Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-05-30T22:18:31Z No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-06-05T18:39:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-05T18:39:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Dengue é uma importante arbovirose causada pelo vírus do dengue (DENV; Família Flaviviridae, Gênero Flavivirus). Notável aumento no número de casos de dengue e dengue hemorrágica foi registrado nas Américas. Neste estudo foi descrito a diversidade de sequências de diferentes genomas completos de DENV-1 e a inferência filogenética de vírus isolados na América. Dois isolados brasilienses (Distrito Federal, Brasil) de DENV-1 foram identificados em testes utilizando anticorpo policlonal e monoclonal. Os vírus foram amplificados in vitro em células C6/36 de Aedes albopictus. O RNA genômico desses isolados (DF01 e DF02) foram amplificados usando pares de oligonucleotídeos específicos para DENV-1 por RT-PCR. O genoma foi dividido em três fragmentos de cDNA que se sobrepõem e os cDNA amplificados foram clonados em pCR4-TOPO. O DNA plasmidial foi purificado e a sequência de nucleotídeos determinada. DF01 e DF02 foram completamente sequenciados e suas sequências comparadas a um grupo de dados representativo da diversidade genotípica americana de DENV-1 e a um isolado de Singapura, geneticamente distinto dos genótipos de circulação americana. Embora sejam observadas consideráveis diferenças em sequências de aminoácidos presentes em regiões importantes, vários elementos chaves (sítios de glicosilação, pontes disulfeto e sequências características a domínios funcionais de proteínas) foram completamente conservados. Análises filogenéticas indicaram a existência de um grupo monofilético dividido em dois sub-grupos na população de DENV-1 circulante na América Latina, relacionando a sua distribuição geográfica. Foram descritos três potenciais eventos de recombinação entre os isolados analisados, um destes ocorreu no novo vírus identificado DF01. Nossas análises de sequências genômicas completas de populações geograficamente estruturadas e com baixa diversidade na América Latina produziram forte evidência de recombinações relativamente difundidas. Os clones obtidos com fragmentos genômicos de DENV-1 utilizados no estudo, foram transferidos para um vetor modificado para o possível desenvolvimento de cDNA infeccioso. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dengue is an important arboviral disease caused by dengue viruses (DENV; Family Flaviviridae, Genus Flavivirus). A dramatic increase in the number of dengue fever and hemorrhagic dengue cases had been reported in the American continent. In this work we describe the diversity found in full-length DENV-1 sequences and phylogenetic inference of dengue virus isolated in Americas. Two DENV-1 isolates form Brasília (Federal District, Brazil), were identified using polyclonal and monoclonal antibody-assay. The viruses were amplified in vitro in an Aedes albopictus C6/36 cell line. Genomic RNA of those isolates (DF01 e DF02) were amplified using specific primer pairs for DENV-1 by RT-PCR. The genome was divided into three overlapping cDNA fragments, and amplified cDNA was linked into pCR4-TOPO. Plasmid DNA was purified and nucleotide sequences were determined. DF01 and DF02 were completely sequenced and compared to a data set of full genomic sequence of DENV-1, that represent the genotypic diversity of this serotype, and one sequence from Singapura, used as outgroup. Although our genetic analyses revealed considerable differences at protein levels, several key elements (i.e. disulfide bridges, glycosylation sites and protein functional domains) were fully conserved. Phylogenetic analysis indicated the existence of one monophyletic Latin American cluster (LA) which could in turn be divided into two major sub-clusters, characterized by a geographical subdivision. We found three recombination events among all DENV examined sequences, one of the new full length genome described here was apparently recombinant. Our analysis of full genome sequences samples of DENV-1 population geographically structured and with low-diversity in Latin American has yielded strong evidence of relatively pervasive recombination. The clones obtained with DENV-1 subgenomic fragments used in this study, were transferred into lowcopy plasmid modified for the possible construction of an infectious cDNA clone.