Considerando o melanoma a forma mais agressivas de câncer de pele e mais resistente aos tratamentos convencionais, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade de um novo complexo de platina (II) com derivado de hidantoína (CX42) em células de melanoma humano e murino. Foram utilizados também para comparação células da pele (fibroblastos, queratinócitos e melanócitos) e os compostos cisplatina (CIS) e complexo de hidantoína isolado (NN10). Ensaios de viabilidade, ciclo e morte celular foram realizados. Investigou-se também a atividade da enzima tirosinase, principal enzima que regula a síntese de melanina durante o processo conhecido como melanogênese. Como resultados, obteve-se a diminuição da viabilidade celular e parada de ciclo na fase G0/G1 nas células de melanoma, principalmente na linhagem murina B16F10, frente ao composto CX42. Em células B16F10, foi possível observar estímulo na melanogênese, com aumento da atividade da enzima tirosinase. O CX42 apresentou uma atividade com efeito citostático nas células de melanoma, não sendo observado efeito citotóxico nas células da pele. Ainda, com a prévia estimulação da melanogênese, o CX42 apresentou-se mais efetivo, aumentando a morte celular em 40% por apoptose. Portanto, conclui-se que o CX42 diminuiu a viabilidade celular e seu efeito foi mais intenso quando as células apresentavam-se pigmentadas, demonstrando indução da tirosinase e da morte celular, atributo importante para potenciais novos fármacos anti-melanoma. / Since melanoma is one of the most aggressive forms of skin cancer and more resistant to conventional treatments, the present study aimed to evaluate the activity of a new platinum complex (II) with hydantoin derivative (CX42) in melanoma cells human and murine. Skin cells (fibroblasts, keratinocytes and melanocytes) were used as control and the compounds cisplatin (CIS) and hydantoin compound alone (NN10) were also evaluated. Viability assays, cell cycle analysis and cell death characterization were performed. Likewise, the activity of tyrosinase, the key enzyme that regulates melanin synthesis during the process known as melanogenesis, was also investigated. The results demonstrated a reduction in cell viability and cell cycle arrest in G0/G1 phase of murine melanoma B16F10 treated with CX42. In B16F10 cells, it was also observed melanogenesis stimulation with increased activity of tyrosinase. The CX42 showed a selective cytostatic effect on melanoma cells, however no toxic effects were observed in skin cells. In addition, with prior stimulation of melanogenesis, the CX42 demonstrated to be more effective, increasing apoptosis cell death in 40%. Therefore, the results demonstrated that CX42 decreased cell viability and the intensity of its effect is associated with cell pigmentation, demonstrating an association between tyrosinase high activity and induction of cell death which is an important attribute for new potential anti - tumoral drugs.

Les aurones, qui constituent une sous-classe des flavonoïdes, présentent un profil pharmacologique et un spectre d'activités biologiques prometteurs. Au cours de ce travail, nous avons mis à profit ce potentiel pour la modulation de deux cibles thérapeutiques majeures. En premier lieu, depuis la mise sur le marché d'inhibiteurs de la protéase NS3/4A, l'inhibition de la polymérase NS5B du virus de l'hépatite C représente un enjeu primordial dans la lutte contre cette maladie. L'utilisation des aurones contre cette polymérase trouve ici ses premiers développements. L'évaluation de quatre générations de composés a mené à l'identification de plusieurs dérivés actifs, dont certains produits naturels, présentant un IC50 inférieur à 5 μM. L'étude des interactions ligand - récepteur a en outre permis de déterminer que les aurones se fixent probablement sur le site " Thumb I ". En second lieu, si la modulation de la tyrosinase dans un cadre thérapeutique reste actuellement hypothétique, de nombreuses études voient en cette enzyme une cible pour le traitement futur de pathologies difficilement curables, comme le cancer ou la maladie de Parkinson. Les aurones ont fait preuve lors de ce travail d'une grande versatilité face à la tyrosinase, adoptant au gré des substitutions des comportements très différents de substrat alternatif, d'activateur hyperbolique ou d'inhibiteur mixte. Un modèle cohérent a cependant été proposé, qui regroupe et explique ces comportements. Au cours de ce travail, de nombreux dérivés d'aurone diversement substitués ou modifiés ont été préparés, par le biais de méthodes de synthèse adaptées à la structure de chaque produit formé.