En 1989, près de quinze ans après la mise en évidence d’une forme d’hépatite virale « non A-non B », le virus de l’hépatite C (VHC) a pu être isolé et son génome séquencé. En presque vingt ans, de nombreuses avancées techniques majeures ont permis de mieux comprendre le cycle de réplication de ce virus. Cependant, l’infection par ce virus représente actuellement la première indication de transplantation hépatique dans les pays industrialisés. On estime que 3% de la population mondiale est constituée de porteurs chroniques du VHC ; faisant de cette maladie un problème majeur de santé publique. De plus, même si des thérapies anti-virales sont disponibles pour enrayer la réplication du VHC, ces traitements ne sont vraiment efficaces que pour la moitié des patients traités. Malgré une recherche intensive, il n’existe toujours pas de vaccin préventif contre le VHC ayant fait la preuve définitive de son efficacité. La plupart des candidats vaccins en développement reposent sur l’utilisation de formes tronquées des protéines d’enveloppe du virus, constituant des immunogènes probablement moins pertinents que les formes complètes retrouvées sur l’enveloppe virale. L’objectif de ce travail de thèse a donc été de développer et de produire des particules dites sous-virales d’enveloppe constituées uniquement de l’enveloppe lipoprotéique du virus comme candidat vaccin potentiel contre le VHC, en exploitant les stratégies utilisées pour la production du vaccin contre le virus de l’hépatite B (VHB). En effet, le vaccin contre l’hépatite B repose sur la capacité de la petite protéine d’enveloppe S du VHB à générer spontanément des particules d’enveloppe vides sécrétées et non infectieuses. L’utilisation de ces particules comme vaccin a fait ses preuves depuis maintenant plus de vingt ans. Au cours de ce travail, nous avons dans un premier temps développé un modèle d’étude de la morphogenèse de ces particules sous-virales du VHB, basé sur la production de la protéine S du virus à l’aide d’un vecteur dérivé du génome du virus de la Forêt de Semliki (SFV). Ce modèle s’est avéré déterminant pour apporter des informations originales sur la morphogenèse et le trafic intracellulaire des particules sous-virales d’enveloppe du VHB. Nous avons pu montré que le bourgeonnement de ces particules au sein du réticulum endoplasmique (RE) se fait initialement sous forme de structures filamenteuses ; contrairement à ce qui était présumé dans le modèle couramment admis. Empaquetés et transportés vers un compartiment intermédiaire entre le RE et l’appareil de Golgi (ERGIC), ces filaments sont ensuite convertis en particules sphériques qui seront sécrétées. Dans un second temps, ce modèle nous a permis d’étudier les capacités d’assemblage en particules sous-virales d’enveloppe de différentes protéines chimères d’enveloppe VHC-VHB. Nous avons démontré que ces protéines de fusion, contenant la totalité de la protéine d’enveloppe E1 ou E2 du VHC, étaient capables de s’assembler puis d’être sécrétées sous forme particulaire lorsqu’elles étaient co-produites avec la protéine S sauvage du VHB. De telles particules, morphologiquement similaires à celles du vaccin contre l’hépatite B, pourraient donc constituer la base d’un vaccin prototype. Le système d’expression transitoire utilisé pour ces expériences ne permettant pas de produire ces particules en grande quantité, des clones cellulaires de la lignée CHO produisant de manière stable les particules d’enveloppe chimèriques ont été développés. Si comme nous l’espérons ce vaccin prototype donnait des résultats encourageants, sa production pourrait s’appuyer à terme sur les procédures industrielles existantes pour la production du vaccin contre le VHB, dans le but d’obtenir à grande échelle un vaccin protégeant à la fois contre l’hépatite B et l’hépatite C. / N/a

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-05-08T17:15:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Nut_ Ana Paula Paim.pdf: 642640 bytes, checksum: a0d21dd2552dd3082aca1cdae9a91c10 (MD5) / Approved for entry into archive by Flávia Ferreira(flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-05-29T19:58:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Nut_ Ana Paula Paim.pdf: 642640 bytes, checksum: a0d21dd2552dd3082aca1cdae9a91c10 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-29T19:58:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Nut_ Ana Paula Paim.pdf: 642640 bytes, checksum: a0d21dd2552dd3082aca1cdae9a91c10 (MD5) / Os vírus da hepatite C e HIV ocasionam repercussões metabólicas importantes, no curso da infecção crônica, principalmente a resistência insulínica e Diabetes Mellitus. Artigos recentes, envolvendo investigações entre pacientes portadores do vírus C mono ou coinfectados com o HIV, mostraram por meio da variável peso, relações com a progressão da doença. Estas relações não consideraram as diferentes distribuições de massa magra e adiposa. Objetivo: Avaliar a composição corpórea e perfil bioquímico de pacientes mono e coinfectados com os vírus VHC e HIV correlacionando-os ao estadiamento histológico da doença hepática crônica. Metodologia: Estudo transversal realizado com 231doentes, sendo 142 portadores de VHC, 44 de HIV e 45 coinfectados com VHC e HIV. Foram aferidas medidas antropométricas e registrados os dados demográficos, de estilo de vida, perfil bioquímico, genótipo, contagem de células CD4, carga viral do HIV e estadiamento histológico para