In this thesis we have attempted to study four basic aspects of DNA-protein interactions: Affinity, specificity, accessibility and kinetics. With NF-kB as our model transcription factor, we wanted to investigate how a particular dimer recognizes a specific binding sequence? How fast are these interactions? And finally, how does the NF-kB interact with it binding site in the chromatin context? Specificity of NF-kB-DNA interactions has recently come into focus after it was shown that these dimers can bind to the sequences which do not fall into the NF-kB general consensus motif. We studied seven such sequences for their specificity for four NF-kB dimers. Our results show that p50 homodimers are least discriminative and can bind specifically to all these sequences. While as, RelA homodimers were highly discriminative and did not bind to most of these nontraditional sequences. We used two different methods to measure binding affinities: traditional gel mobility shift assay (EMSA) and a novel technique called as UV laser footprinting. Our results show that UV laser footprinting is the better method to determine the binding constants.For studying the dynamics of NF-kB-DNA binding, we combined UV laser footprinting with stopped flow device. This combination, not only give us one base pair resolution but also milli-second time resolution. Using p50 homodimers as a model transcription factor, we showed that the binding of this factor follows a two-step mechanism. First step involves the fast recognition of the sequence and second step follows a slower kinetics most likely for the stabilization of the complex. Our experiments suggest that flanking sequences play a role in the recognition and stabilization process of the complex formation.Finally, we also studied the accessibility of nucleosomes to NF-kB. Our in vitro data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. These include either a removal of H2A-H2B dimers from the nucleosome and/or chromatin remodeler induced relocation of the histone octamer.Our data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. We hypothesize that some factors like PU.1 might be able to target the chromatin remodeling/dimer eviction machinery to particular nucleosomes and lead to productive binding of NF-kB.

Cette thèse présente une étude des propriétés optiques et de la photofragmentation de biomolécules en phase gazeuse. Les expériences sont effectuées sur un piège ionique quadripolaire couplé avec des lasers UV-Visible accordables en longueur d'onde. Les molécules sont isolées en phase gazeuse au centre du piège puis irradiées par le faisceau laser. Pour les molécules polyanioniques, le canal de relaxation principal après excitation laser est l'émission d'électron. Cette perte d'un électron conduit à la formation d'un ion radicalaire. Une partie de ce travail est consacrée à l'étude de la relaxation de molécules polyanioniques après excitation laser et notamment aux mécanismes conduisant à la perte d'électron. Les expériences de photodétachement réalisées à Lyon ont été complétées par des expériences de spectroscopie de photoélectron effectuées à Karlsruhe (Pr. Kappes). La production d'anions radicalaires a un potentiel analytique important. L'un des objectifs de ce travail de thèse a été d'étudier la réactivité de ces ions radicalaires et de montrer l'intérêt de leur fragmentation pour l'analyse structurelle de peptides. L'autre objectif était de sonder les propriétés électroniques de protéines et de peptides en phase gazeuse. Pour cela, le taux de détachement d'électron a été enregistré en fonction de la longueur d'onde du laser. Nous avons notamment pu déterminer des signatures optiques pour des chromophores neutres, déprotonnés ou radicalaires au sein des protéines. Ces résultats ont été comparés à des calculs théoriques (TD DFT). / This manuscript discusses optical properties and photofragmentation of gas phase biomolecules. These experiments are performed with a quadrupolar ion trap coupled to a UV-visible tunable laser. Molecules are isolated at the center of the trap, and irradiated by the laser beam. The most intense relaxation channel observed for multiply negatively charged ions is electron emission. This loss of one electron leads to radical anion formation. The first part of this manuscript is dedicated to the study of the mechanisms leading to the electron loss. Photodetachment experiments performed in Lyon were completed by photoelectron spectroscopy experiments performed in Karlsruhe (Pr. Kappes). The radical anion production has an important analytical potential. One of the main objectives of this work was to study the reactivity of this radical anion and to show the interest of radical fragmentation for the structural analysis of peptides. An other objective was to probe electronical properties of gas phase peptides and proteins. The electron detachment yield is recorded as a function of laser wavelength. We have determinated optical fingerprints for neutral, deprotonated and radical chromophores localized in the heart of proteins. These results are compared to computational methods (TD DFT).

