As peçonhas de artrópodos são ricas fontes de neurotoxinas, verdadeiras ferramentas moleculares com ação seletiva e específica sobre o Sistema Nervoso Central (SNC) de mamíferos, e de grande relevância clínico-científica. Demonstramos recentemente que a peçonha de P. bistriata, quando injetada por via intracerebroventricular (i.c.v.), desencadeava crises convulsivas em ratos, um indício da existência de neurotoxinas pró-convulsivantes na peçonha dessa aranha. O grupo do Prof. Dr. Joaquim Coutinho-Netto isolou da peçonha dessa aranha várias neurotoxinas, dentre as quais uma denominada PbTx 2.2.1, que possui a capacidade de inibir a captação do neurotransmissor GABA em sinaptosomas corticais de ratos (in vitro), uma ação considerada como potencialmente anticonvulsivante. As frações PbTx 2.2.1 e 1.2.3 protegem retinas de ratos após isquêmia. Mas, não se testou o efeito anticonvulsivante dessa fração em experimentos in vivo. O presente trabalho teve dois objetivos: 1- Propor um método cromatográfico para isolar da peçonha de aranhas, neurotoxinas pró-convulsivantes não protéicas e de baixo peso molecular. Isolar e caracterizar parcialmente estas neurotoxinas da peçonha da aranha P.bistriata; 2- verificar se a fração PbTx 2.2.1 possui efeito anticonvulsivante in vivo. O isolamento da peçonha de P. bistriata, realizado com filtração em gel (Sephadex G-50 e G-25), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (colunas de fase reversa e troca catiônica), e CLAE-acoplado a espectrometria de massa (CLAE-MS) produziu uma fração (fração 7) e um subcomponente (fração 7.1) com atividade pró-convulsivante, após injeção i.c.v. Tal fração apresenta características típicas de ácidos nucléicos. Confirmou-se, através de ressonância magnética nuclear (RMN) que o constituinte majoritário desta fração é o nucleosídeo inosina. O método cromatográfico mostrou-se muito lento. Uma outra fração (fração 6) da mesma peçonha inibiu as crises causadas por bicuculina i.c.v., ao passo que a fração 1 apresentou atividade de fosfatase ácida e alcalina. A injeção i.c.v. da fração PbTx 2.2.1, 20 min antes do convulsivante bicuculina também i.c.v., bloqueou as crises convulsivas em 71,4% dos animais, o que caracteriza um efeito anticonvulsivante in vivo desta fração. Conclui-se que: 1- A peçonha de P. bistriata possui, dentre muitas, uma fração (fração 7) com efeito pró-convulsivante quando injetada i.c.v. em ratos. Nesta fração, aparentemente o composto majoritário é o nucleosídeo inosina. A peçonha da mesma aranha possui também uma fração com atividade anticonvulsivante (fração 6) e outra com atividade de fosfatase ácida e alcalina (fração 1). 2- o método cromatográfico proposto pode ser otimizado talvez pelo uso de ultrafiltração; 3- a fração PbTx 2.2.1 apresenta efeito anticonvulsivante in vivo no modelo de indução de crises por injeção i.c.v. de bicuculina. / Arthropod venoms are rich sources of neurotoxins, molecular tools with selective and specific actions over the mamalian central nervous system with great clinical and scientific importance. Previous work of our laboratory showed that the spider venom of Parawixia bistriata, when injected by intracerebroventricular (i.c.v.) route, induced convulsive seizures in rats, a sign of convulsant neurotoxins. The group of Professor Joaquim Coutinho-Netto isolated from this spider venom a neurotoxin called PbTx 2.2.1 which is a GABA transporter inhibitor in the rat cortical synaptosomal preparation (in vitro), a potencially anticonvulsant property. The fractions PbTx 2.2.1 and 1.2.3 protected retinal cells against isquemy. But, it has not been tested if the PbTx 2.2.1 fraction also has an in vivo anticonvulsant action. Present work has two objectives: 1- to propose a chromatographic methodology to isolate non-proteic low molecular weigh convulsant neurotoxins from spider venoms. Isolate and partially characterize these neurotoxins from P. bistriata venom; 2- test if PbTx 2.2.1 has in vivo anticonvulsant effect. Biochemical venom isolation by gel filtration (Sephadex G-50 and G-25), reverse phase and cationic exchange in high pressure liquid cromatography (HPLC) and also HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), has pointed that the P. bistriata spider venom has a fraction (fraction 7) and a subfraction (7.1) with convulsant activity when injected i.c.v. in rats. Fraction 7 has nucleosidic characteristics. Nuclear magnetic ressonance (NMR) has showed that the principal component of this fraction is the nucleoside iosine. An other fraction (fraction 6) isolated from the same venom, inhibited seizures induced by i.c.v. bicuculine and the fraction 1 showed acid and basic phosphatase activity PbTx 2.2.1, when injected i.c.v. 20 min prior to the convulsant bicuculline (i.c.v.), has blocked seizures in 71.4 % of the animals, what was considered an anticonvulsant effect. The conclusions are: 1- the spider venom of P. bistriata has a fraction (fraction 7) with convulsant action when injected i.c.v. in rats. The major component of this fraction is the nucleoside iosine. This spider venom also has another fraction (fraction 6) with anticonvulsant activity and one with acid and alcaline phosphatase (fraction 1); 2- the chomatographic methodology can be improved, perhaps by ultrafiltration methods; 3- the PbTx 2.2.1 fraction has anticonvulsant effect in vivo.

