As vacinas virais, que representam os principais produtos obtidos a partir de células animais, continuam sendo produzidas com partículas virais obtidas a partir de culturas de células em grande escala. A produção industrial da vacina contra febre aftosa envolve o crescimento, em suspensão líquida, de células BHK-21 ("baby hamster kidney cells") usadas como hospedeiras para multiplicação do vírus. Essas células são normalmente cultivadas em um meio nutritivo (Eagle's medium Glasgow modified - MGM) suplementado com soro animal e/ou outros suplementos quimicamente indefinidos como caIdo tripticaseina fosfato (CTF) e hidrolisado de lactoalbumina. A função desses suplementos é estimular o crescimento das células para assegurar a manutenção continua da cultura. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de desenvolver uma metodologia prática, pouco dispendiosa e em escala de laboratório, capaz de avaliar com rapidez e confiabilidade, a atividade promotora de crescimento dos meios de cultura utilizados na fabricação industrial de vacinas. A determinação do tempo de dobramento (TD) e da densidade máxima ou desaturação (OS através de curvas de crescimento em monocamada mostrou-se um método bastante eficaz para avaliar os níveis de atividade promotora de crescimento de diferentes meios de cultura, soros e CTF usados no cultivo de células BHK-21. Os resultados obtidos em monocamada se aplicam a células crescendo em suspensão líquida e reproduzem, com excelente aproximação, aqueles obtidos na indústria. Além de permitir o estudo dos fatores promotores de crescimento, esta metodologia oferece perspectivas concretas no sentido da eliminação do soro no cultivo de células BHK-21. / Viral vaccines, the main product obtained from animal cells, have long been produced with viral particles obtained from large scale cell culture. The industrial production of the foot-and- mouth disease (FMD) vaccine involves growth, in liquid suspension of baby hamster kidney (BHK) cells used as the host for viral replication. Normally, these cells are cultured in nutrient medium (Eagle's medium Glasgow modified, MGM) supplemented with animal serum and/or other chemically undefined supplements like tryptose phosphate broth (TPB) and lactalbumin hydrolysate. These supplements stimulate cell growth and thus warrant continuous maintenance of the culture. The objective of the present work was to develop a practical unexpensive method to rapid and reproducibly evaluate the growth promoting activity of culture media components utilized in the industrial production of vaccines, in laboratory scale. Determination of the doubling time (TD) and saturation density (DS) through growth curves is shown to be an efficient and adequate method to evaluate the leveIs of growth promoting activity displayed by the different culture media, sera and TPBs utilized in BHK-21 cells culture. The results obtained in monolayer are shown to directly apply to suspension cultures both in laboratory and in industrial scale. In addition to allowing the study of growth promoting factors, this methodology offers concrete perspectives for the complete elimination of serum as a medium supplement in BHK-21 cultures.

As vacinas virais, que representam os principais produtos obtidos a partir de células animais, continuam sendo produzidas com partículas virais obtidas a partir de culturas de células em grande escala. A produção industrial da vacina contra febre aftosa envolve o crescimento, em suspensão líquida, de células BHK-21 ("baby hamster kidney cells") usadas como hospedeiras para multiplicação do vírus. Essas células são normalmente cultivadas em um meio nutritivo (Eagle's medium Glasgow modified - MGM) suplementado com soro animal e/ou outros suplementos quimicamente indefinidos como caIdo tripticaseina fosfato (CTF) e hidrolisado de lactoalbumina. A função desses suplementos é estimular o crescimento das células para assegurar a manutenção continua da cultura. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de desenvolver uma metodologia prática, pouco dispendiosa e em escala de laboratório, capaz de avaliar com rapidez e confiabilidade, a atividade promotora de crescimento dos meios de cultura utilizados na fabricação industrial de vacinas. A determinação do tempo de dobramento (TD) e da densidade máxima ou desaturação (OS através de curvas de crescimento em monocamada mostrou-se um método bastante eficaz para avaliar os níveis de atividade promotora de crescimento de diferentes meios de cultura, soros e CTF usados no cultivo de células BHK-21. Os resultados obtidos em monocamada se aplicam a células crescendo em suspensão líquida e reproduzem, com excelente aproximação, aqueles obtidos na indústria. Além de permitir o estudo dos fatores promotores de crescimento, esta metodologia oferece perspectivas concretas no sentido da eliminação do soro no cultivo de células BHK-21. / Viral vaccines, the main product obtained from animal cells, have long been produced with viral particles obtained from large scale cell culture. The industrial production of the foot-and- mouth disease (FMD) vaccine involves growth, in liquid suspension of baby hamster kidney (BHK) cells used as the host for viral replication. Normally, these cells are cultured in nutrient medium (Eagle's medium Glasgow modified, MGM) supplemented with animal serum and/or other chemically undefined supplements like tryptose phosphate broth (TPB) and lactalbumin hydrolysate. These supplements stimulate cell growth and thus warrant continuous maintenance of the culture. The objective of the present work was to develop a practical unexpensive method to rapid and reproducibly evaluate the growth promoting activity of culture media components utilized in the industrial production of vaccines, in laboratory scale. Determination of the doubling time (TD) and saturation density (DS) through growth curves is shown to be an efficient and adequate method to evaluate the leveIs of growth promoting activity displayed by the different culture media, sera and TPBs utilized in BHK-21 cells culture. The results obtained in monolayer are shown to directly apply to suspension cultures both in laboratory and in industrial scale. In addition to allowing the study of growth promoting factors, this methodology offers concrete perspectives for the complete elimination of serum as a medium supplement in BHK-21 cultures.