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 414.pdf: 7133398 bytes, checksum: f3c34dbc03132f760978a32309a5b7ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é uma doença causada por um flavivírus, representado por quatro sorotipos distintos (DENV1-4). Entre as proteínas virais, ENV e NS1 contribuem fortemente com o processo de resposta imune desencadeado pelo vírus. Os principais sistemas de diagnóstico utilizam a detecção de anticorpos através da técnica Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA, a qual, embora útil, apresenta inúmeras limitações (custo, tempo de processamento, entre outros). Neste trabalho, nós desenvolvemos ensaios multiplex de microarranjos líquidos para ENV e NS1. Sequências de aminoácidos codificantes das proteínas, provenientes de cepas isoladas da América Latina foram selecionadas em bancos de dados públicos, alinhadas para a geração das respectivas sequências consenso e construção dos antígenos recombinantes. As sequências obtidas foram otimizadas para expressão bacteriana, submetidas à síntese comercial e clonadas em vetores de expressão procarióticos. Os antígenos foram expressos e validados através de ensaios de microarranjos líquidos, com obtenção de promissores resultados, especialmente para as proteínas ENV (domínios I/II) sorotipo 1 e 2, com potencial aplicação comercial. Este trabalho desenvolveu ainda metodologia para renaturação de NS1 com excelente rendimento. Os resultados das proteínas produzidas neste trabalho foram de forma geral superiores aos obtidos por antígenos comercialmente disponíveis para a proteína ENV de dengue vírus, utilizando a mesma metodologia. As proteínas NS1 foram ainda utilizadas para imunização de coelhos e produção de anticorpos policlonais, que se mostraram bem sucedidos para aplicações em ensaios de imunofluorescência, western blot, citometria de fluxo e como anticorpo de detecção para ensaios quantitativos para a proteína NS1 por ELISA de captura. Os resultados obtidos neste projeto foram considerados extremamente promissores, com potencial aproveitamento no desenvolvimento de testes diagnósticos comerciais com alta precisão, rápidos e com baixo custo

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 205.pdf: 1189300 bytes, checksum: c37aa0ffee9705ba62589fa1555f712c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública global que põe em risco cerca de 2,5 bilhões de pessoas no mundo, com uma incidência de 50-100 milhões de casos resultando em cerca de 24.000 mortes por ano. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente após o contato do hospedeiro com os antígenos virais, levando à secreção de interferon do tipo I (IFN-I), a principal citocina envolvida na resposta antiviral. Entender como o sistema IFN-I é inibido em células infectadas pelo vírus dengue pode fornecer valiosas informações sobre a patogênese da doença. Propomos neste estudo analisar a inibição da via de sinalização do IFN-I por diferentes cepas isoladas no estado de Pernambuco, assim como o desenvolvimento de um vírus recombinante da dengue expressando a proteína Gaussia luciferase, para estudos futuros de replicação e imunopatogênese. A fim de estudar a via de sinalização do IFN-I, foram selecionadas cepas dos quatro sorotipos de dengue para crescimento, concentração e titulação viral. Foi utilizada a linhagem celular BHK-21-ISRE-Luc-Hygro que expressa o gene firefly luciferase fusionado a um promotor induzido pelo IFN-I (ISRE - Interferon Stimulated Response Element). Observamos que todos os sorotipos em estudo foram capazes de inibir, em diferentes proporções, a resposta ou sinalização do IFN-I. Com o intuito de auxiliar as pesquisas em dengue, desenvolvemos um vírus repórter de dengue expressando o gene repórter da Gaussia luciferase. Células transfectadas com o transcrito in vitro de um dos clones resultou em imunofluorescência positiva, porém não houve recuperação de partículas infectivas. Outros clones deverão ser testados para recuperação de vírus recombinante repórter. Juntos, os dados da caracterização das cepas em estudo e a recuperação de partículas infectivas da construção realizada neste trabalho deverão contribuir para as pesquisas em imunopatogênese, replicação viral e desenvolvimento de antivirais contra o dengue

Dengue é uma doença viral que atinge vários países, infectando milhares de pessoas anualmente. Sua transmissão ocorre pelo repasto sanguíneo feito pelas fêmeas dos mosquitos Aedes sp. infectadas e seus sintomas tem um amplo espectro de variação, que vão desde quadros assintomáticos até quadros graves com hipovolemia, podendo levar a óbito. A necessidade de adaptação do vírus a sistemas tão distintos (inseto e mamífero) restringe o espectro de variabilidade que o mesmo pode adquirir, permitindo que o vírus se adapte a ambos os hospedeiros com eficiência replicativa semelhante. Estudos com outros flavivírus já mostraram que a aquisição de variabilidade ocorre de maneiras distintas no hospedeiro mamífero e no inseto vetor, permitindo ao vírus máxima adaptação nas células infectadas. Levando em consideração estes estudos, este trabalho investigou a adaptação de duas cepas do vírus da dengue, a ACS-46, não neurovirulenta para camundongos adultos