análise comparativa entre os três grupos. Foram excluídos indivíduos com outra coinfecção, menores de 18 anos e àqueles em uso de Interferon e Ribavirina. Resultados: A média de idade foi de 47,2 anos, sendo 60% do gênero masculino. Dos 187 pacientes portadores do VHC 80% eram do Genótipo 1 (n=110). O IMC foi predominantemente de eutrofia e a circunferência da cintura estava adequada na maioria dos pacientes inclusos nos três grupos. A proporção de massa adiposa foi maior no grupo VHC representada pela Prega Cutânea Triciptal com média igual a 15,1±8,8 seguida do grupo VHC/HIV=10,3±5,2 e HIV=11,5±5,8 p<0,001, obtida pelo Somatório das quatro pregas (triciptal, biciptal, suprailíaca e subescapular) do VHC=63,7±26,9, VHC/HIV=49,3±24 e HIV=53,4±25,6 p<0,001 e, pelo percentual de Gordura Corpórea Total do VHC=29,7±8,7, VHC/HIV=25±8,6 e HIV=25,3±8,2 p=0,003. O Grau de Inflamação ou de fibrose e a relação do estadiamento da doença com as variáveis antropométricas não apresentaram diferenças significantes entre os grupos com VHC. Porém observamos relação entre o grau de fibrose e idade, onde 71,4% dos idosos apresentaram uma maior prevalência de fibrose em estádio mais avançado F3 e F4 (n=15) quando comparado a 33,7% dos adultos (n=28) p=0,002 . O grau de Fibrose F3 e F4 também foi associado ao menor nível de HDL sérico 53,8% (n=28) p=0,009. Colesterol Total (CT) 200 esteve presente em 33,3% dos mono-infectados com HIV seguidos por 14,9% em VHC e 12,9% dos pacientes com VHC/HIV p=0,041, enquanto que o LDLc 130 foi mais prevalente no grupo infectado com o HIV(36%) do que com VHC(10,7%) e VHC/HIV(11,1%) p=0,003. O HDLc apresentou maior inadequação no grupo HIV(64,3%) seguido de VHC/HIV(58,1%) e VHC(49,6%) porém p=0,069. Conclusão: Existem diferenças na composição corpórea e perfil lipídico entre os pacientes mono e coinfectados com os vírus da Hepatite C e HIV, sendo o VHC o grupo com maior proporção de tecido adiposo. As variáveis antropométricas não apresentaram correlação com o grau de inflamação ou de fibrose. Os níveis aumentados de CT, LDLc e reduzidos HDLc nos pacientes infectados com o HIV mostraram que na era HAART o perfil lipídico deste grupo de pacientes permanece mais alterado quando comparado aos pacientes mono ou coinfectados com o VHC. / Salvador

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-18T19:50:32Z No. of bitstreams: 1 Felicidade Mota Pereira Avaliação da utilização do teste....pdf: 1069374 bytes, checksum: 6d5e3ef5ace61dfaf117c001157d5cec (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-18T19:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felicidade Mota Pereira Avaliação da utilização do teste....pdf: 1069374 bytes, checksum: 6d5e3ef5ace61dfaf117c001157d5cec (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) é comumente assintomática e apresenta uma elevada taxa de cronicidade, podendo evoluir para cirrose e carcinoma hepatocelular. O diagnóstico da hepatite C é realizado através da pesquisa de anticorpos pelo teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) e confirmado por testes suplementares, tais como o RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) e westernblot e teste confirmatório, como a pesquisa do VHC-RNA. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do RIBA no diagnóstico da infecção pelo VHC em doadores de sangue com anti-VHC reagente. Foram analisadas 102 amostras com resultado de anti-VHC reagente na HEMOBA, utilizando-se o teste anti-VHC Architect Abbott por quimioluminescência para detecção dos anticorpos anti-VHC, o RIBA III (CHIRON) como teste suplementar para as amostras anti-VHC reagentes e indeterminadas e a Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) convencional ou em tempo real (Amplicor Roche) para detecção do VHC-RNA. As amostras com VHC-RNA detectável foram genotipadas por hibridização reversa (LIPA; SIEMENS). Das 102 amostras analisadas no LACEN, 38,2% (39/102) foram reagentes, 57,8% (59/102) foram não reagentes e 3,9% (4/102) foram indeterminadas para o anti-VHC. Os resultados do RIBA foram 58,1% (25/43) positivos, 9,3% (4/43) negativos e 32,6% (14/43) indeterminados. Todas as amostras com resultado de RIBA indeterminado tiveram carga viral indetectável. As bandas predominantes nas amostras indeterminadas foram c33 e c22. Das amostras indeterminadas no RIBA, repetidas após seis meses com nova coleta, 20% (2/10) negativaram e 71,4% (10/14) permaneceram RIBA indeterminado. Destas, (8/10) continuaram indeterminadas com o mesmo padrão de bandas. O VHC-RNA foi realizado em todas as amostras do estudo (102) e foi detectável em apenas 22,5% (23/102). Todas as amostras com VHC-RNA detectável foram RIBA positivo e tinham índex maior que cinco na relação S/CO. Em apenas duas amostras que tiveram resultado de RIBA positivo, o VHC-RNA não foi detectado. As 23 amostras com VHC-RNA detectável foram genotipadas, sendo 78,3% (18/23) do genótipo 1, 17,4% (4/23) do genótipo 3 e 4,3% (1/23) do genótipo 2. A positividade do anti-VHC associou-se com o uso de droga intranasal (< 0,001), com drogas injetáveis (< 0,001)) e ocorrência de DST (< 0,05). Diante dos resultados encontrados, observa-se que o RIBA apresenta um elevado número de resultados indeterminados, sendo necessária a realização do VHC-RNA para a confirmação da infecção pelo VHC. Indivíduos com resultado de anti-VHC índex menor que cinco e resultado de RIBA indeterminado têm grande probabilidade de não apresentarem o VHC-RNA detectável