Orientador : Oswaldo Vital Brazil / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-15T09:40:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neder_AntonioCarlos_D.pdf: 11258905 bytes, checksum: 86e01509fecf6b5aa6f007dadc438110 (MD5) Previous issue date: 1966 / Resumo: A peçonha de Tityus serrulatus, quando incubada com o diafragma do rato, o íleo da cabaia ou ganglio celiaco do gato, é capaz de liberar, desses tecidos, um principio hipotensor que foi identificado como sendo um éster da colina, com muita probabilidade, a própria acetilcolina. Esta substancia provem das terminações nervosas colinergica, pois ela não apareceu quando se empregaram estruturas desenervadas...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Odontologia

Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: Lucilene Delazari dos Santos / Banca: Norma Yamanouke / Banca: Valquiria Abrao Coronado Dorce / Resumo: O aumento populacional de animais peçonhentos em áreas urbanizadas ou de atividades relacionadas à exploração de áreas naturais vem favorecendo um aumento significativo na ocorrência de acidentes devido ao contato do homem com estes animais. Dessa forma, o envenenamento por toxinas animais tem sido objeto de muitos estudos pelo homem por se revelarem úteis no desenvolvimento de novos fármacos e de novas abordagens metodológicas ou técnicas resolutivas. Os acidentes por escorpiões são os que apresentam o maior número de registro de casos dentre todos os animais peçonhentos no Brasil. Ao longo dos mais de cem anos de pesquisas com venenos destes animais, o foco toxinológico tem se concentrado quase que exclusivamente nas proteínas, responsáveis pela difusão do veneno nos tecidos das presas e/ou vítimas de ferroadas, e principalmente nos peptídeos longos (apresentando entre 30 e 70 resíduos de amino ácidos) responsáveis pelas ações neurotóxicas. A despeito da existência de pequenos peptídeos lineares nesses venenos são raros os estudos que visam elucidar a estrutura molecular e funcional dos pequenos peptídeos. O presente estudo teve como objetivo investigar peptídeos deste grupo (negligenciados) no veneno do escorpião Tityus serrulatus. Para isto, o veneno bruto deste escorpião foi submetido a extração diretamente em acetonitrila 50 % (v/v), e a fração solúvel foi fracionada, e cada fração individual foi submetida à análise por espectrometria de massas ESI-IT-TOF-MS e MSn a fim obter as sequências completas de novos peptídeos. A estratégia utilizada permitiu a identificação de cinco novos peptídeos, estruturalmente diferenciados daqueles já descritos na literatura. Os peptídeos caracterizaram-se por serem lineares e não possuírem cisteínas. Desta forma, eles ampliam a classe... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The increasing population of venomous animals in urbanized areas or activities related to the exploitation of natural areas has favored significant accidents due to human contact with these animals. Thus, the toxins from animal venoms has been the subject of many studies prove useful in developing new drugs and new methodological approaches or high-resolution techniques. Scorpions's accidents are those with the highest number of reported cases among all venomous animals. More than a hundred years of research with these poisons animals, the principal focus toxinology is on proteins, responsible for the spread of the venom in tissues prey or victims, especially in neurotoxic peptides (presenting between 30 and 70 amino acid residues). Despite on the existence of small and linear peptides in these venoms are few studies exploring the molecular structure and function of small peptides. The present study aimed to the study of this peptides group (at moment is neglected) from scorpion venom Tityus serrulatus. For this, the venom were fractionated by chromatography, posteriorly each fraction was subjected to individual analysis by mass spectrometry (LC-MS IT-ToF) in order to obtain the complete sequence about novel peptides. This strategy promoted the detection of five undiscovered peptide sequences highly differentiated those previously described at literature. The peptides were characterized like non-disulfide-bridged peptides it is contributed to expanding the class of scorpions peptides with similar physicochemical characteristic. Two peptides were synthesized on solid phase (fraction 14 and fraction 18) and tested by biological activity in vivo and in vitro. The fraction 18 showed us antinociceptive and edematogenic effect, in addition to antibiotic effect. These results has been demonstrated the large biotechnology... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Márcia Gallacci / Banca: Selma Maria Michelin Matheus / Banca: Yoko Yoshima-Franco / Resumo: Os acidentes botrópicos representam cerca de 87% dos envenenamentos ofídicos registrados no Brasil e se destacam pelas graves seqüelas que limitam a vida do acidentado. O principal efeito tóxico local destes é a mionecrose, que pode levar à perda tecidual permanente e à amputação. A mionecrose pode ser decorrente da isquemia do tecido muscular, causada por fatores hemorrágicos presentes nestes venenos (metaloproteases), ou da presença de miotoxinas (PLA2s) que afetam diretamente o tecido muscular. O método mais eficaz para o tratamento dos envenenamentos ofídicos é a soroterapia passiva. No entanto, esta é limitada devido à relativa ineficácia do soro em neutralizar a mionecrose dos venenos botrópicos, além de muitas comunidades não terem acesso à soroterapia. Estes fatores conduzem a busca de métodos alternativos, como o uso de extratos vegetais. Evidências mostram que o extrato aquoso da Casearia sylvestris, conhecida popularmente como "guaçatonga, é capaz de neutralizar efeitos tóxicos de venenos brutos e de suas miotoxinas isoladas. A Casearia sylvestris apresenta diversos outros efeitos terapêuticos como: anti-séptico, antiinflamatório, anestésico local, anti-tumoral, anti-úlcera e cicatrizante. Devido à escassez de estudos experimentais para avaliar a eficácia de extratos vegetais na redução dos danos locais ocasionados pelo envenenamento botrópico, torna-se importante avaliar a potencial atividade antiofídica da Casearia sylvestris. O presente estudo teve por objetivo investigar o uso do extrato aquoso da Casearia sylvestris, como terapêutica tópica dos efeitos locais do envenenamento botrópico experimental em camundongos. Foi avaliada a capacidade do extrato bruto da planta em neutralizar a mionecrose induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu e/ou acelerar o processo de regeneração... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops accidents represent about 87% of snakebites recorded in Brazil and account for serious the consequences that affect the life of the victim with social and economic repercussions. Its main toxic effect is myonecrosis, which can lead to permanent tissue loss and amputation. Myonecrosis may result from muscle tissue ischemia, hemorrhage caused by factors present in these venoms (metalloproteases), or the presence of myotoxins (PLA2s) that directly affect muscle tissue. The most effective treatment is passive serotherapy. However, this is limited due the relative ineffectiveness of the serum to neutralize the myonecrosis of Bothrops venoms and the lack of access to serotherapy by many communities. These factors lead to alternative methods such as the use of plant extracts. Evidence shows that the aqueous extract of Casearia sylvestris, known popularly as "guaçatonga", is able to neutralize the toxic effects of venom and their crude myotoxins isolated. Casearia sylvestris presents several other therapeutic effects such as, antiseptic, antiinflammatory, local anesthetic, anti-tumor, anti-ulcer and wound healing. Due to the scarcity of experimental studies to evaluate the efficacy of plant extracts in reducing the harm caused by Bothrops envenomation, it is important to evaluate the potential activity of antiophidic Casearia sylvestris as a complement to conventional serum therapy. The present study aimed to investigate the use of aqueous extract of Casearia sylvestris, topical therapy as complementary to local effects of Bothrops envenomation in experimental mice. We evaluated the ability of the crude extract of the plant to neutralize myonecrosis induced by the venom of Bothrops jararacussu and / or accelerate the process of muscle regeneration. The onset of myonecrosis and the regenerative process... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:49:43Z : No. of bitstreams: 1 menegasso_ars_me_rcla.pdf: 1216083 bytes, checksum: ac3bda955af069df9ded65f304b31e2e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O aumento populacional de animais peçonhentos em áreas urbanizadas ou de atividades relacionadas à exploração de áreas naturais vem favorecendo um aumento significativo na ocorrência de acidentes devido ao contato do homem com estes animais. Dessa forma, o envenenamento por toxinas animais tem sido objeto de muitos estudos pelo homem por se revelarem úteis no desenvolvimento de novos fármacos e de novas abordagens metodológicas ou técnicas resolutivas. Os acidentes por escorpiões são os que apresentam o maior número de registro de casos dentre todos os animais peçonhentos no Brasil. Ao longo dos mais de cem anos de pesquisas com venenos destes animais, o foco toxinológico tem se concentrado quase que exclusivamente nas proteínas, responsáveis pela difusão do veneno nos tecidos das presas e/ou vítimas de ferroadas, e principalmente nos peptídeos longos (apresentando entre 30 e 70 resíduos de amino ácidos) responsáveis pelas ações neurotóxicas. A despeito da existência de pequenos peptídeos lineares nesses venenos são raros os estudos que visam elucidar a estrutura molecular e funcional dos pequenos peptídeos. O presente estudo teve como objetivo investigar peptídeos deste grupo (negligenciados) no veneno do escorpião Tityus serrulatus. Para isto, o veneno bruto deste escorpião foi submetido a extração diretamente em acetonitrila 50 % (v/v), e a fração solúvel foi fracionada, e cada fração individual foi submetida à análise por espectrometria de massas ESI-IT-TOF-MS e MSn a fim obter as sequências completas de novos peptídeos. A estratégia utilizada permitiu a identificação de cinco novos peptídeos, estruturalmente diferenciados daqueles já descritos na literatura. Os peptídeos caracterizaram-se por serem lineares e não possuírem cisteínas. Desta forma, eles ampliam a classe... / The increasing population of venomous animals in urbanized areas or activities related to the exploitation of natural areas has favored significant accidents due to human contact with these animals. Thus, the toxins from animal venoms has been the subject of many studies prove useful in developing new drugs and new methodological approaches or high-resolution techniques. Scorpions’s accidents are those with the highest number of reported cases among all venomous animals. More than a hundred years of research with these poisons animals, the principal focus toxinology is on proteins, responsible for the spread of the venom in tissues prey or victims, especially in neurotoxic peptides (presenting between 30 and 70 amino acid residues). Despite on the existence of small and linear peptides in these venoms are few studies exploring the molecular structure and function of small peptides. The present study aimed