Orientador: Ana Maria de Andrade Caldeira / Banca: João José Caluzi / Banca: Lilian Al-Chueyr Pereira Martins / Resumo: O médico francês Léon Charles Albert Calmette (1863-1933) é conhecido como um dos colaboradores para o desenvolvimento do bacilo nomeado BCG (bacilo Calmette-Guérin), importante na história da medicina por seu possível emprego como vacina contra a tuberculose. O nome do bacilo BCG tem sua origem por causa de seu desenvolvimento em associação com o veterinário francês Jean-Marie Camille Guérin (1872-1961). Nós organizamos as contribuições de Albert Calmette, do período de 1905 a 1933, para o desenvolvimento do bacilo BCG. Para esse propósito, utilizamos os artigos originais publicados por ele. Com esses artigos, nos mostramos as controvérsias e diálogos com outros pesquisadores, integrando uma abordagem internalista e externalista da História da Ciência, realizando uma discussão dos conceitos científicos presentes em seus trabalhos e as influências social, econômica e política do respectivo contexto histórico. Existe uma crença comum entre os alunos de que a Ciência é uma busca solitária e as ideias aparecem espontaneamente na mente dos cientistas. Trata-se de uma percepção estereotipada sobre a natureza da Ciência que procuramos superar, mostrando as pesquisas de Calmette sobre o desenvolvimento do bacilo BCG utilizando uma Rede de Sociabilidade elaborada por nós. Para ilustrar como a Rede de Sociabilidade pode explicar a natureza social da Ciência, delineamos o desenvolvimento do BCG por Calmette e Guérin. Durante este processo, eles contaram com muitos cientistas, como o mi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The French doctor Léon Charles Albert Calmette (1863-1933) is known as one of the contributors for the development of the bacillus named BCG (Bacillus Calmette-Guérin), important in medicine history due to its use as a vaccine against tuberculosis. The name bacillus BCG has its origin from its development in association with the French veterinarian Jean-Marie Camille Guérin (1872-1961). We organized the contributions of Albert Calmette, in the period of 1905 to 1933, for the development of de bacillus BCG. For this purpose, we used the original papers published by him. With these papers, we show controversies and dialogues with other researchers, integrating an internalist and externalist approach of the History of Science, by doing a discussion of Scientific concepts within his papers and the social, economical and political influences in the respective Historical context. There is a common belief among students that Science is a solitary pursuit and the ideas appear spontaneously in the scientists' mind. This is a stereotyped perception about the nature of Science that we seek to disavow, showing Calmette's researches about the development of bacillus BCG using a Sociability Network elaborated by us. To illustrate how the Sociability Network can explain the social nature of Science, we delineate BCG's development by Calmette and Guérin. During this process they have counted on many scientists, such as the German microbiologist Emil von Behring (1854-1917) and the French vet... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Enfermagem, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-30T17:39:08Z No. of bitstreams: 1 2017_RegianeTigulinideSouzaJordão.pdf: 1597365 bytes, checksum: f81ff71d39bd971a50cae60fed3c0197 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-05T18:23:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RegianeTigulinideSouzaJordão.pdf: 1597365 bytes, checksum: f81ff71d39bd971a50cae60fed3c0197 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-05T18:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RegianeTigulinideSouzaJordão.pdf: 1597365 bytes, checksum: f81ff71d39bd971a50cae60fed3c0197 (MD5) Previous issue date: 2018-02-05 / A prevalência da infecção pelo papilomavírus humano (hpv), importante fator de risco para o desenvolvimento do câncer cervical em mulheres, varia de 5 a 30%. Atualmente, três tipos de vacina contra o hpv estão disponíveis: bivalente (bhpv), quadrivalente (qhpv) e nonavalente (9vhpv). No brasil, a vacina qhpv foi introduzida no programa nacional de imunizações em 2014, atingindo altas taxas de cobertura vacinal; no entanto, os casos de reações psicogênicas relatados após aplicação da vacina têm interferido incisivamente na tomada de decisão pelas famílias e adolescentes. Portanto, este estudo teve como objetivo identificar a prevalência de eventos adversos reportados após a aplicação das vacinas quadrivalente e nonavalente de hpv, em pessoas de 9 a 19 anos de idade. Trata-se de revisão sistemática registrada no prospero pelo identificador crd42016049301, cujas buscas foram realizadas nas bases de dados pubmed, cochrane central, web of science, scopus, lilacs, cinahl e literatura cinzenta, sem restrição de período e idioma. Os estudos foram selecionados pelo título e resumo e, após, pela leitura na íntegra, seguido pela coleta de dados, sempre por dois revisores independentes. O risco de viés nos estudos foi avaliado por meio do jbi critical appraisal checklist for studies reporting prevalence data e a qualidade da evidência por meio do sistema grade. Foram identificados 3417 estudos nas seis bases de dados e após a remoção de duplicatas restaram 2022. Estes foram analisados por título e resumo, dos quais 133 foram selecionados para leitura na íntegra. Ao final, 14 estudos compuseram a amostra desta revisão. A prevalência de eventos adversos (ea) relacionados à vacina qhpv nas meninas variou de 79,3% a 90,3%, dos quais os ea locais foram de 11% a 88,3% e os sistêmicos de 24,3% a 78,2%. Nos meninos a ocorrência de ea de forma geral para a qhpv foi de 79,2%, sendo os ea locais 74% e os sistêmicos 27,2%. A prevalência de eventos adversos relacionados à vacina 9vhpv nas meninas variou de 86,6% a 93%, dos quais a ocorrência de ea locais foi de 81,9% a 91,6% e os sistêmicos foi de 20,7% a 20,9%, enquanto nos meninos os ea gerais foram de 81%, 72,8% de registro de ea locais e 21,8% sistêmicos. A metanálise mostrou para os eventos elencados como críticos ou importantes, que a frequência de dor intensa no local da injeção foi de 2,9% (ic 95%: 2,4 - 3,4), de febre foi 11,5% (ic 95%: 7,23 – 16,49), de tromboembolismo venoso foi 0,007% (ic 95%: 0,000470 - 0,0227), de síncope foi 0,072% (ic 95%: 0,000515 - 0,313), de convulsão foi 0,00141% (ic 95%: 0,0000410 - 0,00662). A maioria dos estudos foi avaliado como moderado risco de viés. De forma geral, os eventos adversos