La maladie de la pourriture noire des Brassicacées est causée par la colonisation du système vasculaire des plantes par Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Cette bactérie, largement retrouvée sur les cinq continents, peut infecter de nombreuses espèces d'intérêts agronomiques et la plante modèle Arabidopsis. Malgré l'importance de cette maladie, la génétique et les bases moléculaires de la résistance à Xcc et de la résistance vasculaire en général restent méconnues et ont été le sujet de mes travaux de thèse. Des approches génétiques chez Arabidopsis ont permis d'identifier trois gènes (ZAR1, PBL2, RKS1) requis pour la résistance à Xcc et la reconnaissance de l'effecteur de type III XopAC de Xcc. Ces trois gènes codent respectivement une protéine de résistance canonique (famille des NLR) et deux kinases de la famille des RLCK. En collaboration avec l'équipe de J-M Zhou (Pékin), nous avons élucidé le mécanisme moléculaire de reconnaissance de XopAC: Un complexe de résistance préformé ZAR1-RKS1 reconnaît spécifiquement l'uridylylation de la kinase PBL2 par XopAC et induit la résistance à Xcc. Contrairement aux données existantes, la spécificité de reconnaissance du complexe de résistance n'est pas portée par la NLR mais par la kinase adaptateur RKS1. Ces résultats constituent la première description des mécanismes moléculaires sous tendant la résistance des brassicacées à Xcc et pourront servir de bases pour la mise en place de programmes rationnels d'amélioration variétale chez les Brassicacées cultivés. / Black rot disease of Brassicaceae is caused by the colonization of plant vasculature by Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). This worldwide-distributed bacterium causes serious losses in brassica crops and also infects Arabidopsis. Despite of the economic importance of this disease, genetics and molecular bases of resistance to Xcc and vascular resistance in general is poorly understood. This topic was thus selected as my thesis project. Genetic approaches in Arabidopsis identified three genes (ZAR1, PBL2, RKS1) required for resistance to Xcc and the recognition of the Xcc type III effector XopAC. These three genes code for a canonical resistance protein of the NLR family and two kinases of the RLCK family, respectively. In collaboration with the group of J-M Zhou (Beijing), we uncovered the molecular mechanism of XopAC recognition: a preformed ZAR1-RKS1 resistance complex specifically recognizes PBL2 uridylylated by XopAC and triggers resistance to Xcc. In contrast to existing knowledge, the recognition specificity of the resistance complex is not conferred by the NLR but by the adaptor kinase RKS1. These results are the first description of the molecular mechanisms underlying Brassicaceae resistance to Xcc and pave the avenue for the rationale breeding of resistance in Brassica crops.

L’accident vasculaire cérébral, est une pathologie aigüe et grave, qui peut conduire au décès rapide du patient ou à un handicap neurologique sévère, moteur et/ou cognitif. Dans les situations les plus sévères, l’action médicale amène à envisager des limitations ou arrêt de certains traitements si le pronostic s’avère « catastrophique », signifiant le plus souvent le risque d’un handicap « inacceptable ».L’action médicale dans ces situations est particulièrement complexe. Elle pose la question de la finalité de l’acte médical au regard de la qualité de vie future du patient, qui suppose l’estimation délicate de la valeur de la vie, prédiction par essence incertaine. Mais si le pronostic tient une place centrale dans cette action, d’autres facteurs jouent également un rôle déterminant, comme celui du contexte. Ce travail de thèse propose une exploration des notions de pronostic et de « proportionnalité des soins » et une approche éthique reposant sur la prise en compte de la complexité et la délibération aristotélicienne. / Stroke is an acute and severe pathology, which can lead to rapid death or severe neurological motor and / or cognitive disability. In the most severe situations, medical action leads to consider withholding or withdrawal of treatments, if the prognosis appears to be "catastrophic", meaning most often the risk of "unacceptable" disability.The medical action in these situations is particularly complex. It raises the question of the purpose of the medical act in relation to the future quality of life of the patient, which involves the delicate estimate of the value of life, prediction inherently uncertain. But if the prognosis holds a central place in this action, other factors also play a role, such as the context. This thesis offers an exploration of the concepts of prognosis and “proportionality care” and an ethical approach based on taking into account the complexity and Aristotelian deliberation.

