Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Hiro Goto / Resumo: O objetivo do estudo foi avaliar o papel imunomodulatório das citocinas TGF-ß1, IL-10 e INF-g nos extratos de baço e de fígado e no sobrenadante de cultura de células brancas esplênicas, em cães machos assintomáticos e sintomáticos, naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi. Trinta cães oriundos da cidade de Araçatuba, SP, área endêmica para leishmaniose visceral, selecionados por reação sorológica ELISA positiva para Leishmania sp. foram divididos em dois grupos: cães sem sintomas (n=15) que constituíram o grupo assintomático, e os cães com pelo menos três dos sinais clínicos característicos (febre, dermatites, linfoadenopatias, onicogrifose, perda de peso, caquexia, problemas de locomoção, conjuntivite, epistaxe, hepato-esplenomegalia, edema, apatia), que constituíram o grupo sintomático (n=15). Após a eutanásia, fragmentos de baço e de fígado foram coletados para quantificação de TGF-ß1, IL-10 e INF-g ex vivo. O TGF-ß1 ativo naturalmente produzido in vitro também foi avaliado no sobrenadante de cultura de células esplênicas. O extrato de baço e de fígado do grupo de cães assintomáticos apresentou níveis médios maiores de TGF-ß1, quando comparado ao grupo de cães sintomáticos. A citocina IL-10 foi detectada em altas concentrações no extrato de baço e, principalmente, de fígado dos dois grupos de cães avaliados. O INF-g foi encontrado no extrato de baço, do grupo de cães assintomáticos, e de fígado, do grupo de cães sintomáticos. Embora a citocina INF-g tenha sido detectada na infecção canina, os níveis médios de TGF-ß1 e IL-10 no extrato de baço e de fígado foram mais elevados, sugerindo que tanto em cães assintomáticos quanto em sintomáticos a resposta imune predominante foi do tipo Ta2. / Abstract: The aims of this study were to evaluate the immunomodulatory role of TGF-ß1, IL-10, & INF-g in spleen and liver extracts and supernatant cultures of white spleen cells from male symptomatic and asymptomatic dogs, naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi. Thirty dogs from Araçatuba, SP, an endemic leishmaniasis area, were selected by positive ELISA serological reaction for Leishmania sp. and divided into two groups: asymptomatic (n=15), and symptomatic (n=15) consisting of animals with at least three characteristic signs (fever, dermatitis, lymphoadenopathy, onychogryphosis, weight loss, cachexia, locomotion problems, conjunctivitis, epistaxis, hepatosplenomegaly, edema, and apathy). After euthanasia, spleen and liver fragments were collected for ex vivo quantification of TGF-ß1, IL-10, and INF-g. Naturally active in vitro produced TGF-ß1 was also evaluated in spleen cell culture supernatant. Spleen and liver extract of asymptomatic dogs had higher mean TGF-ß1 levels than symptomatic dogs. High concentrations of IL-10 were found in spleen, and mainly in liver extract of both groups. Higher INF-g concentrations were found in spleen extracts of asymptomatic dogs, and in liver extracts of symptomatic dogs. Although INF-g is being produced in canine infection, mean levels of TGF-ß1 and IL-10 from spleen and liver extracts were much higher, suggesting that immune response in both asymptomatic and symptomatic dogs was predominantly type Th2. / Mestre

Resumo: A estruturação dos serviços de saúde para o desenvolvimento de programas de controle de zoonoses como a raiva e leishmaniose se depara com recomendações sobre a importância de programas de controle populacional de cães, no entanto as normas do Estado de São Paulo para transporte de cães exigem apenas o atestado veterinário, inexistindo controle e registro da entrada de animais importados pelos órgãos oficiais, representando risco da introdução de novas doenças. O presente estudo foi realizado durante a 36ª campanha anual de vacinação anti-rábica de 2004, realizada pela Prefeitura de Botucatu em parceria com a FMVZ/UNESP de Botucatu/SP. O objetivo foi descrever a população de cães com ênfase em sua origem. Foi aplicado um questionário, a 676 proprietários, 4% dos 17.910 cães vacinados, em 20 postos de vacinação, representativos dos 47, distribuídos homogeneamente em cinco regiões da área territorial urbana. Para a escolha dos animais, considerou-se um plano de amostragem sistemática e para definição da amostra foi considerada a taxa de 10% de erro de estimação, com 95% de confiança. Cerca de 10% dos animais são originários de outras cidades, várias com transmissão de leishmaniose visceral, sendo um dos animais originário de outro estado. A maioria destes animais já residia na cidade há mais de um ano. Estes achados reforçam a importância de programas de controle populacional com registro e identificação de cães no estado, a fim de garantir informações para a tomada de decisão e definição de estratégias de contenção de doenças exóticas. / Abstract: The organization of the health services for development of zoonosis programs control, as rabies and leishmaniasis are based on recommendations about the importance of control population of dogs, however São Paulo stateþs norms to transport dogs requires just the veterinarian authorization, no existing control and register of official agencies on the entrance of imported animals, representing risk of new diseases