identificados foram leves e autolimitados, não havendo evidências de relação causal entre a síndrome de guillain barré e tromboembolismo venoso e as vacinas analisadas. No entanto, é importante fortalecer a vigilância dos eventos adversos, especialmente os raros, na fase pós-comercialização. / The prevalence of human papillomavirus infection (HPV), an important risk factor to the development of cervical cancer, in women varies from 5 to 30%. Nowadays, there are three types of vaccine against the HPV available: bivalent (bHPV), quadrivalent (qHPV) and nonavalent (9vHPV). In Brazil, the qHPV vaccine was introduced during the National Immunization Program in 2014, reaching high rates of immunization coverture; nevertheless, the cases of psychogenic reactions reported after the administration of the vaccine have incisively interfered in the decision making of families and teenagers. Thus, the objective of this study was to identify the prevalence of adverse events reported after the administration of quadrivalent and nonavalent HPV vaccines in people ranging from 9 to 19 years old. It was a systematic review, recorded in CRD42016049301 by PROSPERO, of searches performed in PubMed, Cochrane CENTRAL, Web of Science, Scopus, LILACS, CINAHL and gray literature databases, with no restriction related to publication date or language. The studies were selected by title and abstract and, afterwards, by a thorough reading, followed by the data collection, performed by two independent reviewers. The risk of bias in the study was evaluated by applying the JBI Critical Appraisal Checklist for Studies Reporting Prevalence Data and the quality of the evidence by using the GRADE system. Results: 3,417 studies were identified on the six databases and after removing the duplications 2,022 remained. These were analyzed by title and abstract, and 133 were selected for complete reading. In the end, 14 studies composed the sample of this review. The prevalence of adverse events (EA) related to the qHPV vaccine in girls varied from 79.3% to 90.3%, from which the local EA ranged from 11% to 88.3% and the systemic EA ranged from 24.3 to 78.2%. The qHPV EA occurrence in boys was broadly 79.2%, with 74% local EA and 27.2% systemic EA. The prevalence of adverse events related to the 9vHPV vaccine in girls ranged from 86.6% to 93%, from which 81.9% to 91.6% were local EA and 20.7% to 20.9% were systemic EA, whereas in boys the general EA was 81%, with 72.8% local EA and 21.8% systemic EA. The meta-analysis demonstrated that for the events characterized as critical or important, the frequency of intense pain on the spot the shot was applied was 2.92% (CI 95%: 2.4 - 3.4), of fever was 11.46% (CI 95%: 7.23 - 16.49), of venous thromboembolism was 0.007% (CI 95%: 0.000470 - 0.0227), of syncope was 0.072% (CI 95%: 0.000515 - 0.313), of convulsion was 0.00141% (CI 95%: 0.0000410 - 0.00662). Most studies were evaluated as presenting moderate risk of bias. In general, the adverse events identified were mild intensity and self limited, with no evidence of causal relationship between the Guillain-Barré Syndrome and the venous thromboembolism and the analyzed vaccines. However, it is important to strengthen the vigilance over adverse events, especially the rare ones, in the post-commercialization phase. / La prevalencia de la infección por el papilomavirus humano (HPV), importante factor de riesgo para el desarrollo del cáncer cervical, en mujeres varía del 5 al 30%. Actualmente, tres tipos de vacuna contra el HPV están disponibles: bivalente (bHPV), cuadrivalente (qHPV) y nonavalente (9vHPV). En Brasil, la vacuna qHPV fue introducida en el Programa Nacional de Inmunizaciones en 2014, alcanzando altas tasas de cobertura de vacunación; sin embargo, los casos de reacciones psicogénicas informados después de la aplicación de la vacuna han interferido definitivamente en la toma de decisión de las familias y de los jóvenes. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo identificar la prevalencia de eventos adversos informados después de la aplicación de las vacunas cuadrivalente y nonavalente de HPV, en personas con 9 a 19 años de edad. Se trata de una revisión sistemática grabado en CRD42016049301 por PROSPERO, cuyas búsquedas fueron hechas en las bases de datos PubMed, Cochrane CENTRAL, Web of Science, Scopus, LILACS, CINAHL y literatura gris, sin restricción de período de publicación y lengua. Los estudios fueron seleccionados por título y resumen y, después, por la lectura completa, seguido por la compilación de datos, siempre por dos revisores independientes. El riesgo de bies en los estudios fue evaluado por medio del JBI Critical Appraisal Checklist for Studies Reporting Prevalence Data y la calidad de la evidencia por medio del sistema GRADE. Fueron identificados 3417 estudios en las seis bases de datos y después de la remoción de las duplicidades restaron 2022. Estos fueron analizados por título y resumen, de los cuales 133 fueron seleccionados para la lectura completa. Al final, 14 estudios compusieron la muestra de esta revisión. La prevalencia de eventos adversos (EA) relacionados con la vacuna qHPV en niñas ha variado del 79,3% al 90,3%, de los cuales los EA locales variaron del 11% al 88,3% y los sistémicos del 24,3% al 78,2%. En niños la ocurrencia de EA de manera general para la qHPV fue 79,2%; los EA locales fueron 74% y los sistémicos 27,2%. La prevalencia de eventos adversos relacionados con la vacuna 9vHPV en niñas ha variado del 86,6% al 93%, de los cuales la ocurrencia de EA locales fue del 81,9% al 91,6% y los sistémicos fue del 20,7% al 20,9%, mientras en los niños los EA generales fueron del 81%, 72,8% de registros de EA locales y 21,8% sistémicos. La metaanálisis demostró para los eventos clasificados como críticos o importantes, que la frecuencia de dolor intenso en el local de la inyección fue del 2,92% (IC 95%: 2,4 -3,4), de fiebre fue del 11,46% (CI 95%: 7,23 - 16,49), de tromboembolismo venoso fue del 0,007% (IC 95%: 0,000470 - 0,0227), de síncope fue 0,072% (IC 95%: 0,000515 - 0,313), de convulsión fue del 0,00141% (CI 95%:0,0000410 - 0,00662). La mayoría de los estudios fue evaluado como teniendo riesgo moderado de bies. De manera general, los eventos adversos identificados fueron ligeros y auto limitados, no existiendo evidencias de relación causal entre la Síndrome de Guillain Barré y el tromboembolismo venoso y las vacunas analizadas. Sin embargo, es importante fortalecer la vigilancia de los eventos adversos, especialmente los raros, en la fase de post-comercialización.