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DEFINITIVA c ficha catalografica.pdf: 2149699 bytes, checksum: ebcbff0f45d07e12d12a9708947a59eb (MD5) Previous issue date: 2009-07-15 / Tyrosinase (E.C.1.14.18.1) is an enzyme of industrial interest that catalyses the ohydroxylation of monophenols (monophenolase activity) and the oxidation of o-diphenols to reactive o-quinones (diphenolase activity), both reactions using molecular oxygen. Pycnoporus sanguineus (L. ex Fries) Murril, is a white rot fungi capable of producing tyrosinase and widely distributed in nature. It is found in regions of mild climate and in tropical forest. The production and characterization of tyrosinase from P. sanguineus were investigated. The selection of inductors, determination of the luminosity influence, biomass and culture media in the production of tyrosinase and the effect of inhibitors on enzyme activity were determined. The fungus produced intracellular tyrosinase and the higher activity was observed using 0.15% L-tyrosine as inducer, in the presence of light, with inoculum of 10 mycelium discs, medium malt extract broth 2%, incubation at 30°C, and constant agitation of 150 rpm, during 2 days. 6 mmol.L-1 salicylhydroxamic acid (SHAM) and 6 mmol.L-1 phenylthiourea (PTU) inhibited 100% of the tyrosinase activity. 0.1 mmol.L-1 sodium azide inhibited 4.15% of tyrosinase activity, while no inhibition was observed after addition of 0.1 mmol.L-1 of phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). Using L-dopa as substrate, the intracellular crude extract presented optimum pH of 6,6, optimum temperature of 45°C, low stability at 50°C, maintaining about 50% of the activity after 15 min of incubation. The tyrosinase production was confirmed by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, using commercial fungal tyrosinase as positive control / A tirosinase (E.C.1.14.18.1), também conhecida como polifenoloxidase ou catecolase, é uma enzima de interesse industrial que catalisa a o-hidroxilação de monofenóis (atividade monofenolase) e a subseqüente oxidação do o-difenol resultante em o-quinonas reativas (atividade difenolase), usando oxigênio molecular. O Pycnoporus sanguineus (L. ex Fries) Murril, um fungo de decomposição branca (white rot) capaz de produzir a tirosinase, é amplamente distribuído na natureza, sendo encontrado em regiões de clima mais ameno e em florestas tropicais. A produção e caracterização da tirosinase produzida por P. sanguineus foi investigada. Foi realizada seleção de indutores, determinação da influência da luminosidade, biomassa e meios de cultura na produção de tirosinase, bem como o efeito de inibidores sobre a atividade enzimática. O extrato bruto enzimático foi caracterizado quanto ao pH ótimo, temperatura ótima e termoestabilidade. Os resultados obtidos demonstraram que o fungo produziu tirosinase intracelular e a mais alta atividade ocorreu com a utilização de 0,15% de L-tirosina como indutor, na presença de luz, com inóculo de 10 discos de micélio fúngico, meio caldo extrato de malte 2%, incubação à 30°C e agitação de 150 rpm, durante 2 dias. Ácido salicilhidroxâmico (SHAM) 6 mmol.L-1 e feniltiouréia (PTU) 6 mmol.L-1 inibiram 100% da atividade de tirosinase. Azida sódica 0,1 mmol.L-1 inibiu 4,15% da atividade de tirosinase, enquanto nenhuma inibição foi observada após adição de fluoreto de fenilmetanosulfonil (PMSF) 0,1 mmol.L-1. Utilizando a L-dopa como substrato, o extrato bruto intracelular apresentou pH ótimo de 6,6, temperatura ótima de 45°C, baixa estabilidade à temperatura de 50°C, mantendo apenas cerca de 50% de atividade após 15 minutos de incubação. A produção da tirosinase foi comprovada através de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, tendo como controle positivo tirosinase fúngica comercial