Roughly 123 million people worldwide are affected by conditions such as epilepsy, dementia, and cardiovascular diseases. Wearable electrodes are currently used to monitor these conditions short-term. Long-term monitoring would allow for predicting seizures and could be used as a preventive treatment. As opposed to the currently used electrodes, wearables that are intended for long-term use must be soft and flexible in order not to cause harm or discomfort for the user. The electrodes should also have high resolution, meaning that the electrode paths should be as narrow as possible without negatively affecting the performance of the electrode. In this thesis, soft and flexible electrode grids based on silicones are developed using UV laser patterning. Two different methods are evaluated: laser curing of silicones with the addition of a photoinitiator, and laser ablation of conductive composite. The results found in this thesis are that photocuring silicones gives a too low resolution to be useful for patterning soft electrode grids. UV laser ablation on the other hand showed high resolution while the electrodes retained stretchability. / <p>Examensarbetet är utfört vid Institutionen för teknik och naturvetenskap (ITN) vid Tekniska fakulteten, Linköpings universitet</p>

Electronic devices define our everyday lives. They are often large, rigid, and brittle. Modern medical science has come so far as to start using miniature electronic devices to monitor many types of diseases. Especially, neurological disorders pose obstacles hard to overcome when treating them but it also motivates finding methods that allow for continuous monitoring. Implementing a small electronic device inside the human body adds requirements on the device to be stretchable, biocompatible, and more. Not only is the device limited by these factors, but also, current fabrication methods are not efficient for creating nanoscale versions for these types of devices. patterninglaser ablation is a growing field for cutting out and pattern nano-materialistic devices with high precision and good repeatability. This project is focused on using a laser engraving tool from metaquip on different substrates. This project is focused on the development of methods for laser fabrication of soft neural electrodes. The requiered steps are the alignment of samples to assure good precision when engraving it with the laser engraving tool, that also will be called “laserpatterner”, finding good parameters for cutting out devices and pattern conductors for said devices. On top of that, a linear force stretching will be used to characterize samples that were cut, in the form of strips, using the laserpatterner. The stretching behavior of strips consisting of the elastomer polydimethylsiloxane, which in turn will be the insulator for silver nanowires, is examined in the stretching setup. Parameter optimization is relevant in all experiments done in this project and lay the foundations for cutting and patterning silver nanowires devices. All factors included will eventually lead to a good method for fabricating soft neural electrode devices and this project is stepping stone towards that goal. / <p>Examensarbetet är utfört vid Institutionen för teknik och naturvetenskap (ITN) vid Tekniska fakulteten, Linköpings universitet</p>

The use of beam-based technologies to process optical elements with nanoscale precision enables the fabrication of freeform surfaces. Especially, atmospheric pressure plasma jets (APPJ) have desirable properties such as atmospheric pressure machining, dry processing, and direct writing capabilities. However, the presence of metal oxides in optical glasses leads to the formation of nonvolatile reaction products during APPJ etching with fluorine-containing gas mixtures, forming a residual layer that increases surface roughness and alters etching behavior. To prevent the formation of the residual layer, the APPJ process is combined with laser cleaning. For a possible future in situ cleaning of the residual layer during the plasma process, laser parameter ranges need to be found to remove the residual layer without damaging the glass surface. Therefore, planar etchings are performed by APPJ on N-BK7 and Zerodur and the etched planes are subsequently laser irradiated with varying pulse numbers and fluences. The processed samples are then examined by scanning electron microscopy. For both N-BK7 and Zerodur, a parameter range is identified that results in clean surfaces. The best machining results are achieved with 2–16 pulses and laser fluences of 0.6–1.2 J cm−2 for N-BK7 and 0.56–0.7 J cm−2 for Zerodur.