Orientadora : Profª Drª Vanete Thomaz-Soccol / Co-orientadora : Profª Drª Silvana Maria Alban / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba,26/07/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Parasitologia / Resumo:As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania Ross, 1903. Esta doença é uma das principais parasitoses negligenciadas, re-emergentes e afeta cerca de 350 milhões de indivíduos no mundo. O objetivo deste trabalho foi identificar peptídeos miméticos, para uso como antígenos em imunodiagnóstico e imunoprofilaxia da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Bacteriófagos, expressando peptídeos em sua superfície, foram selecionados por imunoglobulinas específicas para Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Posteriormente os mesmos foram submetidos à extração e sequenciamento do seu DNA. Três peptídeos (P-1, P-2 e P-3) foram identificados, sintetizados e inoculados individualmente ou combinados (MIX) em hamsters golden. Os animais imunizados com peptídeos produziram anticorpos que reconheceram diferentes proteínas do antígeno solúvel (AS) de L. braziliensis. A comparação das sequências dos três peptídeos, em banco de dados, demonstrou que elas apresentam homologia com glicoproteína de 63 kDa de Leishmania, lipofosfoglicano e com outras proteínas hipotéticas de Leishmania. Os peptídeos foram avaliados como antígenos no teste ELISA indireto. Dois grupos de pacientes foram investigados, sendo o primeiro constituído por 25 indivíduos que tiveram diagnóstico parasitológico confirmado e o segundo por 57 pacientes que apresentavam suspeita clínica de LTA, eram moradores de área endêmica e que tinham teste sorológico positivo para a doença. Os três peptídeos e o MIX foram imunorreativos contra soro de pacientes dos dois grupos. O peptídeo 1, 2, 3, MIX e AS reagiram com 64, 56, 44/56, 40/72 e 80% das amostras de soro, respectivamente. No Grupo 2, os três peptídeos só ou em combinação foram capazes de diagnosticar 82 a 84% dos indivíduos. Para obtenção do ponto de corte (Cut-off) entre soros positivos e negativos dois cálculos foram aplicados. O primeiro foi realizado calculando a média das absorbâncias obtidas para um grupo de indivíduos considerados negativos e acrescidos de dois desvios padrão (2SD) e o segundo foi empregando a Curva ROC (Receiver Operating Characteristics). As sensibilidades do teste ELISA utilizando os peptídeos foram de 64 a 74% para o peptídeo 1, 56 a 65% para o peptídeo 2, 44 a 68% para o peptídeo 3, 40 a 79% para o MIX e de 80 e 91% para o AS. O MIX de peptídeos apresentou o melhor desempenho (79% de sensibilidade) entre os peptídeos seguido do P-1 (74%). A aplicação do teste t sugeriu que o P-1 seria melhor alternativa entre os peptídeos para o diagnóstico da LTA. As especificidades dos antígenos variaram de 92 a 100% demonstrando a habilidade destes em diagnosticar corretamente os indivíduos sadios. Reações cruzadas com soros de pacientes com doença de chagas, hanseníase e tuberculose foram avaliadas contra todos os antígenos. A reação cruzada com soro de pacientes com doença de chagas foi 0% para o P-1 enquanto que para o AS foi 60%. Os peptídeos sintéticos também foram testados em ensaios de imunoproteção contra leishmaniose experimental (LE) em hamsters. Foi possível observar que os animais do grupo controle positivo (que receberam o desafio com L. braziliensis e não receberam peptídeos) apresentaram lesões específicas de LE, enquanto que os animais imunizados com os peptídeos individualmente ou em combinação não apresentaram lesões ou as apresentaram em menor número. Os animais que receberam o peptídeo 2 não desenvolveram lesões. Promastigotas de L. braziliensis foram isoladas, em meio de cultura, da pata, baço e fígado de animais de todos os grupos, com exceção do grupo dois e do grupo controle negativo. Essas análises demonstram que a metodologia selecionada para a realização dessa pesquisa foi adequada, visto que sequências peptídicas com homologia aos principais fatores de virulência de Leishmania sp. foram obtidas, resultados promissores em testes sorológicos de diagnóstico foram alcançados e imunoproteção de animais contra a leishmaniose experimental foi observada. Palavras-chave: Phage display. leishmaniose. ELISA. Vacinas. / Abstract: Leishmaniosis are caused by protozoan parasites of the genus Leishmania Ross, 1903. This is one of the main neglected, re-emerging parasitic diseases and affects about 350 million people worldwide. The objective of this study was to identify mimetic peptides to use as antigens in immunodiagnosis and immunoprophylaxis of American Cutaneous Leishmaniosis (ACL). Bacteriophages expressing peptides on their surface were selected by specific immunoglobulins for Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Subsequently, they were subjected to DNA extraction and sequencing. Three peptides (P-1, P-2 e P-3) were identified, synthesized and individually or combined (MIX) inoculated in Golden hamsters. Animals immunized with peptides produced antibodies that recognized different proteins from the Soluble Antigen (SA) from L. braziliensis. Comparison of the sequences of the three peptides in database showed that they have similarity with a 63 kDa glycoprotein of Leishmania, a lipophosphoglycan and other hypothetical proteins of Leishmania. The peptides were evaluated as antigens in indirect ELISA. Two groups of patients were studied: the first consists of 25 individuals who had confirmed parasitological diagnosis and the second group of 57 patients who had clinical suspicion of ACL and were residents of endemic area and also had a positive serologic test for the disease. The three peptides and the MIX were immunoreactive against sera of patients in both groups. Peptide 1, 2, 3, MIX and AS were reactive with 64, 56, 44/56, 40/72 and 80% sera samples, respectively. In