Tityus serrulatus é o principal causador de acidentes por escorpião no Brasil. O seu veneno pode causar reações sistêmicas severas, como disfunção cardíaca e edema pulmonar agudo. Sabendo que fatores genéticos podem influenciar na gravidade dos sintomas apresentados pelos pacientes, o objetivo deste estudo foi avaliar a ação do veneno de T. serrulatus na inflamação pulmonar em linhagens de camundongos geneticamente selecionados para máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) resposta inflamatória a fim de verificar o envolvimento de fatores genéticos na resposta ao veneno. Após inoculação do veneno observaram-se alterações pulmonares, como presença de edema e hemorragia alveolar, bem como aumento do número de neutrófilos e macrófagos e detecção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas mais significativamente nos pulmões dos camundongos AIRmax. Os resultados sugerem que o veneno do escorpião T. serrulatus é capaz de induzir inflamação pulmonar aguda, sendo maior nos animais AIRmax, sugerindo a importância de fatores genéticos na resposta inflamatória a venenos animais. / Tityus serrulatus is the main cause of scorpion accidents in Brazil. Its venom may cause severe systemic reactions such as cardiac dysfunction and acute pulmonary edema. Knowing that genetic factors may influence the severity of symptoms reported by patients, the aim of this study was to evaluate the action of T. serrulatus venom in lung inflammation in strains of mice selected for maximal (AIRmax) or minimal (AIRmin) inflammatory response in order to verify the involvement of genetic factors in response to the venom. After venom inoculation lung alterations were observed, such as presence of alveolar edema and hemorrhage as well as increased numbers of neutrophils and macrophages and the detection of pro-inflammatory cytokines and chemokines most significantly in the lungs of AIRmax mice. The results suggest that T. serrulatus scorpion venom is able to induce higher acute lung inflammation in AIRmax animals, suggesting the importance of genetic factors in the inflammatory response to animal venoms.

Durante a evolução, alguns animais desenvolveram toxinas que são capazes tanto de paralisar quanto de matar suas presas, através de ação seletiva sobre receptores ou canais iônicos. As acilpoliaminas, por exemplo, são componentes não-proteicos antagonistas dos receptores glutamatérgicos acoplados a canais iönicos, que mostraram-se anticonvulsivantes em diversos modelos animais. Apesar do estudo das alterações comportamentais em animais após a injeção de substâncias químicas (etofarmacologia) ter auxiliado a estudar o mecanismo de ação destas substâncias no SNC, não há relatos sobre os efeitos comportamentais da injeção i.c.v. e i.v. da peçonha da aranha Parawixia bistriata. Descobriu-se recentemente na peçonha bruta da aranha Parawixa bistriata uma ação potencialmente anticonvulsivante in vitro: ela potencia a neurotransmissão gabaérgica e desloca receptores glutamatérgicos de seus sítios específicos em sinaptosomas do cérebro de rato (FONTANA, 1997). O objetivo do presente trabalho é estudar as alterações comportamentais causadas pela injeção central e periférica da peçonha bruta de P. bistriata através de uma metodologia quantificativa (método neuroetológico), e verificar se esta peçonha possui ação anticonvulsivante in vivo em um modelo químico de indução de crises agudas - o pentilenotetrazol (PTZ, 80 mg/kg, i.p.). Os resultados mostram que a injeção i.c.v. da peçonha bruta origina nos ratos dois quadros comportamentais, identificados como crises convulsivas, denominados de crises graves e leves. Nas crises graves, observou-se, entre outros, mioclonias semelhantes às crises convulsivas límbicas descritas por Racine (1972). As crises leves são caracterizadas por tremores generalizados, e sacudidelas de corpo (wet dog shakes). A injeção da peçonha i.v. não origina crises nos animais mas, no entanto, causa um intenso aumento nas interações estatísticas das seqüências comportamentais, que lembram em muito as atividades de deslocamento. Tanto nas crises graves, leves, e na injeção i.v., a neuroetologia permitiu a visualização das interações entre as mioclonias convulsivas límbicas e os outros comportamentos, dados não fornecidos pelas escalas de medição de intensidade das crises límbicas. Buscando indícios