Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-31T14:47:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 678274 bytes, checksum: 035d6d898c1ba0a9d2455fe9227848d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T14:47:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 678274 bytes, checksum: 035d6d898c1ba0a9d2455fe9227848d8 (MD5) Previous issue date: 2008-11-19 / A finalidade deste trabalho de pesquisa foi realizar contagem dos diferentes grupos microbianos presentes em grãos de kefir de origens diferentes, verificar suas características de morfologia, identificar isolados de leveduras e avaliar o potencial do soro de kefir esterilizado por filtração em membrana MILIPORE (membrana em éster de celulose, 0,22 μm de poro, 25 mm de diâmetro) em inibir o crescimento de microrganismos patogênicos Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC11229), Salmonella typhimurium (ATCC 6539), Listeria monocytogenes (ATCC 15313) e Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4). O kefir é um produto lácteo fermentado feito a partir da inoculação de grãos de kefir em leite, ou parte da bebida como cultura inicializadora, resultando em um produto semelhante ao iogurte, porém com características próprias devido, principalmente, à presença de CO 2 e etanol. Sua origem é antiga, estimada em mais de 2.000 anos a.C nas montanhas da região do Cáucaso. Os grãos de kefir avaliados foram obtidos em três diferentes regiões sendo dois do estado de Minas Gerais (Viçosa e Caratinga) e um do estado de São Paulo (São Paulo). As amostras de grãos de kefir 1 (Viçosa), kefir 2 (Caratinga) e kefir 3 (São Paulo), apresentaram distribuição morfológica média em relação à proporção de cocos, bacilos e leveduras de (18%, 59% e 23%) respectivamente. As contagens dos grupos microbianos observadas nas três amostras apresentaram resultados médios em Log UFC.mL -1 para BAA (7,07), Lactobacilos (8,05), Lactococos (4,76), Leuconostoc (8,18) e Leveduras (6,55). A identificação das leveduras isoladas das amostras de grãos de kefir apresentou Cândida kefir, Cândida dubliniensis, Pichia ohmeri e Cândida zeilanoides, com classificação de identificação que variou de boa a excelente utilizando o kit API 20 AUX. Todas as amostras de kefir avaliadas apresentaram redução de no mínimo 30% no crescimento dos patógenos em relação ao controle. As maiores inibições ocorreram para a amostra de kefir (2) para o crescimento de Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4) (86,8%) e Salmonela typhimurium (ATCC 6539) (73,05%) e amostra do kefir (1) para o crescimento de Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4)(72,88%). O patógeno que sofreu maior inibição em relação às três amostras de kefir foi, Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4) apresentando crescimento (76,69%) menor que o controle. A inibição de Staphylococcus aureos (ATCC 6538) nas três amostras avaliadas variou de (42,80% a 69,15%), para o crescimento de Escherichia coli (ATCC 11229) a faixa de inibição foi de (30,73% a 59,89%), sendo este patógeno o que mostrou a maior diferença de inibição em relação às três amostras de kefir, Salmonela typhimurium (ATCC 6539) apresentou faixa de inibição de (44,99% a 73,05%), Listeria monocytogenes (ATCC 15313) de (41,45% a 54,18%) e Bacillus cereus (RIBO 1222- 173-S4) de (70,38% a 86,80%). Essa capacidade de inibição apresentada é interessante porque justifica a sua caracterização como alimento funcional. Alem disso, a técnica utilizada no estudo viabiliza a avaliação da bebida “in vitro”. É a primeira vez que se utiliza o soro de kefir (bebida) esterilizado em membrana para avaliar essa inibição, uma vez que, devido à presença de polissacarídeos na bebida, os testes em placas impedem a difusão para os meios de cultura inviabilizando a avaliação por essa técnica. De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho é possível concluir que os grãos de kefir das três diferentes origens avaliadas possuem características microbiológicas diferentes e capacidade antagonística frente a diferentes patógenos variada, refletindo a necessidade de se conhecer mais a respeito dos diversos grãos que existem no Brasil e no mundo. / The purpose of this study was to count different microbial groups in kefir grains of different origins; to verify the morphological characteristics and to identify yeast strains; and evaluate the potential of kefir serum sterilized by membrane filtration through Millipore filter (cellulose ester membrane, pores 0.22 UM, diameter 25 mm) for growth inhibition of the pathogenic microorganisms Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC11229), Salmonella typhimurium (ATCC 6539), Listeria monocytogenes (ATCC 15313) and Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4). Kefir is a milk product fermented by the inoculation of kefir grains in milk, or of part of the milk as initiating culture, resulting in a yogurt-like product, but with proper characteristics, mainly due to the presence of CO 2 and ethanol. The origin is ancient, estimated