Group 2, the three peptides alone or in combination were able to diagnose 82 a 84% of individuals. In order to obtain the cut-off between positive and negative sera, two calculations were applied. The first one was conducted by calculating the mean absorbance obtained for a group of individuals considered negative plus two standard deviations (2SD). The second calculation was using the ROC curve (Receiver Operating Characteristics). The sensibility of the ELISA assay using the peptides were 64 to 74% for peptide 1, 56 to 65% for peptide 2, 44 to 68% for peptide 3, 40 to 79% for the MIX and 80 to 91% for the SA. The MIX of peptides showed the best performance (79%) among the peptides followed by P-1 (74%). The application of the t-test suggested that P-1 was the best alternative among the peptides for the diagnosis of ACL.The specificities of antigens ranged from 92% to 100% demonstrating the ability to correctly diagnose the healthy individuals. Cross-reactions with sera from patients with Chagas disease, leprosy and tuberculosis were evaluated against all antigens. Cross-reactivity with Chagas disease was zero for the P-1 and 60% for SA. The synthetic peptides were also tested in assays of immune protection against experimental Leishmaniosis (EL) in hamsters. It was possible to observe that the animals in the positive control group (that received a challenge with L. braziliensis and did not receive peptides) presented specific lesions of EL, whereas animals immunized with the peptides alone or in combination presented a few or no lesions. The animals receiving the peptide 2 did not develop lesions. Promastigotes of L. braziliensis were isolated in culture medium from the paw, spleen and liver from animals of all groups except group 2 and negative control group. These analysis show that the methodology selected for this study was appropriate. Since peptide sequences with homology to the main virulence factors of Leishmania sp. were obtained, promising results in serological diagnostic tests were achieved and immune protection of animals against EL was observed. Keywords: Phage display. Leishmaniosis. ELISA. Vaccines.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-16T14:15:13Z No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T11:44:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T11:44:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) Previous issue date: 2007-06 / Paracoccidioides brasiliensis causa uma micose crônica granulomatosa prevalente na América Latina. O sucesso da resolução da infecção por este fungo é dependente da ativação da imunidade celular. Nós identificamos previamente a proteína de choque térmico 60 (HSP60) como um alvo da resposta humoral na paracoccidioidomicose. Neste trabalho nós expressamos o gene codificante para a proteína de choque térmico 60 em Escherichia coli e a atividade imunobiológica deste antígeno recombinante foi analisada. A imunização de camundongos BALB/c com a proteína recombinante emulsificada em adjuvante estimulou a resposta immune celular como acessado pela proliferação e produção de interferon-gama. A vacinação com a HSP60 reduziu a carga fúngica em camundongos infectados com f 106 ou 107 leveduras. As células T CD4+ foram necessárias para a eficácia da vacinação e ambas as fases: aferente e eferente. Contudo, nós demonstramos que o antígeno imunodominante é um candidato para o desenvolvimento de uma vacina contra este fungo. Na segunda parte do trabalho, leveduras de P. brasiliensis foram convertidas em resistentes a higromicina B pelo sistema de transformação mediado por Agrobacterium-tumefaciens utilizando um vetor binário plasmidial pCB301 contendo os genes da higromicina B fosfotransferase (hph) e o repórter green fluorescent protein (GFP) controlados pelo promotor CBP1 de Histoplasma capsulatum e o terminador Ura5. A transformação mediada por Agrobacteriumtumefaciens produziu transformates estáveis capazes de crescer em altas concentrações de higromicina B. A expressão de GFP foi analisada por microscopia confocal e a variação da intensidade de fluorescência sugeriu a integração do TDNA em sítios randômicos do genoma do fungo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis causes a chronic granulomatous mycosis prevalent in Latin America. Successful resolution of infection with this fungus is dependent on activation of cellular immunity. We previously identified heat shock protein 60 as a target of the humoral response in paracoccidioidomycosis. Herein we expressed the gene encoding the heat shock protein 60 in Escherichia coli and analyzed the immunological activity of this recombinant antigen. Immunization of BALB/c mice with recombinant protein emulsified in adjuvant stimulated a cellular immune response as assessed by proliferation and interferon-gamma production. Vaccination with heat shock protein 60 reduced fungal burden in mice given 106 or 107 yeasts. CD4+ cells were necessary for the efficacy of vaccination in both the afferent and efferent phases. Thus, we have demonstrated that this immunodominant antigen is a candidate for development of a vaccine against this fungus. In a second part of this work, yeasts of P. brasiliensis were transformed to hygromycin B resistance by a Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation system using a binary plasmid vector pCB301 containing the hygromycin B phosphotransferase hph) and the enhanced green fluorescent protein (GFP) genes controlled by the CBP1 promoter from Histoplasma capsulatum and the Ura5 terminator. Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation yielded stable transformants capable of growing on increased concentrations of hygromycin B. The expression of GFP was analyzed by confocal microscopy and the intensity fluorescence variation suggested an integration of the T-DNA at random sites in the genome of the fungus.