to the study of this peptides group (at moment is neglected) from scorpion venom Tityus serrulatus. For this, the venom were fractionated by chromatography, posteriorly each fraction was subjected to individual analysis by mass spectrometry (LC-MS IT-ToF) in order to obtain the complete sequence about novel peptides. This strategy promoted the detection of five undiscovered peptide sequences highly differentiated those previously described at literature. The peptides were characterized like non-disulfide-bridged peptides it is contributed to expanding the class of scorpions peptides with similar physicochemical characteristic. Two peptides were synthesized on solid phase (fraction 14 and fraction 18) and tested by biological activity in vivo and in vitro. The fraction 18 showed us antinociceptive and edematogenic effect, in addition to antibiotic effect. These results has been demonstrated the large biotechnology... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Durigon_AndreMarchi_M.pdf: 4253171 bytes, checksum: d40a5c4577ed52c635254ee0ab159b13 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: No presente estudo, os efeitos farmacológicos do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis foram estudados em preparações nervo frêniCCHiiafragma de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Em preparações biventer cervicis de pintainho, na temperatura de 37°C, o veneno, (1,5, 10,50 e 100 J1g/ml) produziu bloqueio neuromuscular progressivo e dependente da concentração. Em baixas concentrações (1,5, 10 e 20 J1g1m1), as respostas ao KCI (13,4 mM), aplicado ao banho, foram parcialmente inibidas, enquanto que as respostas à ACh (110 mM ou concentrações cumulativas de 10-6 - 10-2 mM) permaneceram após a incubação com o veneno, e na vigência de bloqueio total. Em altas concentrações (50 - 100 J1g1ml), o veneno causou contratura, inibiu as respostas à ACh, ao KCI e as contrações em resposta à estimulação elébica direta. Estes efeitos não foram observados à temperatura ambiente (20 - 24° C), quando COf11)8rados aos obtidos a 37°C. Na preparação hemidiafragma de camundongo, na concentração de 20 p.gImI, o veneno inibiu irreversivelmente (60 :t 10 % de bloqueio; p < 0,05; n = 6) as respostas à estimulação elétrica indireta. Na mesma preparação a concentração de 50 J1g1ml do veneno determinou bloqueio completo das contrações musculares em resposta à estimulação elétrica indireta (n = 5) e direta (n = 6). Na ausência do ea2+ (1,8 mM), substituído pelo s.-2+ (4 mM), o p < 0,05; n = 3) após 120 min de incubação. O registro eletrofisiológico demonstrou um aumento na freqüência dos pptms (562 :t 3%; p < 0,05), após 120 min de incubação. O veneno (20 f.1g1ml) determinou um aumento (25 :t 2%; p<0,05) na freqüência dos potenciais gigantes em 9 das 10 placas examinadas após 30 min de observação (LEE et ai., 1985). O registro do potencial de repouso mostrou que após 90 min de incubação com o veneno (20 f.1g/ml) houve uma redução no valor médio do potencial de membrana de -81 :t 1,4 mV para - 41,3 :t 3,6 mV (24 fibras; p < 0.01; n = 4) em regiões de placa terminal e de -77,4 :t 1,4 mV para - 44,6 :t 3,9 mV (24 fibras; p < 0.01; n = 4) em regiões distantes da placa. Estes resultados indicam que o veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis exibe neurotoxicidade em preparações neuromusculares isoladas e sugerem uma ação preferencial em sítios pré-sinápticos. Além disso, uma atividade enzimática parece estar envolvida na indução de seus efeitos farmacológicos, pois mostrou ser cálcio-dependente / Abstract: In the present study, the phannacological effects of Bothrops neuwiedi pauloensis venom were studied in mouse phrenic nerve-diaphragm and chick biventer cervicis preparations. In chick preparations, venom (1, 5, 10,50 and 100 J.1g1ml) produoed progressive, concentration-dependent neuromuscular blockade. At low venom concentrations (1, 5, 10 and 20 J.1g1m1) , the responses to exogenously applied KCI (13.4 mM) were inhibited whereas those to acetylcholine (ACh, 110 mM alone or cumulative concentrations of 10-6-10-2 M) were unaffected. At high venom concentrations (50 and 100 J.1g1ml) , there was pronounoed muscle contracture with inhibition of the responses to ACh, KCI and direct stimulation. These activities were not observed at 20-24°C compareci to 37°C. At 20 J.1g1m1, the venom irreversibly inhibited indirectly evoked twitches in mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (60 ::t 10% inhibition, mean ::t SEM; p<0.05; n = 6). At 50 J.1g1m1, the venom blocked indirectly (n = 5) and directly (n=6) evoked twitches in mouse hernidiaphragms. When Ca2+ (1.8 mM) was replaced by S~ (4 mM), the venom (50 J.1g/ml) produoed only partial blockade (40.3:t 7.8% inhibition; p<0.05; n = 3) after 120 mino The venom (20 J.1g1m1) inaeased the number of miniature end-plate potentials by a maximum of 562::t 3%, (p<0.05) after 120 min, and also increased the frequency of giant miniature end-plate potentials (25 ::t 2%, 1><0.05) in 9 out of 10 end-plates -41.3:t 3.6 mV (24 fibers; p<O.01; n = 4) in the end-plate region, and trom - 77.4 :t 1.4 to -44.6 :t 3.9 mV (24 fibers; p<O.01; n = 4) in regions distant trom the end-plate. These results indicate that B. n. pauloensis venom is neurotoxic and has a presynaptic adion. They also suggest that enzymatic activity may be involved in this phannacological action / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_DanieladeOliveira_D.pdf: 11046039 bytes, checksum: b59847c8c17a448c14ff005914cccd57 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Nesta tese foram apresentados os resultados da purificação de várias proteínas biologicamente ativas do veneno de serpentes