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Estudo das interações entre fosfolipases A2 e o inibidor vegetal, ácido rosmarínico de Cordia verbenacea (Boraginaceae) por cocristalização e modelagem molecular / Study of interactions between phospholipases A2 and the plant inhibitor, rosmarinic acid from Cordia verbenacea (Boraginaceae) by co-crystallization and molecular modelingMelim, Lorane Izabel da Silva 30 October 2009 (has links)
As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.
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Proteômica e transcriptômica aplicadas ao estudo da variabilidade do veneno de Bothrops jararaca (serpentes:viperidae) / Proteomics and transcriptomics applied to the study of Bothrops jararaca venom variability (Serpentes: Viperidae)Pereira, André Zelanis Palitot 30 May 2011 (has links)
Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species
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Caracterização estrutural e funcional de um fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, da peçonha da serpente Crotalus durissus collilineatus / Structural and functional characterization of a vascular endothelial growth factor, VEGF, from the snake venom Crotalus durissus collilineatusFerreira, Isabela Gobbo 11 August 2017 (has links)
As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Estudar seus componentes permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. As serpentes da espécie Crotalus durissus habitam diversas regiões do Brasil e suas peçonhas são compostas de grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, componentes não enzimáticos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. Muitos componentes ainda não foram isolados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) identificado por estas técnicas na peçonha de Crotalus durissus collilineatus (C.d.c). Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massas moleculares de 20 a 30 kDa, para o dímero, e de 13 a 16 kDa, para o monômero. Eles desempenham o papel principal na angiogênese (crescimento de novos vasos). No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está elucidado. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo isolar e elucidar os aspectos estruturais e funcionais parciais, de um VEGF da peçonha da serpente C.d.c. A peçonha foi inicialmente submetida a uma análise por LC-MS para um conhecimento geral dos seus componentes. Em seguida, foi fracionada por cromatografia líquida de fase reversa em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) e, posteriormente, todas as 43 frações obtidas foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF. As frações 23, 24 e 25 foram positivas para VEGF e, por isso, escolhidas para serem estudadas. Estas frações foram recromatografadas por meio de três protocolos (troca catiônica, fase reversa e troca aniônica). Após os fracionamentos, todas as subfrações foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF e à eletroforese em gel de poliacrilamida para a análise da composição das mesmas. Em seguida, essas amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina e submetidas a ensaios de espectrometria de massas (ESI-Q-TOF e PMF), para identificar peptídeos trípticos de VEGF e, as que mostraram maior pureza na eletroforese, foram analisadas por sequenciamento amino-terminal, a fim de elucidar sua estrutura primária. Nestes estudos foram identificados um Fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e duas isoformas de VEGF. A cromatografia em coluna de troca iônica (HiTrap QXL) foi a mais efetiva na purificação dos compostos das frações 23, 24 e 25. As 6 subfrações obtidas, após confirmação da presença de VEGF pelo ELISA, eletroforese e espectrometria de massas, foram submetidas a uma análise de reconhecimento do VEGF pelo soro anticrotálico comercial por meio do ELISA e o VEGF foi reconhecido com alta afinidade pelo soro. Em seguida, essas amostras foram analisadas por ELISA com anticorpo anti-FGF a fim de confirmar a presença do FGF, porém, este não foi reconhecido nas amostras pelo anticorpo, nas concentrações utilizadas. As frações contendo VEGF, denominado de CdcVEGF, foram submetidas aos ensaios funcionais. No ensaio de angiogênese in vitro, no qual se analisa a indução da formação de tubos em Matrigel® pelas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs), todas as 6 subfrações induziram a angiogênese, confirmando que mantiveram sua atividade após os fracionamentos e dentre estas, a subfração denominada de 24-QXL3 foi a mais potente, mostrando uma indução da formação dos tubos