e a cepa JHA, neurovirulenta para camundongos adultos. O estudo foi feito utilizando cultura de células de mosquito (C6/36), cultura de células de mamífero (HepG2) e infecção em cérebro de camundongos neonatos. Utilizando sequenciamento de nova geração, foi possível verificar as mutações adquiridas ao longo de passagens em cada sistema de cultura. Foram realizadas 20 passagens seriadas em célula C6/36 e seis passagens alternadas entre C6/36 e HepG2. Os vírus obtidos na décima sexta e vigésima passagens do modelo seriado e na quarta e sexta passagens do modelo alternado foram completamente sequenciados utilizando a plataforma de sequenciamento em larga escala Ion Torrent. A análise das sequências revelou duas populações virais claramente distintas, já observadas a partir de décima sexta passagem, identificadas através da deleção de dois códons no sítio de glicosilação do domínio I da proteína de Envelope. Essa deleção induziu aumento na fusão do vírus à célula de mosquito, visto que a partir dessa passagem houve aumento no efeito citopático do vírus e na carga viral produzida durante infecções em células de mosquito. Contudo, essa mutação teve um perfil deletério em células humanas, fato deduzido pelo total desaparecimento da população com a deleção durante as passagens alternadas. Além desta deleção, foram detectadas sete mutações não sinônimas em região de proteínas não estruturais com porcentagens muito próximas, sugerindo que as mesmas fazem parte de uma mesma população. A cepa JHA teve seu caráter neurovirulento perdido após 29 passagens em C6/36, porém rapidamente recuperado após uma única passagem em cérebro de camundongo neonato. O sequenciamento dos vírus dessas passagens mostrou certa variabilidade em sítios distintos entre as variantes do vírus parental, vírus não neurovirulento e vírus neurovirulento passado em camundongo. Esse resultado indicou que aparentemente, não há sítios específicos determinantes de neurovirulência em DENV2, ao menos no nosso modelo, mas sim, um conjunto de mutações podem levar ao fenótipo neurovirulento, a depender das condições as quais o vírus é exposto. / Dengue is a viral disease that affects several countries, infecting thousands of people annually. It is transmitted by blood meal of the female Aedes sp mosquitoes infected. Symptoms have a wide range of variation, ranging from asymptomatic to severe symptoms, including hypovolemia and death. The need for adaptation in such distinct systems (insect and mammalian) restricts the variability that the viruses can acquire, allowing them to adapt to both hosts with similar replicative efficiency. Studies performed with other flaviviruses have shown that acquisition of variability occurs differently between the mammalian host and the insect vector, allowing the virus to adaptat in both systems. Therefore, this study investigated the adaptation of two strains of dengue virus, the ACS-46, not neurovirulent for adult mice and JHA strain, which is neurovirulent for adult mice. The study was done using mosquito cells culture (C6/36), mammalian cells (HepG2) and in vivo infection in newborn mouse brain. Using next-generation sequencing, we analyzed the mutations acquired over passages in each culture system. Twenty serial passages were conducted in C6/36 cells and six alternate passages between C6/36 and HepG2. Viruses obtained in the sixteenth and twenty passages from the serial experiment and the fourth and sixth passages from alternate model were completely sequenced using the next generation sequencing platform Ion Torrent. Sequence analysis revealed two clearly distinct viral populations observed from the sixteenth passage identified by deletion of two codons in the glycosylation site in the envelope protein domain I. This deletion led to increased fusion of the virus to mosquito cell, since the cytopathic effect increased from this passage to next as well as the viral load. However, this mutation had a deleterious profile in human cells since the mutated population was vanished during the alternate passages. It was also identified seven non-synonymous mutations in the region of nonstructural proteins with very similar percentages, suggesting that they belong to the same population. JHA strain lost the neurovirulent characteristic after 29 passages in C6/36, but quickly recovered it after a single passage in newborn mouse brain. The sequencing of the virus of these passages showed some variability in different sites among the parental virus, not neurovirulent viruses and neurovirulent virus after the single passage in mice. These data indicated that apparently there is no specific determinants of neurovirulence in DENV2, at least in our model, but rather a set of mutations can lead to neurovirulent phenotype, depending on the conditions in which the virus is exposed.