In dieser Arbeit wurde eine einfache laserspektroskopische Messmethode für lokale elektrische Feldstärken im Hinblick auf ihre Messmöglichkeiten und -grenzen untersucht. Als empfindliche optische Feldsensoren dienen dabei Wasserstoffatome, für die die Stark-Aufspaltung der Spektrallinien im elektrischen Feld wohl bekannt und exakt berechenbar ist. Die experimentellen Untersuchungen wurden an einer Niederdruck-Gaszelle durchgeführt, in der ein elektrisch geheizter Wolframdraht für thermische Dissoziation von Wasserstoffmolekülen sorgte. Die Wasserstoffatome wurden durch zwei gegenläufige Laserstrahlen Doppler-frei angeregt. Die Durchstimmung der schmalbandigen Laserstrahlung über den Wellenlängenbereich der Zwei-Photonen-Resonanz lieferte direkt das vom elektrischen Feld hervorgerufene Stark-Spektrum des angeregten Zustands. Weil die Methode im Gegensatz zu ähnlichen, erheblich aufwendigeren Verfahren nur die niedrigsten Wasserstoff-Energieniveaus benutzt, die mit Zwei-Photonen-Anregung direkt aus dem Grundzustand erreichbar sind, kommt sie mit einem einzigen Laser aus. Für das erste angeregte Niveau mit n = 2 wird Strahlung bei 243 nm benötigt, das nächsthöhere Niveau mit n = 3 erfordert 205 nm. Für n = 2 wurden Untersuchungen an Wasserstoff und Deuterium durchgeführt und Stark-Spektren mittels optogalvanischer Detektion gemessen. Schwerpunkt der Arbeit waren aber die Messungen an Wasserstoff für n = 3, bei denen zusätzlich Balmer-alpha-Fluoreszenz im Sichtbaren zur Detektion eingesetzt werden konnte. Bei elektrischen Feldern bis 200 V/cm wurden Stark-Spektren für drei verschiedene Polarisationszustände der Laserstrahlung aufgenommen. Als Ergebnis konnte jeweils ein Paar isolierter Stark-Komponenten in den Spektren identifiziert werden, dessen gut messbarer Frequenzabstand durch Vergleich mit theoretischen Werten die Bestimmung der elektrischen Feldstärke ermöglicht. / A method for electric field measurements that observes the Stark spectra of the low excited levels n = 2 and n = 3 of atomic hydrogen has been explored in this work. As advantage these levels can be excited Doppler-free from the ground state by a single laser and the highly resolved Stark spectra are easy to understand and to be calculated. Good sensitivity of electric field measurements is achieved with specially designed solid state laser systems, which provide tuneable pulsed UV radiation with a high pulse peak-power and a narrow bandwidth needed for Doppler-free two-photon excitation. Using hydrogen and deuterium the Stark spectra of the n = 2 level are detected as optogalvanic signal. For three different cases of laser polarization the n = 3 spectra of hydrogen are measured simultaneously with optogalvanic and laser induced Balmer alpha fluorescence detection. Electric fields down to 200 V/cm can be determined from the Stark spectra of n = 2 level, while the spectra of n = 3 level enable measurements of electric fields as small as 50 V/cm in each of the three cases of laser polarization.