at over 2,000 years BC from the mountains of the Caucasus region. Kefir grains from the state of Minas Gerais (Viçosa and Caratinga) and from the state of Sao Paulo (Sao Paulo) were used here. The morphological distribution of the kefir grain samples 1 (Viçosa), 2 (Caratinga) and 3 (Sao Paulo) was average in relation to the proportion of cocci, bacilli and yeasts (18%, 59% and 23%, respectively). The counts of the microbial groups of the three samples showed average performance in Log UFC.mL -1 for BAA (7.07), Lactobacilli (8.05), Lactococci (4.76), Leuconostoc (8.18) and yeasts (6.55). Yeast isolation from the kefir grains samples identified Candida kefir, Candida dubliniensis, Pichia ohmeri and Candida zeylanoides. The yeasts were classified as good to excellent by the kit API 20 AUX. All kefir samples reduced the pathogen growth by at least 30% in comparison to the control. Highest inhibition was observed in sample 2 on the growth of Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4) (86.8%) and Salmonella typhimurium (ATCC 6539) (73.05%) and sample 1 on the growth of Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4). Highest inhibition by the three kefir samples was observed in the pathogen Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4) with a growth reduction of 76.69% compared to the control. The inhibition of Staphylococcus aureos (ATCC 6538) in the three samples ranged from 42.80% to 69.15%, and from 30.73% to 59.89% for Escherichia coli (ATCC 11229), where the growth inhibition range induced by the three kefir samples was greatest. The inhibition range of Salmonella typhimurium (ATCC 6539) was 44.99% to 73.05%, of Listeria monocytogenes ( ATCC 15313) from 41.45% to 54.18% and of Bacillus cereus (RIBO 1222-173-S4) from 70.38% to 86.80%. This inhibition capacity is interesting since it characterizes kefir as functional food. Furthermore, the beverage can be evaluated "in vitro" by the technique used here. It is the first time the kefir serum (beverage) was sterilized in membrane to evaluate this inhibition, since, due to the presence of polysaccharides, the spread of the medium is impeded in plate tests hampering the culture evaluation by this technique. Based on the results of this study it was possible to conclude that the kefir grains from the three different origins have different microbiological characteristics and antagonistic capacity towards different pathogens, which points to the need to learn more about the various grains that exist in Brazil and around the world. / Dissertação antiga, sem ficha catalográfica.

Made available in DSpace on 2014-07-28T18:09:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 123.pdf: 1294684 bytes, checksum: 49987dde78a9f73cea93a1d2691f5c4f (MD5) Previous issue date: 2006 / Made available in DSpace on 2014-12-22T16:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 123.pdf: 1294684 bytes, checksum: 49987dde78a9f73cea93a1d2691f5c4f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O presente estudo teve como proposta o monitoramento da resistência a drogas antimicrobianas entre 390 isolados de Salmonella Typhimurium de diversas fontes (animal, ambiental, alimentar, humana e de matéria-prima/rações) de contaminação da cadeia alimentar no Brasil, no período de 1999 a 2003. Todas as regiões geográficas brasileiras foram contempladas. Para o desenvolvimento deste trabalho, além da avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, foram utilizadas ferramentas epidemiológicas mais comumente usadas para este sorovar (lisotipia, perfil plasmidial e PFGE). Das 390 cepas avaliadas neste estudo, 346 apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano, sendo Tetraciclina (85,84 por cento), Nitrofurantoína (67,63 por cento), Cloranfenicol (30,93 por cento) e Ácido Nalidíxico (26,01 por cento) os mais prevalentes. Três cepas apresentaram resistência à ceftriaxona e uma ao imipenem e todas as cepas foram susceptíveis à ciprofloxacina. Foram obtidos 72 perfis de susceptibilidade. O fagotipo prevalente em todos os anos, fontes e regiões geográficas foi o DT193. A multirresistência esteve associada em 44,13 por cento dos isolados deste fagotipo. Também foi caracterizado o fagotipo DT104 multirresistente. Este foi o primeiro relato deste fagotipo no Brasil. Foram caracterizados, no total, 14 fagotipos. Noventa e nove isolados foram submetidos à análise do perfil plasmidial, obtendo-se 28 perfis distintos. Treze isolados humanos foram submetidos à técnica de PFGE com a enzima XbaI. Foram identificados sete perfis de macrorrestrição, sendo encontrada clonalidade entre os isolados testados. / The present study aimed at monitoring the resistance to antimicrobian drugs in 390 isolates of Salmonella Typhimurium from different sources (animal, environmental, alimentary, human and from raw material/feed animal of contamination of the food chain in Brazil, from 1999 to 2003, including all geographic regions of this country. For such, as well as an evaluation of the profile of susceptibility to antimicrobian