e portanto, de não estarem infectados pelo VHC, mas devem ser acompanhados sorologicamente, de acordo com o critério médico. / The hepatitis C virus (HCV) infection is usually asymptomatic and has a high rate of chronicity, which may progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The hepatitis C diagnosis is realized by antibodies research using ELISA test (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) and confirmed by additional serological tests, such as RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) and westernblot, and confirmatory test, like HCV-RNA research. The objective of this study was to evaluate the RIBA efficacy in the diagnosis of HCV infection in blood donors with anti-HCV reagent. Were analyzed 102 samples with anti-HCV reagent in HEMOBA using the anti-HCV test Abbott Architect chemiluminescence for detection of anti-HCV antibodies, the RIBA III (Chiron) as a supplemental test for anti-HCV reactive and indeterminate samples and the Polymerase Chain Reaction test (RT-PCR) conventional or realtime (Roche Amplicor) for HCV-RNA detection. Samples with HCV-RNA detectable were genotyped by reverse hybridization (LIPA SIEMENS). Of the 102 samples analyzed in LACEN 38.2% (39/102) were positive, 57.8% (59/102) were negative and 3.9% (4 / 102) were indeterminate for anti-HCV. The RIBA results were 58.1% (25/43) positive, 9.3% (4 / 43) negative and 32.6% (14/43) indeterminate. All samples with indeterminate RIBA results had undetectable viral load. The predominant bands in the indeterminate RIBA samples were c33 and c22. Of the RIBA indeterminate samples, repeated after six months with a new collection, 20% (2 / 10) became negative and 71.4% (10/14) remained indeterminate. Of these, (8 / 10) remained undetermined with the same banding pattern. HCV-RNA was performed in all study samples (102) and was detectable in only 22.5% (23/102). All samples with detectable HCV-RNA were RIBA positive and had more than five in the ratio index S / CO. Only two samples had RIBA positive results with HCV-RNA not detected. The 23 samples with detectable HCV-RNA were genotyped, and 78.3% (18/23) were genotype 1, 17.4% (4 / 23) genotype 3 and 4.3% (1 / 23) genotype 2 . The anti-HCV positivity was associated with intranasal drug use (p<0.001), injectable drugs (p<0.001)) and STDs (p<0.05). Given the results, it is noted that the RIBA has a high number of indeterminate results, requiring the HCVRNA detection for HCV infection confirmation. Individuals with anti-HCV index below five, and indeterminate RIBA results are likely undetectable HCV-RNA and therefore are not infected with HCV, but must be serologically accompanied, according to medical criteria.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-03-04T14:47:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Marcelo Costa Silva.pdf: 1474279 bytes, checksum: a5754792847599a84503f55508f0a64d (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2016-04-20T12:24:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Marcelo Costa Silva.pdf: 1474279 bytes, checksum: a5754792847599a84503f55508f0a64d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T12:24:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Marcelo Costa Silva.pdf: 1474279 bytes, checksum: a5754792847599a84503f55508f0a64d (MD5) / INTRODUÇÃO: A literatura é pobre quanto ao tema da coinfecção pelo vírus C da hepatite com o vírus linfotrópico de células T do tipo 1 (HTLV-1). Os poucos estudos encontrados não esclarecem os mecanismos que envolvem essa coinfecção e os efeitos da infecção pelo vírus HTLV-1 em pacientes com infecção crônica pelo vírus C da hepatite não é conhecido. A doença pelo vírus C da hepatite é dependente de uma série de fatores que podem determinar sua evolução mais grave. A infecção pelo HTLV-1 determina uma resposta imunológica exacerbada no organismo infectado pela ativação da resposta do tipo 1 (Th1), interferindo na evolução de algumas doenças infecciosas. O ambiente de estudo é propício por ser o Estado da Bahia (Brasil) considerada área de alta prevalência para as duas infecções. OBJETIVO: Avaliar clinicamente o efeito da infecção pelo HTLV-1 em pacientes portadores de infecção crônica pelo vírus C da hepatite. MÉTODOS: Selecionaramse 31 pacientes coinfectados com o vírus HTLV-1 e pelo vírus C da hepatite; foram avaliados do ponto de vista clínico, epidemiológico, bioquímico e histológico, e comparados com um grupo de 64 pacientes com infecção única pelo vírus C da hepatite (hepatite C crônica), que constituiu o grupo controle. RESULTADOS: O grupo foi semelhante do ponto de vista demográfico. O grupo monoinfectado pelo VHC apresentou mais sinais clínicos de doença crônica de fígado e mais fibrose no tecido hepático. A avaliação bioquímica mostrou paciente em monoinfecção com transaminases em níveis mais elevados. A resposta ao tratamento antiviral para o vírus C da hepatite, com interferon peguilado associado à ribavirina, foi semelhante nos dois grupos avaliados. CONCLUSÃO: O estudo mostra que os pacientes portadores da infecção única pelo vírus C da hepatite, apresentam doença hepática mais avançada, com mais sinais de doença avançada do fígado e mais fibrose no tecido hepático. A infecção pelo vírus HTLV-1 em pacientes com infecção pelo vírus C da hepatite está relacionada com desenvolvimento de doenças mais leves em coinfectados. o que poderia ser explicado pela resposta TH1 determinada pelo vírus HTLV-1.