A dengue é uma infecção viral sistêmica, autolimitada, transmitida para os humanos através da picada de mosquitos fêmeas infectadas do gênero Aedes sp. Trata-se de uma doença com grandes impactos na economia e na saúde pública, e estima-se que entre 50 a 100 milhões novas infecções ocorram anualmente em mais de 100 países. A dengue é causada pelo Dengue virus (DENV), um vírus pertencente à família Flaviviridae, com genoma composto de uma única molécula de RNA, fita simples com polaridade positiva. A infecção pelo DENV pode ser assintomática ou apresentar diferentes manifestações clínicas, como febre do dengue (FD), febre hemorrágica do dengue (FHD) e Síndrome do Choque do dengue (SCD). Dados da literatura indicam que algumas infecções virais podem causar alterações epigenéticas em seus hospedeiros, principalmente a metilação do DNA. Assim, o propósito deste trabalho foi investigar a influência da infecção pelo DENV no perfil global de metilação dos pacientes, através da técnica de MethELISA, e analisar o padrão de metilação no promotor dos genes fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon gama (IFN-γ). Os resultados obtidos indicam uma tendência na diminuição do percentual relativo de metilação após a infecção pelo DENV, sugerindo uma influência da infecção viral nos mecanismos epigenéticos do hospedeiro. Observou-se também uma maior taxa de desmetilação do promotor do TNF-α dos pacientes infectados em relação ao grupo controle. Em relação ao IFN-γ, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene entre os dois grupos analisados. A meta-análise de microarranjos de DNA obtidos de pacientes infectados pelo DENV indica um aumento na expressão dos genes da Timina DNA Glicosilase (TDG) e das DNA Metiltransferases 1 e 3 (DNMT1 e DNMT3) nos pacientes infectados. Estes dados sugerem que o DENV é capaz de interferir com os mecanismos epigenéticos do hospedeiro. / Dengue fever is a systemic viral infection, self-limited, transmitted to humans through the bite of infected female mosquito from Aedes genus. It is a disease with major impacts on the economy and public health, and it is estimated that between 50 to 100 million new dengue infections occur annually in more than 100 countries. Dengue fever is caused by Dengue virus (DENV), a single strand positive sense RNA virus belonging to the Flaviviridae family. The DENV infection may be asymptomatic or present different clinical manifestations, such as dengue fever (DF), hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS). Published data indicate that some viral infections can cause epigenetic changes in their hosts, especially in the DNA methylation. Thus, the aim of this study was to investigate the influence of DENV infection in global methylation profile of DENV infected patients by MethELISA technique, and analyze the pattern of methylation in the promoter of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interferon gamma (IFN-γ) genes. The results obtained show a decrease the relative methylation percentage after DENV infection, suggesting an influence of viral infection in the epigenetic mechanisms of the host. There was also detected a higher rate of demethylation of TNF-α promoter in infected patients if compared to the control group. No difference was found in the methylation frequency between the two analyzed groups regarding the IFN-γ promoter. Meta-analysis of DNA microarray indicates that patients infected with DENV shows an increase in the expression of Thymine DNA Glycosylase (TDG) and DNA methyltransferases 1 and 3 (DNMT1 and DNMT3) genes, all involved in epigenetic regulation. So, these data indicated that DENV is able to interfere with the host epigenetic mechanisms. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-26T18:51:42Z No. of bitstreams: 1 nieli_rc_faria_ioc_mt_0004_2010.pdf: 2864802 bytes, checksum: c145add19e57c3ab4fb2c9dd01632d8e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-26T18:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nieli_rc_faria_ioc_mt_0004_2010.pdf: 2864802 bytes, checksum: c145add19e57c3ab4fb2c9dd01632d8e (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz / A epidemiologia do dengue mudou dramaticamente nos últimos 50 anos, especialmente nas regiões tropicais do mundo. No Brasil, o dengue tem sido um problema de saúde pública desde a sua introdução nos anos 80. Estudos filogenéticos constituem uma ferramenta importante para monitor a introdução e a dispersão dos vírus, assim como predizer as potenciais conseqüências epidemiológicas destes eventos. Com o objetivo de realizar a caracterização molecular e análise filogenética de cepas de DENV-2 isoladas no país durante vinte anos de circulação viral, cepas isoladas de pacientes infectados e apresentando diferentes manifestações clínicas (n=34), representantes de seis estados do país (RJ, ES, BA, RN, CE e RS), do período compreendido entre 1990 e 2010 foram seqüenciadas. Em 25 cepas foi realizado o sequenciamento dos genes C/prM/M/E e em 9 foi realizado o sequenciamento completo do genoma (região codificante). A análise da similaridade entre os DENV-2 com cepas de referência identificou a formação de dois grupos epidemiologicamente distintos: um formado por cepas isoladas entre os anos de 1990 a 2003 e outro por cepas entre 2007 e 2010. Todas as cepas analisadas neste estudo possuem uma asparagina (N) em E390, previamente caracterizada como um provável determinante genético desencadeador de FHD detectado em cepas de origem asiática. Não foram observadas diferenças consistentes entre as seqüências dos genes codificantes das cepas dos diferentes casos clínicos de dengue, sugerindo