Chez les mammifères adultes, les cellules souches et les progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) présents dans la moelle osseuse sont à l'origine de la production des cellules sanguines tout au long de la vie. L'auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation des CSPH sont sous le contrôle d'un microenvironnement cellulaire spécifique appelé " niche ". Deux niches sont identifiés dans la moelle osseuse : une niche endostéale et vasculaire. Les processus moléculaires contrôlant les communications cellulaires entre les niches et les HSPC sont complexes et demeurent mal connues. Du fait de la conservation des facteurs de transcription et des voies de signalisations entre les mammifères et la drosophile, l'organe hématopoïétique de la drosophile : la glande lymphatique s'est avéré être un excellent modèle pour étudier les communications cellulaires entre les niches et les CSPH. La glande lymphatique est accolée au tube cardiaque (système vasculaire), qui contrôle la morphologie et la fonction du PSC (Posterior Signaling Center), un centre de signalisation contrôlant la différenciation des cellules immunitaires/sanguines dans la glande lymphatique. Au cours de mes travaux de thèse, j'ai réalisé un crible fonctionnel in vivo, pour déterminer si indépendamment de son effet sur le PSC, les cellules du tube cardiaque étaient capables de contrôler directement l'homéostasie de la glande lymphatique. La réalisation de ce crible m'a permis d'identifier quatre ligands produits par les cellules du tube cardiaque et requis au maintien des progéniteurs hématopoïétiques dans la glande lymphatique, notamment le ligand Branchless de la voie de signalisation FGF (Fibroblast Growth Factor). La perte de fonction du ligand FGF/Branchless dans le tube cardiaque ou du récepteur FGF/Breathless dans les progéniteurs hématopoïétiques entraine une différenciation accrue et une diminution du pool de progéniteurs dans la glande lymphatique. Mes résultats indiquent que le tube cardiaque a un rôle équivalent à une niche pour contrôler l'hématopoïèse dans la glande lymphatique et que la voie de signalisation FGF joue un rôle clé dans ces communications cellulaires. [...] / In adult mammals, hematopoietic stem cell and progenitors (HSPC) are present in the bone marrow and produce all blood cell type along the life. Renewal, proliferation and differentiation of the HSPC are tightly control by a specific microenvironment called the "niche", composed by an endosteal and a vascular niche. Molecular processes controlling cellular communications between niches and HSPC are complex and remain poorly understood. Since many transcription factors and signalization pathway are conserved in controlling hematopoiesis both in mammals and Drosophila, the Drosophila hematopoietic organ: the lymph gland became an excellent model to decipher cellular communications between the niche and HSPC. The lymph gland is aligned the cardiac tube (vascular system), which control the size and the function of the PSC (Posterior Signaling Center). The PSC is a signaling center controlling the differentiation of immune/blood cells in the lymph gland. During my PhD, I performed an in vivo functional screen to determine whether independently of its role on the PSC, cardiac cells were able to control directly the lymph gland homeostasis. The realization of this screen, allowed me to identify four ligands produced by cardiac tube cells and required to maintain lymph gland hematopoietic progenitors. One of this ligand is a FGF (Fibroblast Growth Factor) ligand Branchless. Knock down of FGF/branchless ligand in cardiac tube cells or FGF/Breathless receptor in hematopoietic progenitors lead to an increase in immune cells differentiation at the expense of the progenitor pool. My results establish that the cardiac tube plays a role similar to a niche in controlling lymph gland homeostasis and the FGF pathway plays a key role in this cellular communication. [...]

Les plaquettes jouent un rôle central dans l’hémostase et dans la réponse immunitaire. Elles interviennent en effet à toutes les étapes des réactions inflammatoires. Nos objectifs ont été de : (i)caractériser les mécanismes plaquettaires responsables de la prévention des saignements inflammatoires, qui sont à différencier des saignements provoqués par un traumatisme et de (ii)caractériser les déterminants de la régulation des activités cytotoxiques des neutrophiles par les plaquettes. In vivo dans un modèle de réaction immuno-induite cutanée, nous avons mis en évidence le rôle de la glycoprotéine (GP) VI dans la prévention des saignements inflammatoires provoqués par les neutrophiles. Nos résultats suggèrent que GPVI exercerait son effet protecteur par une action mécanique associée à l’activation de sa voie de signalisation ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en absence d’une agrégation plaquettaire. En revanche, dans un modèle d’inflammation pulmonaire aigue les récepteurs à ITAM, GPVI et CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2), ne sont pas requis alors que l’absence de GPIb conduit à des saignements inflammatoires. In vitro, nous avons montré que la régulation par les plaquettes des activités cytotoxiques des neutrophiles est déterminée par l’interaction préalable des neutrophiles avec les cellules endothéliales. Ainsi, nos résultats contribuent à une meilleure compréhension des fonctions des plaquettes dans les réactions inflammatoires, une première étape nécessaire au développement de nouvelles applications thérapeutiques des médicaments antiplaquettaires. / Platelets are crucial players in hemostasis and immune responses. They intervene at various stages of inflammatory reactions. Our objectives were : (i)to characterize platelet mechanisms responsible for the prevention of inflammatory bleeding, which differs from trauma-induced bleeding, and (ii)to characterize the determinants of the regulation of neutrophil cytotoxic activities by platelets. In vivo, in an immune complex-mediated cutaneous inflammation, we demonstrated the role of glycoprotein (GP) VI in the prevention of inflammatory bleeding caused by neutrophils. Our results suggest that GPVI has a protective effect, independent of platelet aggregation, by a mechanical action associated to an activation of the ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)-based signaling pathway. In contrast, in an acute pulmonary inflammatory model, the ITAM receptors GPVI and CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) were not required while the absence of platelet GPIb led to inflammatory bleeding. In vitro, we showed that physical interactions between neutrophils and endothelial cells are major determinants that guide the regulatory action of platelets towards neutrophil cytotoxic activities. In conclusion, our results contribute to a better understanding of platelet functions in inflammatory reactions, a necessary first step for future therapeutic applications of antiplatelet agents.

