Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Lucilene Delazari dos Santos / Banca: Nanci Nascimento / Resumo: A giroxina isolada do veneno de Crotalus durissus terrificus apresenta atividades coagulante e neurotóxica, caracterizada pelo "rolamento em barril". É uma serinoprotease do tipo trombina-símile que tem a capacidade de converter o fibrinogênio em fibrina. Visando a atenuação destas atividades, a irradiação com 60Co aparece como uma importante ferramenta. O presente estudo teve por objetivo isolar e purificar a giroxina e avaliar o efeito da irradiação com 60Co sobre suas atividades coagulante e tóxica. O isolamento da giroxina envolveu duas etapas cromatográficas: gel filtração em coluna Sephadex G-75 e afinidade em coluna Benzamidina-Sepharose 6B. O alto grau de pureza foi confirmado por RP-HPLC C2/C18 e pela análise eletroforética, que revelou uma massa molecular de aproximadamente 30 kDa. A giroxina nativa catalisou a hidrólise dos substratos cromogênicos S-2238 e S-2288, demonstrando tratar-se de uma serinoprotease pertencente à subclasse das enzimas trombina-símile, estável em diferentes pHs (5,5 a 8,5), sensível aos metais Mn2+ e Cu2+ e aos inibidores de serinoprotease PMSF e benzamidina. Apresentou melhor atividade coagulante sobre o plasma humano entre os pHs 6,0 e 7,4. A irradiação da giroxina nas doses de 0,5; 1,0 e 2,0 kGy anulou completamente suas atividades coagulante e tóxica. Os ensaios de toxicidade in vivo mostraram apenas alterações comportamentais sem demonstrar o rolamento em barril. Este fato sugere que as toxinas purificadas são mais sensíveis à irradiação, pois não há proteção mútua entre as proteínas presentes no veneno total. A giroxina nativa também não causou o bloqueio da contração neuromuscular in vitro sugerindo que a sua ação não tem efeito sobre o sistema nervoso periférico nas concentrações utilizadas / Abstract: Gyroxin isolated from Crotalus durissus terrificus venom presents coagulant and neurotoxic activities. It belongs to the thrombin-like enzyme group capable of converting fibrinogen into fibrin. To reduce these toxic activities, the irradiation with Cobalt-60 appears to be an important tool. The present study was carried out in order to isolate and purify the gyroxin and evaluate the effects of irradiation with Cobalt-60 on coagulant and toxic activities. The gyroxin isolation consisted of two chromatographic steps: gel filtration (Sephadex G-75) and affinity (Benzamidine-Sepharose 6B). The high purity level of gyroxin was confirmed by RP-HPLC C2/C18 and electrophoretic analysis that showed a molecular weight of 30 kDa. The native gyroxin hydrolyzed the chromogenic substrates S-2238 and S-2288, indicating that this enzyme is a serine proteinase that belongs to the group of thrombin-like enzymes, stable when submitted to pHs from 5.5 to 8.5 and inhibited by Mn2+, Cu2+, PMSF and benzamidine. It was capable of coagulating human plasma at pH 6.0 and 7.4. The gyroxin irradiated at 0.5, 1.0 and 2.0 kGy doses neutralized the coagulant and toxic activities. The in vivo toxic study showed only behavioral alterations with no barrel rotation. This fact suggests that purified toxins are more sensitive to the irradiation because they e mutual protection with the other proteins present in the total venom. The native gyroxin was not able to block in vitro neuromuscular contraction, suggesting that the action of gyroxin, in the concentration used in this study, has no effect on the peripheral nervous system / Mestre