que a gravidade da doença seja multifatorial e que, não se deve apenas as diferenças observadas no genoma viral. Os resultados obtidos referentes à caracterização do genoma completo dos DENV-2 de diferentes casos clínicos não apontaram diferenças consistentes que pudessem estar associadas a um quadro mais grave da doença. Sugere- se, porém, que a ocorrência de infecção secundária tenha sido um fator de risco ao desenvolvimento dos casos graves e fatais. A análise filogenética baseada no sequenciamento parcial ou completo do genoma caracterizou DENV-2 como pertencentes ao genótipo do Sudeste Asiático, porém com uma segregação em duas linhagens distintas sustentada por um “bootstrap” de 100%. A análise filogenética independente de cada gene sugeriu com um suporte de “bootstrap” de 100% que todos os genes estruturais (C, prM/M e E) e não–estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) podem ser utilizados para a genotipagem dos DENV-2. Contudo, a árvore filogenética baseada na análise de prM/M foi incapaz de discriminar corretamente a segregação do genótipo do Sudeste Asiático nas duas linhagens distintas. Ficou caracterizado que as cepas do período pré-emergência (1990-2003) pertencem ao genótipo do Sudeste Asiático, Linhagem I e as cepas isoladas após a re-emergência deste sorotipo em 2007, pertencem ao genótipo Sudeste Asiático, Linhagem II. O percentual de similaridade destas cepas com a cepa isolada na República Dominicana em 2001 combinado ao percentual de divergência com as cepas introduzidas no país na década de 90 sugere que estes vírus não sofreram uma evolução local, e sim uma introdução no país de uma linhagem viral distinta provavelmente importada do Caribe. / Dengue epidemiology has changed dramatically in the last 50 years, especially in the tropical regions of the world. In Brazil, dengue has been a major public health problem since its introduction in the 80`s. Phylogenetic studies constitute an valuable tool to monitor the introduction and spread of viruses as well as to predict the potential epidemiological consequences of such events. Aiming to perform the molecular characterization and phylogenetic analysis of DENV-2 during twenty years of viral activity in the country, viral strains isolated from patients presenting different disease manifestations (n=34), representing six states of the country (RJ, ES, BA, RN, CE e RS), from 1990 to 2010 were sequenced. Partial genome sequencing (genes C/prM/M/E) was performed in 25 DENV-2 strains and full-length genome sequencing (coding region) was performed in 9 strains. The percentage of similarity among the DENV-2 strains in this study and reference strains available in Genbank identified two groups epidemiologically distinct: one represented by strains isolated from 1990 to 2003 and one from strains isolated from 2007 to 2010. All DENV-2 strains analyzed in this study presented an aspargin (N) in E390, previously identified as a probable genetic marker of virulence observed in DHF strains from Asian origin. No consistent differences were observed on coding region from the different clinical manifestations analyzed, suggesting that if the disease severity has multifactorial, it is not only due to the differences observed on genome region viral. The results obtained by the DENV-2 full-length genome sequencing did not point out consistent differences related to a more severe disease either. However, it is suggested that secondary infections may be implicated as a risk factor for a more severe disease and fatal outcome. Phylogenetic analysis based on the partial or complete genome sequencing has characterized the brazilian DENV-2 from this study as belonging to the Southeast Asian genotype, however a distinction of two clades within this genotype has been identified and supported by a bootstrap of 100%. The phylogeny based on the analysis of individual genes suggested with a bootstrap of 100% that all structural (C, prM/M and E) and non- structural genes (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5) may be used for DENV-2 genotyping. However, the phylogenetic tree generated from the analysis of the prM/M gene was unable to correctly discriminate the two clades observed for the Southeast Asian genotype. It was established that strains circulating prior DENV-2 emergence (1990-2003) belong to Southeast Asian genotype, clade I and strains isoladed after DENV-2 emergence in 2007 belong to Southeast Asiant genotype, clade II. The percentage of identity of the latter with the Dominican Republic strain isolated in 2001 combined to the percentage of divergence with the strains first introduced in the country in the 90 ́s suggests that those viruses did not evolved locally but were due to a new viral clade introduction in the country from the Caribbean.