La stéatose hépatocytaire, définie par l’accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, est fréquente au cours de l’hépatite chronique C. La stéatose peut être induite par le VHC de génotype 3 et constitue alors une lésion cytopathique virale au cours de l’hépatite chronique C. Cette observation clinique suggère que la stéatose viro-induite est liée à la fonction d’une ou de plusieurs protéine(s) virale(s) du génotype 3 rarement portée par les protéines correspondantes de génotype non-3. L’objectif de ce travail a été d’identifier des déterminants viraux de la stéatose hépatocytaire viro-induite au cours de l’hépatite chronique C et entrevoir les mécanismes impliqués dans cette pathologie. Des analyses menées sur des séquences de VHC strictement sélectionnés pour leur génotype et leur capacité à induire une stéatose chez les patients atteints d’hépatite chronique C, ont permis de mettre en évidence des déterminants putatifs de la stéatose viro-induite. Des résidus associés au caractère stéatogène ou non stéatogène des séquences de VHC étudiées ont été identifiés dans les régions codant E1, E2 et NS3. Le caractère partiel de la compartimentation de ces mutations nécessite toutefois une étude fonctionnelle de ces séquences pour valider leur pertinence. Le motif FATG164-167 de la protéine de capside, qui a été impliqué dans l’accumulation spécifique de triglycérides par la protéine de capside, se révèle caractéristique du génotype 3 et non associé à un pouvoir stéatogène in vivo. Nous avons examiné, in vitro, selon le génotype de la protéine virale et son association avec une stéatose in vivo, d’une part les interactions entre les gouttelettes lipidiques et les protéines de capside, et d’autre part les changements morphologiques des gouttelettes lipidiques liés à l’expression de la protéine de Capside. Ces travaux montrent que les protéines de Capside de génotypes 1b et 3a sont localisées de manière similaire à la surface des gouttelettes lipidiques indépendamment du caractère stéatogènes de VHC dont elles sont issues. Néanmoins, l’expression de la protéine de capside de génotype 3 est associée à la formation de gouttelettes lipidiques plus grosses et plus nombreuses par rapport à celles de génotype 1b. Ces résultats suggèrent que l’interaction de la protéine de Capside avec les gouttelettes lipidiques pourrait jouer un rôle dans l’induction d’une stéatose par le VHC de génotype 3. L’absence de différences génétique ou fonctionnelle entre les protéines de Capside de génotype 3 issues de VHC stéatogène ou non stéatogène in vivo suggèrent cependant que d’autres protéines virales et/ou facteurs cellulaires doivent certainement être impliqués dans le développement d’une stéatose hépatocytaire chez les patients infectés par un VHC de génotype 3a / Hepatocellular steatosis is common in patients with chronic hepatitis C. Steatosis can be considered as a true cytopathic lesion induced by hepatitis C virus genotype 3, suggesting that one or more viral proteins produced during genotype 3 infection are involved in the steatogenic process, while the same proteins produced during infection by other genotypes are not. Our objective was to identify the viral determinants of HCV-induced steatosis and to understand the underlying mechanisms. Extensive analysis performed on HCV sequences selected on their genotype and their association with in vivo steatosis are revealed putative viral determinants of viral-induced steatosis in E1-E2 and NS3 proteins coding regions. However, we can not rule out the potential role of these positions in HCV-induced steatosis and experimental study should be drawn to explore this issue. In addition, the FATG164-167 motif, which has been implicated in HCV core protein induced steatosis, was constantly present on genotype 3a sequences independently of the original presence or absence of liver steatosis. We examined in vitro interactions between lipid droplets and full-length core protein isolated from patients with HCV genotype 3a infection, with and without steatosis, and from steatosis-free patients infected by hepatitis C HCV 1b. We also examined morphological changes in the lipid droplets according to the HCV genotype and the presence of steatosis in vivo. We showed that the core protein of both HCV genotypes 1b and 3a binds tightly to the surface of intracellular lipid droplets. However, cells transfected with genotype 3a contain more neutral lipids in lipid droplets, and more large lipid droplets, than cells transfected with genotype 1b sequences. This suggests that hepatitis C virus core protein-lipid droplet interaction could play a role in virus-induced steatosis. Importantly, we found no genetic or functional differences between genotype 3a core proteins from patients with and without hepatitis C virus-induced steatosis. This suggests that other viral proteins and/or host factors are involved in the development of hepatocellular steatosis in patients infected by hepatitis C virus genotype 3a

El virus de la hepatitis C (VHC) constituye la causa más prevalente de hepatitis crónica en los países desarrollados. El principal fármaco en el tratamiento de la hepatitis crónica C es el interferón. La monitorización de la respuesta a la terapia se basa en la evolución de los niveles de ALT, aunque más recientemente el desarrollo de técnicas de detección molecular del ARN del VHC ha permitido establecer la dinámica viral de la respuesta al tratamiento con interferón. En 1998 fueron publicados varios estudios que demostraron que la terapia combinada de interferón más ribavirina era más eficaz que el interferón. La dinámica viral de la respuesta a la terapia combinada no ha sido establecida. El objetivo de esta tesis es la valoración de la utilidad de la determinación del ARN de VHC durante la terapia antiviral como predictor de respuesta mantenida. Para conseguir este objetivo hemos llevado a cabo tres estudios.A) Para la evaluación de unas técnicas de RT/PCR de segunda generación en sus versiones cualitativa (Amplicor v2.0) y cuantitativa (Monitor v2.0) utilizamos tres tipos de muestras: donantes de sangre con anticuerpos Anti-VHC pero ARN no detectable por una técnica cualitativa de primera generación (n=132), pacientes con hepatitis crónica C (n=326) y diluciones de un estándar de VHC de concentración