L'épissage est une étape clef de la multiplication du VIH-1. Par utilisation de 4 sites donneurs et 8 sites accepteurs d'épissage, plus de 40 ARNm différents sont produits. Une approche protéomique nous a permis d'identifier de nouvelles protéines interagissant avec la région de l'ARN viral contenant le site A7. Nous avons démontré l'interaction directe avec l'ARN viral de 5 des protéines identifiées (nucléoline, hnRNP A1/B, hnRNP H et hnRNP K). Nous avons montré que hnRNP K a plusieurs sites de fixation dans la région du site A7 et que hnRNP A1et hnRNP K se lient de façon coopérative. Nous avons montré un effet inhibiteur de hnRNP K sur l'épissage au site A7. Comme la protéine hnRNP A1 est un régulateur négatif de plusieurs sites accepteurs d'épissage (A1, A2, A3, A7), nous avons testé si la protéine hnRNP K pouvait renforcer l'inhibition à ces sites. En fait, hnRNP K active l'épissage in vitro des introns entre le site donneur D1 et les sites accepteurs A1, A2 et A3. Nous avons montré que la protéine hnRNP K renforce fortement l'activité de ASF/SF2 au site A2, ce qui indique que selon le contexte, la protéine hnRNP K peut être activatrice ou inhibitrice de l'épissage du VIH-1. J'ai observé de plus que la surexpression de la protéine hnRNP K dans des cellules HeLa, transfectées avec le plasmide p PSP contenant le virus VIH-1 dépourvu de ses capacités d'encapsidation, produit un changement très marqué de l'épissage alternatif de l'ARN PSP, ce qui confirme la forte influence de hnRNP K sur l'épissage alternatif du VIH-1. L'augmentation de la concentration cellulaire de hnRNP K dans les cellules HeLa conduit aussi à une diminution de la protéine virale Nef. La protéine hnRNP K intervient donc non seulement dans la régulation du site A7, mais aussi dans celle de la majorité des sites d'épissage régulés de l'ARN du VIH. L'action de cette protéine sur plusieurs des sites d'épissage montre que la protéine hnRNP K est probablement un régulateur général de l'épissage de VIH-1 / HIV-1 pre-mRNA splicing depends upon 4 donor and 8 acceptor sites, which are used in combination to produce more than 40 different mRNAs. To further characterize nuclear factors involved in these processes, we purified RNP complexes formed by incubation of SLS2-A7 transcripts in HeLa cell nuclear extracts by affinity chromatography to identify new associated proteins. We showed that, in addition to the well known hnRNP A1 inhibitor of site A7, nucleolin, hnRNP H and hnRNP K interact directly with SLS2-A7 RNA. We demonstrated that hnRNP K has multiple binding sites in the vicinity of site A7 and that binds cooperatively to hnRNP A1 to the A7 RNA region and limits the A7 utilization in vitro. As hnRNP A1 is a negative regulator of several HIV-1 splicing sites (A1, A2, A3), we tested whether hnRNP K may also reinforce hnRNP A1 inhibition at these sites. Surprisingly, hnRNP K activated in vitro splicing of the D1-A1, D1-A2 and D1-A3 introns. Interestingly, hnRNP K was found to reinforce strongly the ASF/SF2 activity at site A2, which indicates that depending on the splicing site hnRNP K can be a splicing activator or inhibitor. To test how hnRNP K influences the relative utilization of HIV-1 splicing sites in cellulo, we used plasmid p PSP containing all the HIV-1 splicing sites and tested the effect of over-expression in HeLa cells on alternative splicing of the PSP RNA. Doubling the amount of hnRNP K in HeLa cells led to a drastic change of the PSP RNA alternative splicing, which confirms the strong influence of hnRNP K on alternative splicing. Moreover, increase of cellular concentration of hnRNP K strongly decrease the viral Nef protein production. hnRNP K protein affects A7 splicing regulation but also regulates the majority of regulated splicing sites of HIV. By extension of the study of hnRNP K effect to other HIV-1 splicing sites, we discovered that hnRNP K is a general regulator of HIV-1 splicing