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 536.pdf: 12060845 bytes, checksum: 5af1c56abad31cc9c82bc99e14652b56 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é um problema de Saúde Pública em termos de morbidade e mortalidade, sendo reconhecida em mais de 100 países. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina encontra sua dificuldade na imunopatogênese da doença, fazendo-se necessária a construção de uma vacina tetravalente que seja capaz de imunizar contra os quatro sorotipos do vírus, em diferentes faixas etárias, sem elicitar o efeito deletério da febre hemorrágica do dengue. Para isto, novas tecnologias têm sido utilizadas no lugar dos sistemas de atenuação e inativação viral. Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver duas novas estratégias vacinais contra o vírus dengue, utilizando as seguintes abordagens: a primeira consistiu no desenvolvimento de uma vacina de DNA que expressava epítopos definidos de células B e T, do DENV-3, associados ao sinal de tráfego celular da proteína de membrana do lisossomo- LAMP. A segunda consistiu na expressão in tandem dos domínios III da proteína do envelope dos quatro sorotipos, fusionados ao replicon do vírus da febre amarela 17D. Foram utilizadas técnicas padrão de clonagem e de recombinação homóloga em levedura para a construção das diferentes abordagens. A expressão da vacina de DNA e a replicação autônoma dos replicons foram confirmadas pelo ensaio de imunofluorescência indireta de células transfectadas. Os resultados para a vacina de DNA mostraram com sucesso a expressão do LAMP-1 humano fusionado aos epítopos, no entanto, a construção não foi capaz de gerar resposta imune por anticorpos neutralizantes. A vacina baseada em replicons mostrou que é possível utilizar com sucesso os replicons como vetores vacinais e que estes permitem a expressão de genes heterólogos alvos. Nossos estudos representam uma etapa inicial para o desenvolvimento de novas formulações vacinais que podem constituir um importante avanço para o desenvolvimento de vacinas de última geração para o dengue

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 simone_costa_ioc_dout_2008.pdf: 34704570 bytes, checksum: e34eaf901d373dd2f63e3ffbecbb7e50 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue (DENV) consiste de quatro sorotipos antigenicamente relacionados: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Apesar dos diversos esforços para o desenvolvimento de uma vacina contra dengue, ainda não há nenhuma comercialmente disponível. As proteínas não estruturais 1 e 3 (NS1 e NS3) são indicadas como antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina contra DENV. Segundo alguns estudos, a proteína NS1 é capaz de induzir uma resposta protetora de anticorpos com atividade de fixação do complemento. A proteína NS3, que realiza reações enzimáticas essenciais para a replicação viral, parece ser imunogênica, contendo um predomínio de epítopos para linfócitos T CD4+ e CD8+. No presente trabalho nós avaliamos o potencial de vacinas de DNA baseadas nas proteínas NS1 e NS3 de DENV-2. Foram construídos cinco plasmídeos, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N e pcTPANS3C, contendo a seqüência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) fusionado ao gene NS3 inteiro ou partes destes. Todos estes plasmídeos mediaram a expressão das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas Camundongos foram inoculados com estes plasmídeos e desafiados com DENV-2 por via intracerebral (i.c.). Nenhuma destas construções induziu níveis satisfatórios de proteção. Além dos plasmídeos com NS3, foram construídas quatro vacinas de DNA baseadas no gene NS1: 1 - pcENS1, que codifica a região C-terminal da proteína E fusionada à NS1, 2 - pcENS1ANC, similar ao pcENS1 com a adição da porção N-terminal da NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, que codifica o peptídeo sinal t-PA fusionado à NS1 e 4 - pcTPANS1ANC, semelhante ao pcTPANS1 com a adição da seqüência ANC. A proteína NS1 recombinante foi detectada nos extratos celulares e sobrenadante das culturas de células BHK transfectadas com pcTPANS1, pcENS1 e pcENS1ANC. Tais resultados indicam que as seqüências sinais t-PA e E direcionaram a NS1 para secreção. A proteína NS1 também foi observada associada à membrana plasmática de células transfectadas com pcENS1ANC, demonstrando a importância da seqüência ANC para o seu ancoramento. Todos os camundongos imunizados com pcTPANS1 ou pcENS1 produziram altos níveis de anticorpos, direcionados principalmente para epítopos conformacionais da NS1, enquanto que somente metade dos animais inoculados com pcENS1ANC apresentaram níveis detectáveis de anticorpos A resposta de anticorpos se mostrou duradoura (até 56 semanas após a primeira dose das vacinas), e os animais apresentaram uma rápida resposta secundária após um reforço de DNA. Camundongos imunizados com os plasmídeos pcTPANS1 e pcENS1 se mostraram protegidos contra desafios com DENV-2 por via i.c., sendo o pcTPANS1 levemente mais protetor. Estes dois plasmídeos ativaram a produção de diferentes subclasses de IgG específicas contra NS1. Não foi observada proteção interespecífica quando camundongos imunizados com pcTPANS1 foram desafiados por via i.c. com DENV-1. Os animais imunizados com o pcTPANS1 foram desafiados com DENV-2 por via intraperitoneal e também se mostraram protegidos. Neste modelo de desafio, foi observada uma diminuição dos efeitos histopatológicos do vírus no fígado dos animais vacinados. Resultados preliminares sugerem à lise de células infectadas com DENV-2, dependente do complemento, na presença dos anticorpos direcionados contra NS1 / Dengue virus (DENV) consists of four antigenically related serotypes: DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. Although considerable research has been conducted towards the development of a DENV vaccine, no vaccine is yet commercially available. The non-structural proteins 1 and 3 (NS1 and NS3) have been identified as promising antigens for the development of vaccines against DENV. According to some reports, NS1 can elicit a protective antibody response with complement-fixing activities. NS3, a protein that carries out enzymatic reactions essential for viral replication, appears to be immunogenic, presenting a preponderance of the CD4+ and CD8+ T cell epitopes. In the present work we investigate the potential of DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 and NS3 proteins. We