introduction. The present study was realized during the 36ª anti-rabies campaign on 2004 for the Botucatu city and the FMVZ/UNESP of Botucatu/SP. The objective was to describe the population of dogs emphasing the source, it was applied a questionnaire on 676 owners, 4% of 17,910 vaccinated dogs, in 20 ranks of vaccination, representing from 47, with equal distribution in five regions of the urban area. For selection of the animals, a systematic sample was performed and for sample definition, it was considered the tax of 10% of estimate error, with 95% confidence interval. Around 10% of the animals are from other cities, several had transmission of visceral leishmaniasis. Being one of the animals from another state. The majority of these animals inhabited in this city over than one year. These findings strengthen the importance of programs identification, register and control population of dogs in the state, in order to guarantee information for the decision and definition of strategies to block exotic diseases. / Orientador: José Rafael Modolo / Coorientador: Hélio Langoni / Banca: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Sônia Regina Pinheiro / Mestre

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2018-04-30T14:51:55Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Patrícia Lazari.pdf: 1908360 bytes, checksum: 5c0cb095c70321b58bc79e57b6f59453 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-05-16T14:36:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Patrícia Lazari.pdf: 1908360 bytes, checksum: 5c0cb095c70321b58bc79e57b6f59453 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-16T14:36:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Patrícia Lazari.pdf: 1908360 bytes, checksum: 5c0cb095c70321b58bc79e57b6f59453 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / CNPq / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença causada pelo protozoário Leishmania chagasi e transmitida pela picada de fêmeas de flebotomíneos. O cão é considerado o principal reservatório do agente em áreas urbanas e a eutanásia de cães sororreagentes é um dos métodos de controle da LV. As técnicas utilizadas para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) no Brasil, Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), foram amplamente questionadas devido à precisão desses testes. Neste contexto, testes moleculares têm sido utilizados para caracterizar o agente. Com o objetivo de isolar por cultura axênica, identificar a espécie de Leishmania circulante em cães e comparar a detecção pelas técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e eletroforese de isoenzimas, foram submetidos à eutanásia, 101 cães sororreagentes para LV aos testes de ELISA e RIFI, pertencentes à área urbana de Jaciara, Mato Grosso, município endêmico para LV e coletadas as amostras de baço, medula óssea, pele e sangue para estudo. Através da PCR, o baço apresentou melhor percentual de detecção, seguido da medula óssea e em 97 (96,03%) cães foi detectado DNA de Leishmania, confirmada como L. chagasi. A cultura axênica apresentou 60 (15%) isolados com a medula óssea apresentando maior percentual de isolamento da L. chagasi. Em 13 (12,87%) cães foi possível a caracterização do agente através da eletroforese de isoenzimas. Os resultados deste trabalho concluem que a L. chagasi circula em cães pertencentes à área urbana de Jaciara, ampliando informações sobre a distribuição do parasito no Estado e ressaltam a importância da identificação etiológica em área de simpatria com outros agentes, principalmente onde a eutanásia é método de controle de expansão da doença. / The visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by Leishmania chagasi and transmitted by the bite of female sand flies. The dog is considered the main agent reservoir in urban areas and euthanasia of seropositive dogs is one of the LV control methods. The techniques used for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) in Brazil, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Reaction Immunofluorescence Assay (IFA), were widely questioned due to the accuracy of these tests. In this context, molecular tests have been used to characterize the agent. In order to isolate by axenic culture, identify the species of Leishmania circulating in dogs and compare the detection by reaction techniques Polymerase Chain (PCR) and isozyme analysis were euthanized, 101 seropositive dogs for LV to test ELISA and IFA, from the urban area of Jaciara, Mato Grosso, an endemic county for LV and collected the spleen samples, bone marrow, skin and blood to study. Using PCR, the spleen showed better detection percentage, followed by bone marrow and 97 (96.03%) dogs Leishmania DNA was detected and confirmed as L. chagasi. The axenic culture showed 60 (15%) isolates with bone marrow showing higher percentage of isolation of L. chagasi. In 13 (12.87%) dogs was possible to characterize the agent by isoenzyme electrophoresis. These results conclude that L. chagasi circulating in dogs from the urban zone of Jaciara, expanding information on the distribution of the parasite in the state and emphasize the importance of etiological identification sympatric area with other agents, especially where euthanasia is method expansion of disease control.