A coloração dos vertebrados deve-se a presença de pigmentos, sintetizados e/ou armazenados em células denominadas células pigmentares cutâneas. A mudança de cor nos vertebrados é principalmente regulada por α-MSH e uma família de enzimas melanossômicas, que incluem tirosinase e as proteínas relacionadas à tirosinase 1 e 2 (TRP-1 e TRP-2, respectivamente). Sua ação está ligada à dispersão dos melanossomos ou síntese de melanina, processos que resultam em escurecimento do animal, enquanto a agregação ou inibição de síntese leva ao seu empalidecimento. Opsinas, como a melanopsina e a rodopsina, além de presentes na retina, podem ser expressas em células pigmentares cutâneas, intermediando foto-respostas de proliferação e de dispersão de melanossomos. O objetivo deste trabalho foi investigar a expressão temporal da rodopsina, tirosinase e do receptor MC1R, bem como os efeitos do tratamento com α-MSH 10-7 M, 10-8 M e 10-9 M por 24 horas sobre esses parâmetros, em melanócitos B16 de Mus musculus, mantidos em escuro constante. Através de PCR em tempo real (quantitativo) demonstrou-se que α-MSH 10-7 M não modula os níveis de mRNA para o receptor MC1R quando comparado com o grupo controle, contudo há uma evidente tendência de redução dos níveis do transcrito. Todavia, na concentração de 10-8 M, observou-se um aumento estatisticamente significativo no nível do transcrito na hora 20 quando comparado ao grupo controle e na concentração de 10-9 M o tratamento mostrou uma diminuição estatisticamente significativa no nível do transcrito entre o grupo controle e o tratado para cada ponto temporal analisado. Para a rodopsina, foi demonstrado que &alpha-MSH 10-7 M modula os níveis do mRNA quando comparado ao grupo controle, mostrando uma diminuição estatisticamente significativa na hora 0 e 16. Na concentração de 10-8 M houve um aumento estatisticamente significativo nos níveis do transcrito na hora 4 quando comparado ao grupo controle. Já, na concentração de 10-9 M, o hormônio induziu um robusto aumento no nível do transcrito quando comparado ao grupo controle para cada ponto temporal analisado. Nossos resultados são pioneiros em demonstrar a modulação de rodopsina por α-MSH, pois não há dados na literatura, seja em retina ou em outros tecidos, que tenham investigado essa ação do hormônio melanotrópico. O mesmo padrão foi observado para a tirosinase, demonstrando uma diminuição estatisticamente significativa na concentração de 10-7 M na hora 0 e um aumento significativo na concentração de 10-8 M na hora 8 e na concentração de 10-9 M na hora 12 e 8. Através de PCR em tempo real (quantitavo) nós demonstramos que α-MSH apresenta uma modulação dose-dependente para o transcrito do mRNA do receptor MC1R, tirosinase e rodopsina, mas não sincronizou a expressão desses genes, que permaneceram arrítmicos / In vertebrates, skin color is given by pigments, synthesized and/or stored in cutaneous pigment cells. The vertebrate color change is mainly regulated by α-MSH and a family of melanosome enzymes, which includes tyrosinase and tyrosinaserelated proteins 1 and 2 (TRP-1 and TRP-2, respectively). α-MSH action is associated with melanosome dispersion or melanin synthesis, processes which lead to skin darkening, whereas melanin aggregation or synthesis inhibition results in skin lightening. Opsins, such as melanopsin and rhodopsin, may be expressed in skin pigment cells, besides being present in the retina, and mediate non visual photoresponses such as cell proliferation and melanosome dispersion. The aim of this study was to investigate the temporal expression of rhodopsin, tyrosinase and the receptor MC1R, as well as the effects of 10-7 M, 10-8 M and 10-9 M α-MSH for 24 hours in Mus musculus B16 melanocytes, kept in constant darkness. Using real time PCR (quantitative) we demonstrated that 10-7 M α-MSH does not modulate MC1R mRNA levels, as compared to the