drugs, the epidemiological tools most commonly employed for this serovar (phage typing, plasmid profile and PFGE) were used. From the 390 isolates evaluated in the present study, 346 showed resistance to at least one antimicrobian drug, the most prevalent of which being Tetracycline (85,84%), nitrofurantoin (67,63%), chloramphenicol (30,93%) and naladixic acid (26,01%). Three isolates showed resistance to ceftriaxone and one to imipenem. All strains were susceptible to ciprofloxacin. A total of 72 profiles of susceptibility were obtained. The prevalent phage type in every year, source and geographic regions was the DT193. A multiresistance was found in 44,13% of the isolates of this phage type. The multiresistant phage type DT104 was also characterized. This was the first report of this phage type in Brazil. A total of 14 phage types were characterized. Ninety-nine isolates were subjected to the analysis of the plasmidial profile, from which 28 distinct profiles were obtained. Thirteen human isolates were subjected to the PFGE technique with the enzyme XbaI. Seven macrorestriction profiles were identified, with clonality having been found among the tested isolates.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-04Bitstream added on 2014-06-13T19:15:41Z : No. of bitstreams: 1 sierraarguello_ym_me_jabo.pdf: 437516 bytes, checksum: abb22bba7e231f6d649f66ef3238046a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Patogenos intestinais são expostos a várias condições de estresse durante o ciclo de infecção. Anaerobiose é uma condição hostil oferecida pelo hospedeiro no intestino e lúmen intestinal, onde a sobrevivência, multiplicação e entrada nas células epiteliais é prioridade para a invasão do agente patogênico. A fumarato reductase (frdABCD), dimetil sulfóxido (DMSO)- Nóxido de trimetilamina (TMAO) reductase (dmsABC), e nitrato reductase (narGHIJ), são genes de Salmonella Typhimurium que codificam enzimas envolvidas na respiração anaeróbica de fumarato, DMSO ou TMAO, e nitrato, respectivamente. Eles são regulados em resposta à disponibilidade de nitrato, oxigênio e a taxa de crescimento celular. A vitamina B12 (cobalamina) é sintetizada por Salmonella Typhimurium em condições anaeróbicas, sendo usado como cofator em quatro reações conhecidas. A deleção dos genes cobS e cbiA inibem a produção de cobalamina. No presente estudo, foi avaliada a infecção de aves por mutantes de STM, com o sistema respiratório comprometido por alterações nos genes narG, napA, cobS, cbiA, frdA, dmsA e torC. Aves de um dia de idade, foram inoculadas com 0.1 mL de cultura de Salmonella Typhimurium contendo 108 UFC/mL, diluída a 10-2 e 10-3. Sinais clínicos e mortalidade foram avaliados durante 21 dias. Em geral, os sintomas das aves infectadas com as cepas mutantes foram semelhantes aos apresentados pelas aves do grupo controle. Com exceção de STM cbiA, os demais mutantes reduziram a capacidade de causar mortalidade em comparação com a cepa original. A mortalidade do grupo de aves infectadas com STM ΔnarG, STM ΔfrdA, STM ΔdmsA e STM ΔcobSΔcbiA, apresentaram diminuição significativa da mortalidade em comparação ao grupo controle (p<0.05) / Intestinal pathogens are exposed to various stress conditions during their infectious cycle. Anaerobiosis, one of such hostile condition, is offered by the host within gut and intestinal lumen, where survival, multiplication and entry into intestinal epithelial cells are priority for the invasion of the pathogen. The fumarate reductase (frdABCD), dimethyl sulfoxide (DMSO)- trimethylamine N-oxide (TMAO) reductase (dmsABC), and nitrate reductase (narGHIJ) operons in Salmonella Typhimurium (STM) encode enzymes involved in anaerobic respiration to the electron acceptors fumarate, DMSO, TMAO, and nitrate, respectively. They are regulated in response to nitrate and oxygen availability and changes in cell growth rate. Vitamin B12 (cobalamin) is synthesized by Salmonella Typhimurium only under anaerobic growth conditions used as a cofactor in four known reactions. The deletion of cobS and cbiA genes prevent any form of cobalamin production. In the present study we evaluate the infection of birds by mutants of STM, with the anaerobic respiratory system committed by mutations in the genes: narG, napA, cobS, cbiA, frdA, dmsA, and torC. Virulence was assessed by oral inoculation of groups of one-day-old broilers with 0.1 mL of culture contained 108 CFU/mL or diluted at 10-3 and 10-2 of strains mutants of Salmonella Typhimurium. Clinical signs and mortality were recorded over a period of 21 days. In general, the symptoms of chickens infected with the mutant strains were similar to those presenting by control birds. Except for STM ΔcbiA, all showed reduced capacity to cause mortality in comparison with the original strain. The mortality of group of chickens infected with STM ΔnarG, STM ΔfrdA, STM ΔdmsA and STM ΔcobSΔcbiA showed significant decrease in mortality compared to control group (p<0.05)