Dans cette thèse nous avons étudié quatre aspects fondamentaux de l’interaction ADN-protéine, notamment : l’affinité, la spécificité, l’accessibilité et la cinétique. En particulier, nous avons adressé les questions suivantes : comment un dimer du facteur de transcription NF-kB reconnait spécifiquement sa séquence d’ADN-cible, quelle est la rapidité de ces interactions, comment NF-kB interagit avec son site de fixation dans le contexte de la chromatine? Récemment, la spécificité de l’interaction NF-kB – ADN a reçu une attention particulière après l’observation que NF-kB peut se lier à des séquences qui n’entrent pas dans la classification de ses motifs « consensus ». Nous avons étudié la spécificité d’interaction de sept de ces motifs avec quatre dimers de NF-kB. Nos résultats montrent que le homo-dimer p50 sont les moins discriminatives et peuvent s’associer spécifiquement avec ces sept séquences. Par contre, les homo-dimers RelA se sont révélés hautement discriminatives ne pouvant pas s’associer spécifiquement avec ces séquences. Pour mesurer l’affinité de l’interaction nous avons utilisés deux méthodes distinctes : le traditionnel gel de retard (EMSA) et une nouvelle technique – « l’empreinte » au laser UV. Nos résultats montrent que le deuxième approche est plus approprié pour la mesure des constantes spécifiques de dissociation.Pour étudier la dynamique de l’interaction NF-kB – ADN, nous avons couplé l’empreinte au laser UV avec un appareil de mélange-rapide à façon. Cette combinaison nous a permis d’atteindre une résolution spatiale d’un nucléotide et temporaire de quelques millisecondes. Nous avons montré que l’homo-dimer p50 s’associe avec sa séquence-cible (MHC) H2 en suivant une cinétique à 2 pas. Le premier, de durée ~100 ms, reflète une reconnaissance initiale rapide, tandis que le deuxième, de durée ~1s, reflète une stabilisation lente du complexe. Nos expériences suggèrent aussi que les séquences voisines du site de reconnaissance jouent aussi un rôle dans la stabilisation du complexe.Finalement, nous avons étudié aussi l’accessibilité du nucléosome pour le NF-kB. Nos données in vitro montre que l’invasion spécifique de l’ADN à l’intérieure du nucléosome par NF-kB nécessite une perturbation majeure de la structure du nucléosome telle que l’éviction d’au moins un dimer d’histones H2A-H2B. / In this thesis we have attempted to study four basic aspects of DNA-protein interactions: Affinity, specificity, accessibility and kinetics. With NF-kB as our model transcription factor, we wanted to investigate how a particular dimer recognizes a specific binding sequence? How fast are these interactions? And finally, how does the NF-kB interact with it binding site in the chromatin context? Specificity of NF-kB-DNA interactions has recently come into focus after it was shown that these dimers can bind to the sequences which do not fall into the NF-kB general consensus motif. We studied seven such sequences for their specificity for four NF-kB dimers. Our results show that p50 homodimers are least discriminative and can bind specifically to all these sequences. While as, RelA homodimers were highly discriminative and did not bind to most of these nontraditional sequences. We used two different methods to measure binding affinities: traditional gel mobility shift assay (EMSA) and a novel technique called as UV laser footprinting. Our results show that UV laser footprinting is the better method to determine the binding constants.For studying the dynamics of NF-kB-DNA binding, we combined UV laser footprinting with stopped flow device. This combination, not only give us one base pair resolution but also milli-second time resolution. Using p50 homodimers as a model transcription factor, we showed that the binding of this factor follows a two-step mechanism. First step involves the fast recognition of the sequence and second step follows a slower kinetics most likely for the stabilization of the complex. Our experiments suggest that flanking sequences play a role in the recognition and stabilization process of the complex formation.Finally, we also studied the accessibility of nucleosomes to NF-kB. Our in vitro data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. These include either a removal of H2A-H2B dimers from the nucleosome and/or chromatin remodeler induced relocation of the histone octamer.Our data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. We hypothesize that some factors like PU.1 might be able to target the chromatin remodeling/dimer eviction machinery to particular nucleosomes and lead to productive binding of NF-kB.

Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur l'étude, la conception et le développement de deux nouveaux prototypes de reconstruction tridimensionnelle, spécifique aux objets transparents. La numérisation 3D d'objets opaques est abondamment traitée dans la littérature et de nombreux systèmes sont d'ailleurs commercialisés. Cependant, lorsqu'il s'agit de la numérisation 3D d'objets transparents, les publications se font rares et aucun système de scanning n'existe sur le marché. La technique de numérisation de surfaces transparentes demeure compliquée et non maîtrisée à l'heure actuelle. L'opacification de la surface avant le scanning s'avère être la solution retenue dans le domaine du contrôle qualité. Néanmoins, cette alternative n'est pas optimale en raison du coût de traitements et du manque de précision éventuellement engendré. Afin de solutionner les problèmes de la numérisation d'objets transparents, nous avons développé deux approches dites non conventionnelles en étendant les méthodes existantes (dans le visible) aux longueurs d'onde dans lesquelles les sujets apparaissent opaques (IR et UV). Les deux méthodes de mesure sans contact retenues sont : - la reconstruction par polarisation dans l'IR, en vue de s'affranchir des problèmes d'inter-réflexions; - le scanning par laser UV, pour satisfaire les contraintes industrielles (précision, rapidité et coût) tout en résolvant de manière efficace le problème de réfraction. La première approche est fondée sur la réflexion spéculaire de l'objet dans l'IR tandis que la seconde exploite la propriété de l'objet à fluorescer sous l'irradiation UV. L'inexistence des lentilles télécentriques dans l'IR nous a conduits à adapter la reconstruction par polarisation dans l'IR à l'aide d'une lentille non télécentrique. Pour ce faire, une méthode d'approximation du modèle orthographique a été développée et une méthode de validation visant à améliorer la précision des résultats a été en outre intégrée dans le processus de reconstruction après l'étape d'estimation des paramètres de Stokes. Nos résultats sont très satisfaisants et attestent la faisabilité de la reconstruction par polarisation dans l'IR. Quatre configurations de système de scanning par triangulation ont été déployées afin d'exploiter la propriété de fluorescence des objets transparents irradiés sous un rayonnement UV. Des expérimentations visant à caractériser la fluorescence induite à la surface des objets considérés et à vérifier l'éligibilité de notre approche ont été menées. Les mesures spectroscopiques nous ont permis d'élaborer des critères de "tracking" (détection et localisation) des points fluorescents en présence des bruits inhérents à l'acquisition. Nous avons également mis au point des méthodes de validation des paramètres du modèle de reconstruction 3D estimés lors de la calibration, permettant ainsi d'optimiser la configuration du système de scanning. Les méthodes de "tracking" et de validation ont contribué considérablement à l'amélioration de la précision des résultats. Par ailleurs, la précision obtenue n'a jamais été atteinte au regard de ce que l'on trouve dans la littérature. / Two non-conventional methods for the 3D digitization of transparent objects via non-contact measurement are reported in this thesis. 3D digitization is a well acknowledged technique for opaque objects and various commercial solutions based on different measurement approaches are available in the market offering different types of resolution at different prices. Since these techniques require a diffused or lambertian surface, their application to transparent surfaces fails. Indeed, rays reflected by the transparent surface are perturbed by diverse inter-reflections induced by the refractive properties of the object. Therefore, in industrial applications like quality control, the transparent objects are powder coated followed by their digitization. However, this method is expensive and can also produce inaccuracies. Among the rare methods suggested in the literature, shape from polarization provides reliable results even though their accuracy had to be improved by coping with the inter-reflections. The two proposed solutions handle the extension of the existing methods to wavelengths beyond visible ranges: - shape from polarization in Infra Red (IR) range to deal with the above-mentioned inter-reflections; - scanning by Ultra Violet (UV) laser (based on triangulation scheme) to overcome the refraction problem that can be feasibly applied in industrial applications. The characteristic physical properties of transparent objects led us to explore the IR and UV ranges; since, transparent glass has strong absorption bands in the IR and UV ranges and therefore has opaque appearance. The first approach exploits the specular reflection of the considered object surface in IR and the second one exploits the fluorescence property of the object when irradiated with UV rays. Shape from polarization traditionally based on telecentric lenses had to be adapted with non-telecentric lenses to be used in the IR range. Thus, an approximation of the orthographic model is developed in this thesis while a validation method is implemented and integrated in the reconstruction process after Stokes parameters estimation, in order to improve the accuracy of the results. Some results of digitized objects are presented, which prove the feasibility of the shape from polarization method in the IR range to be used for transparent objects. A total of four configurations of the triangulation system are implemented in this thesis to exploit fluorescence produced by the UV laser scanning of the second approach. Experimental investigations aimed at characterizing the fluorescence are done. A specific fluorescence tracking method is carried out to deal with the inherent noise in the acquisitions. The uniqueness of the method relies on the criteria that are derived from the analysis of spectroscopic results. A validation method is made to optimize the configuration system while reducing the accuracy of reconstruction error. The results of some object digitization are presented with accuracies better than previously reported works.