control group, although a tendency to reduction was evident. On the other hand, at the concentration of 10-8 M, we observed a statistically significant increase of the transcript level at the hour 20, as compared to the control group and at the concentration of 10-9 M the treatment showed a statistically significant decrease of the transcript level for each temporal point analyzed. For rhodopsin, we showed that 10-7 M α-MSH modulates mRNA levels, as compared to the control group, demonstrating a statistically significant decrease at the hour 0 and 16. At the concentration of 10-8 M there was a statistically significant increase of transcript levels at the hour 4, as compared to the control group. The hormone at 10-9 M induced a robust increase of the transcript levels, as compared to the control group, for each time point analyzed. Our results are pioneering in demonstrating the regulation of rhodopsin by α-MSH, since there are no data in the literature which report the action of melanotropic hormone on rhodopsin in either the retina or other tissues. Similar pattern was observed for the tyrosinase gene, demonstrating a statistically significant decrease in the concentration of 10-7 M at the hour 0 and a significant increase in the concentration of 10-8 M at the hour 8 and in the concentration of the 10-9 M at the hour 12 and 8. Using real time PCR (quantitative) we demonstrated that α-MSH shows a dose-dependent modulation for mRNA transcripts of the MC1R receptor, tyrosinase and rhodopsin, but the hormone was not able to synchronize the expression of these genes, which remained arhythmic

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina. / Melanin is a polymer consisting of a large heterogeneity of monomers having as a common feature the presence of indole groups. Contrarily, eumelanin produced by enzymatic oxidation of tyrosine is a simpler polymer consisting mainly of 5,6-dihidroxindol (DHI) and indole-5,6-quinone (IQ) monomers. Tyrosinase is the key enzyme in melanin production, and its kinetic activity is measured by the formation of the intermediate dopacroma. Nanoparticles (NPs) are made of silica nanoparticles of silicon oxide and are obtained by sol-gel method developed by Stöber of hydrolysis and condensation of tetraethylorthosilicate (TEOS), using ethanol as solvent in an alkaline medium. NPs were functionalized with 3-Aminopropyltriethoxysilane (ATPES) and then with glutaraldehyde. The latter allows the immobilization of tyrosinase on the silica surface. We characterized NPs before and after the reaction of the enzyme, the catalytic activity of the enzyme bound to the NP and melanin-forming mechanisms on the silica surface. NPs were characterized by absorption spectrophotometry and reflectance, electron microscopy and thermogravimetric analysis. The synthesis of silica NP returned spherical particles of 55nm diameter and particle functionalization showed efficiently modify its surface. The immobilization of tyrosinase by covalent bond was 99.5% versus 0.5% by physical adsorption. The activity of tyrosinase was characterized by the formation of dopacroma. The Km of the immobilized enzyme did not change compared to the free tyrosinase, but the catalytic efficiency - considering the recovered efficiently - was only 1/3 for the enzyme covalently bound, meaning that 2/3 of the enzymes are not connected active. We obtained melanin coated NPs from tyrosine oxidation in two preparations: NP with covalently bound tyrosinase in the NP surface and NP functionalized with glutaraldehyde dispersed in DHI and IQ solution. The melanin coating was in the form of a thin film with the thickness of ~ 1,9 nm, giving light absorption profile equivalent to that of melanin itself. We showed that the polymerization mechanism involves the oxidation of tyrosine by tyrosinase, which generates oxidized intermediates (especially DHI and lQ) that go into solution (even when tyrosinase is covalently bound to the silica). These intermediates bind the glutaraldehyde and the surface of the silica begins to function as an environment for melanin polymerization.

