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Clonagem de serino proteases do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus e expressão da giroxina em célula de mamífero / Cloning of serine proteases from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus and expression of a gyroxin in mammalian cellsYonamine, Camila Miyagui 05 December 2007 (has links)
As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / The serine proteases affect several physiological processes (such as the coagulation cascade) and pathological ones. These enzymes are widely distributed beyond the species; they are also toxins from snake venoms and are called SVSPs (snake venom serine proteases). These SVSPs are multifunctional and have a catalytic triad formed by HDS amino acids. Some of them are commercially available for use in clinical treatment for heart attack, tromboses and pulmonary embolism. So far, in Crotalus durissus terrificus venom only two SVSPs are described and gyroxin is considered the most studied SVSP which represents about 2,5% of the total venom. In the present study was reported the cloning of seven serine proteases amplified from a cDNA library of a venomous gland of a single adult specimen from Crotalus durissus terrificus venom. These clones have been analyzed in relation to the cDNA organization, structure and probable functions. The three-dimensional model of the gyroxin made possible the analysis of similarities with trypsin, thrombin and other SVSPs. The glycosylation and many disulfide bonds of the SVSPs make difficult the expression in E.coli to obtain the soluble recombinant toxin with activity. The expression in mammalian cells is very promising, because it is possible to make pos translation modification and to obtain the recombinant toxin secreted to the culture medium. The IgK signal peptide, the mature sequence and 3\'UTR region of gyroxin were cloned in the pED expression vector resulting in a new vector (pED-Giro). This vector carries the Igk signal peptide, which allows the secretion of the protein to the culture medium. The pED-Giro vector was transfected in CHO DXB11 dhfr and COS-7 cells. The gyroxin was detected in COS-7 total extract by western blot and after, purified from the medium culture and its integrity was confirmed by esterase activity assay.
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Caracterização bioquímica e biológica de toxinas presentes na peçonha e no muco do bagre Cathorops spixii. / Biochemical and biological characterization of toxins in the venom and mucus of the catfish Cathorops spixii.Ramos, Anderson Daniel 09 October 2009 (has links)
Dos peixes peçonhentos encontrados no Brasil os bagres destacam-se pelo número de acidentes provocados. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os componentes tóxicos presentes na peçonha e no muco. Obtivemos uma média protéica de 3,1 mg/mL (peçonha) e 1,4 mg/mL (muco). O perfil eletroforético da peçonha e do muco possui poucas bandas protéicas. O fracionamento isolou 11 frações para peçonha e 13 frações para o muco. Com relação às atividades biológicas avaliadas, as frações peptídicas induziram danos teciduais ao passo que as frações protéicas induziram processo inflamatório. Isolamos duas frações com atividade antimicrobiana para cada secreção. Isolamos uma toxina de 65,1 kDa que apresenta homologia com Wap65 e análise por microscopia intravital revelou que esta proteína causa aumento dos leucócitos rolantes assim como a presença de leucócitos aderidos ao endotélio. Nossos resultados indicam uma diferença entre os componentes protéicos e peptídicos do muco e da peçonha. Finalmente, conseguimos isolar e caracterizar a proteína Wap65 da peçonha deste peixe. / Of the venomous fish found in Brazil, catfish noteworthy for the number of accidents they cause. The objective of this study was to characterize the toxic compounds present in the venom and mucus. We obtained an average protein intake of 3,1 mg / mL (venom) and 1,4 mg / mL (mucus). The electrophoretic profile of venom and mucus has a few protein bands. Fractionation isolated 11 fractions to the venom and 13 fractions to the mucus. With respect to biological activities evaluated, the peptide fractions induced tissue damage while the protein fractions induced inflammation. We isolated two fractions with antimicrobial activity for each sample. We isolated a toxin of 65,1 kDa which shows homology with Wap65 and intravital microscopy analysis revealed that this protein causes an increase in leukocyte rolling as well as the presence of leukocytes adhered to the endothelium. Our results indicate a difference between the peptide and protein components of mucus and venom. Finally, we isolate and characterize the protein Wap65 from the venom of this fish.