Orientador: Angelo Berchieri Júnior / Banca: Raphael Lucio Andreatti Filho / Banca: Ivens Gomes Guimarães / Resumo: Patogenos intestinais são expostos a várias condições de estresse durante o ciclo de infecção. Anaerobiose é uma condição hostil oferecida pelo hospedeiro no intestino e lúmen intestinal, onde a sobrevivência, multiplicação e entrada nas células epiteliais é prioridade para a invasão do agente patogênico. A fumarato reductase (frdABCD), dimetil sulfóxido (DMSO)- Nóxido de trimetilamina (TMAO) reductase (dmsABC), e nitrato reductase (narGHIJ), são genes de Salmonella Typhimurium que codificam enzimas envolvidas na respiração anaeróbica de fumarato, DMSO ou TMAO, e nitrato, respectivamente. Eles são regulados em resposta à disponibilidade de nitrato, oxigênio e a taxa de crescimento celular. A vitamina B12 (cobalamina) é sintetizada por Salmonella Typhimurium em condições anaeróbicas, sendo usado como cofator em quatro reações conhecidas. A deleção dos genes cobS e cbiA inibem a produção de cobalamina. No presente estudo, foi avaliada a infecção de aves por mutantes de STM, com o sistema respiratório comprometido por alterações nos genes narG, napA, cobS, cbiA, frdA, dmsA e torC. Aves de um dia de idade, foram inoculadas com 0.1 mL de cultura de Salmonella Typhimurium contendo 108 UFC/mL, diluída a 10-2 e 10-3. Sinais clínicos e mortalidade foram avaliados durante 21 dias. Em geral, os sintomas das aves infectadas com as cepas mutantes foram semelhantes aos apresentados pelas aves do grupo controle. Com exceção de STM cbiA, os demais mutantes reduziram a capacidade de causar mortalidade em comparação com a cepa original. A mortalidade do grupo de aves infectadas com STM ΔnarG, STM ΔfrdA, STM ΔdmsA e STM ΔcobSΔcbiA, apresentaram diminuição significativa da mortalidade em comparação ao grupo controle (p<0.05) / Abstract: Intestinal pathogens are exposed to various stress conditions during their infectious cycle. Anaerobiosis, one of such hostile condition, is offered by the host within gut and intestinal lumen, where survival, multiplication and entry into intestinal epithelial cells are priority for the invasion of the pathogen. The fumarate reductase (frdABCD), dimethyl sulfoxide (DMSO)- trimethylamine N-oxide (TMAO) reductase (dmsABC), and nitrate reductase (narGHIJ) operons in Salmonella Typhimurium (STM) encode enzymes involved in anaerobic respiration to the electron acceptors fumarate, DMSO, TMAO, and nitrate, respectively. They are regulated in response to nitrate and oxygen availability and changes in cell growth rate. Vitamin B12 (cobalamin) is synthesized by Salmonella Typhimurium only under anaerobic growth conditions used as a cofactor in four known reactions. The deletion of cobS and cbiA genes prevent any form of cobalamin production. In the present study we evaluate the infection of birds by mutants of STM, with the anaerobic respiratory system committed by mutations in the genes: narG, napA, cobS, cbiA, frdA, dmsA, and torC. Virulence was assessed by oral inoculation of groups of one-day-old broilers with 0.1 mL of culture contained 108 CFU/mL or diluted at 10-3 and 10-2 of strains mutants of Salmonella Typhimurium. Clinical signs and mortality were recorded over a period of 21 days. In general, the symptoms of chickens infected with the mutant strains were similar to those presenting by control birds. Except for STM ΔcbiA, all showed reduced capacity to cause mortality in comparison with the original strain. The mortality of group of chickens infected with STM ΔnarG, STM ΔfrdA, STM ΔdmsA and STM ΔcobSΔcbiA showed significant decrease in mortality compared to control group (p<0.05) / Mestre

Orientador: Igor Polikarpov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T11:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lee_WenHwa_D.pdf: 8676479 bytes, checksum: fe860bf2f06ea88d21a3e1f9f4aa09de (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Yuji Takahata / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T05:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Okamoto_AndreKimura_M.pdf: 9235596 bytes, checksum: c2080072a6edb12399c9deb5463ffb17 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es una de las mayores causas de enfermedad entérica tanto en el hombre como en animales, estimando la OMS que decenas de millones de casos se producen en el mundo cada año. En Chile, la norma de referencia para la detección de este patógeno en productos hidrobiológicos es la norma chilena NCh 2675.Of2002, esta no tiene validación internacional, como si lo tiene la normativa ISO 6579:2002. Este estudio tiene por finalidad implementar y verificar ambos métodos de detección de Salmonella spp. para las matrices alimentarias chorito (Mytilus chilensis) y salmón del Atlántico (Salmo salar), en el Laboratorio de Inocuidad de los Alimentos (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. La verificación de las metodologías se llevó a cabo, siguiendo los pasos descritos en la norma ISO 16140-3. Además, se usó la cepa bacteriana Salmonella Typhimurium, la cual fue confirmada para género y especie en