Submitted by Mariana Gatto (marianagatto11@hotmail.com) on 2018-05-21T17:47:50Z No. of bitstreams: 1 Tese Mariana Gatto.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-22T14:28:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gatto_m_dr_bot.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T14:28:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gatto_m_dr_bot.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada causada por Leishmania donovani na Índia e África ou Leishmania infantum na Europa e América Latina. O desenvolvimento de resposta imune eficaz e subsequente eliminação destes patógenos, requer o reconhecimento inicial da Leishmania, o qual é intermediado por receptores de reconhecimento padrão expressos por células da imunidade inata, entre eles os receptores de ligação a nucleotídeo (NLRs). Alguns NLRs ativam uma plataforma de proteínas, os inflamassomas, responsáveis pela ativação da caspase-1 e maturação de IL-1β e IL-18 e outra classe de NLRs, chamada NODs, ativam vias que culminam na ativação de NF-κB e produção de mediadores inflamatórios. O envolvimento desses receptores na LV ainda é pouco elucidado. Mesmo diante dos mecanismos de defesa do hospedeiro, esses parasitas conseguem sobreviver dentro dos macrófagos utilizando várias estratégias para escapar da resposta imune. Para um melhor entendimento dos mecanismos imunes envolvidos na LV, caracterizamos o perfil transcricional e a formação de inflamassomas e NODsomas de células THP-1 infectadas com L. infantum. Os resultados mostram que a L. infantum não induziu produção de TNF-α, IL-6 e IL-1β e nem ativação de caspase-1 após 8, 24 e 48 horas de infecção. Além disso, a infecção resultou em padrão de expressão gênica similar às células sem estímulo e distinto de células estimuladas com LPS, indicando que os parasitas entram nas células de forma mais silenciosa. Após a infecção houve aumento da expressão de alguns genes como ACTG1, ACTB, CD36 e DUSPs relacionados com vias de motilidade celular e regulação de MAPKs. Os genes CSF1 e CDC20 foram dois dos 30 mais expressos após infecção e estão relacionados com ciclo celular e diferenciação de macrófagos para um perfil anti-inflamatório. O gene GBP1, associado com ativação de inflamassomas, foi sub expresso após a infecção. Além disso, infecção com L. infantum resultou na expressão de poucos genes relacionados com a via dos NLRs, destacando-se entre esses o TNFAIP3 e IL1RN, referentes à modulação negativa dessa via. Os resultados obtidos indicam que a L. infantum entra nas células THP-1 de forma mais silenciosa, desativa vias inflamatórias, entre essas a via de receptores NLRs e evita a montagem de uma resposta imunológica efetora. Provavelmente o parasita usa esses recursos como mecanismos adicionais de escape para garantir sua sobrevivência dentro das células. / Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected infectious disease caused by Leishmania donovani in India and Africa or Leishmania infantum in Europe and Latin America. The development of an effective immune response and subsequent elimination of these pathogens requires the initial recognition of the Leishmania that is mediated by pattern recognition receptors expressed in innate immunity cells, such as nucleotide-binding receptors (NLRs). Some NLRs activate a multiprotein platform named inflammasomes, responsible for the activation of caspase-1 and consequent maturation of IL-1β and IL-18; and another class of NLRs, the NODs, activate pathways that trigger NF-κB activation and production of inflammatory mediators. The involvement of NLRs in LV is poorly elucidated. Even in the presence of host defense mechanisms, these parasites can survive within the macrophages by employing successful strategies to escape from immune response. For a better understanding of the immune mechanisms involved in LV, we characterized the transcriptomic profiling and assembly of inflammasomes and NODsomas during infection with L. infantum in THP-1 cells. The results show that L. infantum did not induce the production of TNF-α, IL-6 and IL-1β nor activation of caspase-1 after 8, 24 and 48 hours of infection. In addition, the infection resulted in a pattern of gene expression similar to the non-stimulated cells and distinct from LPS-stimulated cells, indicating that the parasites enter inside cells in a more silent way. After infection, there was increased expression of some genes, such as ACTG1, ACTB, CD36 and DUSPs related to cellular motility and regulation of MAPKs pathways. The CSF1 and CDC20 genes were two of the 30 most expressed after infection and were related to cell cycle pathway and macrophage differentiation to an anti-inflammatory profile. The GBP1 gene, associated with inflammasome activation, was downregulated after infection. In addition, infection with L. infantum resulted in the expression of few genes related to the NLRs pathway, such as TNFAIP3 and IL1RN that are related to down modulation of this pathway. The results indicate that L. infantum enters inside the THP-1 cells more quietly, deactivates inflammatory pathways, including the NLR receptor pathway, and avoids the assembly of an effector immune response. Probably the parasite uses these strategies as additional escape mechanism to ensure its survival within host cells.