ainda mais potente que o controle positivo (bFGF). No ensaio in vitro de migração de células mononucleares de sangue periférico humano (quimiotaxia em câmara de boyden), os CdcVEGFs não alteraram significativamente a migração das células, nas concentrações testadas. Os dados obtidos neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a composição da peçonha de C.d.c, além de desenvolver um novo protocolo para isolamento de VEGF e possibilitar sua caracterização. Adicionalmente, foi possível a identificação de um novo FGF, o qual ainda não havia sido identificado na peçonha de C.d.c. / Snake venoms are considered rich sources of a variety of components that displays important pharmacological activities. The study of these diverse components allows the elucidation of envenoming pathology and the identification of molecules with potential biotechnological applications. The snakes of Crotalus durissus species inhabit various regions of Brazil and their venoms are a complex mixture of proteins (around 95%), carbohydrates, metal cations, biogenic amines, nucleosides, non-enzymatic components, free amino acids and a small lipid fraction. Many components have not yet been isolated, although some of them have already been identified in omics analysis (transcriptome and proteome), like the VEGF (Vascular Endothleial Growth Factor) identified by these techniques in the Crotalus durissus collilineatus (C.d.c) venom. VEGFs are non-enzymatic homodimers with molecular weights varying from 20 to 30 kDa for the dimer and 13 to 16 kDa for the monomer. They have a central role in angiogenesis (growth of new vessels) but their role in the envenoming pathophisiology is not elucidated. This study aimed to isolate and perform the elucidation of the structural and functional aspects of a VEGF from C.d.c snake venom. Initially, the venom was submitted to a LC-MS analysis for the global knowledge of its components. Then, it was fractionated by reversed phase chromatography on FPLC system (Fast Protein Liquid Chromatography) and later all the fractions collected were submitted to an ELISA for identification of VEGF. The fractions 23, 24 and 25 proved being positive for VEGF and therefore, were chosen to be studied. These fractions were rechromatographed by three different protocols (cation exchange, reversed phase and anionic exchange). All the subfractions obtained by these chromatographies were analyzed by ELISA for the confirmation and identification of VEGF and by an SDS-PAGE for the analysis of their composition. These subfractions were then reduced, alquilated and digested with tripsin and submitted to spectrometry analysis (ESI-QTOF and PMF) in order to identify tryptic peptides of VEGF and the ones that presented a higher level of purity in the electrophoresis, were analyzed by amino-terminal sequencing to elucidate its primary structure. In these studies were identified an FGF and two isoforms of VEGFs. The chromatography on ion-exchange column (HiTrap QXL column) was the most effective in purifying the compounds of fractions 23, 24 and 25. The six subfractions obtained, after confirmation of the presence of VEGF by the ELISA, electrophoresis and mass spectrometry, were analyzed by another ELISA with anticrotalic serum and the VEGF was recognized with high affinity by the serum, indicating that the molecule is immunogenic. Subsequently, another ELISA was performed with a FGF-antibody to confirm the presence of FGF in the samples. However, the antibody was not able to recognize it in the concentrations used of the fractions. The VEGF found in all six subfractions was denominated as CdcVEGF and submitted to functional analysis. In the in vitro angiogenesis assay, which analyzes the induction of tube formation in Matrigel® by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cells, all 6 subfractions induced angiogenesis, confirming that they maintained their activities after the fractionations. Among those, the subfraction 24-QXL3 showed a more potent response, demonstrating a tube formation even more significant than the positive control (bFGF). In the in vitro assay for the migration of human peripheral blood mononuclear cells (chemotaxis technique in boyden chamber), the CdcVEGFs did not significantly alter cell migration at the concentrations tested. The data obtained in this study amplify the knowledge about the composition of C.d.c venom and the development of a new isolation protocol for VEGF, possibiliting its characterization. Additionally, it was possible to identify a new FGF, which had not yet been identified in C.d.c venom.