el Instituto de Salud Pública de Chile. En la verificación de ambas metodologías, se logró la detección de un 100% de las muestras contaminadas en el laboratorio, cumpliendo todos los criterios de aceptación descritos en la norma ISO 16140-3 para las matrices analizadas. Los resultados obtenidos demuestran la capacidad del Laboratorio de Inocuidad de los Alimentos, de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile para realizar ambos métodos en las matrices estudiadas, entregando resultados confiables, en la detección de Salmonella spp. en productos hidrobiológicos. Todo esto, verificado a través de estándares dictados por la Organización Internacional de Normalización (ISO). El uso de normas ISO, facilitaría el comercio internacional al proporcionar estándares comunes entre países. / Salmonella spp. is one of the major causes of enteric disease as much in man and animals; the WHO estimates that tens of millions of cases occur each year worldwide. In Chile, the reference standard for detection of this pathogen in seafood products is the Chilean norm Nch 2675.Of2002, which does not have international validation, different from the ISO 6579:2002, which does have. The purpose of this study is to implement and verify both methods of detection of Salmonella spp. for food matrices for mussel (Mytilus chilensis) and Atlantic salmon (Salmo salar), in the Laboratory of Food Safety (LIA), Faculty of Veterinary and Animal Sciences at the University of Chile. Verification methodologies were carried out following the steps described in ISO 16140-3. In addition, the bacterial strain Salmonella Typhimurium, which was confirmed for genus and species at the Institute of Public Health of Chile, was used for the investigation. For the verification of both methods, a detection of a 100% of the samples contaminated in the laboratory was achieved, meeting all acceptance criteria described in ISO 16140-3 standard for matrices analyzed. The obtain results demonstrate the ability of the Laboratory of Food Safety, of the Faculty of Veterinary and Animal Sciences at the University of Chile for both methods in the matrices studied, delivering reliable results, in detecting Salmonella spp . in seafood products . All this, verified through standards issued by the International Organization for Standardization (ISO). The use of ISO standards, facilitate international trade by providing common standards between countries.

Evalúa la expresión relativa de las citoquinas involucradas en la respuesta inmune Th1 y Th2 en 21 cuyes (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente con una cepa aislada de campo de Salmonella Typhimurium a una dosis de 102 UFC/ml vía intraperitoneal y 7 cuyes inoculados con la misma cepa inactivada (grupo control). Se utilizó animales destetados de 15-30 días de edad, sin importar sexo y clínicamente sanos, todos mantenidos en las mismas condiciones en el bioterio de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se agruparon los cuyes en 4 pozas (A, B, C y D) y cada poza con 7 animales cada uno, además se colocaron 2 cuyes centinelas no inoculados. La toma de muestras de sangre y tejidos se realizó lo días 1, 3, 5, 7, 9, 15 y 30 postinoculación, siendo colectados 3 individuos del grupo tratamiento y 1 del grupo control. El aislamiento de los leucocitos sanguíneos se realizó por la técnica del gradiente de Ficoll y la extracción del ARN total de éstas células mediante el uso de Trizol. El ADNc fue sintetizado a partir de las muestras de ARN y luego se desarrolló la PCR en tiempo real con “primers” específicos para las citoquinas en estudio. La expresión relativa fue determinada por el método comparativo 2-ΔΔCt a fin de evaluar la expresión de los ARNm de las citoquinas analizadas con respecto al calibrador (cuy sano), usando como gen constitutivo de referencia al GAPDH. Las expresiones de los genes de todas las citoquinas mostraron un aumento con respecto a los calibradores y un incremento con mayor intensidad con respecto a las expresiones de los cuyes del grupo control; además, una cinética ascendente con respecto a los días post-inoculación, los primeros días hubo predominio de las expresiones del perfil Th1, posteriormente ambas aumentan con predominio final de las citoquinas de la respuesta inmune Th2. El análisis histopatológico y el aislamiento se realizó para confirmar la infección y los animales mostraron las lesiones características de salmonelosis, siendo el hígado el órgano afectado con mayor frecuencia. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú). Fondo para la Innovación, la Ciencia y la Tecnología (FINCyT) / Tesis