Le mélanome cutané est l'un des cancers les plus agressifs et mortel capables de dissémination métastatique à distance. L’intravasation cellules tumorales dans le vaisseau sanguin dans les tumeurs primaires et l'extravasation sont des étapes importantes dans la formation de métastases. Ces étapes impliquent la perturbation de la barrière endothéliale par des cellules tumorales afin de faciliter leur migration transendothéliale et la colonisation métastatique. Cependant, le processus par lequel les cellules tumorales modulent l'intégrité des jonctions vasculaires est encore mal compris. Afin de déterminer les facteurs de perméabilité sécrétés par les cellules métastatiques, nous avons identifié la protéine matricielle SPARC comme un facteur critique contribuant à la perméabilité vasculaire et l'extravasation des cellules tumorales. Nous montrons que SPARC sécrété par les cellules de mélanome induit une perméabilité vasculaire via l'ouverture des jonctions intercellulaires des monocouches endothéliales et entraîne la migration transendothéliale de cellules de mélanome. In vivo, l’extinction de SPARC mène à une diminution drastique dans la colonisation à court et long terme des poumons et de la perméabilité des capillaires pulmonaires. A l’inverse, sa surexpression augmente les capacités d’extravasation et les métastases. / Cutaneous melanoma is one of the most aggressive cancers capable of distant and lethal metastatic spread. Tumor cell intravasation into blood vessel at primary tumor sites and subsequent extravasation are critical steps in the formation of metastases. These steps entail disruption of the endothelial barrier by tumor cells to facilitate their transendothelial passage and metastatic seeding. However, the way by which tumor cells modulate vascular junction integrity is still poorly understood. In an attempt to determine permeability factors secreted by metastatic cells, we identified the matricellular protein SPARC as a critical signaling factor that contributes to elevated vascular permeability and tumor cell extravasation. We show that SPARC released by melanoma cells enhances vascular leakiness by inducing opening of intercellular junctions of endothelial monolayers and drives melanoma cell transendothelial migration. In vivo vascular permeability and metastatic assays demonstrate that SPARC deficiency abrogates tumor-induced permeability of lung capillaries and prevents extravasation from blood vessels and metastasis, whereas overexpression of SPARC increases the lung metastatic potential of melanoma cells. Mechanistically, SPARC-induced endothelial gap formation and transmigration is dependent on vascular cell adhesion molecule (VCAM1) and p38 MAPK signaling pathway in endothelial cells. Importantly, blocking VCAM1 impedes melanoma cell extravasation. The clinical relevance of our findings is highlighted by the high levels of SPARC detected in tumor cells from human pulmonary melanoma lesions.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l'action conjuguée d'un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l'oxygène. Dans le cadre d'un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l'effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d'un corécepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d'ARN interférence visant à éteindre l'expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur dépendante du conjugué. In vivo, l'accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l'endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l'accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d'augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide Aψ[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse.

