La protéine Nef du VIH-1 joue un rôle important dans la pathogenèse du VIH-1 en modulant les voies de signalisation de la cellule hôte. La signalisation par le TcR est essentielle à la sélection positive pour générer les cellules simples positives (SP) CD4+ et simples positives (SP) CD8+, processus largement dépendant de l’activité de la Src kinase Lck et de son habileté à lier la queue cytoplasmique des corécepteurs CD4 et CD8. Nous avons précédemment trouvé que l’expression de Nef dans le VIH ou VIS peut induire une sévère déplétion des thymocytes et une baisse d’expression du corécepteur CD4 à la membrane. Nous avons également montré que Nef bloque la génération des thymocytes doubles positifs (DP) CD4+ CD8+ en plus d’altérer la transition des cellules DP vers CD4+ SP. Par contre, ce phénotype est récupérable par plusieurs approches dont le croisement d’une souris transgéniques exprimant Nef avec une souris exprimant la forme constitutivement active de Lck Y505F. Les résultats indiquent que la maturation des cellules CD4+ est altérée par le dysfonctionnement de la signalisation CD4-Lck. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels Nef contribue au bloc de la génération des cellules CD4+ dans le thymus demeurent très imprécis. Dans cette étude, en utilisant des approches biochimiques et de microscopie confocale, nous avons trouvé que les thymocytes transgéniques Nef+ expriment plus de Lck que les thymocytes Nef-. Malgré cette augmentation, une partie significative de Lck est incapable d’atteindre la membrane plasmique. Cette fraction était significativement accumulée dans un compartiment intracellulaire des thymocytes transgéniques exprimant Nef. Également, en utilisant la technique d’essai kinase in vitro, nous avons trouvé que l’activité kinase de Lck est significativement augmentée dans les thymocytes transgéniques mais demeure stable suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4. Également, comparativement aux thymocytes Nef-, la kinase Lck dans les thymocytes transgéniques était résistante à la dégradation suite à une stimulation. En examinant le statut de c-Cbl, le principal régulateur négatif de Lck, nous avons montré que c-Cbl colocalise faiblement avec Lck, malgré son hyperphosphorylation constitutive. Ceci pourrait expliquer l’échec de la dégradation de Lck. En plus, nous avons trouvé que suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4, la phosphorylation de Zap-70 en tyrosine 493 par Lck est diminuée, résultant d’une importante baisse de l’activité kinase de Zap-70 et d’un bloc des premiers évènements de la voie de signalisation par le TcR. Ces données indiquent que la signalisation CD4-Lck est interrompue par la présence de Nef. / HIV-1 Nef protein plays an essential role in the HIV-1 pathogenesis by modulating the host signaling transduction pathways. TcR signalling is important for the thymic selection process to CD4 and CD8 single positive T cells and is greatly dependent on the activity of Src kinase Lck and its ability to bind to CD4 and CD8 cytoplasmic tail. We previously found that expression of HIV or SIV Nef can induce severe thymocytes depletion and downregulation of CD4 expression in Nef+ mice. We also recently showed that Nef blocks generation of double positive thymocytes and impairs DP to CD4+ SP T cells transition. The reversal of this phenotype was accomplished by several approaches, among them by crossing Nef+ mice with mice expressing constitutively active Lck Y505F. These results imply that the maturation of CD4+ T cells is disrupted due to impairment of Lck-mediated CD4 receptor signaling. However, the molecular mechanisms by which Nef contributes to the impairment in thymic CD4 generation remains largely unclear. In this study, using confocal microscopy and biochemical approaches, we found that Nef+ thymocytes express more Lck than the Nef- control. Despite of this increase, a significant portion of Lck molecules were unable to reach to the plasma membrane. It was significantly accumulated in the intracellular endosomal compartment of the Nef+ thymocytes. Moreover, using IVKA we found that the activity of Lck is significantly increased in Nef+ thymocytes but was not further increased upon stimulation by α-CD3ε, α-CD4 or α-CD3ε + α-CD4. Moreover, compared to Nef- controls, Lck kinase in Nef+ thymocytes was resistant to degradation upon stimulation. Examining the status of c-Cbl, the main negative regulator of Lck, showed that c-Cbl localized with Lck poorly, despite his constitutive hyperphosphorylation. This explains the failure of Lck degradation. In addition, we found that upon stimulation, Zap-70 phosphorylation at tyrosine 493 by Lck is decreased, resulting by a decrease of Zap-70 kinase activity and TcR proximal event block. These data indicate that CD4-Lck signaling was interrupted by the presence of Nef.