Nowdays there is a plethora of evidence for H2O2-mediated oxidative stress in the epidermis as well as in the system in patients with vitiligo (for review see (Schallreuter, Bahadoran et al. 2008). Xanthine dehydrogenase / xanthine oxidase (XDH / XO) catalyses the oxidative hydroxylation of hypoxanthine to xanthine followed by xanthine to uric acid, the last two steps in purine degradation pathway. Under oxidative conditions, XDH is converted to XO. The reactions catalysed by this enzyme generate H2O2 and O2 ¿- , yielding in the presence of ROS accumulation, allantoin from uric acid. Therefore XO has been considered a major biologic source of oxygen-derived free radicals in many organs. The presence of XO in the human epidermis has not been shown so far. In this study several techniques were utilised to nail the presence and activity of XO in epidermal melanocytes and keratinocytes. The enzyme is regulated by H2O2 in a concentration dependent manner, where concentrations of 10-6M upregulate activity. Importantly, the results showed that the activity of XO is little affected by H2O2 in the mM range. H2O2-mediated oxidation of tryptophan and methionine residues in the sequence of XO yields only subtle alterations in the enzyme active site. These findings are in agreement with enzyme kinetics in the presence of 10-3M H2O2. Since uric acid is the end product of XO activity and this can be oxidised to allantoin by H2O2, we wanted to know whether allantoin is formed in the epidermis of patients with vitiligo. In order to address this issue, we utilised HPLC/mass spectrometry analysis. Analysis of epidermal cell extracts from suction blister tissue identified the presence of allantoin in patients with acute vitiligo, while this product was absent in healthy controls. In conclusion, our results provide evidence for functioning epidermal XO in the human epidermis which 4 can be a major source for the production of H2O2 contributing to oxidative stress in vitiligo. In addition, this thesis also demonstrates for the first time the presence of XO in melanosomes, and we showed that both 7BH4 and 7-biopterin inhibit XO activity in a concentration dependent manner. Moreover, XO has the potential to bind to 6/7BH4 and 6/7-biopterin from the pterin/tyrosinase inhibitor complex. This discovery adds another receptor independent mechanism for regulation of tyrosinase within the melanocyte similar to ¿/ß-MSH as shown earlier (Moore, Wood et al. 1999; Spencer, Chavan et al. 2005). Since the entire epidermis of patients with vitiligo is under H2O2-mediated oxidative stress, oxidative DNA damage would be highly expected. This thesis shows for the first time that epidermal 8-oxoG levels as well as plasma level of this oxidised DNA base are significantly increased in patients compared to healthy controls. We have shown that epidermal cells from patients with vitiligo respond to oxidative DNA damage via the overexpression of p21 and Gadd45¿ leading to a functioning increased short-patch base-excision repair (BER), while increased apoptosis can be ruled out due to lower caspase 3 and cytochrome c response compared to healthy controls. Our results show that patients develop effective DNA repair machinery via hOgg1, APE1 and DNA polymeraseß. Taking into consideration that these patients do not have an increased prevalence for solar-induced skin cancers, our data suggest that BER is a major player in the hierarchy to combat H2O2-mediated oxidative stress preventing ROS-induced tumourigenesis in the epidermis of these patients.

No / The biochemistry of hair pigmentation is a complex field involving a plethora of protein and peptide mechanisms. The in loco factory for melanin formation is the hair follicle melanocyte, but it is common knowledge that melanogenesis results from a fine tuned concerted interaction between the cells of the entire dermal papilla in the anagen hair follicle. The key enzyme is tyrosinase to initiate the active pigmentation machinery. Hence, an intricate understanding from transcription of mRNA to enzyme activity, including enzyme kinetics, substrate supply, optimal pH, cAMP signaling, is a must. Moreover, the role of reactive oxygen species on enzyme regulation and functionality needs to be taken into account. So far our knowledge on the entire hair cycle relies on the murine model of the C57BL/6 mouse. Whether this data can be translated into humans still needs to be shown. This article aims to focus on the effect of H2O2-redox homeostasis on hair follicle pigmentation via tyrosinase, its substrate supply and signal transduction as well as the role of methionine sulfoxide repair via methionine sulfoxide reductases A and B (MSRA and B).