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Envenenamento por serpentes é um importante problema de saúde pública em vários países tropicais e subtropicais, pois além da mortalidade, pode resultar em sequelas permanentes como consequência de danos locais, representando assim um grande desafio à terapia utilizando antivenenos. As proteínas fosfolipases A2 (PLA2s) e fosfolipases A2 homólogas de venenos têm um papel fundamental na complexa patogênese da necrose do músculo esquelético e seus mecanismos de ação são apenas parcialmente entendidos. Por isso, a busca por inibidores e da completa descrição do mecanismo de ação das PLA2s e PLA2s homólogas representam assuntos amplamente abordados no campo acadêmico-científico. Para o melhor entendimento desses mecanismos e a busca por novas moléculas inibidoras, o entendimento dos processos de reconhecimento molecular de pequenos ligantes e macromoléculas biológicas é fundamental e requer a completa caracterização da energética de ligação desses agentes e da correlação entre os dados termodinâmicos e cinéticos com as estruturas moleculares envolvidas na ligação. Para tanto, a calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é a metodologia mais utilizada com este fim. Nesse trabalho, nossos objetivos foram: i) determinar os parâmetros termodinâmicos de moléculas candidatas a inibidores da atividade miotóxica de PLA2s homólogas: bothropstoxina-I (BthTX-I) e moojenitoxina I (MjTX-I) e II (MjTX-II), purificadas do veneno de serpentes do gênero Bothrops e (ii) caracterizar a interação ent... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Se ha estudiado el veneno del escorpión Tityus sp. (aff. T. silvestris Pocock, 1897) habiéndose determinado que contiene 47,6% de proteína. Las proteínas del veneno fueron separadas a partir de 12,9 mg de veneno, mediante cromatografía de intercambio catiónico en CM Sephadex C-25, con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 7,0 a temperatura ambiente y a un flujo de 11 mL/h. El perfil cromatográfico mostró la presencia de siete picos proteicos y por PAGE-SDS se diferenciaron por lo menos cinco bandas proteicas en el veneno crudo. Los ensayos de toxicidad han permitido identificar tres toxinas que afectan a Mus musculus y que se encuentran asociadas a los picos IV, V y VII; y asimismo se ha detectado toxicidad sobre Gryllus sp., la cual está asociada a los picos IV, V, VI y VII. Entre las actividades enzimáticas se ha determinado la presencia de actividad proteolítica sobre azocoll y caseína relacionada al pico I. También se ha encontrado actividad de hialuronidasa en el pico IV con una actividad específica de 205,6 μg/min/mg. Finalmente tanto en el veneno crudo como en las fracciones colectadas no se ha encontrado actividad de fosfolipasa, anticoagulante ni hemolítica. / This research has shown that 47,6% of Tityus sp. (aff. T. silvestris Pocock, 1897) venom consists of protein. The venom proteins were separated from 12,9 mg of venom using cationic exchange chromatography in CM Sephadex C-25 with a 0,05 M ammonium acetate buffer pH 7,0 at room temperature and 11 mL/h flow. The chromatography profiles show seven peaks of proteins and by PAGE-SDS, five protein bands were distinguished in the crude venom. The toxicity assays allowed the identification of three toxins that affect Mus musculus which were associated to peaks IV, V and VII. Toxic proteins to Gryllus sp. were also found associated to peaks IV, V, VI and VII. Through the enzymatic activity, the presence of proteolytic activity was found related to the first peak, which has activity over azocoll and casein. Hyaluronidase activity has also been found in the peak IV with a specific activity 205,6 μg/min/mg. However, the crude venom and collected fractions did not show any phospholipase, anticoagulant, nor hemolytic activity.