constructed five recombinant plasmids, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N and pcTPANS3C, which contain the sequence that codes the signal peptide derived from the human tissue plasminogen activator (t-PA) fused to the full or partial length of the DENV-2 NS3 gene. Results indicated that these plasmids promoted the expression of recombinant proteins in eukaryotic cells. Mice were inoculated with these plasmids and challenged by the intracerebral (i.c.) route with DENV-2. None of these constructs induced acceptable protection. Moreover, we constructed four DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 gene: 1 - pcENS1, coding the C-terminal of the E protein fused to NS1, 2 - pcENS1ANC, similar to pcENS1 with the addition of the N-terminal of NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, coding the t-PA signal sequence fused to NS1 and 4 - pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 with the addition of the ANC sequence. The recombinant NS1 protein was detected in cell extracts and culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected BHK cells. Such results indicated that the E and t-PA sequences targeted NS1 to secretion. NS1 was also observed in association with plasma membrane of pcENS1ANC-transfected cells, which demonstrated the importance of the ANC sequence for cell anchoring. High levels of antibodies, mainly recognizing surface-exposed conformational epitopes of NS1, were induced in all mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only half of pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable antibody levels. Long-term antibody response was observed in pcTPANS1 and pcENS1 immunized animals (56 weeks after the first vaccine inoculation) and there was a rapid secondary response after a DNA booster. Protection was elicited in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice challenged with DENV- 2 by the i.c. route and the pcTPANS1 seemed to generate a slightly higher protection. Moreover, these two plasmids induced different NS1-specific IgG subclasses. No protection was displayed when pcTPANS1-immunized animals were i.c. challenged with DENV-1. Animals inoculated with pcTPANS1 were also protected when they were challenged with DENV-2 by the intraperitoneal route. Liver tissue from vaccinated animals presented a remarkable decrease of hepatic damages in this challenge mouse model. Preliminary results suggested the complement-mediated lyses of DENV-2 infected cells in the presence of the NS1-specific antibody.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_castro_ioc_dout_2012.pdf: 21978043 bytes, checksum: e9eba4cae64a400b5fd4d642dfb66bf2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O dengue tem se apresentado como um grave problema de saúde pública no Brasil, razão pela qual, vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer aspectos da epidemiologia dessa doença em diferentes localidades, com histórias distintas de circulação dos diferentes sorotipos dos vírus dengue (DENV). A implantação de um Programa de vigilância entomológica e virológica e, que desde 1986 visa detectar e monitorar a circulação dos sorotipos e genótipos DENV, resultou em distintas oportunidades, no isolamento de amostras de DENV de vetores e de casos humanos permitindo a caracterização molecular e a análise filogenética, fornecendo informações relevantes para a compreensão da interação vetor- vírus- humanos. O entendimento da variação genética no vírus quando este replica em mosquitos, e como essas variações atuam durante a transmissão entre humanos e mosquitos permanecem desconhecidos. Portanto, visando contribuir para um melhor conhecimento dos DENV e sua interação com o mosquito vetor, realizamos neste trabalho, a caracterização molecular e análise filogenética de DENV isolados de mosquitos naturalmente infectados e de casos humanos, provenientes de epidemias ocorridas entre 1986 e 2011 no Brasil. Foi demonstrado que os métodos moleculares foram fundamentais por facilitarem a rápida identificação dos vírus e consequentemente o monitoramento dos genótipos circulantes A RT-PCR para a triagem de DENV em vetores se mostrou uma ferramenta útil para a vigilância virológica, com taxas de detecção que variaram de 0,78% a 25% no período estudado. A análise filogenética dos DENV-1 isolados de mosquitos e humanos mostrou que o genótipo V (Américas/África) continua o mesmo circulante desde a sua introdução, porém foi demonstrada a co-circulação de duas novas linhagens (II e III) no período de 2009 a 2011. O sequenciamento do genoma completo de DENV-3 isolado a partir de Ae. aegypti naturalmente infectados no Rio de Janeiro (RJ), assim como a análise da região 3´NC de vírus isolados em mosquitos e humanos, caracterizou estes vírus como pertencentes ao GIII e revelou a presença de inserções e deleções na região 3´NC do genoma. As deleções observadas na região 3´NC resultaram em estruturas secundárias porém nem todas as cepas com inserções nesta região apresentaram estrutura similar substituições exclusivas à cepa de DENV-3 isolada em mosquito foram observadas no gene NS5, incluindo a substituição que resultou na formação de um códon de terminação. O teste comercial Simplexa\2122 Dengue Real Time RT-PCR, disponível recentemente, foi utilizado pela primeira vez para detecção dos DENV e se mostrou um método molecular alternativo para as vigilâncias entomológica e virológica. O RT-PCR em Tempo Real possibilitou, pela primeira vez, a quantificação de DENV-1 e DENV-4 em fêmeas individuais naturalmente infectadas (1,6 x 104 cópias/mL e 1,08 x 103 cópias/mL, respectivamente) Considerando-se