conocida. El límite inferior de detección fue de 100 copias de estándar del VHC /mL para Amplicor v2.0 y de 1000 copias/mL para Amplicor v1.0. De los 132 donantes de sangre con serología anti-VHC positiva y ARN del VHC indetectable por Amplicor v1.0, en 6 (5%) casos se detectó ARN del VHC utilizando Amplicor v2.0. La carga viral según Monitor v2.0 fue mayor que la obtenida mediante Monitor v1.0 para todos los genotipos. No hubo diferencias entre las cargas virales medias de los genotipos 1, 2 y 3 al utilizar Monitor v2.0, mientras que la carga viral del genotipo 4 fue inferior al resto. Se ha descrito que Monitor 1.0 subestima la carga viral en los genotipos 2 y 3 con respecto al genotipo 1. En cambio Monitor v2.0 cuantifica por igual los genotipos 1, 2 y 3. Además ha reducido la diferencia entre el genotipo 4 y el resto de 1.5 log a 0.5 log. En conjunto las técnicas de segunda generación son más sensibles en un logaritmo y menos genotipo dependientes que las de primer generación. B) Fueron incluidos 184 pacientes afectos de hepatitis la crónica C que habían seguido tratamiento antiviral: 62 pacientes con interferón y 122 pacientes con interferón más ribavirina. En ambos grupos ALT y ARN de VHC se determinaron mensualmente. La respuesta mantenida ocurrió en 13 (22%) pacientes en el grupo de interferón y 21 pacientes (17%) en el grupo de terapia combinada. La persistencia de viremia cualitativa tras un mes de interferón monoterapia y tras cinco mes de terapia combinada eran los predictores más potentes de no respuesta (valor predictivo negativo de 100% y 99%, respectivamente). Las variables asociadas con la respuesta mantenida eran HCV genotipo (P=0.06), carga viral < 5.1 log/ml (P=0.005) y ARN VHC no detectable tras un mes (P<0.0001) en el grupo de interferón monoterapia; sexo femenino (P=0.04), genotipo (P=0.03), la carga viral < 5.5 log/ml (P=0.01), ALT normal (P=0.001) y descenso en la carga viral >1.2 log/ml después de 2 meses de interferón monoterapia (P<0.001) y viremia negativa tras cinco meses de terapia combinada (P<0.0001) en el grupo de tratamiento combinado. La evaluación cualitativa de ARN de VHC durante el tratamiento es el predictor más potente de respuesta mantenida de la hepatitis crónica C.C) Se incluyeron 30 pacientes que habían seguido tratamiento con interferón-"2b más ribavirina durante 12 meses. Seis meses tras la retirada de la terapia 10 pacientes presentaron una respuesta mantenida y los otros 20 fueron considerados no respondedores. Se determinó la carga viral basal, al mes, dos meses y tres meses de tratamiento mediante una RT/PCR cuantitativa calibrada en unidades internacionales (Amplicor HCV Monitor v2.0). La carga viral no mostró variaciones significativas en los pacientes no respondedores durante los primeros meses de terapia combinada (6.3±0.7 versus 6±0.9, 5,7±1 and 5,9±0.9 log UI/mL al inicio y tras uno, dos y tres meses, respectivamente). Sin embargo la carga viral de los pacientes que presentaron respuesta mantenida disminuyó progresivamente en cada muestra mensual, llegando a ser indetectable al tercer mes en todos los pacientes. Se construyeron curvas COR referentes a la carga viral en los meses 1, 2 y 3 para predicción de respuesta mantenida. Fueron detectados los siguientes picos de sensibilidad: 5 log/mL en el mes 1, 4 log/mL en el mes 2 y 3 log/mL en el mes 3. La carga viral durante los tres primeros meses de tratamiento con interferón y ribavirina es el predictor de respuesta más potente. / The hepatitis C virus (HCV), a single-stranded RNA virus, is the etiologic agent in most cases of post-transfusion and sporadic non-A, non-B hepatitis worldwide. This infection has a high rate of persistence and progression to chronic liver disease. HCV infection is a leading cause of end-stage liver disease requiring liver transplantation, and is also associated with hepatocellular carcinoma. To evaluate the utility of monitoring RNA HCV levels during antiviral therapy as predictor of long-term response, we have done three studies.A) HCV RNA qualitative and quantitative second generation assays (Amplicor HCV v2.0 and Amplicor HCV Monitor v2.0, respectively) have been evaluated by testing serum samples from 132 blood donors anti-HCV positive HCV RNA negative by first generation qualitative assay and 326 viremic patients. An HCV RNA transcript was synthesized and ten-fold dilutions were used to assess sensitivity. Second generation assays were one log more sensitive than their respective first generation tests (102 copies/ml vs. 103 for the qualitative tests; 103 copies/ml vs. 104 for the quantitative tests). From the 132 anti-HCV positive RNA negative subjects, 6 (5%) were positive by Amplicor v2.0. Quantification figures by Monitor v2.0 were similar in genotypes 1, 2 and 3, whereas Monitor 1.0 values were higher in genotype 1 than in genotype 2 or 3. In 114 patients, branched-DNA v2.0 obtained higher values than Monitor v2.0 and Monitor v1.0 (6.6+0.6 log RNA copies/ml, 6.4+0.6, and 5.3+0.7, respectively, P<0.001). HCV RNA qualitative and quantitative second generation assays are more sensitive and genotype independent than first generation assays.B) One hundred and eighty-four patients with chronic hepatitis C treated with interferon alone (62 patients) or interferon plus ribavirin (122 patients) for 12 months were studied. In both groups aminotransferase and HCV RNA were tested weekly for one month, biweekly for two months and monthly thereafter. Sustained response ocurred in 13 (22%) and 21 patients (17%) in the interferon and combination group, respectively. Persistence of viremia at one month of interferon monotherapy and at five month of combination therapy were the strongest predictors of non-response (predictive value of 100% and 99%, respectively; 95% confidence interval 93.2-99.9%). Independent variables associated with sustained response were HCV genotype (P=0.06), viral load £ 5.1 logs/ml (P=0.005) and negative HCV RNA at one month (P<0.0001) in the interferon group. And female sex (P=0.04), genotype (P=0.03), viral load £ 5.5 logs/ml (P=0.01), normal ALT (P=0.001) and decline in viral load *1.2 logs/ml after 2 months of interferon monotherapy f(P<0.001) and negative viremia at five months of ribavirin onset (P<0.0001) in the combination group. Qualitative assessment of HCV RNA during