crotálicas (CrotaJus durissus temfjcus, Crotalus durissus cascavel Ia, Crotalus durissus ruruima e CrotaJus durissus colliJineatus); botrópica (Bothrops pirajal) e coral (Mícrurus dumerilíi carínícauda). Muitas destas frações foram purificadas e caracterizadas do ponto de vista biológico, bioquímico e farmacológico. FraçOes como: crotamina, fosfolipase A2 (PLA2), crotapotinas e outras mostraram uma significativa atividade antibacteriana contra bactérias frtopatogênicas e patogênicas. As análises ultraestruturais e outros dados bioquímicos indicam que estas frações exercem essa atividade de formas diferenciadas. Foram observados quatro mecanismos de ação: 1.interação das frações com a membrana bacteriana, induzindo a ruptura e desorganização da mesma com posterior lise celular, 2. desorganização citoplasmática através da entrada das frações por poros na membrana causando lise celular, 3. digestão da membrana com posterior extravasamento do conteúdo interno bacteriano com lise celular, 4.1ise da membrana através dos radicais livres gerados pela reação enzimática do veneno com a membrana bacteriana. Durante o desenvolvimento da tese foram publicados e submetidos à publicação os seguintes artigos: 1.0liveira et aI., 2002 apresentaram o fracionamento do veneno de CrotaJus durissus terrificus em HPLC de fase reversa, com obtenção das frações: crotapotinas (F5 e F7) e PLA2 (F15, F16 e F17). As frações apresentaram atividade antibacteriana contra Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. A fração F17 apresentou atividade anticoagulante e foi seqüenciada apresentando uma homologia estrutural com outras PLA2 em tomo de 60-90%. Sua massa molecular de 14,6kDa foi determinada através de tricina SDS-PAGE, eletroforese de duas dimensões e MALDI TOFF. 2. T oyama at aI., 2003 verificaram a atividade enzimática, neurotóxica e antibacteriana da fração PLA2 (F15) isolada do veneno de CrotaJus dirissus teTTificus. 3.0liveira et aI., 2003 isolaram, purificaram, seqüenciaram a fração crotapotina, um componente ácido da crotoxina do veneno de Crotalus duríssus cascavel Ia, e realizaram testes para verificar a atividade antibacteriana em bactérias fitopatogênicas Gram-positivas e Gram-negativas, além de testes inflamatórios e nefrotóxicos. 4.Havt et aI., 2005 isolaram uma nova lectina tipo C (BPL) de Bothrops pirajai que foi caracterizada biológica e bioquimicamente. Esta fração também mostrou um efeito nefrotóxico em perfusão em rins isolados de ratos. 5. Toyama et al.,2004 isolaram, purificaram e caracterizaram bioquimicamente uma nova crotamina símile do veneno de Crotalus durissus cascavel/a. Foram identificados os peptídeos biologicamente ativos da crotamina, os quais foram responsáveis pela estimulação de secreção de insulina. . 6.Gandhi et aI., 2004 purificaram uma nova lectina tipo C (crotacetin), obtida do veneno de Crotalus durissus cascavel/a. Esta nova lectina induziu a agregação plaquetária, a aglutinação eritrocitária e também mostrou uma atividade antibacteriana. 7. Cavada et aI., 2004 purificaram e caracterizaram uma nova lectina da semente de Lonchocarpus sericeus, com alta especificidade por N-acetilglicosamina. 8. Cháriston et ai, 2004 isolaram e determinaram a estrutura primária de uma nova PLA2 de Micrurus dumerilli carinicauda. 9.Toyama et aI., 2004 isolaram, purificaram e caracterizaram uma nova isoforma da crotamina do veneno de Crotalus durissus ruruima e mostraram seu efeito antibacteriano. 10.Toyama et aI., 2004 isolaram, purificaram e caracterizaram uma nova PLA2 do veneno de Crotalus durissus collilineatus. Nestes trabalhos foram determinadas as regiões moleculares responsáveis pela atividade antibacteriana. 11. Toyama et a/., 2004 purificaram e caracterizaram uma nova L-amino oxidase do veneno de Crotalus durissus cascavel Ia (Casca LAO) através de exclusão molecular e HPLC de troca iônica. Casca LAO apresentou uma grande inibição bacteriana em bactérias Gram-negativas (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae) e Gram-positivas (Streptococcus mutans). Os estudos destas frações apresentam perspectivas futuras na aplicação terapêutica, como agentes antibacterianos, de novos peptídeos sintéticos ou naturais / Abstract: In this dissertation we present the results of purification of several biologically active protein from the crotalic rattlesnake venom (Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus cascavel/a, Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus collilineatus); from bothropic (Bothrops piraja) and coral (Micrurus dumerilli camicauda). Many of these fractions were purified and biochemical, biologically and pharmacologically characterized, some were reported and other submitted for publication in specialized joumals. Some fraction as crotamine, phospholipase A2 (PLA2), crotapotins and other showed a significant antibacterial activity against phytopatogenical and pathogenic bacterium. Ultra structural and biochemical analyses suggest that this fraction exert this antibacterial activity by different ways, which are grouped according to the mode action into four different mechanisms: 1.interaction of some fractions with the bacterial membrane inducing cellular Iyses by membrane rupture and disorganization. 2. Bacterial cell Iyses by action of fraction from the venom that form pore on the membrane and consequently cytoplasmatic disorganization and membrane rupture. 3. Membrane cell digestion induced by protein from the venom and consequently lost of cytoplasmatic content and cellular Iyses. 