La protéine Tat du VIH-1 est essentielle à la multiplication virale. Elle permet la transactivation de la transcription et, par ses propriétés apoptotiques, elle participe à la pathologie SIDA. D'où l'importance d'étudier les mécanismes régulant sa production. L'épissage alternatif de l'ARN du VIH-1, en particulier, l'utilisation des sites accepteurs d'épissage A3 et A7 est nécessaire pour la production des ARNm tat. L'utilisation du site A3 est fortement régulée par des éléments agissant en cis contenus dans une structure tige-boucle SLS3A3 située en aval du site A3. En purifiant les complexes RNP formés en extrait nucléaire sur un segment de l'ARN viral renfermant le site A3, et en analysant par spectrométrie de masse les protéines contenues dans ces complexes, nous avons pu mettre en évidence la fixation d'une protéine inhibitrice de l'utilisation du site A3, la protéine DAZAP1. Sur la base d'un ensemble de données antérieures du laboratoire et de nouvelles données que j'ai obtenues, nous avons montré que la protéine SRSF7, sans doute en synergie avec SRSF1, limite la fixation de DAZAP1 et active l'épissage au site A3. Nous avons aussi montré que la protéine virale Tat exerce un rétro-contrôle négatif au niveau de la production de l?ARNm tat, ceci en limitant l'activation du site A3 par SRSF7. La partie apicale de la structure tige-boucle SLS3A3 (motif B) est très conservée dans les souches de VIH-1. L'équipe d'E Guittet a déterminé sa structure 3D par RMN. La conformation de sa boucle terminale est caractéristique des structures tige-boucle reconnues par les protéines à domaines dsRBD (double stranded RNA Binding Domain). J'ai pu confirmer cette hypothèse en purifiant les complexes formés par le motif B en extrait nucléaire. Nous avons ainsi pu montrer que la protéine kinase PKR, qui joue chez l'Homme un rôle majeur dans la réponse à une infection virale, est un partenaire du motif B. Par utilisation de sondes chimiques de la structure 2D de l'ARN, j'ai pu montrer que la structure tige-boucle SLS3A3, contenant le codon d'initiation de l'ORF Tat, est présente dans l'ARNm tat1. Nous avons alors développé un système visant à étudier les mécanismes de régulation de l'initiation de la traduction de la protéine Tat. Par l'emploi d'une construction bicistronique, j'ai pu confirmer l'existence d'une activité IRES dans la région 5'UTRtat1 de l'ARNm tat1 et définir deux segments ayant cette activité. Des résultats préliminaires obtenus avec une construction bicistronique, nous ont permis de commencer à tester l'effet de différentes protéines SR et hnRNP sur l'activité de ces IRES / HIV-1 Tat protein is essential for viral replication. It allows the transcription of full-length viral RNAs, and due to its apoptotic properties it contributes to the AIDS disease. Hence, it is important to study the mechanisms regulating its production. Alternative splicing of the HIV-1 RNA, in particular, the use of acceptor sites A3 and A7 is required for tat mRNA production. Splicing at site A3 is highly regulated by cis-acting elements contained in a stem-loop structure SLS3A3, located downstream from site A3. By purifying RNP complexes formed in nuclear extract on a segment of the viral RNA containing site A3 followed by mass spectrometry analysis, we were able to highlight the binding of a new inhibitory protein, DAZAP1. Based on a set of ancient laboratory data and new results that I obtained, we have shown that SRSF7 protein, probably in synergy with SRSF1, limits the binding of DAZAP1 and splicing activation at site A3. We also showed that the viral protein Tat exerts a negative feedback control on tat mRNA production by restricting splicing activation of site A3 by SRSF7. The apical part of the stem-loop structure SLS3A3 (B motif) is highly conserved among HIV-1 strains. E Guittet team determined its 3D structure by NMR. The conformation of this apical loop is characteristic of stem-loop structures recognized by dsRBD proteins (double-stranded RNA binding domain). I was able to confirm this hypothesis by purifying RNP complexes formed by the B motif in nuclear extract. Thus, we have shown that the RNA dependent protein kinase (PKR), which plays in humans a major role in response to viral infection, is a partner of the B motif. By using chemical probes specific of the 2D structure of RNAs, I showed that the stem-loop structure SLS3A3 that contains the initiation codon of Tat is present in tat1 mRNA. We then developed a system to study the mechanisms regulating the initiation of translation of Tat protein. By using a bicistronic construct, I was able to confirm the existence of IRES activity in the 5?UTRtat1 region of tat1 mRNA, and define two segments that contain this activity. Preliminary results obtained with a bicistronic construct allowed us to begin testing the effect of different SR and hnRNP proteins on the activity of the IRES