treatment is the strongest predictor of sustained response during interferon or combination therapy for chronic hepatitis C.C) The dynamics of hepatitis C virus RNA during treatment with interferon plus ribavirin are not well known. We evaluated the predictive value of HCV RNA early decline during combination therapy. Thirty chronic hepatitis C patients that had followed interferon plus ribavirin for twelve months were included. Serum HCV RNA was measured in sera obtained at baseline and at 4, 8 and 12 weeks after initiation of treatment using a second generation commercially available quantitative RT/PCR assay. After six months of postherapy follow-up 10 (33%) patients were considered sustained responders and 20 (66%) non responders. While in non responders HCV RNA levels remained stable during the first three months of treatment (6.3±0.7 versus 6±0.9, 5,7±1 and 5,9±0.9 log10 HCV RNA IU/mL at baseline and at weeks 4, 8 and 12 respectively) sustained responders showed significant declines in viral load at each subsequent sample (rHCV RNA of 3.5±1.6 log10 IU/mL, 5.1±1.7, and 6±0.9 at weeks 4,8 and 12 respectively). At week 12 all sustained responders had HCV RNA levels below 600 IU/mL, as compared to only one of 20 non responders (P<0.001). ROC curves of HCV RNA level for sustained response prediction identified sensitivity peaks (5 log at 4 weeks, 4 log at 8 weeks and 3 log at 12 weeks) with 100% negative predictive value. Our results suggest that HCV RNA levels during the first three months of combination therapy for chronic hepatitis C are the strongest predictors of response.

En esta tesis, se recogen los resultados de un estudio aleatorizado y comparativo llevado a cabo en nuestro centro, en el que se demuestra que la combinación de peginterferon alfa-2b y ribavirina es igual de segura y más eficaz que el interferón convencional y la ribavirina para el tratamiento del VHC en pacientes coinfectados por VIH. Es preciso destacar la importancia de la monitorización durante el tratamiento las manifestaciones clínicas secundarias a toxicidad mitocondrial, asociada con la co-administración de ribavirina y determinados fármacos antiretrovirales, sobre todo con didanosina, que debe ser evitada. Finalmente, destaca la importancia práctica de la monitorización de la dinámica de respuesta durante las primeras semanas de tratamiento. Así, la respuesta virológica observada en las semanas 4ª, 8ª y 12ª nos permite detectar a los pacientes sin posibilidad respuesta virológica a los que podremos suspender precozmente el tratamiento. Este hecho, aparte del ahorro económico que supone, tiene especial relevancia en los pacientes coinfectados por el mayor riesgo de toxicidad asociado al tratamiento concomitante de ambas infecciones. Además, nuestros resultados cuestionan la validez de un reciente documento de consenso en el que se aconseja tratar a todos los pacientes coinfectados por VIH durante 48 semanas con independencia del genotipo del VHC. En este estudio, los pacientes con genotipo 3 que muestran una respuesta virológica rápida (ARN VHC indetectable en la semana 4ª de tratamiento) pueden ser tratados durante 24 semanas con un riesgo de recidiva muy bajo. Aun considerando las limitaciones de este estudio como el limitado número de pacientes con genotipo 3 incluido y el análisis post-hoc de los datos, estos resultados sugieren que la monitorización de la respuesta virológica en la 4ª semana de tratamiento puede ser utilizada como guía para individualizar la duración del tratamiento en este subgrupo de pacientes, que representa el 25% del total de pacientes tratados. Otro aspecto analizado es la utilidad de la monitorización de la concentración de ribavirina en suero como guía para ajustar e individualizar precozmente la dosis de ribavirina, con la finalidad de disminuir la toxicidad y aumentar su eficacia. Entre los resultados obtenidos, destaca que la concentración valle sérica de ribavirina depende de la dosis administrada ajustada al peso del paciente, y que la co-administración de tenofovir se asoció con concentraciones más elevadas de ribavirina. A diferencia de la mayoría de los datos preliminares, publicados recientemente en otros estudios, observamos una correlación inversa entre la concentración de ribavirina en suero y la respuesta virológica en la semana 4ª de tratamiento. Estos datos concuerdan con los resultados publicados recientemente por Dahari et al (J Hepatol 2007; 47:1 23-30) y sugieren que la incorporación intracelular de ribavirina durante las primeras semanas de tratamiento pude mejorar la dinámica de respuesta del VHC al tratamiento. Sin embargo, en nuestro estudio, la concentración de ribavirina en suero mostró escasa capacidad para discernir entre los pacientes con y sin respuesta virológica en las semanas 4ª y 12ª de tratamiento. Además, correlación entre la concentración de ribavirina y el descenso de hemoglobina fue débil. Por tanto, los datos de este estudio no apoyan la utilidad de la monitorización de ribavirina en suero en la optimización del tratamiento del VHC en pacientes coinfectados por VIH. No obstante, son necesarios nuevos estudios para verificar la hipótesis de la incorporación intracelular de ribavirina y la dinámica de respuesta precoz, y estudios que aborden la potencial interacción entre el tenofovir y la ribavirina. Finalmente, hemos evaluado la eficacia del tratamiento con peginterferon alfa-2b y ribavirina en pacientes con historia de fracaso virológico previo al tratamiento con interferón convencional y ribavirina. Los resultados obtenidos deben merecen una interpretación cautelosa por el limitado número de pacientes incluidos. El 43% (9/21) de los pacientes obtuvo respuesta virológica al final de las 48 semanas de tratamiento, a pesar de las características pre-tratamiento adversas (genotipo 1/4, 76%; cirrosis 42%) y de que hasta el 71% de los pacientes precisó disminuir la dosis de peginterferon por efectos adversos. No obstante, se produjo un elevado porcentaje de recidivas (55%) por lo que sólo 4 pacientes (19%) obtuvo una respuesta virológica mantenida. Estos datos sugieren que son necesarias estrategias de tratamiento individualizadas que refuercen el cumplimiento terapéutico o bien pautas de tratamiento más prolongadas para mejorar la eficacia en este subgrupo de tratamiento muy difícil.