o elevado índice de infestação por Ae. aegypti em todo o país, o estudo da caracterização dos DENV circulantes torna-se de grande importância no conhecimento da relação vírus-vetor pela análise da variabilidade genética, dispersão e persistência de genótipos durante a transmissão destes vírus / Dengue has been a major public health problem in Brazil with several studies performed aiming to elucidate the disease epidemiology in geographically distinct areas with different dengue viruses (DENV) circulation. The establishment of an entomological and virological program since 1986 with the objective of detecting and monitoring DENV serotypes and genotypes resulted in distinct opportunities in DENV isolation from vectors and human cases, allowing the molecular characterization and phylogenetic analysis, providing relevant information for the understanding of the vector-virus-humans interactions. The understanding of the virus genetic variability when it replicates on mosquitoes and how those variations act during the transmission between humans and mosquitoes is not fully understood. Therefore, aiming to contribute for a better understanding of DENV and its interactions with the mosquito vector, we performed in this study the molecular characterization and phylogenetic analysis of viruses isolated from naturally infected mosquitoes and human cases, from epidemics occurred between 1986 and 2011 in Brazil. It has been shown that the molecular techniques were essential for allowing the rapid identification of the viruses and consequently the monitoring of the circulating genotypes. The RT-PCR for DENV screening in vectors has shown to be a useful tool for the virological surveillance, with detection rates varying from 0.78% to 25% in the studied period. The phylogenetic analysis from DENV-1 isolated from mosquitoes and human cases showed that genptype V (America/Africa) is still the same genotype circulating since this serotype introduction, however it was demonstrated the co-circulation of two distinct new viral lineages (II and III) from 2009 to 2011. The complete genome sequencing of a DENV-3 isolated from naturally infected Ae. aegypti in Rio de Janeiro (RJ) and the analysis of the 3´UTR region from viruses isolated from mosquitoes and humans, has characterized those viruses as belonging to genotype III (GIII) and revealed the presence of insertions and deletions in the 3´UTR region of the genome. The deletions observed in the 3´UTR region resulted in similar secondary structures, however not all strains with insertions were similar in structure. Exclusive substitutions to the DENV-3 isolated from the mosquitoes were observed in NS5, including a substitution leading to a stop codon formation. The Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR commercial kit, recently available, was used for the first time for DENV detection and it has been shown to be an alternative molecular method for the entomological and virological surveillances, The Real Time RT-PCR has allowed, for the first time the DENV-1 and DENV-4 quantification in single Ae. aegypti naturally infected (1.6 x 104 copies/mL e 1.08 x 103 copies/mL, respectively). Considering the high Ae. aegypti infestation index in the country, the characterization of DENV circulating is very relevant for the understanding of the virus-vector relations by the analysis of the genetic variability, spread and persistence of genotypes during the transmission of those viruses.

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:13:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 153.pdf: 1182479 bytes, checksum: 572ca8cb379e9adc3ceb185ab244a3eb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é uma arbovirose causada pelo vírus Dengue (DENV), cujos principais vetores são os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus. A. aegypti é o único vetor de DENV em Cabo Verde, país que teve a sua primeira epidemia da dengue registrada em 2009. Contudo, pouco se sabe acerca da variação no nível de competência vetorial das populações do vetor aos diferentes sorotipos de DENV. O estudo teve como objetivo avaliar a competência vetorial de A. aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, a quatro sorotipos de DENV. Para isso, os mosquitos foram alimentados artificialmente com sangue contendo diferentes sorotipos de DENV, e em seguida dissecados ao 7º, 14º e 21º dia após infecção (dpi) para verificar a presença do vírus no intestino, cabeça e glândulas salivares usando a técnica de RT-PCR. Adicionalmente, o número de cópias de RNA viral presente nas glândulas salivares foi determinado por qRT-PCR. Foram observadas altas taxas de infecção das glândulas salivares para DENV-2 e DENV-3 (65 e 75 por cento respectivamente), enquanto que para DENV-1, o RNA viral só foi detectado no intestino e cabeça, não chegando a infectar as glândulas salivares. DENV-4 não disseminou para cabeça e glândulas salivares, mantendo a infecção apenas no intestino (9 por cento). O número de cópias de RNA viral nas glândulas salivares não variou significativamente entre DENV-2 e DENV-3 e nem entre os diferentes períodos de incubação do vírus e títulos de DENV testados. Conclui-se, que a população de Aedes aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, possui alta competência vetorial para as cepas de DENV-2 e DENV-3 e são pouco susceptíveis para as de DENV-1 e DENV-4. As cópias de RNA viral nas glândulas salivares mantêm-se relativamente constante por 21 dias após a infecção, o que pode potencializar a capacidade vetorial de mosquito A. aegypti e sugere alguma forma de modulação da replicação do vírus nesse órgão