Problemas dermatológicos relacionados com a pigmentação resultam em hiperpigmentações ou hipopigmentação cutâneas. Produtos cosméticos e farmacêuticos com atividade despigmentantes são utilizados para o tratamento de pacientes que apresentam distúrbios de hiperpigmentação. Os despigmentantes atualmente utilizados não são totalmente eficazes ou seguros, razão pela qual há intensa pesquisa, principalmente em países asiáticos, com a finalidade de se obter novos agentes com esta ação, em especial, inibidores de enzimas envolvidas na melanogênese como a tirosinase. Considerando-se que algumas substâncias obtidas de plantas apresentam essa atividade, a flora brasileira constitui-se uma fonte potencial de obtenção de novos despigmentantes. No presente trabalho, 24 extratos aquosos e 23 extratos orgânicos de plantas da Floresta Amazônica, 01 aquoso e 01 orgânico da Mata Atlântica, foram avaliados quanto à inibição da tirosinase, pelo método enzimático, com leitura espectrofotométrica. Do total de 49 extratos testados, 09 mostraram atividade. Estes extratos foram retestados e os valores de concentração da atividade inibitória 50%(AI 50%), determinados. O mais ativo foi o extrato orgânico de Ruprechtia sp com AI 50% de 33,76µg/mL, seguido do extrato orgânico de Rapanea parviflora com AI 50% de 64,19µg/mL. / Dermatological disorders related to pigmentation result in cutaneous hyperpigmentation or hipopigmentation. Cosmetic and pharmaceutical products with despigmentant activity are used for the treatment of patients who have hyperpigmentation disorders. Nowadays, skin whitening agents are not to tally effective and safe, reason for intense researches in order to obtain new agents with action especially ones which inhibit enzymes involved in melanogenesis like tirosinase, mainly in Asian countries. Since some substances from plants have this activity, the flora of Brazil is a potential source of new skin whitening agents. In this study 24 aqueous extracts and 23 organic ones of plants from Amazonian region, and 1 aqueous extracts and 1 organic extract from Atlantic Forest were tested to inhibition of tirosinase using enzymatic method with photometric reader. Out of the 49 tested extracts, 9 showed activity in the screening. These extracts were tested again and 50% tyrosinase inhibitory activity concentration (IA 50%) was calculated. The most activite of them was the organic extract of Ruprechtia sp with IA 50% 33,76µg/mL and the organic extract of Rapanea parviflora with IA 50% 64,19µg/mL.

Neste trabalho, apresentamos a eletrossíntese de um novo polímero condutor derivado do polipirrol (PPI) funcionalizado com um grupo carboxílico, o polipirrol-2-ácido carboxílico (PPI-2-COOH), e o seu uso como transdutor amperométrico em biossensores pelo uso da polifenol oxidase (PFO). São apresentadas todas as etapas de síntese e de caracterização dos filmes poliméricos em microeletrodos e o preparo e a resposta dos biossensores montados para a detecção de um composto fenólico. Nossos estudos sobre eletrossíntese, respostas eletroquímicas dos filmes, juntamente com resultados de microgravimetria e modelagem molecular de dímeros e trímeros derivados de PI-2-COOH, permitiram com que pudéssemos sugerir pela primeira vez um mecanismo de eletropolimerização deste monômero em meio não aquoso. Na caracterização dos filmes por espectroscopia in situ no UV-visível e infravermelho próximo foram observadas duas bandas idênticas às transições pi-pi* características dos filmes de PPI no seu estado neutro e de maior dopagem, confirmando a possibilidade de haver duas conformações na cadeia do PPI-2-COOH. Com a modelagem molecular de um oligômero formado a partir da oxidação do PI-2-COOH, verificamos que para cada 4 anéis heterocíclicos acoplados entre si na posição 4-5, um par de anéis se encontrava em um plano diferente do segundo par de anéis, mantendo este padrão em toda a extensão da cadeia polimérica. A resposta redox dos filmes nos permitiu observar a preferência do polímero pela entrada de cátions em sua estrutura. Nos espectros de FTIR também comprovamos a presença do grupo carboxílico na estrutura do polímero, o que permitiu uma imobilização enzimática por ligação covalente. A confecção de microeletrodos destinados para a análise por injeção em fluxo (FIA) nos possibilitou uma economia de reagentes, praticidade e boa reprodutibilidade das medidas. Os biossensores amperométricos obtidos pela imobilização covalente da PFO sobre filmes de PPI-2-COOH apresentaram um pH ótimo de funcionamento em 9,4 e um potencial ótimo de trabalho em +70 mV vs Ag/QRE. Finalizamos nosso trabalho obtendo as respostas amperométricas dos biossensores para a detecção de um composto fenólico, pirocatecol, com uma linearidade entre as concentrações