Del veneno del escorpión Brachistosternus ehrenbergii, se ha aislado una toxina específica para ratones. La toxina denominada Be1 fue purificada mediante cromatografía de intercambio catiónico, en CM-Sephadex C-25 (16 x 1,1 cm) con buffer acetato de amonio 0,05 M a pH 7, y se caracteriza por ser una proteína básica que constituye el 8,1 % de la proteína total del veneno. La pureza de la toxina fue evaluada por electroforesis en condiciones nativas, de acuerdo al método de Reisfeld, y en condiciones denaturantes por el método de Schägger y von Jagow, determinándose que la toxina es de una sola cadena polipeptídica de 6,3 kDa. La toxina al ser inoculada en ratones albinos adultos; vía intraperitoneal (62 µg) produce la aparición de algunos signos locales como hipersecreción salival seguido por cuadros de afección respiratoria, arrastre de las patas posteriores, hasta causar la muerte. Vía intramuscular (7,6 µg), Be1 produce parálisis temporal de la extremidad inoculada. La toxina no tiene actividad de fosfolipasa, proteasa, acetilcolinesterasa ni actividad inhibidora de acetilcolinesterasa. / From Brachistosternus ehrenbergii scorpion venom a specific toxin to mice has been isolated. The toxin denominated Be1 was purificated by means of cationic exchange chromatography on CM-Sephadex C-25 column (16 x 1,1 cm) with ammonium acetate buffer 0,05 M at pH 7, and it characterizes to be a basic protein that constitute 8,1 % of venom total protein. Toxin purity was evaluated by electrophoresis in natives conditions, according to Reisfeld-method, and denaturants conditions by the Schägger-and-von Jagow-method, the toxin is a single chain polypeptide of 6,3 kDa has been determined. The toxin to be inoculated on albino mice; intraperitoneal way (62 mg of Be1) produces some local signals as salival hipersecretion followed by respiratory affection, drags hind feet until death. Intramuscular way (7,6 mg) produces temporal paralysis of the inoculated limb. The toxin has neither phospholipase, nor protease, nor acetylcholinesterase nor acetylcholinesterase inhibitor activity.

Orientador: Márcia Regina Brochetto Braga / Banca: Regina Barretto Cicarelli / Banca: Frederico Gonzalez Colombo Arnoldi / Resumo: Polybia paulista ou popularmente "paulistinha" é uma vespa social da família Vespidae. Possui hábitos urbanos e grande ocorrência no Sudeste do Brasil, especialmente no Estado de São Paulo, onde tem causado muitos acidentes de importância médica. Na composição de seu veneno encontra-se um potente alérgeno, a proteína Antígeno 5 (Ag5) e embora sua função biológica ainda seja desconhecida, este alérgeno é responsável por importantes reações imunológicas cruzadas com o Ag5 do veneno de outros insetos sociais e com outras proteínas de eucariotos. A importância da reatividade cruzada em pacientes alérgicos ao veneno de vespas sociais é inquestionável, pois estas interações têm impacto direto sobre o diagnóstico e a seleção da melhor conduta terapêutica. Os diagnósticos de alergia são baseados na detecção de anticorpos do tipo IgE específico ao veneno por testes cutâneos ou de sangue. No entanto, respostas falso-positivas decorrentes da reatividade cruzada e respostas falso-negativas provenientes da baixa quantidade de IgE detectada, dificultam a interpretação dos resultados. A sequência completa de cDNA (621 pb) do alérgeno Ag5 do veneno da vespa P. paulista, foi clonada e a análise dos nucleotídeos revelou uma similaridade de 99% com a vespa Polybia scutellaris. Anticorpos policlonais foram produzidos contra a fração eletroforética protéica do Ag5 (25 kDA) de P. paulista e analisados imunologicamente por Western blotting. Os resultados demonstraram que os anticorpos reconheceram especificamente o alérgeno Ag5 no veneno bruto de P. paulista bem como, desenvolveram maior reação imunológica cruzada com os alérgenos Ag5 do veneno das vespas do gênero Polybia, embora não se descarte a possibilidade de ocorrência de reação cruzada com venenos de outros insetos sociais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Polybia paulista, commonly known as "paulistinha", is a social wasp of the family Vespidae. This species occurs in urban areas and is frequent in the Southeastern Brazil, especially in the State of São Paulo, where it has been responsible for many accidents of medical significance. A potent allergen, the protein