da presença de componentes anticonvulsivantes não-proteicos (como acilpoliaminas), injetou-se i.c.v. a peçonha de P. bistriata fervida (numa dose que não causa crises nem alteração motora per se), seguida da injeção i.p. de PTZ. Verificou-se que este tratamento abole as crises clônicas e tônicas induzidas por PTZ. Conclui-se que a peçonha bruta de P. bistriata provavelmente possui componentes pró-convulsivantes com possível ação sobre o sistema límbico. Esta peçonha pode conter, também, componentes anticonvulsivantes não-proteicos, possivelmente acilpoliaminas. / Spider venoms have hight affinity and specificity for neuronal receptors, transporters and ion channels, therefore been important tools to characterize mammal and insect nervous system. However, behavioural alterations in mammals caused by injections of spider venoms have not been studied in detail. In this work we describe the rat behavioural alteration caused by central injection of the crude venom of the spider Parawixia bistriata, using a neuroethological methodology. There were seen two types of seizures, named mild and severe. Neuroethological flowcharts showed that in mild seizures, there was a strong statistical correlation (c2) between tremor followed by laying or by laying left, which indicates that the venom, perhaps, is difficulting central coordination of movements. In severe seizures, this effect is enworsed, with the animal falling.This type of seizure are similar to those described by Racine (1972). Since the crude venom of P. bistriata showed a potencial anticonvulsant activity in vitro, we tested if it would indeed inhibit clonic and tonic convulsions induced by pentilenetetrazole (PTZ; 80 mg/kg, i.p.). Boiled crude venom of P. bistriata was i.c.v. injected, and 20 minutes later, animals (n=10) received PTZ. A control group (n=10) received only PTZ. The results were: central injection of the venom abolished clonic and tonic convulsions induced by PTZ, in 60% of the animals. In conclusion, the crude spider venom of P. bistriata, centrally injected, causes central loss of movement coordination, and elicits limbic seizures similar to those described by Racine (1972), but, when boiled and injected in lower doses, it blocks clonic and tonic convulsions induced by PTZ (80 mg/kg).

O veneno da Bothrops jararaca (VBj) causa inflamação aguda local. Os mastócitos secretam mediadores que desencadeiam a inflamação por sua ação direta ou pelo recrutamento de células. Este trabalho avalia o papel dos mastócitos na inflamação induzida por VBj em camundongos geneticamente selecionados para alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda. Os animais foram tratados com o inibidor de mastócito Cromoglicato de Sódio (CROM) e receberam o VBj, e apresentaram formação de edema similar em resposta ao veneno. Os animais AIRmax apresentaram maior dor que os AIRmin, sendo esta inibida por CROM. O VBj aumentou o número de células peritoneais em AIRmax, bem como o número de macrófagos, e diminuiu o número de mastócitos. O VBj também aumentou neutrófilos e a produção de ROS em AIRmax, efeito inibido por CROM. Os resultados mostram, portanto, que os animais AIRmax apresentam maior dor, migração de neutrófilos e macrófagos e produção de ROS que os AIRmin, e que essas reações são reduzidas quando os mastócitos são inibidos. / Bothrops jararaca venom (BjV) causes acute local inflammation. Mast cells acts secreting mediators that trigger inflammatory events through their direct action or the recruitment of other cells. This study aims to evaluate the role of mast cells in inflammation induced by BjV in mice genetically selected for maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory response. Animals were treated with mast cell degranulation inhibitor cromolyn (CROM) and received BjV, and showed similar edema formation in response to BjV. AIRmax mice exhibited greatest pain than AIRmin, which was inhibited by CROM. BjV increased peritoneal cells number in AIRmax, as well as the number of macrophages, and diminished the number of mast cells. BjV also increased neutrophils and ROS production in AIRmax, which was inhibited by CROM. These results shows, therefore, that AIRmax mice exhibit more pain, macrophage and neutrophil migration, and ROS production than AIRmin mice, being all these reactions reduced when mast cells are inhibited.