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NÃO CITOTÓXICA DO VENENO DA COBRA BOTHROPS PAULOENSIS EM CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO HUMANOCastro, Fernanda de Oliveira Feitosa de 25 February 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011-02-25 / Snake s venoms are complexes mixtures of proteins and peptides,
aminoacids, nucleotides, lipids and carbohydrates, that showes importants
biologicals activities like cytotoxicity, neurotoxicity, systemic myolysis,
cardiotoxicity, kidney damage, hematologic disorders, like others. These
molecules has shown pharmacological potential components with potent action
against bacterias, virus and fungis. This present work aimed assed no cytotoxic
effect of the crude venom of the snake Bothrops pauloensis in the culture of
peripheral blood mononuclear cells (PBMC). After standardization of obtaining
PBMC and evaluation of ideal concentration of fitohemagglutinin (PHA) and
interleukin-2 (IL-2) for the cell culture was performed the evaluation of no citotoxic
effect on CMN by different doses of crude venom of Bothrops pauloensis. The
CMN was separated by density gradient, posterior being cultured. The evaluation
of the no cytotoxic activity of the venom was performer by the visualization of the
plate after 24, 48 and 72 hours. The concentration 0,05 mg/ml did not appear
citotoxic activity, suggesting the possibility of using in testing with CMN infected by
viruses, bacteria and fungi. / Os venenos de serpentes são misturas complexas compostas por
proteínas e peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, lipídios e carboidratos que
apresentam importantes atividades biológicas como citotoxicidade,
neurotoxicidade, miólise sistêmica, cardiotoxicidade, danos renais, desordens
hematológicas entre outras. Essas moléculas têm-se mostrado como potenciais
componentes farmacológicos com potente ação contra a atividade de bactérias,
vírus e fungos. O presente trabalho visou avaliar a atividade não citotóxica do
veneno bruto da cobra Bothrops pauloensis em células mononucleares (CMN) do
sangue periférico humano. Após a padronização da obtenção de CMN do sangue
periférico e da concentração ideal de fitohemaglutinina(PHA) e interleucina-2 (IL-
2) para cultivo celular, foi realizada a avaliação do efeito não citotóxico de
diferentes concentrações do veneno bruto da Bothrops pauloensis no cultivo
celular. As células mononucleares do sangue periférico foram separadas por
meio gradiente de densidade e cultivadas em meio de cultura. A avaliação da
atividade citotóxica do veneno foi realizada pela visualização da placa após 24, 48
e 72 horas. A concentração 0,05 μg/ml não apresentou atividade citotóxica,
sugerindo a possibilidade de utilização em ensaio com CMN infectadas por vírus,
bactérias e fungos.
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Clonagem de serino proteases do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus e expressão da giroxina em célula de mamífero / Cloning of serine proteases from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus and expression of a gyroxin in mammalian cellsCamila Miyagui Yonamine 05 December 2007 (has links)
As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / The serine proteases affect several physiological processes (such as the coagulation cascade) and pathological ones. These enzymes are widely distributed beyond the species; they are also toxins from snake venoms and are called SVSPs (snake venom serine proteases). These SVSPs are multifunctional and have a catalytic triad formed by HDS amino acids. Some of them are commercially available for use in clinical treatment for heart attack, tromboses and pulmonary embolism. So far, in Crotalus durissus terrificus venom only two SVSPs are described and gyroxin is considered the most studied SVSP which represents about 2,5% of the total venom. In the present study was reported the cloning of seven serine proteases amplified from a cDNA library of a venomous gland of a single adult specimen from Crotalus durissus terrificus venom. These clones have been analyzed in relation to the cDNA organization, structure and probable functions. The three-dimensional model of the gyroxin made possible the analysis of similarities with trypsin, thrombin and other SVSPs. The glycosylation and many disulfide bonds of the SVSPs make difficult the expression in E.coli to obtain the soluble recombinant toxin with activity. The expression in mammalian cells is very promising, because it is possible to make pos translation modification and to obtain the recombinant toxin secreted to the culture medium. The IgK signal peptide, the mature sequence and 3\'UTR region of gyroxin were cloned in the pED expression vector resulting in a new vector (pED-Giro). This vector carries the Igk signal peptide, which allows the secretion of the protein to the culture medium. The pED-Giro vector was transfected in CHO DXB11 dhfr and COS-7 cells. The gyroxin was detected in COS-7 total extract by western blot and after, purified from the medium culture and its integrity was confirmed by esterase activity assay.
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Proteoma de peçonhas de serpentes Crotalus durissus collilineatus: análise de variações individuais / Proteome of Crotalus durissus collilineatus venoms: analysis of individual variationsOliveira, Isadora Sousa de 27 October 2016 (has links)
As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. / Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective
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Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus / Expression of a protease of biotechnological interest cloned from C. d. collilineatus venom glandFrança, Johara Boldrini 10 May 2013 (has links)
As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.
