar a incorporação de rifapentina para ILTB na população geral e em pessoas que vivem com HIV/AIDS, mas aspectos como taxa de adesão, viabilidade da implementação, custos e peculiaridades locais devem ser considerados no momento da decisão. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Latent tuberculosis infection (LTBI) and HIV-coinfection are challenges to tuberculosis transmission control. We aimed to assess and synthesize the information available in the literature regarding the treatment LTBI in both general and HIV-positive population to support the Brazilian Tuberculosis Control Program decision-making for LTBI secondary chemoprophylaxis. We searched MEDLINE, Cochrane Library, Centre for Reviews and Dissemination, EMBASE, LILACS, SCIELO, Tripdatabase, National Guideline Clearinghouse and Brazilian Thesis Repository to identify systematic reviews, randomized clinical trials and clinical guidelines that assessed the LTBI pharmacological treatment. Quality of evidence from randomized clinical trials was assessed by using Jadad Scale and recommendations from other evidence sources by the Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation (GRADE) approach. The available evidences suggest that there are no differences between rifapentine short course treatment and the standard 6-month therapy with isoniazid in reducing active tuberculosis incidence or death. Adherence was better with directly observed therapy rifapentine compared to self-administered isoniazid. The quality of evidence is moderate or low. Rifapentine is recommended by one guideline based on this quality of evidence. Evidence available is scarce and of moderate or low quality, and ongoing trials are design as open label. Available evidences may seem insufficient to support rifapentine incorporation for LTBI in general and HIV-positive populations, but aspects such as adherence rates, implementation feasibility, costs and local particularities should be considered in the decision-making process.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-04-30T14:30:23Z No. of bitstreams: 1 2009_TomasAizaAlvarez.pdf: 399408 bytes, checksum: 8dbee1ca4180376e07bec29c16b120cb (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-21T17:08:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_TomasAizaAlvarez.pdf: 399408 bytes, checksum: 8dbee1ca4180376e07bec29c16b120cb (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-21T17:08:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_TomasAizaAlvarez.pdf: 399408 bytes, checksum: 8dbee1ca4180376e07bec29c16b120cb (MD5) Previous issue date: 2009 / Introdução: A resistência do Mycobacterium tuberculosis às drogas se desenvolveu principalmente pela exposição aos diversos tratamentos, ao passo que se constituiu importante obstáculo à eficácia da terapêutica. Objetivo: Comparar índices de resistência micobacteriana de pacientes com tuberculose entre uma comunidade submetida a tratamento parcialmente intermitente com outra a tratamento com tomadas diárias. Método: Foram utilizados dados de 5138 pacientes com tuberculose pulmonar bacilífera em todo o Brasil, produzidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e analisados em dois grupos: a) Distrito Federal (DF), que pratica tratamento intermitente de três tomadas semanais após o primeiro mês diário; e b) Demais regiões brasileiras, cujo esquema é inteiramente diário. A resistência foi categorizada em primária ou adquirida, conforme a existência de tratamento anterior. O padrão de multi resistência envolvia isoniazida e rifampicina, simultaneamente, com ou sem outra droga, e o de mono resistência, quando apenas envolvia uma única droga. Resultado: A prevalência da resistência primária como um todo obteve os índices de 9,2% para o Distrito Federal e 9,3% para o restante do Brasil (p = 0,94); enquanto a de mono resistência e multi resistência obtiveram os índices de 6,6% e 6,9% (p = 0,89); 1,0% e 1,2% (p = 0,85); respectivamente. No que se refere à resistência adquirida como um todo identificaram-se os índices de 15,8% para o Distrito Federal e 26,8%% para o restante do Brasil (p = 0,39); os índices de mono resistência e multi resistência foram 5,3% e 13,7% (p = 0,33); 0,0% e 10,2% (p = 0,16); respectivamente. Conclusão: Não houve diferença significativa entre os índices de resistência observados na comunidade usuária do esquema parcialmente intermitente e do esquema diário. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background: Drug resistance relative to Mycobacterium tuberculosis is mainly due to the kind of treatment usually taken and is a problem to the therapy efficiency by itself. Objective: Compare mycobacterial resistance to drugs between two communities, one that takes partially intermittent therapy, and another that takes it daily. Methods: data from 5138 patients who had pulmonary tuberculosis with positive smear made by World Health Organization in Brazil were divided into two groups and analyzed. The first one was formed by the community who lives in Distrito Federal, where they use thrice weekly after one month of daily therapy. The second one was formed by the other regions of Brazil, where they use entirely daily therapy. The resistance was classified into primary or acquired as there was or not a history of past treatment. Multidrug resistance was only defined if at least both isoniazid and rifampin were involved. Results: Primary resistance prevalence as a whole was 9.2% in Distrito Federal, and 9.3% in other regions of Brazil (p = 0.94 ) while single resistance (any drug) and multi drug resistance were 6.6% and 6.9% (p = 0.89), 1.0% and 1.2% (p = 0.85), respectively. In relation to acquired resistance prevalence, it was 15.8% in Distrito Federal, and 26.8% in other regions of Brazil (p = 0.39), while single acquired resistance (any drug) and multidrug resistance were 5.3% and 13.7% (p = 0.33), 0.0% and 10.2% (p = 0.16), respectively. Conclusion: There wasnt any significant difference in resistance rates between people who has taken partially intermittent and daily therapy.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-06-22T21:14:52Z No. of bitstreams: 2 projeto 078-04.pdf: 2997884 bytes, checksum: 32b229d931341fda5f9c8f726d3b12ee (MD5) 2011_ElianeRamosTeixeira.pdf: 1914680 bytes, checksum: ff1b6b8437020e38eacec7f69642b026 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-06-28T01:13:44Z (GMT) No. of bitstreams: 2 projeto 078-04.pdf: 2997884 bytes, checksum: 32b229d931341fda5f9c8f726d3b12ee (MD5) 2011_ElianeRamosTeixeira.pdf: 1914680 bytes, checksum: ff1b6b8437020e38eacec7f69642b026 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-28T01:13:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 projeto 078-04.pdf: 2997884 bytes, checksum: 32b229d931341fda5f9c8f726d3b12ee (MD5) 2011_ElianeRamosTeixeira.pdf: 1914680 bytes, checksum: ff1b6b8437020e38eacec7f69642b026 (MD5) / INTRODUÇÃO: A tuberculose continua no cenário epidemiológico mundial e a sua permanência relaciona-se a vários processos e um dos principais obstáculos encontrado entre os portadores da doença é a não-adesão ao tratamento, vários são os fatores que contribuem para esta ocorrência. OBJETIVO: Identificar os fatores associados à não–adesão ao tratamento da tuberculose entre os pacientes atendidos nas unidades de saúde do Distrito Federal (DF) e municípios do seu entorno. METODOS: estudo transversal, de abordagem quali-quantitativa, com amostra de 863 pacientes em tratamento nos Centros de Saúde e Hospitais com o Programa de Controle da Tuberculose, de Regiões Administrativas do DF e de seis municípios do Entorno, entre 2006 e 2008. Foi analisada a associação da não-adesão em relação a variáveis socioeconômicas e demográficas, hábitos, suporte social, qualidade de vida, questões relacionadas à doença, tratamento e serviço. Foram utilizados testes convencionais na análise univariada (X2 - Mantel-Haenszel ou teste exato de Fisher) e utilizada regressão logística com o teste Wald. Para avaliação dos dados qualitativos, utilizou-se a Teoria das Representações Sociais como principio teórico – metodológico e para o tratamento dos dados a técnica de análise de conteúdo. RESULTADOS: Na análise não ajustada houve associação da não–adesão com: estado civil, escolaridade, local de residência, fase do tratamento, efeitos adversos dos medicamentos, consultas com menos de 15 minutos de duração, falta de acesso do paciente à equipe de saúde para resolução de dúvidas, situação emocional impedindo o exercício das tarefas cotidianas, não sentir-se otimista em relação ao futuro e indisposição para o lazer. A presença do Programa de Saúde da Família agiu como fator protetor. Após a regressão logística, permaneceram associadas a não–adesão: idade menor de 40 anos, local de residência (maior no DF que no Entorno), baixa escolaridade, presença de efeitos adversos, não ter sido informado sobre interação de medicamentos, e situação emocional impedindo atividades corriqueiras. Outras variáveis apareceram incluídas no modelo final de regressão, como o preconceito de amigos e parentes, não ter alguém para falar sobre a saúde/doença, e insatisfação com a vida sexual. CONCLUSÕES: a não-adesão é multifatorial. Além dos fatores já conhecidos e dos ligados ao serviço de saúde, questões relacionadas ao apoio micro-social, incluindo situações vivenciadas de preconceito e à qualidade de vida mostraram-se associadas à não-adesão ao tratamento. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / INTRODUCTION: The tuberculosis remains the epidemiological scenario and its permanence is related to various processes and the main obstacles encountered among patients with the disease are non - adherences to treatment, several factors are contributing to this occurrence. OBJECTIVE: to identify factors associated to non-adherence to tuberculosis (TB) treatment among patients at primary care health units at the Brazilian capital Federal District (FD) and sorrounding municipalities. METHODS: Cross sectional study of qualitative - quantitative approach, with a sample of 863 patients under TB treatment at Health centers and hospitals with the Tuberculosis Control Program, in Administrative Regions of the FD and six municipalities of the surrounding area, between 2006 and 2008. We analized the association between non-adherence and social-economic and demographic variables, practices, social support, life quality, factors related to disease, treatment and health care. We used conventional tests at the univariate analysis (א ² - Mantel Haenszel or Exact Fisher‟s Test) and logistic regression with Wald‟s Test. For evaluation of qualitative data, we used the theory of social representations as a principle theoretical - methodological and data processing technique of content analysis. RESULTS: At the unadjusted analysis there were associations between non-adherence and: marital status, educational level, residence region, treatment phase, adverse effects, medical consultations lasting less than 15 minutes, lack of access to the health professionals for solving any doubts, emotional situation making difficult daily routine tasks, lack of optimism with respect to future and lack of disposition to leisure. The presence of the Family Health Program was a protective factor for non-adherence. After logistic regression, the variables that remained associated to non-adherence were: age (less than 40 years old), residence place (greater non-adherence at the FD), low educational level, treatment adverse effects, no information on drug interaction provided by health professionals, and emotional situation turning difficult daily activities. Other variables remained at the final regression model, such as prejudice of friends and relatives, not having anyone to talk about health / disease, lack of satisfaction with sexual life. CONCLUSIONS: Non-adherence is multifactorial. Besides predictors already described in the literature and those related to health care quality, variables of micro-social support including the situations of preconcept experienced and quality of life were associated to non-adherence.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-30Bitstream added on 2014-06-13T19:41:20Z : No. of bitstreams: 1 peresi_e_dr_botfm.pdf: 1052630 bytes, checksum: e59a57f6f635bf2f461011c84b7d7f71 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / It is estimated that one-third of the total world population is latently infected with M. tuberculosis and only 5-10% of the infected individuals will develop active TB disease during their life-time. The reason why some infected individuals develop active disease, while others do not is not yet entirely understood. Given the central role of TLR-2 in the incitement of inflammation, polymorphisms in its gene might be involved in both infectious and inflammatory diseases. The aim of this study was to evaluate the influence of TLR2 - 16934A/T and GT repeat polymorphisms on the immune response of PTB patients undergoing anti-TB treatment at different time points of anti-tuberculosis treatment: T1 (beginning), T2 (3 months) and T3 (end). For this we genotyped TLR2 -16934 and (GT)n repeats polymorphisms and evaluated the immune response of pulmonary tuberculosis patients during the time of anti-tuberculosis treatment. The present study suggests that TLR2 - 16934A/T and GT repeats polymorphisms can influence differential TLR-2, NF-κB and cytokine levels during anti-TB treatment. We also suggest that PTB patients with TLR2 - 16934 AA genotype may have a worst outcome of the disease, since they have a lower IFN-γ, cytokine essential to initiate the protective immunity to active TB. This association could not be made in our study due to the low number of patients evaluated. Since TLR-2 play a major role in initiating immune response against M. tuberculosis other polymorphisms in TLR2 would be crucial to better understand protective immune responses and may serve as biomarkers of protection or susceptibility to TB

Orientador: Sueli Aparecida Calvi / Coorientador: Ana Carla Pereira / Coorientador: Edward A. Gravis / Banca: Lenice do Rosário Souza / Banca: Ida Maria Foschiani Dias Baptista / Banca: Fátima Regina Vilani Moreno / Banca: Ana Cláudia Pelizon / Resumo: Não disponível / Abstract: It is estimated that one-third of the total world population is latently infected with M. tuberculosis and only 5-10% of the infected individuals will develop active TB disease during their life-time. The reason why some infected individuals develop active disease, while others do not is not yet entirely understood. Given the central role of TLR-2 in the incitement of inflammation, polymorphisms in its gene might be involved in both infectious and inflammatory diseases. The aim of this study was to evaluate the influence of TLR2 - 16934A/T and GT repeat polymorphisms on the immune response of PTB patients undergoing anti-TB treatment at different time points of anti-tuberculosis treatment: T1 (beginning), T2 (3 months) and T3 (end). For this we genotyped TLR2 -16934 and (GT)n repeats polymorphisms and evaluated the immune response of pulmonary tuberculosis