Cone snails are carnivorous marine mollusks, utilizing their neuropeptide-rich venom for prey capture. The venom of Conus brunneus, a wide-spread Eastern Pacific vermivore, has not been extensively studied. In the current work, peptides from the dissected venom were characterized and tested using preliminary bioassays. Six peptides (A-F) were isolated and tested. Three peptide identities were determined by comparison with previously reported data: bru9a (A), bru3a (F), and an a-conotoxin (E). Preliminary screening in a stroke-related model of induced glutamate excitotoxicity in primary neuronal cells and PC12 cell cultures indicated potential neuroprotective activity of peptide fractions A, D, and F. Further testing is necessary to determine and verify structure, activity, target, and mechanism of action of the promising peptides from C. brunneus, which may prove effective neuropharmacological agents to treat stroke. / by Rebecca A. Crouch. / Thesis (M.S.)--Florida Atlantic University, 2013. / Includes bibliography. / Mode of access: World Wide Web. / System requirements: Adobe Reader.

Acidentes pela serpente Bothrops jararaca (Bj) causam distúrbios hemostáticos em pacientes. Sabe-se que a fisiopatologia desses distúrbios é complexa, porém não se conhece a relevância das duas principais famílias de enzimas presentes no veneno de Bj com atividade anti-hemostática, as metaloproteinases e serinaproteases, para promover esses distúrbios. Além disso, a injúria local induzida no local da inoculação do veneno poderia estimular a liberação de fator tissular (TF) na circulação sanguínea, favorecendo a coagulopatia. Assim, o objetivo deste projeto foi investigar a contribuição das metaloproteinases e serinaproteases do veneno de Bj e a expressão de TF para a gênese dos distúrbios hemostáticos, utilizando um modelo experimental em ratos. O veneno de Bj foi previamente incubado com Na2-EDTA 13 mM ou AEBSF 4 mM para inibir as metaloproteinases e serinaproteases, respectivamente, e administrado pelas vias s.c. ou i.v. Após 3 e 6 h, os parâmetros hemostáticos e de expressão proteica de TF e isomerase de dissulfeto proteico (PDI) foram avaliados. Os níveis de veneno circulante se elevaram mais rapidamente no grupo injetado pela via i.v., e o tratamento do veneno com Na2-EDTA ou AEBSF não reduziu os níveis circulantes de veneno em comparação ao grupo controle com veneno. Em comparação com animais tratados com salina, houve uma queda abrupta na contagem plaquetária em todos os grupos e tempos administrados com veneno de Bj, sendo o grupo administrado pela via i.v. o que apresentou uma queda de maior intensidade. O pré- tratamento do veneno com o AEBSF não impediu o consumo plaquetário e somente o Na2-EDTA parcialmente reverteu a plaquetopenia. Por outro lado, o veneno não tratado causou consumo de fibrinogênio plasmático, geração de produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina, prolongamento do tempo de protrombina (TP) e hemorragia no local de inoculação do veneno. No entanto, o Na2-EDTA, e não o AEBSF, bloqueou completamente esses parâmetros. Não houve redução dos níveis de fator VII ao longo do envenenamento, e seus níveis apresentou um notável aumento nos animais envenenados no grupo 6 h s.c. Ratos envenenados apresentaram notável aumento dos níveis do TF plasmáticos, que foi inibido pelo pré-tratamento com o Na2-EDTA. Houve também aumento da expressão de TF no pulmão e pele. Nos grupos injetados com veneno de Bj em 6 h ocorreu uma redução da expressão de PDI. Os resultados mostram que as metaloproteinases são componentes essenciais para o desencadeamento da coagulopatia do envenenamento. No entanto, as metaloproteinases e serinaproteases não estão diretamente envolvidas na gênese da plaquetopenia induzida pelo veneno de Bj e outros mecanismos/toxinas parecem estar envolvidos. Os resultados também demonstraram o aumento dos níveis de TF plasmático durante o envenenamento, similar àquele observado na coagulação intravascular disseminada, o que sugere a importância da geração de TF como um mecanismo para promover distúrbios sistêmicos da coagulação / Bites by Bothrops jararaca (Bj) snakes evoke hemostatic disturbances in patients. The pathophysiology of such disturbances is complex, but the importance of the major enzyme families with anti-hemostatic activity, found in Bj venom. i.e., metalloproteinases and serine proteinases, to promote them is not known. Moreover, the local injury induced at the site of venom inoculation might also stimulate tissue factor (TF) release into bloodstream, favoring the coagulopathy. The aim of this study was to investigate the contribution of metalloproteinases and serine proteinases of Bj venom, as well the TF expression to the genesis of hemostatic disturbances, using an experimental model in rats. Crude Bj venom was previously incubated with 13 mM Na2-EDTA or 4 mM AEBSF to inhibit metalloproteinases