de 5x10-4 até 2,5x10-2 mol/L. / In this work, we present the electrochemical synthesis of a new conducting polymer derived of polypyrrole (PPI) functionalized by carboxylic group, the polypyrrole-2-carboxylic acid, and its application as amperometric transducer in biosensor by use of polyphenol oxidase (PFO). All the steps of syntheses and characterization of the polymer film in microelectrodes and response of the biosensor build for detection of phenolic compost. Our study about electrosyntheses, electrochemical response of the films (PPI-2-COOH) together with microgravimetry result and the molecular modeling of dimer and trimer derived from PI-2-COOH allowed one to suggest, for the first time, the mechanism of electropolymerization of this monomer in non-aqueous medium. When the technique of in-situ ultraviolet-visible spectroscopy (UV-VIS in-situ) was observed two bands, identical to the transition pi-pi* which are characteristics of the PPI films on their neutral state and of bigger doping, confirming the possibility that there may be two conformations in the PPI-2-COOH chain. With the molecular modeling of an oligomer formed by PI-2-COOH oxidation, we verified that for each four heterocyclic ring coupled together in the position 4-5, there´s a pair of rings, maintaining this pattern in all the extension of the polymeric chain. The redox response through the electrochemical measurement we could observe in FTIR the polymer preference for the cations adsorption. On the FTIR measurements, we could also observe the presence of the carboxylic group in the polymers structure, which is needed for the enzymatic immobilization by covalent binding. The fabrication of the microelectrode destined to flow injection analysis (FIA), made possible not only to save a lot of reagents, but also demonstrated praticity in the experimental set up and good reproducibility of results. Hence, the obtaining of amperometric biosensor by covalent binding of PFO on the PPI-2-COOH film, presented good pH in 9.4 and great work potential in +70 mV vs Ag/AgCl. We finish the work with the amperometric response of the biosensor in the detection of pyrocatechol, forming a straight line between the concentrations of 5x10-4 to 2.5x10-2 mol/L.

Problemas dermatológicos relacionados com a pigmentação resultam em hiperpigmentações ou hipopigmentação cutâneas. Produtos cosméticos e farmacêuticos com atividade despigmentantes são utilizados para o tratamento de pacientes que apresentam distúrbios de hiperpigmentação. Os despigmentantes atualmente utilizados não são totalmente eficazes ou seguros, razão pela qual há intensa pesquisa, principalmente em países asiáticos, com a finalidade de se obter novos agentes com esta ação, em especial, inibidores de enzimas envolvidas na melanogênese como a tirosinase. Considerando-se que algumas substâncias obtidas de plantas apresentam essa atividade, a flora brasileira constitui-se uma fonte potencial de obtenção de novos despigmentantes. No presente trabalho, 24 extratos aquosos e 23 extratos orgânicos de plantas da Floresta Amazônica, 01 aquoso e 01 orgânico da Mata Atlântica, foram avaliados quanto à inibição da tirosinase, pelo método enzimático, com leitura espectrofotométrica. Do total de 49 extratos testados, 09 mostraram atividade. Estes extratos foram retestados e os valores de concentração da atividade inibitória 50%(AI 50%), determinados. O mais ativo foi o extrato orgânico de Ruprechtia sp com AI 50% de 33,76µg/mL, seguido do extrato orgânico de Rapanea parviflora com AI 50% de 64,19µg/mL. / Dermatological disorders related to pigmentation result in cutaneous hyperpigmentation or hipopigmentation. Cosmetic and pharmaceutical products with despigmentant activity are used for the treatment of patients who have hyperpigmentation disorders. Nowadays, skin whitening agents are not to tally effective and safe, reason for intense researches in order to obtain new agents with action especially ones which inhibit enzymes involved in melanogenesis like tirosinase, mainly in Asian countries. Since some substances from plants have this activity, the flora of Brazil is a potential source of new skin whitening agents. In this study 24 aqueous extracts and 23 organic ones of plants from Amazonian region, and 1 aqueous extracts and 1 organic extract from Atlantic Forest were tested to inhibition of tirosinase using enzymatic method with photometric reader. Out of the 49 tested extracts, 9 showed activity in the screening. These extracts were tested again and 50% tyrosinase inhibitory activity concentration (IA 50%) was calculated. The most activite of them was the organic extract of Ruprechtia sp with IA 50% 33,76µg/mL and the organic extract of Rapanea parviflora with IA 50% 64,19µg/mL.