4. Membrane cel! Iyses induced by free radical generated by enzymatic action of protein form the venom. During the development of this thesis we reported and submitted some articles listed below: 1. Oliveira et aI., 2002 presents the purification of crotapotins (F5 and F7) and PLA2 (F15, F16 and F17)from the Crotalus durissus terrificus venom by reverse phase HPLC. These fraction showed significant antibacterial activity against Xanthomonas axonopodis pv. Passiflorae. Fraction F17 also showed an anticoagulant activity and its amino acid sequence showed high amino acid sequence identity with.60-90% with other PLA2 from different sources. Its molecular mass was 14,6kDa determined by Tricine PAGE-SDS, two dimensional electrophoresis and MALDI TOFF. 2. Toyama et aI., 2003 showed the enzymatic, neurotoxic and antibacterial activities of PLA2 isoform (F15) from the Crotalus durissus terrificus venom. 3. Oliveira et aI., 2003 isolated, purified and determined the amino acid sequence of crotapotin fraction, an acid compound of crotoxin from the Crotalus durissus cascavel/a, and detennined its antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative phytopathogenic baderium, intlammatory and nephrotoxicity. 4. Havt et aI., 2005 isolated a new type C-Iectin (SPL) trom the Bothrops pirajaithat was biologically and biochemical characterized. This fraction also showed a nephrotoxic effect on the isolated perfused kidney. 5. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and characterized biochemical a new crotamine like from Crotalus durissus cascavella venom. In this work we identified the biologically active peptide from this crotamine, which were responsible for increasing insulin secretion. 6. Gandhi et aI., 2004 purified a new lectin type C (crotocetin) trom the Crotalus durissus cascavella venom. This lectin induced platelet aggregation, erythrocyte agglutination and also showed an antibacterial activity. 7. Cavada et aI., 2004 purified and characterized a new lectin from the Lonchocarpus serieus seed that showed high specific binding against N-acetyl glucosamine. 8. Cháriston et aI., 2004 isolated and determined the amino acid sequence of new PLA2 from Micrurus dumerilli carinicauda. 9. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and characterized a new crotamine isofonn from the Crotalus durissus ruruima venom and showed its antibacterial activity. 10. Toyama et aI., 2004 isolated, purified and charaderized a new PLA2 trom the Crotalus durissus collilineatus venom. In this work we determined the molecular region of the PLA2 responsible for the antibacterial activity. 11. Toyama et aI., 2004 purified and characterized a new L-amino acid oxidase from the Crotalus durissus cascavella whole venom (Casca LAAO) by molecular exdusion and cation exchange HPLC. Casca LAAO inhibited strongly the bacterial growth rate of Gram-negative (Xanthomonas axonopodis pv passiflorae) and Gram-positive (Streptococcus mutans). These studies presented here showed a future perspective to therapeutic application of these peptides, synthetical/y or natural/y obtained as potential antibacterial substances / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

SOUZA, Ticyano Pereira de. Estudo do efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus na reação de transferência de elétrons da mioglobina. 2016. 68 f. Dissertação (Mestrado em Química)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2017-05-10T23:07:04Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_tpsouza.pdf: 2510854 bytes, checksum: f05409758b4589cd3f1f1ed6119f6ca0 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-19T20:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_tpsouza.pdf: 2510854 bytes, checksum: f05409758b4589cd3f1f1ed6119f6ca0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T20:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_tpsouza.pdf: 2510854 bytes, checksum: f05409758b4589cd3f1f1ed6119f6ca0 (MD5) Previous issue date: 2016 / The effect of the venom of the Crotalus basiliscus snake on the electron transfer (ET) reaction of the myoglobin (Mb) protein was studied using a gold electrode modified with cysteine (Au/Cys) followed by the immobilization of the protein (Au/Cys/Mb). For that, the following techniques were used: cyclic voltammetry, surface plasmon resonance (SPR), absorption spectroscopy in the ultraviolet and visible regions (UV-Vis), circular dicroism (CD), and gel electrophoresis. The electrode reaction assigned to the FeII/III redox pair of Mb was observed at 0.09V vs Ag/AgCl being consistent with the native form of the protein. Upon immersion of the Au/Cys/Mb electrode in solution containing the venom of the Crotalus basiliscus snake, it was observed a decrease in the faradaic current. The deleterious effect of the venom on the electrode reaction of Mb was corroborated by the observation of the loss of the catalytic activity of the Au/Cys/Mb electrode towards the oxidation reaction of the ascorbic acid (AA). The successive mass increments observed by SPR upon the injections of cysteine (0.172 µg cm-2), myoglobin (0.410 µg cm-2) and venom (0.151 µg cm-2) indicated that the adsorbed molecules of cysteine and myoglobin were not desorbed from the gold surface upon exposure to the solution of the venom of the Crotalus basiliscus snake. Rather, the mass increase indicated the molecules of the venom were immobilized on the the Au/Cys/Mb electrode. Such proposition was reinforced by the electrophoresis results which showed a decrease in the mobility of Mb after mixing to the solution containing the snake venom. The electronic UV-Vis spectra did not show meaningful changes in the Soret band of Mb; a band sensitive to the level of protein denaturation. Likewise, the CD spectra obtained in the far-UV, near-UV and Soret regions did not present spectral profile changes indicating that