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina quinasa (HMPK, EC 2.7.1.49) es una enzima perteneciente a la superfamilia riboquinasa y participa en la biosíntesis de tiamina (vitamina B1) en bacterias. Se ha descrito que esta enzima es capaz de catalizar dos fosforilaciones consecutivas dependientes de ATP altamente específicas sobre el sustrato hidroximetil pirimidina (HMP), generando como producto hidroximetil pirimidina pirofosfato. Esto contrasta notablemente con lo que se ha observado en las piridoxal quinasas de bacterias Gram positivas (HMPK/PLK, EC 2.7.1.35), un grupo de enzimas homólogas cercanas capaces de fosforilar hidroximetil pirimidina, piridoxal, piridoxina y piridoxamina, pero incapaces de catalizar dos fosforilaciones consecutivas, por lo que sólo producen hidroximetil pirimidina fosfato. Las HMPKs no han sido estudiadas tan exhaustivamente como las HMPK/PLKs y sólo hay dos caracterizaciones breves disponibles en la literatura; la de la HMPK de Escherichia coli y la de Bacillus subtilis. Por lo tanto, aún no se conoce si las propiedades observadas en las enzimas descritas son ubicuas para linajes bacterianos distintos, especialmente aquellos filogenéticamente distantes y que han sido sometido a presiones selectivas fuertes, como los extremófilos. Por esta razón, en este trabajo se realizó la caracterización bioquímica de la HMPK de la enterobacteria Salmonella typhimurium (StHMPK) y de la bacteria termófila Thermus thermophilus (TtHMPK). A través de experimentos de estequiometría de reacción y análisis de generación de productos, se demostró que ambas enzimas son capaces de catalizar dos fosforilaciones consecutivas. Experimentos de especificidad de sustrato revelaron que ambas enzimas son altamente específicas por hidroximetil pirimidina. Análisis filogenéticos mostraron que estas enzimas están estrechamente relacionadas con las HMPKs/PLK de organismos gram positivos, y estas últimas parecen ser descendientes directos de las HMPKs. Por lo tanto, para estudiar cómo estos grupos de enzimas han divergido en términos de sus actividades catalíticas, se realizaron simulaciones de dinámica molecular del complejo ternario (Mg·ATP - HMP) de StHMPK, para analizar el sitio de unión a sustrato y compararlo con el de la HMPK/PLK de Staphylococcus aureus (SaPLK). Los resultados mostraron que existe un alto grado de conservación entre ambos sitios, existiendo sólo unas pocas diferencias que podrían explicar la divergencia funcional observada, principalmente la presencia de una treonina adyacente a la base catalítica en StHMPK, que es reemplazada por una alanina en SaPLK, y la presencia de una glutamina en StHMPK que forma puentes de hidrógeno con el HMP. La caracterización cinética de StHMPK y TtHMPK mostró que ambas enzimas poseen una KM similar para HMP (cercana a 30μM) y que la Vmax para TtHMPK es un orden de magnitud menor que para StHMPK a 37 °C. Sin embargo, estos parámetros fueron obtenidos para las curvas de saturación de HMP, las cuales mostraban un comportamiento del tipo Michaelis-Menten, mientras que las curvas de saturación para ATP mostraron una clara desviación de este modelo y por lo tanto, no se pudieron determinar parámetros cinéticos. Finalmente, se realizó una caracterización estructural y biofísica para evaluar diferencias de estabilidad. Ambas enzimas parecen ser monómeros en las condiciones estudiadas, a diferencia de lo reportado para la enzima de E. coli que forma un tetrámero. Experimentos de desplegamiento por temperatura y agentes químicos mostraron que TtHMPK es significativamente más estable que StHMPK. Las bases estructurales de estas diferencias fueron analizadas mediante simulaciones de dinámica molecular, las que revelaron que la proteína termoestable es más rígida, tiene un menor contenido de residuos polares en el núcleo y tiene mayor cantidad de interacciones electrostáticas que su homólogo mesoestable. / 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine kinase (HMPK, EC 2.7.1.49) is a bacterial enzyme that belongs to the ribokinase superfamily and participates in the thiamine (vitamine B1) biosynthetic pathway. It has been described that this enzyme is capable to catalyze two consecutive highly specific ATP dependent phosphorylations on the substrate hydroxymethyl pyrimidine, yielding hydroxymethyl pyrimidine pyrophosphate. This contrast notoriously with what has been observed for the closely related homologous enzymes pyridoxal kinases from Gram positive bacteria (HMPK/PLK, EC 2.7.1.35), which can phosphorylate hydroxymethyl pyrimidine, pyridoxal, pyridoxine and pyridoxamine, but are unable to catalyze two consecutive phosphorylations, thus only produce hydroxymethyl pyrimidine phosphate. HMPKs have not been as extensively studied as HMPKs/PLK, and only two brief biochemical characterizations are available on the literature; the characterization of the HMPK from Escherichia coli and from Bacillus subtilis. Therefore, it is still unknown whether the properties observed in the described enzymes are ubiquitous among different bacterial lineages, especially those that come from a very distinct phylogenetic background and have been subject to strong selective pressures, as the enzymes from extremophilic organisms. For this reason, in this work we address the biochemical characterization of the HMPK from the enterobacteria Salmonella typhimurium (StHMPK) and the thermophilic bacteria Thermus thermophilus (TtHMPK). Through