Orientador : Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:39:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arita_GoncalaMariaMartins_D.pdf: 10876562 bytes, checksum: 249660946a1462f3d72549cb5ff24775 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A são avaliadas pelo teste de Habel, considerando o índice 2=104,0 IDL 50 para aprovação oficial das partidas. O objetivo do presente estudo é comparar os testes NIH ("National Institute of Health") e o ELISA indireto com o teste de Habel e produzir experimentalmente a vacina de referência nacional (VRN), para uso no NIH. Foram testadas 210 partidas de vacinas, paralelamente pelos testes de Habel e NIH. O teste de Habel aprovou 82,38% de partidas, enquanto o NIH, segundo os limites de 0,9; 0,97; 0,98; 1,0 e 1,1 aprovou, respectivamente, 77,62%; 75,71%; 75,23%; 73,81% e 71,90%. O valor discriminante encontrado para o NIH foi acima de 0,98, sugerindo o uso oficial de 1,0 DI. O teste ELISA indireto foi aplicado a soros de camundongos imunizados com 70 partidas de vacinas, com diferentes índices no Habel. Os pontos de corte, a sensibilidade (S), a especificidade (E), os valores preditivos de resultados positivo (VPRP) e negativo (VPRN) e a razão entre o soro controle positivo e soro de camundongos não vacinados foram determinados, sendo então, recomendado o uso da diluição 1/400, que apresentou ponto de corte de 0,225; 8=97%; E=1O0%; VPRP=1O0% e VPRN=78%, nesse método. A vacina de referência nacional (VRN) foi produzida experimentalmente em células BHK-21, C 13, infectadas com o vírus Pasteur (PV). As suspensões virais (5!! BHK) apresentaram títulos 1O7,66DL 50/rnL em camundongos lactentes e 107,17 DL 50/rnL em camundongos adultos jovens e 3,10 _glrnL de glicoproteína total. O material foi dividido em duas amostras (A e B) e inativado, respectivamente, pela bromo etilienoimina binária (BEI) e pela _-propiolactona (BPL). Para ambos os inativantes houve decréscimo rápido da infectividade e o conteúdo de glicoproteína (cG) total apresentou lenta redução da degradação viral. As amostras A (BEI-12 horas) e B (BPL-6 horas) apresentaram cG insolúvel de 1,92 µg/rnL e 2,02 _glmL, respectivamente e apresentaram resultados satisfatórios nos testes de inativação viral, toxicidade e esterilidade. Para o teste de potência A e B foram sub-divididas em AI e BI (5x concentradas) e A2 e B2 (l10x concentradas), que apresentaram bom desempenho nos testes de controle de qualidade e foram capazes de estimular a resposta imune em camundongos, manifestada pela quantificação de anticorpos IgG e pela proteção ao desafio viral, sugerindo que a metodologia de produção foi adequada à obtenção de uma VRN, compatível com a Vacina de Referência Regional do INPP AZ, podendo ser ampliada para atender à demanda nacional, no NlH.eficiência das vacinas anti-rábicas inativadas comerciais de uso animal, no Brasil, comparative study between quality control tests of antirabies inactiv ated v accines for animal use and experimental production of the national reference v accine for nm / Abstract: The efficiency of anti-rabies inactivated vaccines that are commercialized for animal use, in Brazil, is evaluated by the Habel test, considering =1 04,o/DL 50 for official approval of the lots. The goals of the present study is to compare the NIH ("National Institute of Health") and the indirect ELISA tests to the Habel test and produce the National Reference Vaccine (VRN) experimentally, to be used in the NIH. Two hundred and ten 10ts of vaccine have been tested by the NIH test parallel to the Habel testo The NIH test, following the limits 0,9UI; 0,97UI; 0,98UI; 1,OUI and 1,1 UI approved, respectively, 77,62%; 75,71%; 75,23%; 73,81%; 71,90%, while the Habel test approved 82,38% ofthe 10ts. The cut offvalue determined for the NIH was more than 0,98 DI so 1,0 UI is recomended as the official cut-offvalue. The indirect ELISA was applied in seras of mice immunized with 70 lots of vaccines with varied results in the Habel. The cut off values, the sensibility (8), the specificity (E), the predictable values for positive (VPRP) and negative (VPRN) results and the ratio between positive standard sera and no vaccinated mice sera were determined, so it was decided to adopt in this method the dilution of 1/400 that presents cut-off value of 0,225; 8=97%; E=1O0%; VPRP=100% and VPRN=78%. The National Reference Vaccine (VRN) was produced in BHK cells, C 13, with the Pasteur vírus (PV). The viral suspensions (5!!! BHK) had been titres of 107,66DL 50/rnL in lactents mice and 107,17 DL 50/rnL in young adult mice and 3,10 _g/rnL of total rabies glycoproteins (G). The final volume was divided into samples A and B, tOOt were inactivated, respectively, by binary ethyleneimine (BEI) and by p- propiolactone (BPL). For both inactivants there was a fast decrease ofthe infectivity and a slow decrease ofviral degradation in G contento Sample A (BEI-12 hours) and B (BPL-6 hours) presented insoluble G=1,92 µg/rnL and 2,02 µg/rnL, respectively, as the contents. Both presented satisfactory results in the viral inactivation, in toxicity and in sterility tests. For the potency test, samples A and B were sub-divided into AI and BI (5x concentrated) and into A2 and B2 (l0x concentrated), that presented good response in quality control tests and were capable of inducing immune response in mice, mesured through IgG quantification and protection against the viral challenge, suggesting that the production methodology was adequate to the VRN obtention, compatible to the Regional Reference Vaccine -INPPAZ-, able to be amplified to supply the national request, in the NIH / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Pedro Bertolini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-03T12:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guidolin_Rosalvo_D.pdf: 1712544 bytes, checksum: 88343955c4116ee8b7f33df0f5cacfbf (MD5) Previous issue date: 1976 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed / Doutorado / Doutor em Odontologia