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Sistema de cocultura com as linhagens celulares humanas HepG2 e HUVEC na investigação da genotoxicidade de toxinas isoladas de Bothrops jararacussu / Co-culture system with the human cell lines HepG2 and HUVEC in the genotoxicity investigation of toxins isolated from Bothrops jararacussuMachado, Ana Rita Thomazela 15 May 2017 (has links)
O carcinoma hepatocelular é um dos tipos de cânceres mais comuns em adultos com sua incidência aumentando mundialmente a cada ano. O tratamento curativo é o transplante de fígado, mas as muitas dificuldades encontradas para o procedimento faz com que a quimioterapia seja amplamente utilizada. Além disso, pode ocorrer quimiorresistência e muitos efeitos adversos, o que impulsiona a busca por novos compostos terapêuticos. L-aminoácido oxidases (LAAO) isoladas de peçonhas de serpentes têm demonstrado bons resultados de citotoxicidade em linhagens celulares tumorais, no entanto estes resultados representam sistemas in vitro em monocultura e estudos recentes demonstram que o microambiente tumoral tem um importante papel na transformação neoplásica, no crescimento e invasão do tumor e na resistência quimioterápica. Assim, avaliou-se uma LAAO purificada da peçonha de Bothrops jararacussu (BjussuLAAO-II) em células de carcinoma hepatocelular (HepG2) em monocultura e em cocultura com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) com o objetivo de simular o microambiente tumoral, onde, normalmente, é observado mais de um tipo celular. A atividade citotóxica foi avaliada por meio do ensaio do MTT e do ensaio de sobrevivência clonogênica, a atividade genotóxica por meio do ensaio do cometa, a produção de espécies reativas de oxigênio por meio de fluorescência e os danos ao cromossomo por meio do ensaio do micronúcleo. Em células HepG2, em monocultura, todas as concentrações testadas (0,25 - 5,00 ?g/mL) foram citotóxicas e aumentaram os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio. Verificou-se dano genotóxico na concentração de 5,00 ?g/mL e não houve dano cromossômico. Quando cultivada em cocultura com células HUVEC, as concentrações de 1,00 e 5,00 ?g/mL de BjussuLAAO-II foram citotóxicas às células HepG2 e aumentaram os níveis de espécies reativas de oxigênio. A concentração de 5,00 ?g/mL induziu danos ao DNA e não houve danos aos cromossomos. Estes efeitos podem ser correlacionados ao aumento de espécies reativas de oxigênio intracelulares e as diferenças entre os resultados de mono e cocultura devido à simulação de parte do microambiente tumoral. Em monocultura de células HUVEC, todas as concentrações testadas foram citotóxicas, houve dano genotóxico nas concentrações de 1,00 e 5,00 ?g/mL e nenhuma concentração testada induziu danos cromossômicos. Como há elevada citotoxicidade, danos ao DNA e indução de efeitos pró-oxidantes em células HepG2, BjussuLAAO-II representa um composto promissor no desenvolvimento de novos fármacos antitumorais / Hepatocellular carcinoma is one of the most common types of cancers in adults whose incidence increases worldwide each year. Liver chirurgic and transplantation is the best choice of treatment, but the many difficulties encountered in the procedure cause chemotherapy to be widely used. In addition, chemo resistance and many adverse effects can occur, which improves the search for new therapeutic molecules. L-amino acid oxidases (LAAO) isolated from snake venoms have demonstrated good cytotoxicity results in tumor cell lines, however these results represent in vitro monoculture systems and recent studies have shown that the tumor microenvironment plays an important role in neoplastic transformation in tumor growth and invasion and chemotherapeutic resistance. A LAAO purified from Bothrops jararacussu venom (BjussuLAA-IIO) venom was evaluated in hepatocellular carcinoma (HepG2) cells in monoculture and co-culture with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with the aim of simulating the tumor microenvironment, where more than one cell type is normally observed. Cytotoxic activity was assessed by the MTT assay and clonogenic survival assay, genotoxic activity by comet assay, reactive oxygen species production by fluorescence, and chromosome damage by the micronucleus assay. In HepG2 cells, in monoculture, all concentrations tested (0.25 - 5.00 ?g/mL) were cytotoxic and increased intracellular levels of reactive oxygen species. Genotoxic damage at the concentration of 5.00 ?g/mL was observed and there was no chromosomal damage. When cultured with HUVEC cells, concentrations of 1.00 and 5.00 ?g/mL of BjussuLAA-II were cytotoxic to HepG2 cells and increased levels of reactive oxygen species. The concentration of 5.00 ?g/mL induced DNA damage and there was no damage to the chromosomes. These effects can be correlated to the increase of intracellular reactive oxygen species and the differences between the mono and co-culture results due to the simulation of part of the tumor microenvironment. In HUVEC monoculture, all concentrations tested were cytotoxic, genotoxic damage at concentrations of 1.00 and 5.00 ?g/mL, and no concentration tested induced chromosome damage. As there is high cytotoxicity, DNA damage and induction of pro-oxidant effects in HepG2 cells, BjussuLAAO-II represents a promising compound in the development of novel antitumor drugs
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Análise da variabilidade ontogenética do veneno de Bothrops insularis (Amaral, 1921)(Serpentes, Viperidae): implicações adaptativas aos itens alimentares / Analysis of ontogenetic variability of Bothrops insularis (Amaral, 1921) snake venom: adaptative implications for dietary itemsPereira, André Zelanis Palitot 14 August 2006 (has links)
Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A e B do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A e Bdo fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais. / Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animals age) and lyophilized for subsequent assays. Offsprings mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animals ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A and B fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animals age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A and B fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snakes diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.