stoichiometric experiments and product generation analysis, it was established that both enzymes are able to perform two consecutive phosphorylations. Substrate specificity experiments revealed that both enzymes are highly specific for hydroxymethyl pyrimidine. Phylogenetic analysis of these enzymes showed that are closely related to HMPKs/PLK from Gram positive organisms, being the later a direct descendant from HMPKs. Therefore, to study how these two groups of enzymes have diverged so much in terms of their catalytic activities, we analysed the substrate binding site of StHMPK by molecular dynamics simulations of the ternary complex (Mg·ATP - HMP) and compared it to the binding site of the PLK from Staphylococcus aureus (SaPLK). The results showed that there is an overall great conservation among the active sites, with just a few differences that could be responsible for the functional divergences observed, mainly the presence of a threonine residue adjacent to the catalytic base in StHMPK which is replaced by an alanine in SaPLK, and the presence of a glutamine that forms hydrogen bonds with the HMP in StHMPK. Kinetic characterization of StHMPK and TtHMPK showed that both enzymes have a similar KM for HMP (around 30 μM) while the Vmax for TtHMPK is one order of magnitude lower than the Vmax for StHMPK. However, these parameters were obtained only for HMP saturation curves, which showed a Michaelis-Menten behaviour, whereas ATP saturation curves displayed a clear deviation from a Michaelis-Menten model and therefore, no kinetic parameters could be deduced from these experiments. Finally, a biophysical and structural characterization to assess stability differences was performed. Both enzymes seem to be in monomeric state under the conditions assayed, in contrast with what was reported for the enzyme from E. coli, which forms a tetramer. Thermal and chemical unfolding experiments showed that TtHMPK is significantly more stable than StHMPK. The structural basis for these differences were investigated through molecular dynamics simulations, which revealed that the thermostable protein is more rigid, has a reduced content of polar amino acids in its core, and has more electrostatic interactions than its mesostable homologous. / Julio del 2019

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Clínica, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Salmonella es un patógeno intracelular capaz de generar cuadros clínicos que incluyen desde una enteritis autolimitada hasta infecciones sistémicas que pueden provocar la muerte del hospedero. Una vez dentro del organismo, la bacteria atraviesa la barrera epitelial intestinal e interactúa con células fagocíticas profesionales del sistema inmune innato, causando una respuesta inflamatoria local que culmina en la excreción del patógeno al medio ambiente. La patogenicidad de Salmonella se debe principalmente a su capacidad de sobrevivir dentro de macrófagos y células dendríticas, los cuales participan como vectores de diseminación dentro del hospedero. Los mecanismos utilizados por esta bacteria para permanecer y replicarse dentro de los macrófagos han sido ampliamente estudiados y descritos en la literatura. Sin embargo, existe escasa información referente a los mecanismos de supervivencia que emplea en otros estadíos de su ciclo de vida. Por ejemplo, en el medio ambiente Salmonella interactúa con otras células fagocíticas eucariontes capaces de alimentarse de bacterias y hongos. Entre ellas destacan las amebas, que utilizan mecanismos de endocitosis y degradación bacteriana similares a los utilizados por células del sistema inmune innato. En esta tesis, nos propusimos identificar un conjunto común de genes requeridos para la supervivencia intracelular de Salmonella Typhimurium en macrófagos murinos y en la ameba Dictyostelium discoideum. Este estudio se realizó mediante el análisis masivo de mutantes bajo selección negativa utilizando distintas genotecas de mutantes. La detección de aquellas mutantes que presentaron defectos en la supervivencia intracelular en ambas células fagocíticas se realizó mediante secuenciación masiva de DNA. En primera instancia, logramos identificar mutantes en 719 genes de S. Typhimurium bajo selección negativa en macrófagos murinos. Entre ellos, se encontraron genes codificados en islas de patogenicidad conservadas dentro Salmonella, genes relacionados con biosíntesis y transporte de aminoácidos y carbohidratos, genes relacionados con reguladores de respuesta a estímulos externos, genes involucrados en la biosíntesis y modificación del lipopolisacárido (LPS) y genes relacionados con estrés nutricional y oxidativo, entre otros. Al comparar estos datos con una base de datos de mutantes con defectos en la supervivencia intracelular en D. discoideum generada en nuestro laboratorio, logramos identificar mutantes en 213 genes de S. Typhimurium que serían necesarios para la supervivencia intracelular del patógeno en ambas células fagocíticas. Dentro de este grupo encontramos genes codificados