L’avènement des multi-thérapies antirétrovirales a permis une réduction importante de la mortalité associée au VIH en induisant notamment la chute de la charge virale à moins de 50 copies/mL et une récupération progressive du nombre de lymphocytes T CD4+ (LT-CD4). Cependant, certains patients définis comme mauvais répondeurs immunologiques (MRI) ne parviennent pas à récupérer un taux de CD4 généralement considéré comme « protecteur » (>500cellules/µL). L’interleukine-7 (IL-7), cytokine essentielle à la thymopoïèse et à l’homéostasie lymphocytaire T, a été utilisée en étude clinique afin de restaurer et maintenir le taux de LT-CD4 chez les patients MRI. La première partie de mon travail de thèse visait à évaluer l’impact d’une telle thérapie sur le réservoir viral circulant. Dans l’essai clinique sur lequel nous avons travaillé (INSPIRE 3, Cytheris), des cycles d’administration d’IL-7 ont induit une augmentation significative du nombre de LT-CD4 et CD8 circulants, avec une expansion majoritaire des populations naïves et centrales mémoires. Nous avons montré qu’un cycle d’injections d’IL-7 induisait une augmentation significative de la quantité de cellules infectées circulantes 28 jours et 3 mois post-injection. Cependant, malgré l’accroissement de la fréquence de LT-CD4 infectés 28 jours post-injection, nous avons observé une diminution significative de la charge virale ADN par million de LT-CD4 chez la majorité des patients 3 mois après l’initiation de la thérapie, suggérant une élimination partielle de cellules infectées. Suite au second cycle d’injections, nous n’avons pas observé d’évolution de la quantité de cellules infectées circulantes ni de la fréquence de LT-CD4 infectés, suggérant un impact différent des 2 cycles d’injections sur la dynamique du réservoir viral périphérique. Enfin, certains patients ayant développé des anticorps neutralisants anti-IL-7 (Nab) suite au second cycle d’injections d’IL-7, nous avons cherché à identifier des facteurs prédictifs de l’apparition de ces anticorps ainsi que leurs conséquences physiologiques in vivo. Le seul paramètre caractérisant ces patients est l’amplitude de la reconstitution T-CD4 au cours du premier cycle d’injections d’IL-7. Il semble donc qu’une meilleure réponse à l’IL-7 ait pour conséquence de faciliter le développement de la réponse immune contre cette cytokine. Cependant, ces anticorps ne sont détectables que de façon transitoire chez les patients. De plus, nous avons observé une diminution significative, mais transitoire, de la prolifération des thymocytes chez les patients présentant des Nab, démontrant un impact fonctionnel de ces anticorps sur l’activité biologique de l’IL-7 endogène. L’injection systémique d’IL-7 induit la migration des cellules circulantes vers différents compartiments tissulaires lymphoïdes et non lymphoïdes. Dans une seconde partie de mon travail de thèse, j’ai étudié le pouvoir adjuvant de cette cytokine administrée localement par pulvérisation à la surface de la muqueuse vaginale. Dans le modèle macaque rhésus, nous avons mis en évidence une augmentation de la production d’un large spectre de chimiokines dans le chorion et l’épithélium vaginal des animaux 48 heures après l’administration vaginale d’IL-7. Cette surexpression de chimiokines s’accompagne d’une migration massive de LT-CD4, CD8, macrophages, cellules dendritiques et cellules NK dans cette muqueuse, suggérant l’augmentation de la vigilance immunologique. L’effet adjuvant de cette cytokine a été confirmé par l’analyse de la réponse humorale muqueuse de macaques vaccinés par pulvérisation vaginale d’antigènes 48h après l’administration du spray d’IL-7. Dans les lavages cervicovaginaux (CVL) des animaux traités à l’IL-7, nous avons mis en évidence des réponses spécifiques de type IgA et IgG plus rapides, plus fortes et plus durables que chez les animaux contrôles, démontrant la capacité de l’IL-7 à préparer la muqueuse vaginale à répondre à une stimulation antigénique locale. / Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) has led to significant reduction of HIV-associated mortality by maintaining an undetectable viral load and inducing progressive CD4-T cell restoration. However, some patients, defined as poor immunological responders (PIR), fail to restore their CD4 counts to 500cells/µL during treatment, a threshold considered as the protective against AIDS related or non AIDS related malignancies, opportunistic infections and cardiovascular events. Interleukin-7 (IL-7), an essential cytokine for thymopoïesis and T cell homeostasis has been used in clinical trials aimed at restoring and maintaining CD4 counts in PIR patients. The first part of my thesis project aimed at assessing the impact of IL-7 therapy on circulating HIV reservoir. In the clinical study we worked on (INSPIRE 3, Cytheris), cycles of IL-7 injections led to a significant increase of the number of circulating CD4 and CD8 T-cells, with a predominance of naïve and central memory T cell expansion. We have shown that one cycle