Ticks are implicated in serious economic losses to animal production worldwide in the order of billions of dollars. Although many antigens have been in vaccine tests, none has been effective in the control of ticks, which justifies the development of new antigens as well as new vaccine strategies. Phage Display techniques have been widely employed to map epitope structures, which have served as the basis for developing molecular vaccines. In the present study, we have applied this technique to map specific epitopes of Rhipichephalus (Boophilus) microplus and to validate the peptides as potential immunogens, we have adopted a process of selection prior to final field tests. This strategy was established in order to reduce the number of clones to be tested in the field. Six Phage -displayed random peptide libraries were selected with seven different strategies against the purified hyperimmune serum of chickens (IgY) that were immunized with total proteins of larvae and adults of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The selected Phage clones were sequenced, translated and analyzed through bioinformatics. To evaluate the potential of these phagotopes as effective candidate vaccines, ELISA assays, dot-blot, mice immunization (MI), humoral immune response (HIR) of cattle against the clones and a cutaneous hypersensitivity tests in cattle were performed. The selected Phage clones were analyzed through bioinformatics, generating 107 different peptides in a total of 281 sequences. Some selected phagotopes showed excellent matches with linear sequences of known proteins of the Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Peptides that did not present significant matches with known proteins, but shared extensive homology among each other, were clustered and classified as conformational epitopes of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, or considered as mimotopes of unknown proteic antigens. Among all clones tested by dot-blots, the 40 most reactive ones were further screened by HIR and MI. The mice sera raised against the Phage clones clearly recognized tick proteins indicating that the phagotope-induced immune responses were antigen-specific, but not all could be identified by the sera of naturally infested cattle (Bos taurus and Bos indicus). Four clones were then selected to go through the cutaneous hypersensitivity tests, and apparently all of them were effectives at diferent degrees. The stringent selection processes coupled with this schemes of validation assays allowed us to narrow down the number of peptides that should be tested in the field. One of the advantages of using whole recombinant M13 virus, carrying the recombinant peptide in fusion with the pIII protein of the virus, is that its capsid acts as adjuvant and could be tested directly without any further mixture. Additionally, we have finally used anergy skin tests (cutaneous hypersensitivity tests) once they are sometimes used to guide clinical decisions. We have assumed that cutaneous hypersensitivity tests measure a common property of cellular immune function relevant to the outcome, which together with the humoral response in naturally infested animals may provide us with sequences of peptides that may be relevant as vaccines. Finally, we have used those sequences to produce multiple antigen peptide system (MAPS), which will be used in future field tests. The present work demonstrates that the whole epitope profile can obtained through screening the Phage Displayed peptide libraries with the hyperimmune serum and reveals the potential of using epitopedisplaying Phage s as peptide vaccines against ticks. / Os carrapatos tem provocado significativas perdas econômicas na produção animal mundial na ordem de bilhões de dólares anuais. Embora vários antígenos específicos tenham sido empregados em testes vacinais, nenhum tem propiciado controle eficaz, sendo necessária a identificação de novos antígenos, bem como de novas estratégias vacinais. A tecnologia de Phage Display tem sido amplamente empregada no mapeamento de estruturas antigênicas as quais tem servido como base para o desenvolvimento de vacinas moleculares e representa uma alternativa as metodologias tradicionais. No presente trabalho, utilizou-se a tecnologia para o mapeamento de epítopos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus e, para validar os peptídeos selecionados como potencial imunógenos, foi adotado um processo com múltiplas etapas de caracterização dos clones previamente aos ensaios clínicos. Esta estratégia foi estabelecida com o objetivo de reduzir o número de clones a ser testados em bovinos como imunógenos candidatos. Foram utilizadas para a seleção seis bibliotecas distintas de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos e sete estratégias de seleção contra as imunoglobulinas (IgY) purificadas de soro hiperimune de galinhas imunizadas com proteínas totais de larvas e adultos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. As seqüências do DNA correspondente aos insertos dos fagos selecionados foram seqüenciados, traduzidos e analisados por análises in silico. Foram realizados testes de ELISA, Dot-Blot, imunização em camundongos, determinação da resposta imune humoral de bovinos naturalmente infestados, e a medição da hipersensibilidade cutânea com o objetivo de evoluir o potencial destes fagotopos