patients during the time of anti-tuberculosis treatment. The present study suggests that TLR2 - 16934A/T and GT repeats polymorphisms can influence differential TLR-2, NF-κB and cytokine levels during anti-TB treatment. We also suggest that PTB patients with TLR2 - 16934 AA genotype may have a worst outcome of the disease, since they have a lower IFN-γ, cytokine essential to initiate the protective immunity to active TB. This association could not be made in our study due to the low number of patients evaluated. Since TLR-2 play a major role in initiating immune response against M. tuberculosis other polymorphisms in TLR2 would be crucial to better understand protective immune responses and may serve as biomarkers of protection or susceptibility to TB / Doutor

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450558-Texto+Completo-0.pdf: 2693787 bytes, checksum: e4ffe9234a98b2ddfc9bc350c708c01c (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB), one of the oldest recorded human afflictions, is still one of the biggest killers among the infectious diseases. The HIV co-infection and the emergence of multidrug resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. The modern approach to the development of new chemical compounds against complex diseases, especially the neglected endemic ones, such as TB, is based on the use of defined molecular targets. Enzymes from the pyrimidine biosynthesis pathway have been considered potential targets for identification or development of novel anti-mycobacterial agents since in bacteria, pyrimidine nucleotide interconvertion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. Cytidine 5'-monophosphate kinase from Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) catalyzes the ATP-dependent phosphoryl group transfer preferentially to CMP and dCMP. Here, initial velocity studies and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) measurements showed that MtCMK follows a random-order kinetic mechanism of substrate binding, and an ordered mechanism for product release. The thermodynamic signatures of CMP and CDP binding to MtCMK showed favorable enthalpy and unfavorable entropy, and ATP binding was characterized by favorable changes in enthalpy and entropy. The contribution of linked protonation events to the energetics of MtCMK:phosphoryl group acceptor binary complex formation suggested a net gain of protons. Values for the pKa of a likely chemical group involved in proton exchange and for the intrinsic binding enthalpy were calculated. The Asp187 side chain of MtCMK is suggested as the likely candidate for the protonation event. Data on thermodynamics of binary complex formation were collected to evaluate the contribution of 2'-OH group to intermolecular interactions. The data are discussed in light of functional and structural comparisons among CMP/dCMP kinases and UMP/CMP ones. / A tuberculose (TB), uma das doenças mais antigas da humanidade, ainda é uma das principais causas de morte entre as doenças infecciosas. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e tem estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Novas abordagens para o desenvolvimento de compostos contra doenças complexas, especialmente doenças endêmicas negligenciadas, são baseadas no uso de alvos moleculares definidos. Enzimas envolvidas no metabolismo de pirimidinas tornam-se alvos moleculares interessantes para compostos inibidores, uma vez que em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biossíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. A citidina 5'-monofosfato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) em estudo, catalisa a transferência reversível de um grupamento fosforil a partir de ATP, preferencialmente para CMP e dCMP. Neste trabalho, os estudos de velocidade inicial e experimentos de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) demonstraram que a adição dos substratos (CMP e ATP) à MtCMK segue um mecanismo cinético sequencial aleatório, e que a liberação dos produtos ocorre de forma ordenada, onde o ADP é o primeiro produto a ser liberado. As assinaturas termodinâmicas da ligação do CMP e do CDP à MtCMK mostraram variações favoráveis da entalpia e desfavoráveis da entropia, e, a ligação do ATP foi caracterizada por mudanças favoráveis da entalpia e da entropia. As contribuições energéticas oriundas dos eventos de protonação, associados à formação do complexo binário MtCMK:receptor do grupamento fosforil, sugerem um ganho líquido de prótons. Além disso, foram calculados os valores de pKa de um provável grupo envolvido na troca de prótons, e da entalpia de ligação intrínseca. A cadeia lateral do Asp187 da MtCMK é sugerido como provável candidato para o evento de protonação. As medidas termodinâmicas da formação do complexo binário foram coletados a fim de avaliar a contribuição do grupo 2'-OH da pentose nas interações intermoleculares. Os dados obtidos foram discutidos comparando-se as características estrutural e funcional entre as CMKs já estudadas e a UMP/CMP quinase humana.