of IL-7 injections induced a significant increase in the number of circulating infected cells 28 days and 3 months post-injections. However, despite a significant increase in the frequency of infected CD4 T-cells 28 days post-injections, we observed a significant decrease of HIV-DNA load in CD4 T-cells in the majority of patients 3 months after the therapy initiation. These data suggest a partial elimination of HIV infected cells. After the second cycle of IL-7 injections, we did not observed any change in the number or frequency of circulating infected cells, suggesting a differential impact of the two IL-7 injection cycles on the dynamics of circulating HIV-reservoir. Finally, considering that some patients developed anti-IL-7 neutralizing antibodies (Nab) after the second cycle of IL-7 injections, we looked for predictive factors of this immunogenicity and analyzed its physiological consequences in vivo. The only parameter that distinguished Nab and non-Nab patients was the extent of CD4 T-cell reconstitution during the first cycle of therapy. This suggests that a better response to IL-7 also facilitates the development of auto-antibodies to the cytokine. However, these antibodies were only transiently detectable after the second cycle of therapy. Moreover, the appearance of Nab was associated with a significant but transient decrease of thymocyte proliferation, suggesting a functional impact of these antibodies on the endogenous IL-7 function. Systemic injection of IL-7 induces circulating T cells homing from the blood into lymphoid and non-lymphoid tissues. In the second part of my thesis project, I evaluated whether this cytokine could be used as an adjuvant when sprayed on the vaginal mucosa. Ten micrograms of IL-7 directly sprayed in the vaginal tract of rhesus monkeys induced, 48h after administration, the production of a large pattern of chemokines in the vaginal chorion and epithelium. This chemokine expression was accompanied by massive homing of CD4 and CD8-T cells, macrophages, dendritic cells and NK cells in the vaginal mucosa, suggesting an increased immunological vigilance. Finally, the adjuvant potential of this cytokine was confirmed by analyzing local humoral immune response after vaginal administration of antigens 48h following IL-7 spray. In cervicovaginal washes (CVL) of treated animals, we observed a faster, stronger and longer-lasting specific IgA and IgG response than in control animals, highlighting the capacity of IL-7 to prepare the vaginal mucosa response to local antigen stimulation.

Les cellules dendritiques (DCs) détectent les particules virales et présentent les antigènes viraux afin d’organiser la réponse immunitaire. La réplication virale dans les DCs induit une réponse immune cytosolique. Comment les DCs tolèrent les virus afin de maintenir leur intégrité fonctionnelle est inconnu. Les DCs sont organisées en sous-populations distinctes d’un point de vue ontogénique. Nous avons observé que le virus du VIH et de la grippe infectaient préférentiellement les DCs CD1c+ par rapport au DCs CD141+ et aux pDCs. La réplication de ces virus au sein des DCs CD1c+ est essentielle afin d’établir une activation efficace des lymphocytes T CD8+ et d’assurer une détection cytosolique. Les DCs CD141+ et les pDCs, quant à elles, répondent aux virus exogènes. L’étape de fusion virale virale est constitutivement réduite dans les DCs CD141+ et les pDCs en comparaison des DCs CD1c+. La petite GTPase RAB15 est exprimée sélectivement dans les DCs CD141+ et les pDCs et contribue à la résistance de ces deux sous-populations de DCs au VIH et à la grippe. La résistance sélective des sous-populations de DC à l’infection virale pourrait représenter un mécanisme de tolérance afin d’augmenter la réponse antivirale. / Dendritic cells (DCs) sense viral particles and present viral antigens to induce immune responses. Viruses also replicate in DCs, engaging cytosolic immune responses. How DCs tolerate viruses to ensure functional integrity is unknown. DCs are developmentally organized in distinct subsets. We find that HIV and influenza preferentially infect CD1c+ DCs over CD141+ DCs and pDCs. Replication in CD1c+ DCs was essential for efficient CD8+ T cell activation and cytosolic sensing, while CD141+ DCs and pDCs responded to exogenous virus. Viral fusion was constitutively reduced in CD141+ and pDCs compared to CD1c+ DCs. The small GTPase RAB15 expressed selectively in CD141+ and pDCs contributed to the resistance. Selective resistance of DC subset to viral infections may thus represent a tolerance mechanism to maximize antiviral responses.