antigen 5 (Ag5), is an important compound of the wasp venom. Although its biological function remains unknown, this component is responsible for substantial cross-immunological reactions with the Ag5 of venoms of other social insects and with eukaryotic proteins. The importance of cross-reactivity in allergic patients to the wasp venoms is unquestionable, because these interactions present a direct impact on the diagnosis and on the selection of the therapeutic treatment. Allergenic diagnoses are based on the detection of IgE specific to the venom via cutaneous or blood tests. However, sometimes they are hampered by false-positive responses as a result of cross-reactivity and false-negative responses that can occur due to the low amount of IgE detected as consequence of the low sensitivity of the test. The fulllength cDNA (621 bp) from the venom allergen Ag5 wasp P. paulista was cloned and nucleotide analysis revealed 99% of similarity with the wasp Polybia scutellaris. Polyclonal antibodies were produced against the electrophoretic protein fraction of Ag5 (25 kDa) of P. paulista and immunologically analyzed by Western blotting. The results showed that the antibodies strongly recognized the allergen Ag5 in the venom of P. paulista and developed higher cross-immune reaction with the same allergen in wasp venoms of the genus Polybia, although the possibility of cross reaction with other insect venoms not tested in this study cannot be excluded. The model carried out for the Ag5 P. paulista revealed the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-06T21:13:13Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) Previous issue date: 2006 / O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-15T20:31:46Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) Previous issue date: 2010 / Peptídeos neurotóxicos encontrados em venenos animais têm despertado um grande interesse de pesquisadores. A possibilidade de utilizá-los como ferramentas moleculares para estudos em canais iônicos, além do uso como bioinseticidas e/ou como biofármacos, tem impulsionado as pesquisas nessa área. Experimentos com o veneno bruto da aranha caranguejeira Lasiodora sp mostraram que o mesmo atua em canais iônicos de pequenos vertebrados e de invertebrados. Recentemente, construímos uma biblioteca de cDNA a partir dos mRNAs presentes na glândula de veneno dessa aranha. A varredura desta biblioteca, usando a técnica de ELISA, e o sequenciamento de DNA, permitiram a identificação de cinco toxinas presentes no veneno, nomeadas LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5. Experimentos realizados com a toxina recombinante LTx2, em células musculares BC3H1, mostraram que esse peptídeo bloqueia canais de cálcio tipo-L e inibe a recarga de Ca2+ dos estoques intracelulares. A estrutura primária do peptídeo LTx2 é muito similar a dos peptídeos LTx1 e LTx3, portanto, espera-se que essas toxinas possuam mescanismos de ação semelhantes. Por outro lado, a sequência de aminoácidos da LTx4 e da LTx5 são bem diferentes, tanto quando comparadas com a LTx1, LTx2 e LTx3, quanto entre si, o que leva a acreditar que elas possam atuar em diferentes canais e/ou ter diferentes mecanismos de ação. Neste trabalho, a sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 foi subclonada no vetor de expressão pET21b (Novagen). A estratégia foi inserir o gene de interesse sob o controle do promotor T7 e obter um produto expresso em fusão com uma cauda de seis histidinas. A confirmação da clonagem foi realizada através de PCR, digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição e, finalmente, seqüenciamento dos DNAs extraídos dos clones positivos. A indução da expressão do peptídeo LTx4 foi realizada com a adição de 1mM de IPTG ao meio de cultura. Nos ensaios de imunodetecção utilizamos o anticorpo monclonal anti His-Tag. O peptídeo recombinante foi identificado tanto em experimentos de Western Blot como em experimentos de Dot Blot. O peptídeo recombinante foi expresso exclusivamente na forma de corpos de inclusão e em maiores quantidades após três a quatro horas de indução. O perfil protéico foi analisado em géis de poliacrilamida (Tricina-SDS). Experimentos de purificação do peptídeo encontramse em andamento. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Peptide neurotoxins found in animal venoms have attracted great interest of researchers. The possibility of using them as tools for molecular studies of ion channels in addition to use as biopesticides and/or as biopharmaceuticals has boosted research in this area. Experiments with the venom of the spider Lasiodora sp showed that it acts on ion channels of small vertebrates and invertebrates. Recently, we constructed a cDNA library from mRNAs present in the venom gland of this spider. The screen of this library, using ELISA and DNA sequencing, allowed the identification of five toxins in the venom, named LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 and LTx5. Experiments conducted with recombinant toxin LTx2 in muscle cells BC3H1 showed that this peptide blocks L-type calcium channels and inhibits Ca+2 recharge from intracellular stores. The primary structure of the peptide LTx2 is very similar to the peptides LTx1 and LTx3, and consequently it is expected that these toxins have similar action mechanisms. On the other hand, the amino acids sequences of LTx4 and LTx5 are quite different, both when compared with LTx1, LTx2 LTx3 and as between themselves, which leads to believe that they can act on different channels and/or have different action mechanisms. In this work, the coding sequence for the mature peptide LTx4 was subcloned at the expression vector pET21b (Novagen). The strategy used was to insert the gene of interest under the control of T7 promoter and obtain the expression product in fusion with a six histidine tag. The cloning confirmation was performed by PCR, plasmid DNA digestion with restriction enzymes, and finally, sequencing of DNAs extracted from the positive clones. The induction of LTx4 peptide expression was performed by addition of 1mM IPTG to the culture medium. At the immunodetection assay, we used monoclonal antibody anti His-tag. The recombinant peptide was identified by both Western Blot and Dot Blot experiments. The recombinant peptide was expressed exclusively as inclusion bodies and in larger amounts after three to four hours of induction. The protein profile was analyzed on polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS). Peptide purification experiments are in course.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-20Bitstream added on 2014-06-13T20:42:45Z : No. of bitstreams: 1 cavalcante_wlg_dr_botib.pdf: 540446 bytes, checksum: aa99d8f07bfca51a15835afc3dc14831 (MD5) / As fosfolipases A2 (PLA2s) que apresentam substituição do resíduo de aspartato pelo de lisina na posição 49, PLA2s Lys49 homólogas, são importantes componentes miotóxicos dos venenos de serpentes da família Viperidae. Estas proteínas induzem severa mionecrose através de um mecanismo cálcio-independente. Tradicionalmente, as PLA2s Lys49 são classificadas como miotoxinas não-neurotóxicas, visto que não causam paralisia quando injetadas in vivo, mesmo em doses elevadas. No entanto, vários estudos in vitro demonstram que as PLA2s Lys49 dos venenos de serpentes do gênero Bothrops induzem bloqueio neuromuscular em preparações isoladas. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avançar no conhecimento do mecanismo da ação paralisante in vitro destas toxinas. Para tanto, foram caracterizadas as atividades da MjTX-II, isolada do veneno da Bothrops moojeni, em preparações frênico-diafragma de camundongos, através de estudos miográfico, eletrofisiológico e morfológico. Os efeitos desta toxina foram comparados com os da PrTX-I e da BthTX-I, isoladas do veneno da Bothrops pirajai e da Bothrops jararacussu, respectivamente. Além disto, foi avaliada a capacidade da suramina e do extrato aquoso de Casearia sylvestris em neutralizarem as ações destas toxinas. Os resultados obtidos mostraram que a MjTX-II, da mesma forma que a BthTX-I e a PrTX-I, induziu efeitos miotóxico e bloqueador neuromuscular na preparação frênico-diafragma de camundongos. O estudo eletrofisiológico revelou a atividade despolarizante das três toxinas na membrana da fibra muscular, bem como a habilidade da MjTX-II em induzir aumento na freqüência dos potenciais de placa motora terminal em miniatura. A pré-incubação com e extrato aquoso de Casearia sylvestris neutralizou as atividades miotóxica e bloqueadora neuromuscular das três toxinas. De forma similar, a pré-incubação com... / Phospholipases A2 (PLA2s) with a lysine substituting for the highly conserved aspartate 49, Lys49 PLA2 homologues, are