the physical integrity of the protein was maintained after the exposure to the snake venom, i.e. the protein was not denaturated. / O efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus sobre a reação de transferência de elétrons (TE) da proteína mioglobina (Mb) foi estudado utilizando-se um eletrodo de ouro modificado com cisteína (Au/Cys) seguido da imobilização da proteína (Au/Cys/Mb). Para tanto, foram utilizadas as técnicas de voltametria cíclica, ressonância de plásmons de superfície (SPR-Surface Plasmon Resonance), espectroscopia de absorção na região do ultravioleta e visível (UV-Vis), espectroscopia de dicroísmo circular (CD-Circular Dichroism) e eletroforese em gel desnaturante. A reação de eletrodo atribuída ao par redox FeII/III da Mb foi observada em 0,09V vs Ag/AgCl sendo consistente com a forma nativa da proteína. Após imersão do eletrodo Au/Cys/Mb em solução contendo o veneno da cobra Crotalus basiliscus, observou-se a diminuição da corrente. O efeito nocivo do veneno sobre a reação de eletrodo da Mb foi corroborado com a observação da perda de atividade catalítica do eletrodo Au/Cys/Mb frente a reação de oxidação do ácido ascórbico (AA). Os aumentos sucessivos de massa observados por SPR quando das injeções de cisteína (0,172 µg cm-2), mioglobina (0,410 µg cm-2) e veneno (0,151 µg cm-2) indicaram que as moléculas adsorvidas de cisteína e mioglobina não experimentam desorção após exposição ao veneno da cobra Crotalus basiliscus. Ao contrário, o aumento de massa indicou que moléculas do veneno foram imobilizadas sobre o eletrodo Au/Cys/Mb. Tal proposição foi reforçada pelos resultados de eletroforese que apresentaram uma diminuição na mobilidade da Mb no gel após a mistura com a solução contendo veneno da cobra Crotalus basiliscus. Os espectros eletrônicos UV-Vis não apresentaram mudança significativa na banda Soret da Mb; banda esta sensível ao grau de desnaturação da proteína. Da mesma forma, os espectros de Dicroísmo Circular obtidos nas regiões do UV-distante, UV-próximo e Soret não apresentaram mudanças no perfil espectral da proteína, indicando que a integridade física da Mb é mantida após exposição ao veneno, ou seja, a proteína não foi desnaturada.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T20:41:37Z : No. of bitstreams: 1 nogueira_rmb_dr_botfmvz.pdf: 1409163 bytes, checksum: 77f246cac8ac22e33da1c78a59c32e6e (MD5) / O presente trabalho teve por objetivo avaliar os aspectos clínico, laboratorial, histopatológico e tratamento na intoxicação experimental com o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus em cães. Foram utilizados 21 cães, adultos, sem raça definida, divididos em três grupos com sete animais: grupo I - somente veneno; grupo II - veneno + cinco ampolas de soro antiofídico + fluidoterapia; grupo III - veneno + cinco ampolas de soro antiofídico + fluidoterapia + alcalinização da urina. O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus liofolizado e reconstituído em solução salina foi inoculado pela via subcutânea, na dose de 1mg/kg de peso vivo, na face lateral da coxa do membro posterior esquerdo dos cães dos grupos I, II e III. Os animais foram submetidos às avaliações clínica, hematológica, hemostática, urinálise, bioquímica sérica, hemogasometria, pressão arterial sistólica, eletrocardiograma e mielograma. Três animais de cada grupo foram eutanasiados e foram colhidas amostras do tecido muscular para avaliação histopatológica. Os resultados mostraram a eficácia da soroterapia na neutralização do veneno e mostrou que o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus provoca alterações clínica, hematológica, hemostática, de urinálise, hemogasométrica, da pressão arterial sistólica, do mielograma e histopatológica nos cães. Não houve evidências de alterações eletrocardiográficas e bioquímica. / This work evaluated the clinical, laboratorial, histological and treatment in the experimental intoxication with the venom of the Crotalus durissus terrificus snake in dogs. Twenty-one adults (mixed breed) dogs divided in three groups with seven animals were used: group I - only venom; group II - venom + five bladders of anti-ophidic serum + fluid therapy; group III - venom + five bladders of anti-ophidic serum + fluid therapy + alkalization of the urine. The lyophilized venom of the Crotalus durissus terrificus snake was reconstituted in saline solution and inoculated subcutaneous, in the dose of 1mg/kg B.W., in the lateral face of the left thigh of the dogs of the groups I, II and III. The animals were submitted to clinical, hematological evaluation, hemostatic, urinalysis, biochemical, blood gas analysis, systolic arterial pressure, electrocardiogram and mielograma. Three animals of each group were eutanasied and samples from the muscular tissue and popliteal lymphonode were collected for hitopatological evaluation. The results showed the effectiveness of the serum therapy in the neutralization of the venom and it showed that the venom of the Crotalus durissus terrificus snake causes clinical, hematological, hemostatic, of urinary, hemogasometric changes, of the systolic arterial pressure, of the mielograma and histopathological in the dogs. There were no evidences of alterations eletrocardiografic and biochemical alterations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-13T15:40:17Z No. of bitstreams: 1 2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T18:06:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T18:06:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ÉlidaCleyseGomesdaMata.pdf: 20672845 bytes, checksum: a126098842e2704babe5730ae79a7ae9 (MD5) / O presente trabalho avaliou as atividades antirretroviral e citotóxica de 