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Análise do papel do sistema complemento na injúria a células renais causada pelo veneno da aranha Loxosceles. / Analysis of the complement system in the injury of kidney cells caused by Loxosceles spider venom.Okamoto, Cinthya Kimori 18 April 2012 (has links)
O envenenamento por aranhas Loxosceles pode resultar dois tipos de manifestações clínicas: o loxoscelismo cutâneo e o sistêmico. Hemólise, agregação plaquetária, inflamação persistente, falência renal e morte podem ser observados em pacientes com manifestações sistêmicas. Apesar da pouca incidência de vítimas com falência renal, esta é a principal causa de óbito, ocorrendo principalmente em crianças. O principal fator do veneno da aranha Loxosceles, responsável pelas manifestações locais e sistêmicas, é a esfingomielinase D. O presente estudo teve como objetivo investigar a ação tóxica do veneno de L. intermedia e das SMases D sobre células renais humanas, o possível envolvimento de metaloproteases endógenas e do sistema complemento neste processo. Os resultados obtidos mostram que tanto o veneno, como a SMase D, foram capazes de provocar morte celular, a qual foi relacionada a ativação de metaloproteases de matriz extracelular, MMP-2 e MMP-9 e, ainda, por ação lítica do complemento, após clivagem do MCP, por ação de metaloproteases da família das adamlisinas. A remoção de MCP permitiu ativação do Complemento, como determinado pelo aumento da deposição de C3 e C4 e da morte celular. Também foi observado um aumento na deposição do fator H e da properdina, mas não de C4bp após a tratamento das células com veneno/ SMase D. Diminuição na expressão das moléculas de superfície MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulina, EPCR e EGFR foi observada e está relacionada com a ativação de metaloproteases da família das adamlisinas. A expressão de outros reguladores do complemento, como DAF e CD59, não foi afetada pelo tratamento. Em conjunto, tais resultados mostram que o veneno e a SMase D induzem aumento na expressão/ativação de metaloproteases endógenas, operantes nos eventos de morte celular por apoptose e necrose, os quais podem ter um papel relevante para os danos renais presentes no loxoscelismo sistêmico humano. / Envenomation by Loxosceles spider can result two forms of clinical manifestations: cutaneous and systemic loxoscelism. Haemolysis, platelet aggregation, inflammation persistent, renal failure and death can be observed in patients with systemic manifestations. Despite the low incidence of renal failure victims, this is the main cause of death, occurring mainly in children. The sphingomyelinase D is the main factor in Loxosceles spider venom responsible for local and systemic manifestations This study aimed to investigate the toxicity of the L. intermedia venom and SMase D on human kidney cells and the possible involvement of endogenous metalloproteinases and complement this process. Results showed that venom and SMase D were able to cause cell death, which was related to activation of extracellular matrix metalloproteases, MMP-2 and MMP-9 and also by lytic action of complement, after MCP cleavage by the action of the family of metalloproteases adamlisins. The removal of MCP, by action of the venom/ SMase D, allowes activation of complement, as determined by increases deposition of C3 and C4 and cell death. There was also an increases in deposition of properdin and factor H, but not C4bp, after treatment of cells with venom/ SMase D. decreased expression of surface molecules MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulin, EPCR and EGFR was observed after incubation of the renal cells with venom or SMase D and is related to activation of metalloproteinases family adamlisins. The expression of others complement regulators such as DAF and CD59 was not affected by treatment. Together, theses results show that the venom and SMase D induce increased expression/ activation of endogenous metalloproteases, operating in the event of cell death by apoptosis and necrosis, which may have an important role for the kidney injury loxoscelism in the human system.
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Alkylations, Rearrangements, and Cyclizations of Oxidized Organosulfur CompoundsSoderman, Stefan Charles 27 August 2013 (has links)
Organosulfur compounds have been used by humans for centuries and played a pivotal role in shaping our history. The chemistry presented herein deals primarily with three distinct organic transformations involving organosulfur species. The three transformations are used in tandem to complete the synthesis of natural products.
The first chapter examines a new diastereoselective alkylation reaction of sulfenate anions with stereoinduction provided by chiral amino iodides. A series of β-amino sulfoxides are accessed in good yields and selectivities from alkylations with the corresponding lithium arene- and E-1-alkenesulfenate anions. The relative reactivity of different electrophiles towards a selection of lithium sulfenate anions was also evaluated by performing competition experiments.
In the second chapter 1,2-dibromotetrachloroethane (C2Br2Cl4) was evaluated as a more economical halogenating agent for the in-situ Ramberg-Bäcklund rearrangement (RBR). A series of trans-stilbenoids were successfully synthesized using this protocol in excellent yields. The new RBR system also worked well for
dialkyl and cyclic substrates, but the reaction was plagued by polyhalogenation for hexyl benzyl sulfone. The methodology was extended to the formal total synthesis of natural polyphenol E-resveratrol.
Chapter three investigates asymmetric aza-Michael reactions of chiral β-amino sulfoxides/sulfones to synthesize thiomorpholine S-oxides and S,S-dioxides, respectively. Remarkably, cyclizations of the β-amino sulfoxides provide the trans- 3,5-substituted heterocycles, while the β-amino sulfones provide the complementary cis-3,5-substituted heterocycles. The aza-Michael chemistry was exploited along with the sulfenate and RBR protocols to access two ant venom alkaloids. / NSERC
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Estudo dos efeitos da radiacao gama de Co-60 nas propriedades bioquimicas, biologicas e imunologicas do veneno de Bothrops jararacaGUARNIERI, MIRIAM C. 09 October 2014 (has links)
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Estudo dos efeitos da radiacao gama de sup(60)Co na peconha de Apis mellifera: aspectos bioquimicos, farmacologicos e imunologicosCOSTA, HELENA 09 October 2014 (has links)
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