en islas de patogenicidad conservadas del género Salmonella (SPI-1 y SPI-3), genes involucrados en la captación de hierro (iroC, iroN y feoB), genes relacionados con la respuesta a estrés por hambruna y pH ácido (spoT y adiY) y genes asociados a la biosíntesis y modificación del LPS (waaB, waaI, waaJ, waaL, waaZ, wbaC, wbaK, wbaM, wbaN, wbaD, oafA, wzzfepE y genes del operón arn), entre otros. Con el propósito de confirmar algunas de las predicciones obtenida a partir de nuestro análisis comparativo, se escogieron mutantes relacionadas con la biosíntesis y modificación del LPS y se evaluó su supervivencia intracelular en ambos modelos de infección. Nuestros resultados demostraron que las mutantes ΔwaaL, ΔwzzST y ΔarnBCADTEF presentaron defectos en la supervivencia intracelular en macrófagos murinos y D. discoideum. Por lo tanto, la presencia de un LPS completo que posea 16 a 35 unidades de AgO (L-AgO) sería necesario para la supervivencia de este patógeno en macrófagos murinos y D. discoideum. De igual forma, la modificación del LPS correspondiente a la adición de un grupo 4-aminoarabinosa al lípido A contribuiría a la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en ambas células fagocíticas. En conjunto, los resultados de esta tesis constituyen un primer acercamiento a los mecanismos moleculares empleados por S. Typhimurium para sobrevivir en reservorios tan distintos como mamíferos y protozoos ambientales / Salmonella is an intracellular pathogen that causes a variety of illnesses ranging from self-limiting gastroenteritis to severe systemic infections that can cause the death of the host. Once inside the organism, these bacteria can cross the epithelial barrier and interact with professional phagocytic cells of the innate immune system, causing a local inflammatory response which culminates in the excretion of the pathogen to the environment. The pathogenicity of Salmonella is associated with its ability to survive in macrophages and dendritic cells, which can act as dissemination vectors inside the host. The molecular mechanisms used for these bacteria to survive and replicate in macrophages have been widely studied. However, no in-depth study has been conducted in order to understand the molecular mechanisms required for Salmonella survival in other stages of its life cycle. For instance, in the environment Salmonella interacts with other phagocytic cells that feed on bacteria and fungus. Among these, the amoebae use similar endocytic and degradation mechanisms to those described in innate immune cells. In this thesis, we aimed to identify a common group of genes required for the intracellular survival of Salmonella Typhimurium in murine macrophages and the amoeba Dictyostelium discoideum. To this end, we performed a high-throughput analysis of mutants under negative selection using different mutant libraries. The identification of mutants unable to survive intracellularly in both phagocytic cells was carried out by deep-sequencing. First, we identified 719 mutants of S. Typhimurium under negative selection in murine macrophages. These mutants included genes encoded in pathogenicity islands conserved in the Salmonella genus, genes involved in transport and biosynthesis of amino acids and carbohydrates, genes encoding regulators associated with response to external signals, genes linked to biosynthesis and modification of lipopolysaccharide (LPS) and genes associated to nutritional and oxidative stress, among other. The comparative analysis between the data of this thesis and data obtained in our laboratory that identified mutants with defects in intracellular survival in D. discoideum, allow us the identification of mutants in 213 genes of S. Typhimurium required to survive intracellularly in both phagocytic cells. Within this group, we found genes encoded in Salmonella pathogenicity islands (SPI-1 and SPI-3), genes involved in iron uptake (iroC, iroN and feoB), genes related with response to starvation and acid pH (spoT and adiY) and genes associated to LPS biosynthesis and modification (waaB, waaI, waaJ, waaL, waaZ, wbaC, wbaK, wbaM, wbaN, wbaD, oafA, wzzfepE and genes in the arn operon), among other. To confirm predictions from our comparative analysis, we choose mutants involved in LPS biosynthesis and evaluated their intracellular survival in both infection models. We demonstrated that mutants ΔwaaL, ΔwzzST and ΔarnBCADTEF are deficient in intracellular survival in murine macrophages and D. discoideum. Hence, a complete LPS containing 16 to 35 AgO units (L-AgO) would be necessary for survival of this pathogen in murine macrophages and D. discoideum. Similarly, a modified LPS containing 4-deoxy-aminoarabinose bound to lipid A would contribute to the intracellular survival of S. Typhimurium in both phagocytic cells. Overall, our results constitute a first step towards understanding the molecular mechanisms exploited by S. Typhimurium in order to survive in strikingly different niches such as mammalians and environmental protozoa / Fondecyt; Conicyt