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Veneno da serpente Bothrops lanceolatus: caracterização, ativação do sistema complemento e mecanismos potenciais envolvidos no envenenamento. / Bothrops lanceolatus snake venom: characterization, activation of the complement system and potential mechanisms involved in envenoming.Delafontaine, Marie Paule Jacqueline 27 June 2016 (has links)
Na Martinica, os envenenamentos por Bothrops lanceolatus apresentam um quadro clínico trombótico, acompanhado de inflamação local extensa, envolvendo edema, dor e hemorragia limitada. Neste estudo foi mostrado que vários componentes do veneno compartilham similaridades antigênicas com venenos de espécies da América do Sul. O veneno de B. lanceolatus é citotóxico para queratinócitos e células endoteliais, induzindo a produção de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias pelas células. O veneno de B. lanceolatus ativa a cascata do complemento, liberando anafilatoxinas, assim como o complexo terminal do complemento. Ele apresenta uma ação proteolítica sobre os componentes purificados C3, C4, C5, e o inibidor de C1, C1-INH. O veneno também desequilibra o balanço de expressão dos reguladores do complemento na membrana das células endoteliais. Estes dados demonstram que o veneno de B. lanceolatus exibe uma potente ação proinflamatória, pela ativação do sistema complemento e pela sua toxicidade em células endoteliais. / In Martinique envenomations by Bothrops lanceolatus are characterized by a systemic thrombotic syndrome and important local inflammation, involving oedema and pain, but limited haemorrhage. In this study, we show that several components of B. lanceolatus venom share antigenic similarities with South American Bothrops species. Still, B. lanceolatus venom proteases present substrate specificity. The venom is cytotoxic for keratinocytes and endothelial vascular cells, inducing the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. B. lanceolatus venom activates the complement cascade, releasing anaphylatoxins and the terminal complement complex. It also shows a direct proteolytic activity upon the purified complement proteins C3, C4, C5, and the inhibitor of C1, C1-INH. B. lanceolatus venom modified the balance of complement regulators on endothelial cells membrane. In conclusion, B. lanceolatus venom displays important pro-inflammatory properties, as it activates the complement cascade and impacts endothelial cells.