L’emtricitabine est une molécule centrale dans la stratégie de lutte contre l’infection à VIH. En effet, elle est recommandée en première intention pour le traitement de l’infection chez l’adulte, ainsi que pour la prévention de la transmission de l’infection. Bien que l’emtricitabine soit une molécule clé, elle reste jusqu’à présent peu étudiée. Il est donc primordial d’analyser et de caractériser la pharmacocinétique de l’emtricitabine dans les différentes populations susceptibles d’être exposées à cette molécule. Une approche de population a été utilisée pour réaliser les analyses pharmacocinétiques, nous permettant de décrire la pharmacocinétique avec peu de prélèvements par individu (contraintes éthiques, difficulté de recueil des prélèvements…) et nous permettant d’expliquer la variabilité observée. L’étude rapportant la pharmacocinétique de l’emtricitabine chez l’adulte a mis en évidence une modification du profil cinétique selon l’état de la fonction rénale. Le modèle développé nous a permis d’évaluer les recommandations posologiques actuelles. Afin d’optimiser l’efficacité, la simulation de schémas thérapeutiques alternatifs chez les patients avec une insuffisance rénale modérée a été réalisée. Dans le cadre de la prévention de la transmission mère-enfant, l’étude décrivant la pharmacocinétique de l’emtricitabine chez les femmes enceintes a mis en évidence une modification de la pharmacocinétique au cours de la période gestationnelle. Toutefois, il ne semblait pas nécessaire d’adapter la posologie au cours de la grossesse. La dernière étude a permis d’étudier la pharmacocinétique de l’emtricitabine dans le tractus génital masculin. L’étude de la pénétration dans le compartiment génital est d’un intérêt capital pour le traitement mais aussi pour la prévention de la transmission de l’infection à VIH dans le cadre de la prophylaxie pré-exposition. Notre étude a rapporté une distribution importante de l’emtricitabine dans le tractus génital, avec des concentrations séminales supérieures aux concentrations plasmatiques. / Emtricitabine is a key antiretroviral drug in the strategy to fight against HIV infection. Indeed, emtricitabine is recommended in first-line treatment for HIV infection in adults, as well as for the prevention of HIV transmission. Although emtricitabine is a key molecule, it remains poorly studied until now. It is therefore essential to analyze and characterize the pharmacokinetics of emtricitabine in the different populations that may be exposed to this drug. A population approach was used to perform pharmacokinetic analyses, allowing us to describe the pharmacokinetics with few samples per individual (ethical constraints, difficulty of samples collection...) and allowing us to explain the observed variability. The study reporting emtricitabine pharmacokinetics in adults highlighted a change in emtricitabine kinetic profile depending on the state of renal function. The developed model allowed us to evaluate the current dosing recommendations. To optimize efficiency, simulations of alternative regimens in patients with moderate renal impairment were performed. As part of the prevention of mother to child transmission, the study describing emtricitabine pharmacokinetics in pregnant women showed a change in pharmacokinetics during the gestational period. However, it did not seem necessary to adjust the dosage during pregnancy. The latest work focused on emtricitabine pharmacokinetics in the male genital tract. Studying the penetration in the genital tract is of major interest for treatment but also for prevention of HIV transmission in the context of pre-exposure prophylaxis. Our study reported a significant distribution of emtricitabine in the genital compartment, with concentrations in seminal plasma higher than concentrations in blood plasma.