and serine proteinases, respectively, and administered s.c. or i.v. into rats. After 3 and 6 h, hemostatic parameters and TF and protein disulfide isomerase (PDI) expression were evaluated in plasma and samples of skin and lungs. Circulating venom levels increased more rapidly in i.v. group, and neither Na2-EDTA nor AEBSF treatment reduced the circulating venom levels in comparison with the control group. Platelet counts showed a marked decrease in all groups administered with Bj venom in comparison with saline-treated rats; the fall in platelet counts was more intense in animals administered i.v. with Bj venom. The pre-treatment of venom with AEBSF failed to block the fall in platelets count, and only Na2-EDTA minimally reversed thrombocytopenia. Nonetheless, non-treated venom provoked plasma fibrinogen consumption, generation of fibrin(ogen) degration products, prolongation of prothrombin time (TP), and hemorrhage at the site of venom inoculation. However, Na2-EDTA, but not AEBSF, completely blocked these parameters. Factor VII levels were not reduced during envenomation, and they showed a marked increase in envenomed rats at 6 h in the s.c. group. Envenomed rats showed a marked increase in plasma TF levels, which was also blocked by Na2-EDTA. In addition, TF expression was increased in the lung and skin samples. PDI expression in skin was reduced at 6 h in all groups treated with venom. These findings demonstrate that metalloproteinases are essential venom components involved in the Bj-induced coagulopathy. Nonetheless, metalloproteinases and serine proteases had no direct involvement in the genesis of Bj-induced thrombocytopenia and other venom mechanisms/toxins seem to be associated therein. High levels of TF in plasma may occur during snake envenomation, so that the etiopathogenesis of coagulopathy in snake envenomation resembled that of true disseminated intravascular coagulation syndrome

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AISLAN SENA STIVAL.pdf: 587198 bytes, checksum: e198d94f5ca28a047840fd9b7bf9147c (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Introduction: Today, Brazil has the second position among the countries with more richness of reptiles in their territory. The Bothrops moojeni is a poisonous snake found abundantly in the Midwest region of Brazil. Neurotoxins are complex mixtures containing neurotoxins, cytotoxins, myotoxins, proteases and nucleases. The venom of Bothrops moojeni and composed a great number of bioactive components that may eventually be a potential therapeutic use in scientific research focused on health. Objectives: The objective of this project was to evaluate the activity of noncytotoxic venom Bothrops moojeni in peripheral blood mononuclear cells (CMN). Methodology: In this work were obtained CMN donations from healthy individuals, MNCs were separated in the density gradient. After activation of CMN with phytohemagglutinin (PHA) and interleukin (IL2) was added different concentrations of cobra venom B. moojeni to evaluate its activity is not cytotoxic. Results: The levels of 0.5 and 0.05 mg / mL crude venom of Bothrops moojeni showed no cytotoxic activity on human peripheral blood CMN. Conclusion: The crude venom of Bothrops moojeni by not showing cytotoxicity at levels of 0.5 and 0.05 mg / mL, is potentially useful for evaluating potential therapeutic effects on these cells infected with microorganisms such as HIV - 1. / Introdução: O Brasil possui hoje a segunda colocação dentre os países com maior riqueza de répteis em seu território. A Bothrops moojeni é uma serpente venenosa encontrada abundantemente na região Centro Oeste do Brasil. O veneno das serpentes são misturas complexas contendo neurotoxinas, citotoxinas, miotoxinas, proteases e nucleases. O veneno da Bothrops moojeni e composto de um grande numero componentes bioativos que poderá ser no futuro um potencial uso terapêutico nas pesquisas científicas voltadas para a área da saúde. Objetivos: O objetivo deste projeto foi o de avaliar a atividade não citotóxica do veneno bruto Bothrops moojeni em células mononucleares de sangue periférico (CMN). Metodologia: Neste trabalho foram obtidas CMN de doações de pessoas sadias, as CMN foram separadas em meio de gradiente de densidade. Após ativação das CMN com fitohemaglutinina (PHA) e interleucina (IL2) foram adicionadas diferentes concentrações do veneno da cobra Bothrops moojeni para avaliar sua atividade não citotóxica. Resultados: As concentrações 0,5 e 0,05 μg/mL do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni não apresentou atividade citotóxica sobre CMN do sangue periférico humano. Conclusão: O veneno bruto da serpente Bothrops moojeni por não apresentar citotoxicidade nas concentrações 0,5 e 0,05 μg/mL, é potencialmente útil para verificar possível efeito terapêutico sobre estas células infectadas por microorganismos como por exemplo o HIV - 1.

Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases. / Despite the constant advances in the treatment of cancer, this disease remains one of the main causes of mortality worldwide. So, the development of new treatment modalities is imperative. Snake venom causes a variety of biological effects because they constitute a complex mixture of substances as disintegrins, proteases (serine and metalo), phospholipases A2, L-amino acid oxidases and others. The goal of the present work is to evaluate a anti-tumor activity of some snake venoms fractions. There are several studies of components derived from snake venoms with this kind of activity. After fractionation of snake venoms of the families Viperidae and Elapidae, the fractions were assayed towards murine melanoma cell line B16-F10 and fibroblasts L929. The results showed that the fractions of venom of the snake Notechis ater niger had higher specificity and potential antitumor activity on B16-F10 cell line than the other studied venoms. Since the components of this venom are not explored yet coupled with the potential activity showed in this work, we decided to choose this venom to develop further studies. The cytotoxic fractions were evaluated to identify and characterize the components that showed antitumoral activity. Western blot assays and zymography suggests that these proteins do not belong to the class of metallo and serine proteinases.

Este trabalho relata o isolamento e caracterização bioquímica parcial de componentes do veneno de Tityus serrulatus (VTs) com ação sobre o sistema complemento (SC). O procedimento de purificação envolveu uma cromatografia de troca iônica do VTs em CM-celulose-52, em pH 7,8 e doze frações foram obtidas, denominadas de I a XIII. A fração I, que apresenta atividade sobre o SC sérico, foi filtrada em Sephacryl S-200 e dez subfrações foram obtidas e denominadas I-1 a I-10. A subfração I-1 foi recromatografada em uma coluna de DEAE-Sepharose, em pH 7,8. Cinco subfrações foram obtidas (DE-1 a DE-5) e as subfrações DE-2, DE-3 e DE-4 incubadas com soro humano normal (SHN) induziram redução da atividade lítica da via clássica/lectina (VC/L) de forma concentração-dependente. A subfração DE-2 apresentou uma banda eletroforética única no gel de eletroforese de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), com peso molecular (PM) de aproximadamente 247.000 na ausência de b-mercaptoetanol e seis bandas na presença de b-mercaptoetanol. O procedimento de purificação dos componentes ativos da subfração I-4 envolveu basicamente uma cromatografia de troca iônica em Mono-Q, em pH 7,1. Sete subfrações (MQ-1 a MQ-7) foram obtidas neste passo cromatográfico. As proteínas MQ-5 e MQ-7 da subfração I-4 induziram redução da atividade hemolítica das VC/L e via alternativa (VA). Com o objetivo de investigar o mecanismo de ação sobre o SC, SHN foi incubado com a subfração I-4 ou seus componentes (MQ-5 e MQ-7). A imunoeletroforese mostrou a clivagem do fator B e de C3 por estas proteínas, similar ao induzido pela incubação de SHN com zimosan, o que confirma a hipótese de que MQ-5 e MQ-7 induzem a ativação do SC. A capacidade de gerar fatores quimiotáticos no soro foi investigada. Nas condições experimentais, a incubação de SHN com a subfração I-4, proteínas MQ-5 e MQ-7 induziu a migração de neutrófilos similar a induzida pela incubação de soro com zimosan, demonstrando que estas proteínas induzem clivagem de C3 e C5, gerando os fragmentos ativos de C3a e C5a. As proteínas MQ-5 e MQ-7 não foram capazes de lisar eritrócitos de coelho e carneiro. MQ-5 e MQ-7 não induziram redução da atividade hemolítica da VC/L após o aquecimento a 100ºC, portanto a ação destas proteínas não é conseqüência da presença de produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS). As proteínas MQ-5 e MQ-7 apresentaram atividade fibrinogenolítica e caseinolítica e são metaloproteases, já que a atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina. Ambas proteínas apresentaram uma banda eletroforética única por SDS-PAGE, com