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Purificação e caracterização da fração neurotóxica da peçonha da anêmona do mar Anthopleura cascaia / Purification and characterization of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaiaMadio, Bruno 14 June 2012 (has links)
A peçonha de anêmonas do mar é uma fonte conhecida de compostos bioativos, incluindo peptídeos, que atuam em canais voltagem-dependentes. Foram descritos 4 tipos de neurotoxinas de anêmonas do mar, que atuam em canais NaV e 4 tipos que atuam em canais KV. Essas toxinas têm permitido discriminar subtipos de canais voltagem-dependentes, estreitamente relacionados, e constituem poderosas ferramentas para estudar o funcionamento e estrutura desses canais. Neste estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos da fração neurotóxica da anêmona do mar Anthopleura cascaia. Esses peptídeos foram nomeados como AcaIII1425, AcaIII2970 e AcaIII3090, onde Aca faz referência a espécie e os números seguem os resultados obtidos nas etapas de purificação. A peçonha foi extraída por meio de estímulos elétricos e purificada por gel-filtração (Sephadex G-50) e fase reversa por HPLC (C-18). As massas moleculares foram obtidas por meio de MALDI-TOF, apresentando 3337,4 Da para a AcaIII1425, 4881,7 Da para a AcaIII2970 e 4880,5 Da para AcaIII3090. Através da técnica de voltage-clamp, esses peptídeos foram testados em diferentes subtipos de canais NaV e KV expressados em ovócito de Xenopus. As toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 retardam, de maneira seletiva, a inativação rápida dos subtipos rNaV1.3, mNaV1.6 e hNaV1.5, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. É importantemente salientar que, a AcaIII2970 e AcaIII3090 também foram examinadas no canal de inseto DmNaV1, revelando uma clara \"filo-seletividade\" na eficácia da atividade das toxinas. A AcaIII2970 e AcaIII3090 inibem fortemente a inativação do canal NaV de inseto, resultando em um aumento na amplitude do pico da corrente e removendo completamente a inativação rápida. Para quantificarmos essa \"filo-seletividade\", foram construídas curvas da dependência da concentração no retardo da inativação induzida pelas toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 nos canais em que apresentaram maior eficácia. Os IC50 foram obtidos após a plotagem dos dados em uma curva sigmoidal. Para a AcaIII2970, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 162,19 ± 11,22 nM, mNaV1.6 = 645,92 ± 18,52 nM, rNaV1.3 = 572,56 ± 44,96 nM. Para a AcaIII3090, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 99,03 ± 9,25 nM, mNaV1.6 = 158,30 ± 33,86 nM, rNaV1.3 = 371,60 ± 6,48 nM. A AcaIII1425 atua, bloqueando, de modo seletivo os subtipos rKV1.1, rKV1.6 e rKV4.3, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. Devido à maior especificidade da toxina AcaIII1425 pelos subtipos rKV1.1 e rKV1.6, foram realizados ensaios de bloqueio da corrente do canal em função da concentração da toxina (curva dose-resposta). Os valores de IC50 para os subtipos rKV1.1 e rKV1.6 são de 7642,98 ±1601,65 nM e 241,65 ±4,27 nM, respectivamente. Desta forma, a AcaIII1425 é cerca de 32 vezes mais potente em canais do subtipo rKV1.6 do que em relação aos canais do subtipo rKV1.1. A estrutura primária das toxinas foram determinadas por degradação de Edman. A sequência parcial da AcaIII2970 e AcaIII3090 revelou que estas são similares a toxinas de canal de sódio do tipo1 de anêmonas do mar. A sequência completa da AcaIII1425 não apresenta similaridade com toxinas de anêmonas do mar, mas é similar a toxinas de Conus e aranha que possuem um motivo estrutural conhecido como ICK. Dessa forma, propomos que a AcaIII1425 seja um novo grupo de toxinas de anêmonas do mar que bloqueiam KV. Dado o ineditismo da toxina AcaIII1425, foram feitos experimentos in silico para obtermos um maior refinamento do mecanismo de interação entre a toxina e o canal rKV1.6. Estes experimentos indicaram que diferentes regiões dos canais KV são importantes para a seletividade e potência da toxina, corroborando com as propostas que vem sendo descritas / The venom of sea anemones is a known source of bioactive compounds, including peptides that act on voltage-gated ion channels. Four types of neurotoxins from sea anemones, acting on NaV channels, and four types acting on KV channels, have been reported. These toxins have developed the ability to discriminate closely related subtypes of voltage-gated channels, making them powerful tools to studying the function and structure of these channels. In this study, we isolated and characterized three peptides of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia. These peptides were named as AcaIII1425, and AcaIII2970 AcaIII3090, where Aca refers to the species and the following numbers refer to results obtained in the purification steps. The venom was milked by electric shock and purified by molecular exclusion (Sephadex G-50) and reverse phase HPLC (C-18). Their molecular weights are 3337.4 Da to AcaIII1425, 4881.7 Da to AcaIII2970 and 4880.5 Da to AcaIII3090, obtained through a MALDI-TOF. Using the voltage-clamp technique, we have assayed the effects of these peptides on different subtypes of NaV and KV channels expressed in Xenopus