como candidatos efetivos a novos imunógenos. Foram gerados 107 peptídeos distintos em um total de 281 seqüências, sendo alguns destes similares às seqüências protéicas lineares do Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Os peptídeos sem similaridades significativas com proteínas conhecidas, mas que apresentaram seqüências consenso entre os peptídeos obtidos, foram agrupados e classificados como epítopos conformacionais ou considerados como mimetopos de antígenos protéicos desconhecidos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entre os clones testados por Dot-Blot, os 40 mais reativos foram posteriormente testados em ensaios de imunização em camundongos e também submetidos ao reconhecimento humoral de bovinos naturalmente infestados com carrapatos. Adicionalmente, utilizou-se o teste cutâneo de hipersensibilidade para a análise da imunidade celular. Os soros de camundongos imunizados com os clones de fagos foram reativos as proteínas de carrapato indicando que os fagotopos foram capazes de gerar resposta imune antígeno específica, embora nem todos os fagos fossem reconhecidos pelo soro de animais naturalmente infestados (Bos taurus e Bos indicus). Após a caracterização e validação, quatro fagotopos foram escolhidos para a realização dos testes cutâneos, os quais apresentaram graus variados de reatividade. Uma das vantagens da utilização do vírus M13 recombinante, contendo o peptídeo recombinante fusionado na proteína PIII do vírus, é que o próprio capsídio atua como adjuvante e pode ser testado diretamente após a seleção sem procedimentos adicionais de preparo do antígeno. Finalmente, as seqüências determinadas foram utilizadas para a produção e expressão de um sistema recombinante de múltiplos antígenos peptídicos (MAPS). Foram escolhidos 10 peptideos para a expressão na forma de multi-epitopos, os quais serão futuramente utilizados em ensaios clínicos. O presente trabalho demonstrou que um perfil geral dos epítopos pode ser obtido através da utilização de bibliotecas de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos contra anticorpos obtidos de soro hiperimune e revela o potencial da seleção e utilização peptídeos epítopos específicos como potenciais vacinas recombinantes multiantigênicas para o controle do carrapato bovino. / Doutor em Genética e Bioquímica

Com o objetivo de otimizar a avaliação de eficácia de vacinas contra o sarampo, discriminando-se imunização primária de secundária com uma única amostra pós-vacinal, o teste de avidez de anticorpos lgG anti-sarampo foi padronizado e avaliado no presente estudo. Aplicando-se a técnica de ELISA e a uréia 7M durante 10 minutos como agente dissociante da ligação antígeno-anticorpo, determinou-se o cut-off do baixo índice de avidez (BIA) para definição de primo-vacinação como 29 por cento e o tempo adequado de coleta da amostra pós-vacinal como 1O semanas. Observou-se BIA em todas as 164 amostras de soro colhidas até 1O semanas após primo- vacinação aos 9 meses com as vacinas Biken-CAM 70 e Edmonston-Zagreb. Após primo-vacinação aos 9 meses com a vacina Schwarz, BIA foi detectado em 233 das 242 (96,3 por cento) amostras colhidas em papel de filtro. No grupo de 41 crianças vacinadas que apresentavam história prévia de vacinação e/ou anticorpos na amostra pré-vacinal (reinfecção), 39/41 (95,1 por cento) das amostras apresentaram altos índices de avidez. Falhas vacinais primária e secundária foram detectadas, respectivamente, em 1/5 e 4/5 amostras de crianças que tinham história de vacinação, mas ausência de anticorpos na amostra pré-vacinal. Nenhuma das 90 amostras de crianças vacinadas no passado com 2 doses da vacina Biken-CAM70 (aos 6 e 11 meses) e nenhum dos 42 soros de cordão umbilical, apresentou BIA. Conclui-se que a determinação da avidez de anticorpos lgG contra o vírus do sarampo, pela técnica utilizada no presente estudo é altamente eficaz na discriminação entre primo-vacinação e reinfecção ou infecção passada, podendo ser utilizada na avaliação de eficácia de vacinas contra o sarampo empregando-se apenas uma amostra pós-vacinal. / In an attempt to improve methods for evaluation of measles vaccine efficacy, by discriminating primary from secondary immunization with only one post- vaccination sample, a measles lgG antibody avidity assay was standardized and evaluated. Using ELISA and treatment with 7M urea for 1O minutes to dissociate antigen- antibody bounds, the cut-off of low avidity indices (LAI) after primary measles vaccination was defined as 29 per cent and 1O weeks as the term for collection of post- vaccination samples. Low avidity indices were observed in all 164 samples collected up to 1 O weeks after primary vaccination at 9 months with Biken-CAM70 and Edmonston-Zagreb vaccines. After vaccination with Schwarz vaccine, LAI were detected in 233 of 242 (96.3 per cent) filter paper blood samples. In the group of 41 vaccinated children who had a history of previous vaccination and/or measles antibody in pre-vaccination samples (reinfection), all but two (95,1 per cent) presented high avidity indices. Primary and secondary measles vaccine failures were detected, respectively, in 1/4 and 4/5 children who had a history of previous vaccination but no measles antibody was detected in pre-vaccination samples. None of 90 children vaccinated in the past with 2 doses of measles vaccine (at 6 and 11 months) and none of 42 cord sera had LAI. We conclude that the measles antibody avidity antibody assay presented in this study is highly efficient in discriminating primary vaccination from reinfection or past infection and can be applied in the evaluation of measles vaccine efficacy, using only one post-vaccination sample.