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MichelleRFV.pdf: 525804 bytes, checksum: d94754591de23bce5b0b460d3e10d382 (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / With advent of the technology of the recombinant DNA, the recombinant protein expression becomes an important tool in the studies of the structure, function and identification of new proteins, mainly with therapeutical purposes. The Escherichia coli has been procarioto predominant in the studies of genetic engineering due to wealth of information regarding its metabolism. Despite the expressivo advance of the studies of molecular biology and the immunology of the infections, it does not exist, currently, no prophylactic drug capable to prevent calazar. Of this form, it exists a great necessity of specific antigen identification for the vaccine development and kits for disgnostic against the visceral Leishmaniose. In this context, this work objectified to study the recombinant antigen expression of the Leishmania chagasi during the culture of Escherichia coli in shaker. A first set of assays was carried through with the objective of if knowing the kinetic behavior of the growth of two clones recombinant proteins (eIF, LACK) in two different compositions of culture medium (2xTY, TB) supplemented by antibiotics, without IPTG addition. In the second stage of the assays, the procedure of induction for IPTG was carried through, in order to verify the influence of the composition of the ways tested in the expression them recombinant proteins. On the basis of the gotten results, can be observed that the high complexity of culture medium favored the kinetic one of growth of clones recombinant (eIF, LACK), however, to if to deal with the assays submitted to the procedure of induction for IPTG, the raised complexity of culture medium did not favor the expression of recombinant proteins. On the other hand, they had been gotten resulted positive for all clones recombinant (eIF, LACK) tested, confirmed through the eletrofor?tico profile / Com advento da tecnologia do DNA recombinante, a express?o de prote?nas recombinantes torna-se uma ferramenta importante nos estudos da estrutura, fun??o e identifica??o de novas prote?nas, principalmente com finalidades terap?uticas. A Escherichia coli tem sido o procarioto predominante nos estudos da engenharia gen?tica devido ? riqueza de informa??es a respeito do seu metabolismo. Apesar do avan?o expressivo dos estudos da biologia molecular e da imunologia das infec??es, n?o existe, atualmente, nenhuma droga profil?tica capaz de prevenir o calazar. Desta forma, existe uma grande necessidade de identifica??o de ant?genos espec?ficos para o desenvolvimento de vacinas e kits para diagn?sticos contra a Leishmaniose visceral. Neste contexto, este trabalho objetivou estudar a express?o de ant?genos recombinantes da Leishmania chagasi durante o cultivo de Escherichia coli em incubador rotativo (shaker). Um primeiro conjunto de ensaios foi realizado com o objetivo de se conhecer o comportamento cin?tico do crescimento dois clones recombinantes (eIF, LACK) em duas diferentes composi??es de meios (2xTY, TB) suplementados por antibi?ticos, sem adi??o de IPTG. Na segunda etapa dos ensaios, foi realizado o procedimento de indu??o por IPTG, a fim de verificar a influ?ncia da composi??o dos meios testados na express?o das prote?nas recombinantes. Com base nos resultados obtidos, pode-se observar que a elevada complexidade do meio de cultivo favoreceu a cin?tica de crescimento dos clones recombinantes (eIF,LACK), no entanto, ao se tratar dos ensaios submetidos ao procedimento de indu??o por IPTG, a elevada complexidade do meio de cultivo n?o favoreceu a express?o das prote?nas recombinantes. Por outro lado, foram obtidos resultados positivos para todos os clones recombinante (eIF, LACK) testados, confirmada atrav?s do perfil eletrofor?tico