oocytes. AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins selectively slow down the fast inactivation of rNaV1.3, mNaV1.6 and hNaV1.5 subtypes, while the other mammalian isoforms remained unaffected. Importantly, AcaIII2970 and AcaIII3090 were also examined in insect DmNaV1 channel, revealing a clear phyla-selectivity with regards to the efficacy of the toxin. AcaIII2970 and AcaIII3090 strongly inhibit the inactivation of the insect NaV channel, resulting in an increase in the amplitude of the peak current, and complete removal of the fast and steady-state inactivation. In order to quantify this \"phyla-selectivity\", curves of the concentration dependence of the delayed inactivation induced by AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins channels with higher efficacy, were built. After plotting the data on a sigmoidal curve the IC50 values were obtained. For AcaIII2970, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 162.19 ± 11.22 nM, mNaV1.6 = 645.92 ± 18.52 nM and rNaV1.3 = 572.56 ± 44.96 nM. For AcaIII3090, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 99.03 ± 9.25 nM, mNaV1.6 = 158.30 ± 33.86 nM and rNaV1.3 = 371.60 ± 6.48 nM. AcaIII1425 acts, selectively, blocking rKV1.1, rKV1.6 and rKV4.3 subtypes, while the others isoforms tested remained unaltered. Due the higher specificity of AcaIII1425 to rKV1.1 and rKV1.6 subtypes, assays were performed to evaluate the blocking channel current versus toxin concentration (dose-response curve). IC50 values for the subtypes rKV1.6 and rKV1.1 are 7642.98 ± 1601.65 nM and 241.65 ± 4.27 nM, respectively. Thus, AcaIII1425 is about 32 times more potent in the rKV1.6 than in the rKV1.1 channel. The primary structure of the toxins was determined by the Edman degradation. The partial sequence of AcaIII2970 and AcaIII3090 revealed that these toxins are similar to the type 1 sodium channel sea anemones neurotoxins. The complete sequence of AcaIII1425 has no similarity with other sea anemone toxins, but is similar to the Conus and spider neurotoxins which have a structural motif known as ICK. Thus, we propose that AcaIII1425 comprises a new group of sea anemones toxins that block KV channels. Given the unprecedented nature of the toxin AcaIII1425, in silico assays were carried out in order to further refining the proposed mechanism underlying the interaction between the toxin and the rKV1.6 channel. The results indicate that, in agreement to what has been proposed elsewhere, different regions of the KV channels are important for the toxin selectivity and potency
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Inervação noradrenérgica na ativação da glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca. / Noradrenergic innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake.Luna, Milene Schmidt do Amaral e 20 February 2008 (has links)
Neste trabalho, mostramos que a extração de veneno promove aumento na ativação dos fatores de transcrição NF<font face=\"symbol\">kB e AP-1. Noradrenalina, liberada após extração de veneno, é responsável por esse aumento. A estimulação dos adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b estão envolvidos nessa resposta, entretanto, o grau de ativação de AP-1 é alterado dependendo do tempo. Foi verificado dimorfismo sexual na ativação dos fatores de transcrição da glândula de veneno, sendo a ativação de NF<font face=\"symbol\">kB mais rápida nas fêmeas do que nos machos e a ativação de AP-1 maior nas fêmeas. Mostramos ainda que a extração de veneno ativa a glândula de veneno através da estimulação da inervação noradrenérgica. Noradrenalina atuando em adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b regula a síntese de proteínas da glândula de veneno e não a síntese de toxinas do veneno. Em conclusão, a estimulação da inervação noradrenérgica desencadeia o ciclo de produção de veneno regulando a síntese de proteínas da glândula que provavelmente são essenciais para sua ativação e posterior produção de veneno, através da ativação de fatores de transcrição. Thesis: Noradrenergic Innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake. / In this work we showed that venom extraction increases the activation of transcription factors like NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1. Noradrenaline released after venom extraction is responsible for NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Stimulation of both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors is involved in this response, however the increase of AP-1 activation is time dependent. A sexual dimorphism has been verified in NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Activation of NF<font face=\"symbol\">kB occurs earlier in female than in male snakes and activation of AP-1 is greater in female than in male snakes. We also showed that venom extraction activates venom gland by stimulating noradrenergic innervation. Noradrenaline acting at both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors regulates synthesis of protein of the venom gland, but not the toxin of the venom. In conclusion, stimulation of noradrenergic innervation triggers the venom production cycle by regulating synthesis of protein that probably is essential to activate venom gland to produce venom by activating transcription factors.