9 peptídeos sintetizados a partir da análise transcritômica parcial de bibliotecas de cDNA obtidas das glândulas de peçonhas de diferentes espécies de escorpiões. Foram utilizados o Vírus da Imunodeficiência Símia/SIV e o HIV defectivo, em linhagens celulares humanas linfoblásticas, leucocitárias primárias e estabelecidas aderentes para a detecção de atividade antirretroviral, assim como citotóxica dos peptídeos sintéticos. Incluíram-se ensaios de viabilidade celular com azul de Tripan, citotoxicidade quantificando-se LDH e citometria de fluxo com detecção de Anexina/Iodeto de propídio. Os peptídeos escorpiônicos 1, 2, 4 e 6 reduziram a produção de SIV em células HUT-78 e 174X100, dentre os quais, os peptídeos 1 e 6 reduziram em 50% a viabilidade celular, em concentrações de 50 μM e 12,5 μM, respectivamente, tornando-os mais adequados aos ensaios. Em análises finais, o peptídeo 6 a 3,12 μM reduziu em 75% a produção viral em relação ao controle de células unicamente infectadas. Células HUT-78 tratadas com o peptídeo 6 e infectadas com SIV, unicamente produziram IL-8, enquanto que os leucócitos primários apresentaram níveis detectáveis de IFN-γ, IL-4, IL-6 e IL- 10. Em estudos de morfologia ultra-estrutural detectou-se o brotamento de virions de SIV unicamente em leucócitos primários infectados, enquanto que os tratados com o peptídeo 6 e AZT, infectados com SIV, não se detectou o brotamento viral. Observou-se lesões citoplasmáticas, extravasamento de material nuclear e acúmulo de cromatina na membrana perinuclear em leucócitos primários tratados com o peptídeo 6, compatível com os resultados obtidos por citometria de fluxo. Exclui-se a possiblidade de lise celular por destruição de membranas, visto que virions infectivos tratados em altas concentrações do peptídeo 6 não inibiram a infecção viral. Ensaios preliminares com células HeLa P4 previamente tratadas com o peptídeo 6 e transfectadas com plasmídeo pCHIV carreando o genoma defectivo de HIV, apresentaram redução da progênie viral quando comparada à produção de células transfectadas sem tratamento, células transfectadas e tratadas posteriormente com peptídeo 6 e tratadas com AZT. De modo geral, os experimentos de cultivo celular com o peptídeo 6 e posterior infecção viral, demonstraram que, nos intervalos iniciais, ocorre forte redução do número de células nas populações em tratamento, no entanto, após 96 horas as células proliferam, ultrapassando o número de células não tratadas, exercendo forte impacto quando avalia-se a interferência nos mecanismos de replicação viral, resultando na redução de progênie viral. Propõe-se que os mecanismos de proteção celular, em resposta à toxicidade do peptídeo 6, induz a expressão de citocinas, dosadas neste estudo e, muito provavelmente, fatores de restrição viral induzidos principalmente por IFN-γ, e modulados por IL-6, IL-10 e IL-4, ademais de outras citocinas e quimiocinas que não foram quantificadas neste estudo. / The present work evaluated the antiretroviral and cytotoxic activity of 9 synthetized peptides based on the transcriptome of the partial cDNA library of different Scorpions venenom glands. The Simian Immunodeficiency Virus/SIV and the defective HIV were utilized in human cell lineages, lymphoblastic cells, primary leucocytes and adherent cells, to screen for antiretroviral activity as also the peptides cytotoxicity. There were included assays for cell viability with trypan blue, citotoxicity quantifying LDH and flow citometry for detection of annexin/propidium iodide. The scorpionic peptides 1, 2, 4 and 6 reduced the SIV production in HUT-78 and 174XCEM cell lines, and among them, the peptides 1 and 6 reduced by 50 % the cell viability at 50 μM and 12,5 μM concentration, respectively, which was more suitable for the assays. In final analyses, the peptide 6 at 3,12 μM concentration reduced at 75 % the SIV production compared to untreated cells but infected. HUT-78 cells treated with peptide 6 and SIV infected solely produced IL-8 while the primary leucocytes displayed detectable levels of IFN-γ, IL-4, IL-6 and IL-10. In morphological ultrastructural studies it could be detected the budding of SIV virions exclusively in infected primary leucocytes, while among leucocytes treated with peptide 6, AZT and SIV infected, no virions budding were observed. Cytoplasmatic lesions, leaking of nuclear material and chromatin condensation in the perinuclear region were evident in leucocytes treated with peptide 6, which was compatible with the results obtained by flow cytometry analysis. It was excluded the possibility of cell lysis by membrane destruction, as infectious virions treated with high concentrations of peptide 6 did not inhibit viral infection. Preliminary assays with HeLa P4 cells previously treated with peptide 6 and transfected with the pCHIV plasmid carrying a defective HIV genome, showed viral progenie reduction when compared with the production of transfected cells without treatment, transfected cells subsequently treated with pepetide 6 and cells treated with AZT. In a general way, the cell culture experiments with peptide 6 and subsequent viral infection showed that, in the initial intervals, a strong cell number reduction occur, but after 96 hours the cells proliferate, outnumbering the untreated cells, exerting significative effect when evaluating the interference in the mechanisms of viral replication, which culminates in the reduction of viral progenie. It is proposed that the mechanisms of cell protection, in response to the peptide 6 toxicity, induce the expression of cytokines, quantified in this work and, very probably, viral restriction factors mainly triggered by IFN-γ, and modulated by IL-6, IL-10 e IL-4, besides other cytokines and chemokines that were not quantified here.