Este é um estudo ecológico misto onde o perfil de distribuição de chuvas e das variações térmicas foi relacionado à variação sazonal das taxas de incidência de leishmaniose visceral em vinte municípios brasileiros de transmissão intensa da doença, no período de 2001 a 2008. O objetivo foi identificar similaridades e diferenças entre os municípios estudados quanto à tendência temporal e sazonalidade da doença e à possível relação entre variações climáticas e a distribuição sazonal da doença. Os dados de incidência de leishmaniose visceral foram obtidos do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan), os dados demográficos foram obtidos do Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS), os dados pluviométricos e de temperatura foram obtidos do Sistema de Monitoramento Agrometeorológico do Ministério da Agricultura (AGRITEMPO). Os resultados são apresentados graficamente e mostram que a distribuição sazonal da incidência e períodos prováveis de transmissão são diferentes em vários municípios e acompanham as diferenças climáticas, sugerindo que as intervenções que visem diminuir a incidência devem ser pontuais, obedecendo às características de cada município. / This is a mixed ecological study where the distribution profile of rainfall and temperature variations were related to seasonal variation in the rate of incidence of visceral leishmaniasis in twenty highly endemic municipalities in the period from 2001 to 2008. The purpose was to identify similarities and differences between the municipalities studied concerning disease trends and seasonal patterns and regarding the potential relationships between climatic variations and the seasonal distribution of the disease. Incidence data on visceral leishmaniasis were obtained from the Sistema de Informação de Agravos de Notificaçao (Sinan), demographic data were obtained from the Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS), the temperature and rainfall data were obtained from agrometeorological monitoring system of the Ministry of Agriculture (AGRITEMPO). The results are presented graphically and show that the seasonal distribution of the incidence and probable transmission periods are different in several municipalities and accompanying climatic differences, suggesting that interventions aimed at reducing the incidence must be punctual, according to the characteristics of each municipality.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada de grande importância no cenário brasileiro, particularmente devido à sua gravidade, sua expansão geográfica e a associação com condições de pobreza. Nesta perspectiva, as condições nutricionais emergem como elementos a serem considerados na compreensão de sua situação epidemiológica, sejam como potenciais fatores de risco para o estabelecimento da doença após infecção ou como fatores associados ao prognóstico. OBJETIVO: Avaliar a associação entre estado nutricional e infecção por Leishmania infantum em moradores de áreas endêmicas para LV no município de Teresina, Piauí. MÉTODOS: Trata-se de um estudo seccional realizado em bairros de alta endemicidade para a doença, envolvendo 198 indivíduos com idade entre 2 e 65 anos. Peso e estatura foram aferidos no domicílio por profissionais treinados. Para a avaliação de adultos foi utilizado o índice de massa corporal (IMC). Para crianças e adolescentes foram avaliados os índices antropométricos (peso / idade, estatura / idade, peso / estatura e IMC / idade). A infecção por L. infantum foi avaliada a partir da intradermorreação de Montenegro (IDRM). Para a análise foi utilizada regressão logística multivariada, estimando-se razões de chances (OR) como medidas de associação e seus respectivos intervalos de confiança (95%). RESULTADOS: A prevalência de infecção assintomática foi de 32,6%. A prevalência de excesso de peso foi de 52% entre adultos (IMC ? 25 kg/m) e de 23,9% entre crianças e jovens (escore-z de IMC / idade > 1). Indivíduos com sobrepeso, tanto adultos como aqueles de até 19 anos, apresentaram chance de infecção cerca de 70% maior quando comparados aos eutróficos (p>0,05 para ambos). CONCLUSÃO: Ainda que não estatisticamente significante, a associação entre infecção assintomática por L. infantum e sobrepeso sugere que estes indivíduos possam estar sob maior risco de infecção por apresentarem déficits de micronutrientes relevantes para a resposta imune específica. Para investigar esta hipótese, são necessários estudos longitudinais que investiguem o papel do consumo alimentar e do perfil de micronutrientes desta população no risco de infecção por L. infantum. / INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) is an important neglected disease in Brazil, particularly due to its severity, geographic expansion and association with poverty. In this perspective, nutritional features emerge as elements to be