Les démences constituent une préoccupation majeure de santé publique. Les facteurs pronostiques des démences vont conditionner la rapidité du déclin des fonctions cognitives et exécutives et la survie des patients. Quand ces facteurs sont modifiables, l'amélioration de leur connaissance peut permettre de mettre en place des actions visant à limiter le déclin cognitif et à prolonger l'autonomie. Les études permettant leur analyse sont réalisées sur des populations de sujets malades et s'inscrivent dans le cadre de la recherche clinique. Les bases de données médicales, qui ne sont pas toujours constituées à des fins de recherche, sont néanmoins de plus en plus utilisées à ces fins.<br />L'objectif de mon travail est l'étude des facteurs pronostiques de patients, pris en charge au centre de mémoire de ressource et de recherche (CMRR) du Centre Hospitalier Régional et Universitaire (CHRU) de Lille et du centre médical des monts de Flandres de Bailleul. Pour cela, nous avons utilisé la base de données médicales informatisées des patients consultant au CMRR de Lille-Bailleul. Ce travail s'est en particulier intéressé aux avantages et aux limites de l'utilisation de bases de données médicales à des fins de recherche clinique dans l'étude des facteurs pronostiques des démences.<br />Dans une population de 670 patients ayant une maladie d'Alzheimer, nous avons confirmé que le déclin des fonctions cognitives (évaluées par le MMSE) était significativement plus élevé chez les sujets ayant un niveau d'éducation intermédiaire ou élevé par rapport aux sujets ayant un bas niveau d'éducation. Cependant, la mortalité ne différaient pas de façon significative entre ces trois groupes. Nous avons décrit une mortalité similaire entre patients ayant une maladie d'Alzheimer, une démence mixte ou une démence vasculaire. Les patients ayant une démence mixte avaient un déclin du MMSE plus important que les patients ayant une démence vasculaire mais moins important que les patients ayant une maladie d'Alzheimer. Enfin, nous avons montré que le risque de développer une démence vasculaire ou mixte augmentait de manière significative avec le nombre d'hypersignaux sous corticaux chez des patients ayant un mild cognitive impairment.<br />Ces travaux soulignent la difficulté de l'établissement du diagnostic des démences mixtes, la complexité de l'analyse du déclin des fonctions cognitives (prise en compte du stade de progression des démences, absence d'instrument de suivi des fonctions cognitives à la fois simple d'utilisation et sensible aux faibles variations au cours du temps ou non linéarité du déclin des fonctions cognitives), les avantages en terme de coût et de temps de l'utilisation de bases de données médicales, et les problème de sélection de la population issue d'une structure de soins.<br />Malgré les problèmes de représentativité des populations, ce travail montre l'intérêt de l'utilisation à des fins de recherche clinique de données médicales concernant des patients pris en charge en structure de soins.

Histoire et suivi d'une cohorte multicentrique de 100 nouveau-nés à terme ayant eu un infarctus cérébral artériel (cohorte AVCnn). L'homogénéité de la population, le nombre d'inclus, la somme des données collectées et leur comparaison à des groupes témoins puis désormais la durée du suivi font de la cohorte AVCnn un outil de travail unique dans la littérature. Les premiers résultats ont permis de définir un profil obstétrico-néonatal clinique et biologique à risque (objectif principal de l'étude). Inversement d'autres facteurs de risque suspectés (comme les dysgravidies ou les mutations des facteurs II et V de la coagulation) n'ont pu être confirmés, probablement du fait de la sélectivité des critères d'inclusion; les études antérieures ayant en effet inclus des enfants avec divers types d'AVC périnatals. La cause de l'accident n'a été établie (objectif secondaire) que pour une minorité d'enfants. Il semble exister plusieurs mécanismes pathologiques, dont le poids de naissance et le sexe seraient des biomarqueurs. Des facteurs pronostiques (objectif secondaire) de l'évolution motrice, accessibles dès les premiers jours de vie à l'lRM, ont également été déterminés alors que les symptômes n'apparaîtront que plusieurs mois après. Ceci permet d'envisager qu'une prise en charge précoce et ciblée sur ces nouveau-nés serait d'autant plus efficace que l'enfant n'a pas encore de symptômes. L'évaluation de la qualité de vie et de l'autonomie à l'âge de 3,5 ans est terminée. L'évaluation développementale (profil moteur, neuropsychologique, langagier, comportemental, épileptique et réussite scolaire) et de la réorganisation fonctionnelle cérébrale par IRM à 7 ans viennent de débuter.