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-02-06T13:17:03Z No. of bitstreams: 1 2016_CamilaFerreiraThéPontes.pdf: 39139838 bytes, checksum: e32ad047bc654e4f6348afd6a8a65637 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-09T20:48:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CamilaFerreiraThéPontes.pdf: 39139838 bytes, checksum: e32ad047bc654e4f6348afd6a8a65637 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-09T20:48:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CamilaFerreiraThéPontes.pdf: 39139838 bytes, checksum: e32ad047bc654e4f6348afd6a8a65637 (MD5) / A peçonha de escorpiões contém diversos tipos de neurotoxinas que podem interagir entre si para modular a função de canais iônicos¹. A ação desses polipeptídeos leva à ativação de canais de sódio e inibição de canais de potássio, causando um elevado influxo de sódio e a liberação de neurotransmissores, seguida por um bloqueio da excitabilidade celular². Apesar de possuírem estrutura 3D similar, as chamadas α- e β-toxinas de escorpião afetam canais iônicos de sódio dependentes de voltagem (NaV) por meio de mecanismos diferentes: as α-toxinas interagem com o sítio 3 no domínio sensor de voltagem IV (VSD-IV) e inibem o processo de inativação rápida do canal¹, enquanto as β-toxinas interagem com o sítio 4 no VSD-II e causam a hiperativação do canal por meio de um mecanismo de aprisionamento do sensor de voltagem³. Em um contexto evolutivo, espera-se que o sistema composto por esses dois tipos de toxinas e os seus alvos moleculares, os VSD de NaV, tenham sofrido um processo de coevolução molecular. Partindo do princípio de que seja possível detectar, através da análise de sequências primárias, sinais de coevolução molecular que determinem a seletividade e afinidade entre os pares toxina-VSD, foi possível propor um um modelo evolutivo de interação e seletividade entre α- e β-toxinas de escorpião e VSD-II e -IV de NaV, o qual representa o melhor conjunto possível de interações toxina-VSD. Para tanto, foi desenvolvido um algoritmo genético capaz de otimizar, baseado em um critério de energia e acoplamento, um dado sistema composto por dois conjuntos de posições de aminoácidos, obtidos de dois alinhamentos múltiplos de sequências (MSA) de proteínas. O algoritmo genético foi desenvolvido para encontrar a melhor forma de parear as sequências do MSA1 com as sequências do MSA2 de forma a minimizar a energia de interação total dos pares. O modelo otimizado de coevolução (MOC) apresentou dois grupos bem definidos, um formado por interações entre α-toxinas e VSD-IV e o outro composto por interações entre β-toxinas e VSD-II. Esse resultado indica que o algoritmo foi capaz de encontrar uma solução realista para o problema. O modelo obtido fornece informações importantes sobre quais interações entre resíduos definem as regras para as afinidade diferenciais entre β-toxinas e VSD-II, e α-toxinas e VSD-IV. Com isso, foi possível inferir um conjunto de resíduos que caracteriza a superfície funcional de cada grupo de toxinas. Os resultados obtidos são corroborados por resultados experimentais da literatura. / Scorpion venoms contain several types of neurotoxins that might interact with each other, modulating the function of ion channels¹. The action of these polipeptides leads to the activation of sodium channels and inhibition of potassium channels, causing a high sodium influx and the liberation of neurotransmitters, followed by a blockage of cellular excitability². Regardless of their similar 3D structures, the so-called α- and β-scorpion toxins affect voltage-gated sodium channels (NaV) through very different mechanisms: α-toxins interact with the extracellular site 3 in the voltage sensor domain IV (VSD-IV) and inhibit the rapid channel inactivation process¹, while β-toxins interact with site 4 in VSD-II and cause channel hyperactivation through a voltage sensor trapping mechanism³. In an evolutionary context, it is expected that the system composed of this two types of gating modifier toxins plus the targeted NaV VSD will present some coevolution traces. Starting from the hypotheses that it is possible to detect, through sole primary sequence analysis, signals of molecular coevolution determining selectivity and specificity between pairs of interacting proteins, it was possible to propose an evolutionary model of interaction and selectivity between scorpion α- and β-toxins and NaV VSD-II and -IV, which represents the best possible arrangement of interacting pairs. To achieve that, a self-developed and implemented genetic algorithm that was able to optimize, based on an energy-coupling criterion, a given system composed of two sets of information channels coming from two different protein multiple sequence alignments (MSA) was used. Basically, the genetic algorithm was designed to find the best way of pairing the sequences coming from MSA1 with the sequences coming from MSA2 in order to minimize the overall interaction energy of the pairs. The optimized model presented two well-defined groups, one composed of α-toxins interacting with VSD-IV and the other composed of β-toxins interacting with VSDII. This result indicates that the model is probably accurate. Going one step further, we applied PCA to extract important information from the optimized model about the interacting residues in the two groups (β- toxins, VSD-II and α-toxins, VSD-IV). It was then possible to infer the set of residues responsible for the unique features observed in the two groups of toxins. The results obtained in this last step are in conformation with data coming from experimental assays.