important myotoxic components in venoms from snakes of Viperidae family. These proteins induce conspicuous myonecrosis by a catalytically-independent mechanism. Traditionally, the Lys49 PLA2 homologues are classified as non-neurotoxic myotoxins given their inability to cause paralytic effect when injected in vivo, even at relatively high doses. However, a series of in vitro studies has shown that several Lys49 PLA2 homologues from Bothrops snake venoms induce neuromuscular blocking activity on nerve-muscle preparations in vitro. Therefore, the aim of this work was to advance in the understanding of the mechanisms underlying the in vitro paralyzing action of these proteins. Thus, we characterized the activities of MjTX-II, from Bothrops moojeni venom, in mice phrenic-diaphragm preparation by means of myographical, electrophysiological and morphological approaches. The effects of this toxin were compared with those of PrTX-I and BthTX-I, from Bothrops pirajai and Bothrops jararacussu venoms, respectively. Besides this, we evaluated the ability of suramin and the aqueous extract of Casearia sylvestris in neutralizing the actions of these toxins. The results showed that the MjTX-II, as well as BthTX-I and PrTX-I, induced myotoxic and neuromuscular blocking activities in phrenic-diaphragm preparation of mice. The electrophysiological study revealed the depolarizing activity of these toxins in the muscle fiber membrane and the ability of MjTX-II to increase the frequency of miniature endplate potentials. The pre-incubation with the aqueous extract of Casearia sylvestris neutralized both myotoxic and neuromuscular blocking activities of all toxins. Similarly, the pre-incubation with suramin neutralized the activities of MjTX-II. Taken together, these findings suggest that the ... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-05Bitstream added on 2014-06-13T18:43:16Z : No. of bitstreams: 1 santos_ji_dr_botib.pdf: 2854322 bytes, checksum: 40144832d1328710b9a79f30a62356ba (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O envenenamento por picadas de serpentes é um importante problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais. Aspectos científicos, médicos e sociais relacionados ao envenenamento por serpentes do gênero Bothrops são especialmente importantes no Brasil já que estes animais são responsáveis por aproximadamente 90% dos acidentes ofídicos relatados em nosso país. Um dos principais problemas relacionados ao acidente botrópico é o proeminente dano tecidual local cuja patogênese é complexa e envolve a ação combinada de uma variedade de componentes do veneno. As fosfolipases A2 (PLA2s) são os componentes mais abundantes no veneno e tem papel fundamental quando se trata do estabelecimento de lesão muscular. O presente trabalho descreve estudos estruturais com miotoxinas que adotam enovelamento de PLA2s (PLA2s homólogas) com o objetivo de melhor entender a relação estrutura – função destas toxinas. Para tanto, estudos estruturais por cristalografia de difração de raios X com Lys49-PLA2s de venenos botrópicos complexadas com os inibidores manganês e ácido rosmarínico (AR) foram realizados. A estrutura cristalográfica de uma miotoxina Asp49-PLA2 homóloga complexada com cálcio também foi elucidada. Adicionalmente, o arranjo quaternário de miotoxinas Asp49-PLA2s homólogas do gênero Bothrops foi revisado e características estruturais relevantes para a expressão da miotoxicidade destas proteínas foram apontadas. A estrutura cristalográfica do complexo formado entre uma Lys49-PLA2 e o inibidor AR evidencia que este inibidor interage com a proteína na entrada de uma dos canais hidrofóbicos do dímero protéico, estabelecendo ligações de hidrogênio com átomos dos resíduos Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 e Gly15 do monômero com a qual interage. Já no... / Envenoming resulting from snakebites is an important public health problem in many tropical and subtropical countries. Scientific, medical and social aspects related to envenoming by snakes from Bothrops genus are especially important in Brazil because these animals are responsible for approximately 90 % of all ophidian accidents reported in our country. One of the main problems regarding bothropic accidents is a prominent local tissue damage whose pathogenesis is complex and involves the combined action of a variety of