considered in understanding its epidemiological pattern, potentially acting as risk factors for developing disease after infection or as prognostic factors. OBJECTIVE: To evaluate the association between nutritional status and infection by in residents of endemic areas for VL Leishmania infantum in Teresina, Piauí. METHODS: This is a cross sectional study conducted in neighborhoods of high endemicity for disease, with 198 individuals between 2 and 65 years of age. Weight and height were obtained at the household by trained staff. For adults, nutritional status was assessed by the body mass index (BMI). For children and adolescents anthropometric indexes were used (weight/age, height/age, weight/height and also BMI/age). Infection by L. infantum was evaluated using the Montenegro skin test (MST). Multivariate logistic regression was used for estimating odds ratios (OR) and respective confidence intervals (95%). RESULTS: Prevalence of asymptomatic infection was 32.6%. The prevalence of overweight was 52% among adults (BMI ? 25 kg/m) and 23.9% among children and young people (score-z of BMI/age > 1). Subjects with overweight, both adults and those up to 19 years presented increased odds of infection of about 70% as compared to eutrophic individuals (p>0.05 for both). CONCLUSION: Although not statistically significant, the association between asymptomatic infection with L. infantum and overweight suggests that they might be at higher risk of infection due to deficits in micronutrient which are necessary for an adequate specific immune response. To test this hypothesis, longitudinal studies to evaluate the role of dietary intake and micronutrient profile in the risk of infection with L. infantum in this population are required.

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários. / Visceral leishmaniasis (VL), also known as kalazar, is an endemic, chronic, severe and highly lethal disease when not treated. Studies have shown that the protein Mannose-biding lectin (MBL), encoded by the gene MBL2, is the major player in innate immune system due its role in microbial recognition, elimination and inflammation as well as in the cell death. In the current work, we conducted a case-control study which aimed to investigate the association between variants in the gene MBL2 and the susceptibility to VL in individuals living in endemic areas of the São Luís - MA. 322 individuals participated in this study. Of these, 161 were VL cases being unrelated individuals of both sexes, and inhabitants from endemic areas of the disease in São Luís. The other 161 individuals were uninfected healthy controls, being unrelated and from the same region. The identification of VL cases occurred by visiting reference hospitals and clinics in the city. VL patients were identified in the household environment through the records of FUNASA-MA. Molecular analysis consisted in genotyping six variants located in the promoter region [positions -550 (C> G), -221 (G> C), +4 (C> T)] and coding region [codons 52 (C> T), 54 (G> A) and 57 (G> A)] of the MBL2 gene by polymerase chain reaction and automated DNA sequencing. The concentrations of MBL protein in the serum was performed by ELISA. We found that MBL phenotypes depend on the number of alleles present in the gene MBL2, being clear the consequence of the defective variants in the protein levels. There was no significant difference between cases and controls regarding the distribution of MBL2 genotypes and MBL serum levels. The allele frequencies of exon variants in the overall sample showed that the A allele is the most common (74.8%) and that the defective alleles (B, C and D) are mainly heterozygous (36.6%). This highlights the idea that defective MBL2 alleles are maintained in the population to confer selective advantage to heterozygotes. Concerning the three main existing polymorphisms in the promoter region, we noticed that the variant-221G (Y) is more frequent (88%) followed by +4 C (P) (73%) and 550C-(L) (67%) variants. We identified eight haplotypes in MBL2 in a total of 644 chromosomes evaluated in 30 different combinations, being the HYPA and LYQA the most frequent haplotypes and HYPD and HYPB the rarest ones. All carriers with combinations of homozygous haplotypes for defective alleles had undetectable serum levels of MBL. Genotypes LYQA / LYQA and HYPA / HYPA had the highest mean concentrations of MBL in the serum. Combination between SNPs in exon 1 and in the promoter region of the gene MBL2 results in a great variation of MBL concentrations in healthy individuals. We consider that the data set that was generated is a valuable contribution that can be expanded to others cenarios.