um PM aproximado de 24.500 na ausência de b-mercaptoetanol, 33.100 na presença de b-mercaptoetanol e um ponto isoelétrico de 4,2. A seqüência N-terminal (Degradação de Edman) e a seqüência de peptídeos trípticos (Espectrometria de massa ESI-MS/MS) de MQ-5 e MQ-7 foram determinadas. Ambas proteínas apresentaram seqüência similar de aminoácidos. Em resumo, este trabalho mostrou que o VTs contém proteases (MQ-5 e MQ-7, metaloproteases) que são capazes de ativar o SC e podem ser importantes no processo inflamatório que ocorre em conseqüência do envenenamento. Além disso, estas proteínas podem ser usadas para depledar o SC em modelos experimentais de doenças em que este sistema está envolvido. / This work reports the isolation and partial biochemical characterization of components from Tityus serrulatus venom (TsV) with action on the complement system (CS). The purification procedure involved an ion-exchange chromatography of TsV on CM-celullose-52, at pH 7.8, twelve fractions were obtained and named I to XIII. Fraction I, showing activity on the serum CS, was filtered on Sephacryl S200 and ten subfractions were obtained and denominated I-1 to I-10. The subfraction I-1 was rechromatographed on a column of DEAE-sepharose, at pH 7.8. Five subfractions were obtained (DE-1 to DE-5) and subfractions DE-2, DE-3 and DE-4 incubated with NHS induced a concentration-dependent reduction in lytic activity of CP/L. Subfraction DE-2 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with a molecular weight (MW) of approximately 247,000 in the absence of -mercaptoethanol and six bands in the presence of -mercaptoethanol. The purification procedure of the active compounds of subfraction I-4 involved basically an ion-exchange chromatography on Mono-Q, at pH 7.1. Seven subfractions (MQ-1 to MQ-7) were obtained in this chromatography step. We found that proteins MQ-5 and MQ-7 of subfraction I-4 induced reduction in hemolytic activity for CP/L and AP. In order to investigate the mechanism of action on the CS, NHS was incubated with subfraction I-4 or its components (MQ-5 and MQ-7). The immunoelectrophoresis showed cleavage of factor B and C3 by these proteins, similar to that induced by incubation of NHS with zymosan, which corroborated the hypothesis that MQ-5 and MQ-7 induce activation of the CS. Their capacitiy to elicit serum-induced chemotaxis was then investigated. Under our assay conditions, incubation of NHS with subfraction I-4, protein MQ-5 and MQ-7 induced neutrophil migration similar to that induced by incubation of serum with zymosan, showing that the proteins induce cleavage of C3 and C5, thereby generating the active fragments C3a and C5a. Proteins MQ-5 and MQ-7 alone were unable to lyse rabbit or sheep erythrocytes. MQ-5 and MQ-7 did not induce reduction in hemolytic activity for CP/L after being heated to 100ºC, therefore the action of these proteins is not a consequence of the presence of bacterial products, such as lipopolyssaccharides (LPS). Proteins MQ-5 and MQ-7 showed fibrinogenolytic and caseinolytic activities and they probably are metalloproteases, since its fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenantroline. Both MQ-5 and MQ-7 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with an approximate MW of 24,500 in the absence of -mercaptoethanol, 33,100 in the presence of -mercaptoethanol and an isoelectric point of 5.9. The N-terminal sequence (Edman Degradation) and the sequence of tryptic peptides (Mass spectrometry- ESI-MS/MS) from MQ-5 e MQ-7 were determined. The proteins MQ-5 e MQ-7 showed similar sequence of aminoacids. In summary, this work showed that the TsV venom contains proteases (MQ-5 and MQ-7, metalloproteases) which are able to activate the CS, and may therefore be important in the context of the inflammatory process occurring in consequence of envenomation. In addition these proteins may be used to deplete complement in experimental models of diseases involving participation of this system.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.