L’utilisation des semi-conducteurs à large bande interdite (wide bandgap ou WBG) tels que le carbure de silicium SiC, le nitrure de gallium GaN, le diamant, etc… s’est répandue dans le domaine de l’électronique de puissance ces dernières décennies. Leurs caractéristiques électroniques et mécaniques font des WBGs des solutions alternatives pour remplacer le traditionnel silicium. Cependant, des études supplémentaires sont indispensables pour améliorer la tenue en tension, les pertes statiques et dynamiques et les performances en fonctionnement à haute température des composants WBGs. Dans ce cadre, deux bancs expérimentaux OBIC (Optical Beam Induced Current) spécifiques « en cours de développement » sont mis en place pendant cette thèse. L’OBIC consiste à éclairer avec un faisceau laser de longueur d’onde appropriée une jonction polarisée en inverse, des porteurs de charge sont alors créés par absorption photonique. On peut alors mesurer un courant induit par faisceau optique (OBIC) lorsque les porteurs sont générés dans la zone de charge d’espace. Après une première phase de préparation et d’adaptation de l’environnement expérimental, des essais ont mené à la démonstration du principe de génération multi-photonique en éclairant une jonction SiC avec un faisceau vert (532 nm). L’analyse des différentes mesures OBIC nous a permis de construire une image du champ électrique à la surface de la diode : une analyse non destructive pour étudier l’efficacité des protections périphériques des jonctions et pour détecter les défauts dans la structure cristalline. Egalement, la durée de vie des porteurs minoritaires a été déduite par l’analyse de la décroissance du courant OBIC au bord de la jonction. Les coefficients d’ionisation sont également déterminés par la méthode OBIC, ces coefficients sont des paramètres clés pour la prévision de la tension de claquage des composants. Nous avons réalisé des mesures OBIC dans le GaN, et nous avons observé un effet d’absorption bi-photonique dans le diamant avec un faisceau UV (349 nm). / In the last few decades, the use of wide bandgap (WBG) semiconductors (silicon carbide SiC, gallium nitride GaN, diamond, etc…) has become popular in the domain of power electronics. Their electronic and mechanical characteristics made of the WBGs a good alternative to the traditional silicon. However, additional studies are mandatory to improve the breakdown voltage, static and dynamic losses, and the performance at high temperature of the WBG devices. In this context, two specific experimental benches OBIC (Optical Beam Induced Current) -under development- are set up during this thesis. OBIC method consists to generate free charge carriers in a reverse biased junction by illuminating the device with an appropriate wavelength. An OBIC signal is measured if the charge carriers are generated in the space charge region. After a first phase of preparation and adaptation of the experimental environment, OBIC measurements led to demonstrate the multi-photonic generation by illuminating a SiC junction with a green laser (532 nm). OBIC measurements allowed giving an image of the electric field at the surface of the diode: OBIC presents a non-destructive analysis to study the efficiency of the peripheral protection and to detect the defects in the semi-conductor. Minority carrier lifetime was also deduced by studying the OBIC decrease at the edge of the space charge region. Ionization rates were extracted using OBIC method; these coefficients are key parameters to predict the breakdown voltage of the devices. OBIC measurements were also realized on the GaN, and two-photon generation was highlighted by measuring an OBIC current in the diamond when illuminating it with a UV laser beam (349 nm).

科学研究費補助金 研究種目:一般研究(A) 課題番号:63420036 研究代表者:後藤 俊夫 研究期間:1988-1990年度