As leishmanioses são zoonoses de caráter incurável que apresentam diversas manifestações clínicas no homem e tem o cão como seu principal reservatório no ambiente urbano. A Leishmaniose visceral (LV) é a forma mais grave da parasitose e sua ocorrência tem aumentado no Brasil, apesar das ações dos órgãos de saúde pública. Até o do ano de 2002, o Estado do Rio Grande do Sul era área indene para as leishmanioses humana e canina. Em 2003 foi registrado o primeiro caso humano da forma tegumentar e em 2006 e 2008 identificaram-se, respectivamente 3,5% e 30,5% de cães sororreagentes para Leishmania sp. em Porto Alegre/RS. Em 2009, foram confirmados os primeiros casos autóctones humanos de LV e caninos de Leishmaniose visceral canina (LVC) no município de São Borja/RS e registrada, pela primeira vez, a ocorrência do inseto vetor no estado. Em 2010, foi notificado o primeiro caso confirmado de LVC e identificados cães sororreagentes em Porto Alegre/RS. Tendo em vista a importância desta zoonose e as dificuldades de um diagnóstico confiável em cães, o presente estudo objetivou identificar aspectos epidemiológicos da LVC em cães em uma região com registros de casos no município de Porto Alegre/RS. Coletaram-se 300 amostras de sangue de cães desta região as quais foram testas pelos métodos TR-DPP® e ELISA para diagnóstico de Leishmania chagasi. Um questionário epidemiológico foi aplicado durante entrevista com os tutores, contendo aspectos relativos à criação dos animais e fatores ambientais. Na área de estudo, observou-se presença frequente de lixo não acondicionado e saneamento básico precário nas moradias, além de extensas áreas de mata verde e pequenos sítios alternados com áreas urbanizadas. Verificou-se que 83% (250/300) dos cães não tinham raça definida, 58% (175/300) eram fêmeas, 78% (238/300) dormiam ao ar livre e 61% (183/300) conviviam com outras espécies animais. Clinicamente, observou-se que 90% (270/300) dos animais apresentavam infestação por ectoparasitos, 70% (210/300) apresentavam alterações dermatológicas, 24% (72/300) emagrecimento e anorexia e 22% (65/300) alterações oculares. Os resultados dos testes sorológicos foram 100% concordantes uma vez que as mesmas três amostras (1%) apresentaram reação positiva e as demais 297 (99%) foram negativas em ambos os métodos diagnósticos. Concluiu-se que, apesar da baixa prevalência de cães soropositivos para L. chagasi, existem condições de transmissão de LVC, com risco de LV para a população humana no município de Porto Alegre. / Leishmanioses are zoonoses of incurable character that present different clinical manifestations in the man and have the dog as its main reservoir in the urban environment. Visceral leishmaniasis (VL) is the most severe form of the parasitosis and its incidence has been increasing in Brazil, despite the actions of public health authorities. To the year of 2002, the state of Rio Grande do Sul was unscathed to the human and canine Leishmanioses. In 2003, it was first recorded a human case of cutaneous leishmaniasis and in 2006 and 2008 were identified, respectively, 3.5% and 30.5% of seropositive dogs to Leishmania sp. in Porto Alegre/RS. In 2009, the first autochthonous human cases of VL and canine visceral leishmaniasis (CVL) were confirmed in the municipality of São Borja/RS and it was registered, for the first time, the occurrence of the vector insect in the state. In 2010 was reported the first confirmed CVL case and seropositive dogs were identified in Porto Alegre/RS. Given the importance of this zoonosis and the difficulties of a reliable diagnosis in dogs, this study goal was to identify epidemiological aspects of CVL and evaluate the performance of ELISA and TR-DPP® in the diagnosis of this disease in dogs on a region with records of cases in the city of Porto Alegre/RS. Blood samples were collected from 300 dogs of this region. An epidemiological questionnaire, containing aspects of care and management of the animals, was conducted during an interview with the owners. Within the study area, it was observed the frequent presence of unpacked garbage and poor sanitation in the homes, and large areas of green forest and small farms alternated with urbanized areas. It was found that 83% (250/300) dogs were of mixed breeds, 58% (175/300) were females, 78% (238/300) slept outdoors and 61% (183/300) coexisted with other animal species. Clinically, it was observed that 90% (270/300) of the animals had infestation by ectoparasites, 70% (210/300) had dermatological alterations, 24% (72/300) had weight loss and anorexia and 22% (65/300) had ocular disorders. The results of serological tests were 100% consistent since, in both diagnostic methods, the same three samples showed a positive reaction and the remaining 297 were negative. Despite the low prevalence of dogs seropositive for L. chagasi, it was concluded that there are conditions for the transmission of CVL, resulting in a risk of VL for the human population in the municipality of Porto Alegre.