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, est une compo- sante cruciale de l'unité neuro-glio-vasculaire car elle est responsable du maintien de l'homéostasie cérébrale. En limitant l'accès de nombreuses molécules au parenchyme cérébral, cette structure protège efficacement le système nerveux central (SNC) de composés toxiques, mais empêche ainsi de nombreux médicaments d'atteindre leur cible. La difficulté à étudier les caractéristiques et la perméabilité de la BHE in vivo a mené les scientifiques à développer différents modèlesin vitro de BHE. Notre modèle, qui consiste en une coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été largement caractérisé : il exprime les caractéristiques de laBHEin vivoet s'est avéré utile dans l'étude des interactions cellulaires au sein de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques. Le modèle de coculture initialement développé a été complété par l'addition de péricytes cérébraux afin de former des tricultures. En effet, les péricytes apparaissent aujourd'hui comme des acteurs importants de la BHE, mais sont souvent absents des modèles in vitro. Réunir les trois principales populations cellulaires formant la BHE(cellules endothéliales, cellules gliales et péricytes cérébraux) semble nécessaire afin de reproduire encore plus finement la configuration retrouvéein vivo, dans le but de comprendre les interactions cellulaires ayant cours au sein de la BHEen conditions physiologiques et pathologiques. Sur la base de notre coculture originelle, deux tricultures ont été mises en place : alors que dans la première les péricytes sont culti- vés à distance des cellules endothéliales, ces deux types cellulaires sont étroitement associés dans le second. Les deux modèles ont été caractérisés en terme de morphologie et d'expression de marqueurs endothéliaux, de perméabilité paracellulaire et d'expression de pompes d'efflux, démontrant qu'ils représentent tous deux des modèles pertinents de BHE. Ils permettront d'étudier la contribution des péricytes au phénotype de BHE et à sa réponse en conditions pathologiques, prenant en considération la composante glio-vasculaire. Dans la majorité des cas, l'utilisation des modèlesin vitro de BHE au cours des processus de découverte de médicaments vise à prédire si de potentielles molécules thérapeutiques à visée cérébrale peuvent atteindre le SNC, permettant leur effet pharmacologique au niveau de leur cible centrale. Cependant, ces modèles ne présentent généralement pas un débit suffisant pour évaluer rapidement la perméabilité du grand nombre de composés générés par l'industrie pharmaceutique lors des étapes précoces de la découverte de médicaments. A partir de notre coculture d'origine, un premier modèle a été développé pour l'adapter au criblage de molécules en réduisant son format (24 puits au lieu de 6 puits) ainsi que son coût, le temps de culture et les besoins techniques associés. Cette procédure comprend toutefois une étape critique de trypsinisation des cellules endothéliales. Nous avons souhaité rendre ce modèle encore plus facile d'utilisation en le fournissant congelé, afin que l'utilisateur final consacre un minimum de temps et de ressources techniques. Toutes ses caractéris- tiques montrent qu'il constitue un modèle in vitro de BHE pertinent et fiable pouvant répondre au besoin de criblage de composés des groupes pharmaceutiques et des petites entreprises de biotechnologie. Le travail réalisé a permis d'adapter notre modèle deBHEoriginel à deux problématiques. D'une part, la simplification de la procédure associée à sa mise en place permet de répondre aux besoins de l'indus- trie pharmaceutique de générer des données de perméabilité à grande échelle, lors des phrases précoces de la découverte de médicaments. D'autre part, l'intégration des péricytes cérébraux au sein du modèle permet d'étudier les interactions cellulaires mises en jeu au sein de la composante glio-vasculaire. Ces modèles pourront donc respectivement contribuer au développement de médicaments à visée cérébrale dont la perméabilité à travers laBHEpourra être optimisée, et à l'étude les intercommunications cellulaires mises en jeu au niveau de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques.

Les espèces dérivées de l'oxygène comme le peroxyde d'hydrogène jouent un rôle déterminant dans le bon fonctionnement des cellules en tant que molécule de signalisation dans de nombreux processus cellulaires. Les fortes concentrations pouvant être nocive, la régulation de ces substances est vitale. Leur détection résolue en temps est longtemps restée un défi pour la compréhension des mécanismes cellulaires et l'élaboration de traitements efficaces pour des maladies comme l'hypertension ou l'athérosclérose. Ce travail de thèse a ainsi été consacré au développement d'un nouveau type de capteur de substances oxydantes à base de nanoparticules de va- nadate d'Yttrium dopé par de l'Europium. Ces nanoparticules peuvent être internalisées dans les cellules et permettent une détection temporelle de la concentration en peroxyde d'hydrogène dans un domaine étendu de concentrations (1 μM à 5 mM). Après une calibration préalable, ces nanoparticules ont permis de détecter la production de peroxyde d'hydrogène dans les mécanismes de signalisation dans des cellules musculaires lisses vasculaires de souris liés à l'endothéline-1 et au facteur de croissance dérivé des plaquettes. Cette étude comparative a montré deux dynamiques différentes de la production de peroxyde d'hydrogène. Ces dynamiques distinctes peuvent expliquer au moins partiellement la différence de comportement cellulaire.