La infección por el VHC afecta a un 3% de la población mundial. El tratamiento de esta infección consiste en la combinación de interferón pegilado por vía subcutánea una vez por semana, junto a la administración de RBV oral a diario. La curación se obtiene en menos de un 50% de los pacientes. La infección por el VHC es muy frecuente en pacientes con infección crónica por el VIH, llegando hasta un 50% de la población global de VIH. En estos pacientes la infección por el VHC tiene unas características propias. El VHC evoluciona más rápidamente a cirrosis, el porcentaje de hepatocarcinoma asociado al VHC es más alto, y la respuesta al tratamiento (interferón pegilado más ribavirina) es peor, llegando tan solo a un 40% de respuesta viral sostenida o RVS tras la finalización del tratamiento. En la actualidad, el tratamiento doble descrito pasará a ser un tratamiento triple, ya que en octubre del año 2011, se han aprobado dos nuevos fármacos para el tratamiento del VHC: boceprevir y telaprevir. Los nuevos fármacos obtienen porcentajes de RVS mucho más elevados. Por contra, aumentan el nivel de toxicidad y su precio es muy elevado. No está definido el algoritmo de tratamiento contando con la presencia de los nuevos inhibidores de la proteasa: no todos los pacientes serán tributarios de recibir un tratamiento triple. Es fundamental contar con la presencia de factores predictivos de respuesta al tratamiento. Con ellos podremos determinar cual es la mejor opción terapéutica para nuestros pacientes. En septiembre del año 2009 se publicó en Nature la influencia de diversas variantes alélicas a nivel del gen de la IL28B, situado en el cromosoma 19, en la RVS al tratamiento doble del VHC. En febrero del 2010 se publicó el efecto beneficioso de varios determinados genotipos del gen de la ITPA, situado en el cromosoma 20, sobre la anemia secundaria a RBV, en el tratamiento del VHC. No existen datos acerca del efecto conjunto de estos dos marcadores farmacogenéticos en el tratamiento del VHC en pacientes coinfectados por el VIH/VHC. La presente tesis analiza la influencia de estos dos marcadores farmacogenéticos como factores predictivos de respuesta y toxicidad al tratamiento VHC en pacientes coinfectados. Se han incluido 73 pacientes coinfectados con el VIH-VHC que han sido tratados al menos 12 semanas con interferón pegilado más RBV. A todos estos pacientes se les ha realizado la detección de las variantes alélicas a nivel rs12979860 en el gen de la IL28B, y también del rs1127354 a nivel del gen de la ITPA. A nivel del gen de la IL28B encontramos tres genotipos posibles: CC, CT y TT. Un 40% de la población es portador del genotipo CC que habitualmente se asocia con mejores porcentajes de RVS al tratamiento Los genotipos rs1127354 de la ITPA son: CC, CA, AA. La población portadora del alelo A es un 20%. Se asocia el ser portador del alelo A con una menor presencia de anemia secundaria a RBV. En nuestra población de pacientes coinfectados, la RVS se produjo globalmente en un 53%. En los portadores del genotipo CC la RVS asciende hasta el 70%, siendo del 40% en los portadores CT, TT (p = 0,04). La presencia de anemia es claramente superior en los pacientes portadores del genotipo CC del gen de la ITPA: el descenso porcentual de Hb a la semana 12 respecto la basal es del 23 % en los portadores CC, y del 12 % (p > 0,001) en los portadores CA/AA. Los pacientes portadores del alelo A de la ITPA presentan una RVS del 78% vs un 38% de los portadores CC (p = 0,03). Podemos concluir que existe una clara asociación entre RVS y ser portador del genotipo CC del IL28B y del genotipo CA/AA de la ITPA. La presencia de estos polimorfismos protectores puede ser de ayuda en la elección de la terapia anti VHC en pacientes VIH. / Hepatitis C virus (HCV) affects around 3% of the population worldwide. The standard of care is combination therapy with weekly subcutaneous pegylated interferon and twice daily oral ribavirine (RBV) for one year. Fewer than 50% of patients are cured. HCV infection is one of the most common co-morbid conditions in patients with human immunodeficiency virus (HIV) infection. It occurs in 50% of cases. Cirrhosis develops faster in coinfected patients and end-stage liver disease due to HCV is an important cause of death in HCV/HIV patients. Only 40% of HCV/HIV patient’s response to interferon/RBV (sustained viral response-SVR-). HCV treatment is now changing from double to triple therapy as two new therapies, telaprevir and boceprevir, were approved in 2011. This new triple combined therapy achieves higher percentages of SVR. However, such therapy increases toxicity and is very expensive. New treatment algorithms have not yet been defined. Use of predictive factors for SVR is fundamental to help in selecting the best therapeutic option for our patients. In September 2009 Nature published that some allelic variants in IL28B gene, located at chromosome 19, influence SVR to HCV treatment. In February 2010, the same journal published the beneficial effects of allelic variants of ITPA gene, located at chromosome 20, related to anaemia due to RBV use in HCV treatment. No data are yet available about how these two pharmacogenetic markers influence HCV treatment in HCV/HIV coinfected patients. This thesis analyses the influence of pharmacogenetic markers as predictive factors of SVR and toxicity to HCV treatment in HIV/HCV patients. A total of 73 coinfected patients were analysed and treated for at least 12 weeks. Allelic variants of IL28B (rs12979860) and ITPA genes (rs1127354) were determined in all patients. IL28B gene has three possible genotypes: CC, CT and TT. Forty percent of the population in Europe is CC carriers. This genotype is associated with higher percentages of SVR. ITPA gene also has three possible genotypes: CC, CA and AA. A-allele carriers have less anaemia due to RBV. In our series of coinfected patients the global percentage of SVR was 53%. CC carriers showed percentages of SVR around 70%, while CT/TT carriers only showed 40% (p = 0.04) Anaemia was higher in rs1127354 CC-ITPA gene carriers. Hb decreased from week 1 to week 12 by 23% and 12% for CC and CA/AA carriers, respectively (p>0.001). A-allele carriers showed SVR percentages of 78% while CC carriers showed 38% (p = 0.03) We can conclude that being a CC-IL28B and CA/AA-ITPA carrier correlates strongly with SVR. Moreover, CA/AA ITPA protects from anaemia. Presence of these protective polymorphisms helps select the best HCV therapy for our HIV/HCV coinfected patients.