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Resposta imunológica em modelos animais imunizados contra o muco nativo ou irradiado por raios gama de 60 Co da raia de água doce Paratrygon aiereba / Humoral response of animal models immunized against native or 60Co irradiated mucus from the freshwater stingray Paratrygon aierebaThomazi, Gabriela Ortega Coelho 09 November 2016 (has links)
As raias são peixes peçonhentos e estão frequentemente associadas a acidentes em seres humanos, principalmente na região Norte do Brasil, favorecidos pelo hábito desses peixes de permanecerem no fundo de águas rasas e pela contínua utilização humana dos rios. Os ferrões das raias causam lesões dolorosas, edema, necrose, e o muco que recobre toda a extensão do corpo desses peixes pode aumentar a gravidade desses ferimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida pelo muco de Paratrygon aiereba nativo ou irradiado por raios gama de 60Co em modelos animais. Foram realizados ensaios imunoenzimáticos e Western blotting para verificar a resposta humoral e reatividade cruzada dos soros provenientes de camundongos Swiss e coelhos New Zealand previamente imunizados contra o veneno, muco nativo ou irradiado. A indução da produção de anticorpos in vitro, as subclasses de IgG e a quantificação de citocinas foram analisados. Além de realizados ensaios de soroneutralização da atividade edematogênica in vitro e in vivo e de viabilidade celular. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância. O protocolo de imunização possibilitou a obtenção de soros com títulos satisfatórios de anticorpos policlonais. O muco e veneno de P. aiereba são imunogênicos e apresentam reatividade antigênica. O muco nativo ou irradiado induziu a produção de anticorpos IgG e esses reconheceram antígenos presentes no muco de outras espécies de raias. Células esplênicas de animais imunizados contra o muco irradiado produziram IFN-γ, TNF- α e IL-10 e também foi observada a produção sérica de TNF-α (grupo imunizado contra o muco irradiado) e de IL-6 e IL-17 (grupo imunizado contra o muco nativo). O soro anti-muco irradiado reduziu a atividade edematogênica in vitro, ao contrária da in vivo que não foi neutralizada. Os resultados corroboram o uso da radiação ionizante, com produção de anticorpos altamente responsivos e melhor resposta imune, além de comprovar que o muco de Paratrygon aiereba foi capaz de estimular resposta imune adaptativa celular e humoral. / Freshwater stingrays are venomous animals, frequently associated with accidents in northern Brazil where the shallow waters and the human use of the rivers favour close proximity between the fish and potential victims. Ray stings induce painful lesions, edema, necrosis, and the mucus that covers the body of these fishes may increase the severity of the wounds. The aim of this work was to evaluate the immune response induced by native or 60Co Paratrygon aiereba mucus in animal models. Enzyme linked immunosorbent assays and western blots were performed to compare humoral immune response as well as cross reactivity using antibodies raised in mice or rabbits against venom or mucus, the latter either in its native or irradiated form. Antibody production in vitro, immunoglobulins subclasses and cytokines production were evaluated. Immunization resulted in good levels of antibodies. Interestingly, both the mucus and the venom share many cross reactive components. Furthermore, antibodies raised against native mucus or its irradiated counterpart were cross-reactive against the mucus of other stingray species. Splenic cells from mice immunized with irradiated mucus secreted IFN-γ, TNF-α and IL-10. The serum raised against irradiated mucus reduced edematogenic activity in vitro, but not in vivo, when the venom and the serum are injected separately. Our results corroborate the potential of ionizing radiation as a detoxifying agent for immunogens, with production of high antibody titers and, that the highly abundant mucus of freshwater stingrays contains basically the same repertoire of antigens as the venom, inducing the synthesis of high levels of neutralizing antibodies.
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Análise proteônica de venenos de Apis mellifera baseada em espectrometria de massas: abordagem quantitativa label-free e identificação de fosforilação / Mass Spectrometry-based proteomic analysis of honeybee venoms: label-free quantification and phosphorylation identificationResende, Virginia Maria Ferreira 28 March 2013 (has links)
Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies
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