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450257-Texto+Completo-0.pdf: 1851494 bytes, checksum: 45b94fe1b9cb73399670961f3d6d6798 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB), an illness that results from Mycobacterium tuberculosis infection, remains a major health problem worldwide, accounting for an estimated 8. 7 million new cases globally in 2011. Problems related to treatment of M. tuberculosis infection are related to its ability to persist latently in host tissues, getting protection against drug treatment and creating a reservoir of disease. Addictionaly, the emergence of multi, extensively and totally drug-resistant strains, TB-HIV co-infection and the complexity of the treatment currently used, underline the need of new antitubercular drugs, with novel mechanisms of action. The enzyme adenylosuccinate lyase (ASL) is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Here we describe M. tuberculosis ASL (MtASL) cloning and expression in Escherichia coli. N-terminal amino acid sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses confirmed the identity of homogeneous MtASL. Size exclusion chromatography showed that the protein is a homotetramer in solution. Steady-state kinetics revealed that MtASL exhibits hyperbolic kinetics and confirmed that the recombinant enzyme indeed catalyses the cleavage of S-AMP in AMP and fumarate. The pH-rate profile showed that MtASL follows an overall acid-basic mechanism of catalysis and these studies, combined with multiple sequence alignment analysis led us to propose what amino acid residues are involved in the MtASL chemical reaction. In addition, product inhibition studies and isothermal titration calorimetry of binding products allowed us to propose the MtASL kinetic mechanism. The results here reported could lead to the identification of nucleoside analogs that potently inhibit M. tuberculosis viability, with minor damages to the human host. / A tuberculose humana (TB) é uma doença infectocontagiosa provocada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis e permanece sendo um importante problema mundial de saúde. Estima-se que 8,7 milhões de novos casos tenham ocorrido em 2011. Problemas relacionados ao tratamento da infecção ocorrem devido à sua habilidade de persistir de forma latente no hospedeiro criando um reservatório da doença. Adicionalmente, a emergência de cepas multi, extensivamente e totalmente resistentes, a coinfecção TB-HIV e a complexidade do tratamento utilizado atualmente, alertam para a necessidade de novos medicamentos, que possuam novos mecanismos de ação. A enzima adenilossuccinato liase (ASL) está envolvida em ambas as vias de biossíntese de purinas. Neste trabalho, nós descrevemos a amplificação, clonagem da ASL de M. tuberculosis (MtASL) e expressão em Escherichia coli. O sequenciamento N-terminal juntamente com análises por espectrometria de massas confirmaram a identidade da MtASL homogênea. Foi demonstrado através de cromatografia de exclusão por tamanho que a proteína é um homotetrâmero em solução. Ensaios de cinética no estado estacionário revelaram que a MtASL exibe um modelo de cinética hiperbólica e que catalisa a clivagem de S-AMP a AMP e fumarato. Estudos de perfil de pH demonstraram que a MtASL realiza um mecanismo catalítico ácido-básico e, tais estudos, combinados ao alinhamento múltiplo de sequências, permitiram propor os resíduos de aminoácidos envolvidos na reação. Adicionalmente, estudos de inibição pelos produtos somados a estudos de calorimetria de titulação isotérmica da ligação dos mesmos, permitiram propor o mecanismo cinético da MtASL. Os resultados deste trabalho podem auxiliar na posterior identificação de análogos de nucleotídeos que sejam capazes de inibir a viabilidade do M. tuberculosis, com poucos danos ao hospedeiro humano.