El paper de la proteasa NS3/4A de l'hepatitis C (VHC) en el bloqueig de la via de senyalització implicada en la producció dels interferons alfa/beta (IFN-α/β) suggereix una relació entre l'activitat proteolítica de la NS3/4A i la resposta a la teràpia basada en IFN. Per identificar els factors virals associats a la resposta al tractament contra el VHC, es va analitzar la composició de les quasiespècies de la proteasa NS3/4A, de 56 mostres basals, provinents de pacients coinfectats amb el VHC de genotip 1 i el VIH de tipus 1, tractats a la nostra unitat clínica amb IFN pegilat (pegIFN) més ribavirina (RBV). L'eficiència catalítica de la quasiespècie dominant (és a dir, la més abundant) va ser assajada davant el punt de tall Cardif i es va correlacionar amb els resultats obtinguts del tractament. Un total de 1.745 clons es van aïllar i seqüenciar. L’heterogeneïtat de les quasiespècies i valors de l'entropia de Shannon, ambdós magnituds expressades en nucleòtids, van resultar significativament menors, entre el grup de pacients que van obtenir la resposta al tractament (P < 0,05). També, es va trobar una correlació entre l'eficàcia catalítica de la proteasa NS3/4A davant de Cardif i la resposta al tractament. Les proteases de pacients responedors eren més eficients en el processament de Cardif (error ± estàndard de la mitjana [SEM], 0,8960 ±0,05568, n = 19) que les proteases originàries dels no responedors (mitjana ± SEM, 0,7269 ± 0,05306, n = 37, p < 0,05). Finalment, la distància genètica expressada en aminoàcids, va ser significativament menor entre els pacients amb l’al · lel de risc interleucina-28B (IL- 28B) (P <0,01), el que suggereix que els portadors de l'al · lel de risc IL28B exerceixen una menor pressió de selecció positiva sobre la proteasa NS3/4A. Eficiència de la proteasa NS3/4A, en processar Cardif pot estar associada amb la resposta al tractament pegIFN-RBV, com es mostra en la nostra cohort de pacients coinfectats VHC-VIH. Una major heterogeneïtat de la proteasa NS3/4A en nucleòtids i valors més alts de l'entropia de Shannon, també en nucleòtids, en pacients que no responen al tractament, suggereix que una menor complexitat de les quasiespècies del VHC pot afavorir una millor resposta a pegIFN-RBV. / The role of the hepatitis C virus (HCV) NS3/4A protease in ablating the signaling pathway involved in the production of alpha/beta interferon (IFN-­‐α/β) suggests a relationship between NS3/4A proteolytic activity and a patient’s response to IFN-­‐ based therapy. To identify viral factors associated with the HCV treatment response, we analyzed the pretreatment NS3/4A protease gene quasispecies composition of 56 HCV genotype 1–HIV-­‐1-­‐coinfected patients treated in our clinic with pegylated IFN (pegIFN) plus ribavirin (RBV). The catalytic efficiency of the dominant (i.e., the most abundant) quasispecies was also assayed for Cardif cleavage and correlated with treatment outcome. A total of 1,745 clones were isolated and sequenced. Significantly less nucleotide quasispecies heterogeneity and lower Shannon entropy values were detected within the responder group (P < 0.05). A correlation was also found between the efficiency of NS3/4A protease Cardif cleavage and therapy outcome. Proteases from sustained responder patients were more efficient at processing Cardif (mean standard error of the mean [SEM], 0.8960 ± 0.05568; n = 19) than proteases from nonresponders (mean ± SEM, 0.7269 ± 0.05306; n = 37; P < 0.05). Finally, the amino acid p distance (the proportion [p] of nucleotide sites at which two sequences being compared are different) was significantly shorter in patients with an interleukin-­‐28B (IL-­‐28B) risk allele (P < 0.01), suggesting that IL-­‐28B risk allele carriers exert a lower positive selection pressure on the NS3/4A protease. NS3/4A protease efficiency in cleaving Cardif may be associated with the pegIFN-­‐RBV treatment response, as shown in our cohort of HIV-­‐HCVcoinfected patients. Greater NS3/4A nucleotide heterogeneity and higher Shannon entropy values in nonresponders suggest that less HCV quasispecies complexity may favor a better response to pegIFN-­‐RBV.

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