venom components. Phospholipases A2 (PLA2s) are the most abundant muscle-damaging components of these venoms playing a central role in the muscle damage establishment. The present work reports structural studies with myotoxins that adopt a PLA2 fold (PLA2- like myotoxins) aiming a better understanding of their structure-function relationship. For this purpose, X-ray crystallographic studies of Lys49-PLA2s from bothropic snake venoms complexed to the inhibitors manganese and rosmarinic acid (RA) were performed. The crystallographic structure of the complex formed between an Asp49-PLA2-like myotoxin and calcium was also solved. Additionally, the quaternary assembly of Asp49-PLA2-like myotoxins from Bothrops genus was reviewed and relevant structural features for their myotoxicity expression were pointed out. The crystallographic structure of the complex formed between a Lys49-PLA2 and the inhibitor RA demonstrates that the inhibitor interacts with the protein in the entrance of one of its hydrophobic channel, establishing hydrogen bonds with atoms of the residues Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 and Gly15 of the monomer with which it interacts. For the complex formed between a Lys49-PLA2 and the inhibitor Mn2+ the manganese ion is coordinated by atoms of the... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estudar, a morfologia das glândulas produtoras de veneno da aranha L intermedia, bem como esclarecer questões relacionadas ao perfil e funções dos oligossacarídeos conjugados às glicoproteínas deste veneno. A aranha marrom, do gênero Loxosceles, tornou-se de grande importância médica, devido aos acidentes de envenenamento (loxoscelismo) que vem ocorrendo em diferentes partes do mundo. As atividades biológicas do veneno da aranha marrom normalmente incluem lesões dermonecróticas no local da picada, acompanhadas por efeitos hemolíticos e hemorrágicos e também pelo quadro clínico de insuficiência renal aguda (IRA). Pelo uso de microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, demonstrou-se que a organização das glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia seguem a arquitetura geral das glândulas de veneno de outras aranhas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as glândulas de veneno são estruturas pares, situadas no cefalotórax e que descarregam seus produtos de secreção diretamente em um par de tubos ligados a cada quelícera. Usando-se microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão, observou-se que as glândulas apresentam camadas de fibras de músculos estriados, em contato com uma membrana basal que separa a região muscular da camada epitelial. As células epiteliais possuem um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e vesículas secretoras contendo o veneno, uma mistura complexa de proteínas. Com as técnicas de lectina-blotting, cromatografia de afinidade lectínica e tratamentos com glicosidases, detectou-se no veneno estruturas do tipo alta-manose N-ligadas, proteínas com resíduos de fucose N-Iigados e proteínas com resíduos de N-acetilgalactosamina O-ligados, mas ausência de glicosaminoglicanos ou estruturas complexas contendo galactose ou ácido siálico terminais. Com veneno deglicosilado enzimática ou quimicamente, demonstrou-se que a agregação plaquetária (atividade trombocitopênica), como também os efeitos fibronectinolítico e fibrinogenolítico (hemorrágicos), são açúcar-independentes quando comparados com os efeitos do veneno glicosilado. Uma análise através de zimograma copolimerizado em géis de gelatina, mostrou que a loxolisina B, uma metaloprotease gelatinolítica de 32-35 kDa, é uma glicoproteína do tipo alta-manose e que após uma N-deglicosilação enzimática teve seu peso molecular reduzido em aproximadamente 2 kDa e seu efeito gelatinolítico residual em 28%, quando comparado com a molécula glicosilada. Nesta condição apontou também uma atividade gelatinolítica dependente da glicosilação pós-traducional. O tratamento químico ou enzimático do veneno de L. intermedia (deglicosilação), reduziu significativamente seu efeito dermonecrótico quando testado experimentalmente em coelhos. Este dado sugere fortemente que resíduos de oligossacarídeos exercem um importante papel nos efeitos lesivos do veneno da aranha marrom e abre a possibilidade de se postular uma terapia tópica das lesões cutâneas, baseada em carboidratos.