Os parasitas pertencentes ao gênero Leishmania têm distribuição ubíqua. Este táxon inclui Leishmania infantum chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, uma zoonose negligenciada cujas metodologias diagnósticas acumulam uma série de limitações, requerendo a validação e padronização de metodologias diagnósticas satisfatórias. Vários fatores estão relacionados à patogênese causada por este protozoário, entre eles a catepsina L-like, uma cisteíno protease envolvida em processos regulatórios metabólicos e infecciosos. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do gene de catepsina L-like isoforma CPA como alvo de diagnóstico molecular e como marcador filogenético que permita a compreensão das variações intraespecíficas e elucidem a história evolutiva de L. infantum chagasi no Brasil. Foram utilizados 44 isolados de L. infantum chagasi de diferentes estados brasileiros. Os fragmentos do gene de catepsina L-like foram amplificados, purificados, sequenciados, alinhados manualmente e analisados por métodos filogenéticos de máxima parcimônia e inferência bayesiana. As sequências geradas foram usadas para pesquisar e sintetizar iniciadores a serem usados em reações específicas para o parasita alvo. O gene de catepsina L-like não mostrou variabilidade intraespecífica entre os isolados analisados, sugerindo um evento recente de introdução do mesmo nas Américas. O par de iniciadores propostos amplificou o DNA alvo de isolados de L. infantum chagasi, sendo efetivo na amplificação de DNA em concentrações de até 10-11g / µl. O marcador proposto não apresentou reações cruzadas com outros hemoparasitas de importância clínica. Quando utilizado para o diagnóstico em um painel de amostras clínicas de cães, obteve-se uma frequência de positividade de 49,03% (102/208), contrastando com o valor de 14,42% (30/208) obtido com o marcador para o gene do espaçador ribossomal interno ITS. Quando testado em amostras de flebotomíneos se obteve um valor de 6,25% e em amostras de pacientes humanos o valor foi de 14,28%. Os marcadores também foram eficazes em amplificar DNA extraído de amostras de urina, de sangue fixado em papel filtro e mesmo em amostras de swab de lesões conjuntivas. Este conjunto de parâmetros permite inferir que o CatLeish- PCR é sensível e específico para o diagnóstico de L. infantum chagasi podendo ser aplicado tanto em pesquisas clínicas quanto em inquéritos epidemiológicos de vigilância. / The parasites belonging to the Leishmania genus have a wide distribution. This taxon includes Leishmania infantum chagasi, the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis in the Americas, a neglected zoonosis that requires the validation and standardization of satisfactory diagnostic methodologies. Several factors are related to the pathogenesis caused by this protozoan, as Catepsin L-like, a cysteine protease involved in regulatory and infectious processes. Given this information this work aimed to evaluate the effectiveness of Cathepsin L-like isoform CPA as a target for molecular diagnosis and as a phylogenetic marker that allows understanding the intraspecific variations and the evolutionary history of L. infantum chagasi in Brazil. We used 44 isolates of L. infantum chagasi from different Brazilian states. The cathepsin L-like gene fragments were amplified, purified, sequenced, manually aligned and analyzed by maximum parsimony and Bayesian inference methods. The sequences generated were researched to construction of oligonucleotide primers to be used in reactions specific to the target parasite. The Cathepsin L-like gene did not show intraspecific variability among the isolates analyzed, suggesting a recent event of introduction of the same in the Americas. The pair of proposed primers amplified the target DNA of L. infantum chagasi isolates, being effective in DNA amplification at concentrations of up to 10-11g/µl. The proposed marker did not present cross-reactions with other hemoparasites of clinical importance. When used for the diagnosis in a panel of clinical samples of dogs obtained a positive frequency of 49.03% (102/208), against the 14.42% (30/208) to ribosomal ITS marker. Samples of sandflies obtained a value of 6.25% and in humans the value was 14.28%. The markers were also effective in blood samples fixed on filter paper and even in samples from conjunctival lesion swabs. This set of parameters allows to infer that CatLeish-PCR is a sensitive and specific marker for the diagnosis of L. infantum chagasi in clinical and epidemiological surveys.