L’infection à VIH-1 est associée à une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales (GALT, gut-associated lymphoid tissues). Ceci conduit à la translocation microbienne, qui est une cause d’activation immunitaire chronique et de progression de la maladie. Les cellules épithéliales (CE) jouent un rôle critique dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie au niveau des muqueuses intestinales via le recrutement des cellules de l’immunité innée (e.g., neutrophiles) et adaptative (e.g., cellules Th17). Les neutrophiles produisent des molécules antivirales (e.g., défensines-) et ont la capacité de limiter la réplication virale au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 jouent un double rôle lors de l’infection à VIH. Elles contribuent d’une part à la défense contre différents pathogènes opportunistes en augmentant, via la production d’IL-17, la capacité des CE à attirer les cellules Th17 et les neutrophiles. D’autre part, les cellules Th17 jouent un rôle délétère en tant que cibles de réplication virale et sources de cytokines pro-inflammatoires. La fréquence des cellules Th17 est diminuée dans les GALT mais pas dans les poumons des patients infectés par le VIH, suggérant qu’il existe des mécanismes différents par lesquels les cellules Th17 sont recrutées vers ces sites anatomiques. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle le VIH interfère avec la capacité des CE intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 et des neutrophiles. Nous avons démontré que les CE intestinales et pulmonaires produisent des CK spécifiques pour les cellules Th17 (CCL20) et les neutrophiles (CXCL8) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IL-1 et le TNF-. Le TNF- agit en synergie avec l’IL-17, un « signal de danger » récemment identifié, et augmente la capacité des CE intestinales mais pas pulmonaires à produire la chimiokine CCL20. Cette synergie s’explique par l’augmentation préférentielle de l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des CE intestinales suite à la stimulation par le TNF-. L’exposition au VIH n’affecte pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les CE intestinales, mais altère la capacité des CE alvéolaires à produire ces chimiokines en accord avec la permissivité sélective de ces dernières à l’infection par le VIH. En conclusion, nos résultats démontrent que (i) le VIH n’interfère pas directement avec la capacité des CE intestinales à recruter des cellules Th17 et des neutrophils et que (ii) la production de CCL20 par ces cellules est dépendantes de la synergie entre le TNF- et l’IL-17. Ainsi, la déplétion des cellules Th17 et la pénurie en IL-17 dans les GALT des sujets infectés pourrait causer de façon préférentielle des altérations fonctionnelles au niveau des CE intestinales, se traduisant par l’altération du recrutement des cellules Th17 en réponse au CCL20. / The HIV-1 infection is associated with a severe loss of CD4+ T-cells with Th17 polarization from the gut-associated lymphoid tissues (GALT). These alterations lead to microbial translocation, which is a cause of chronic immune activation and disease progression in HIV-infected subjects. Epithelial cells (EC) play a critical role in maintaining mucosal integrity and homeostasis in the GALT by mechanisms including recruitment of innate (e.g., neutrophils) and adaptive immunity cells (e.g., Th17 cells). Neutrophils produce antiviral molecules (e.g., -defensins) that may limit HIV replication at mucosal sites. Th17 cells play a dual role in HIV pathogenesis. Th17 cells contribute to the defence against different opportunistic pathogens by increasing the ability of epithelial cells to attract neutrophils in an IL-17-dependent manner. On the other hand, Th17 cells play a deleterious role in HIV pathogenesis as they are sites of productive viral replication and a source of pro-inflammatory cytokines. The frequency of Th17 cells is decreased in the GALT but not in the lungs of HIV-infected individuals, suggesting distinct mechanisms of Th17 recruitment in these anatomic sites in the context of HIV pathogenesis. In this manuscript we tested the hypothesis that HIV differentially interfere with the ability of intestinal but not pulmonary EC to produce chemokines that attract Th17 cells and neutrophils. We demonstrated that both intestinal and pulmonary EC produce chemokines that specifically attract Th17 cells (CCL20) and neutrophils (CXCL8) upon stimulation with the pro-inflammatory cytokines IL-1 and TNF- . TNF-α acted in synergy with IL-17, a recently identified « danger signal », and increases the capacity of intestinal but not pulmonary EC to produce CCL20. This synergistic effect can be explained by the preferential upregulation of IL-17 receptor expression on intestinal EC upon TNF- stimulation. The exposure of intestinal EC to HIV did not affect their ability to produce CCL20 and CXCL8; however, exposure to HIV altered the production of these chemokines by alveolar EC, consistent with their selective permissiveness to infection. In conclusion, our results demonstrate that (i) HIV does not interfere directly with the ability of intestinal EC to attract Th17 cells and neutrophils and that (ii) the ability of intestinal EC to recruit the Th17 cells via CCL20 production is selectively dependent on the synergy between TNF- and IL-17. Thus, the depletion of Th17 cells and the shortage in IL-17 in the GALT of HIV-infected subjects may preferentially lead to functional alterations of the intestinal barrier resulting by the alteration of Th17 recruitment in response to CCL20.

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