L'ARN génomique du Virus de l'Immunodéficience Humaine-1 (VIH-1) est multifonctionnel. Il constitue le génome encapsidé dans les virions et sert d'ARN messager pour la traduction des protéines virales Gag et Gag-Pol. La traduction de ces protéines dépend exclusivement de la machinerie traductionnelle cellulaire et est initiée par deux mécanismes différents : l'initiation canonique dépendante de la coiffe et l'initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Le VIH-1 présente deux IRES, l'un dans la région 5' non traduite (5'-UTR) qui est stimulé en phase G2/M du cycle cellulaire et l'autre dans la région codante de Gag. Ce dernier permet l'initiation de la traduction sur deux AUG en phase et conduit à la production de la protéine Gag pleine longueur mais également à la production d'une isoforme alternative de Gag, tronquée en région N-terminale. Le rôle de cette isoforme reste mal connu. Toutefois la mutation du second AUG chez VIH-1 et donc la suppression de la seconde isoforme de Gag provoque une diminution importante du taux de la réplication virale. La conservation structurelle et fonctionnelle de l'IRES Gag parmi les lentivirus suggère un rôle important de cette isoforme et de l'IRES gag dans le cycle viral. Nos travaux visent à comprendre à un niveau moléculaire les relations hôtes-pathogènes lors de la traduction des messagers viraux. Je me suis particulièrement intéressée aux rôles de la sous unité ribosomale 40S et de l'hélicase cellulaire DDX3 dans l'initiation de la traduction de la polyprotéine Gag du VIH-1. La première partie de ma thèse est consacrée à l'étude de l'interaction entre la sous unité ribosomale 40S et l'IRES gag du VIH-1. Par l'utilisation d'approches complémentaires, nous avons pu démontrer la présence de deux sites distincts de liaison au ribosome qui sont présents à proximité des deux codons d'initiation. Nous avons ensuite évalué à la fois in vitro et in cellulo (en collaboration avec l'équipe de T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon) l'effet de la délétion de chacun des sites de liaison au 40S sur l'efficacité de traduction de la polyprotéine Gag. Nos résultats valident l'importance fonctionnelle des sites de liaison au ribosome pour une production optimale des deux isoformes de la polyprotéine Gag. La seconde partie de mon travail a consisté à définir le rôle de DDX3 dans l'initiation « coiffe-dépendante » de la traduction de la polyprotéine Gag. DDX3 est une hélicase à ARN à boîte DEAD impliquée dans de nombreux processus cellulaires tels que la régulation du cycle cellulaire et la réponse immunitaire innée mais également dans tous les aspects du métabolisme de l'ARN comme la transcription, l'épissage, l'export nucléaire ou encore la traduction. Plus récemment, il a été montré que DDX3 est nécessaire à la traduction de l'ARN génomique du VIH-1, cependant son rôle exact n'a pas encore été défini. Nous avons purifié une forme recombinante de la protéine en fusion avec la MBP (Maltose Binding Protein) et effectué des cinétiques enzymatiques afin de caractériser ses propriétés biochimiques. Contrairement à ce qui a été précédemment décrit, nos résultats montrent que DDX3 possède une activité ATPase strictement ARN-dépendante avec des constantes cinétiques similaires à celles de son homologue chez la levure, Ded1p. Nous avons également évalué l'activité hélicase de la protéine en présence de substrats de longueur et de nature variables (duplex ARN/ARN ou des hétéroduplex ADN/ARN). D'un point de vue fonctionnel, nous avons réalisé une première série d'expériences qui confirme la stimulation exercée par DDX3 sur la traduction de Gag in vitro. Ces résultats permettent d'envisager la caractérisation biochimique fine des interactions DDX3-ARN viral ainsi que de disséquer le rôle de DDX3 dans l'expression du génome viral. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) genomic RNA is multifunctional. It acts both as a genome that is packaged within virions and as messenger RNA translated to yield the Gag and Gag-Pol polyproteins. The translation of these proteins relies exclusively on the cellular translation machinery and is initiated through two mechanisms: the canonical cap-dependent initiation pathway and the use of internal ribosome entry sites (IRESes). HIV-1 has two IRESes, one located within the 5' UTR (5' UnTranslated Region) that is stimulated during the G2/M phase of the cell cycle, and the other embedded within the Gag polyprotein coding region. The later drives translation initiation from two AUG in frame and results in the production of the full-length Gag protein but also of an additional N-terminally truncated Gag isoform. Few things are known about this isoform, but the mutation of the second AUG causes a significant decrease in the rate of viral replication. The structural and functional conservation of Gag IRES among lentiviruses suggests an important role of this isoform and thus of the IRES in the viral cycle. Our work aims to understand at a molecular level the host-pathogen relationships in the translation of the viral messenger RNA. My work focused on the roles of the 40S ribosomal subunit and of the cellular helicase DDX3 in the translation initiation of Gag. During the first part of my Phd, I studied the interaction between the 40S ribosomal subunit and HIV-1Gag IRES. Following complementary approaches, we evidenced two distinct ribosome binding sites present close to the two the initiation sites of Gag. Then, we evaluated the effect of each 40S binding site deletion on Gag translation efficiency, both in vitro and in cellulo (in collaboration with the team of T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon). Taken together, our results confirm the functional relevance of the two ribosomal binding sites to ensure optimal production of the two Gag isoforms. The second part of my Phd project aims to define the role of DDX3 in the translation initiation of Gag. DDX3 is a RNA DEAD-box helicase involved in many cellular processes such as cell cycle regulation and the innate immune response but also in all aspects of RNA metabolism such as transcription, splicing, mRNA nuclear export and translation. Recently DDX3 has been shown to favor HIV-1 Gag translation. To define its role, we first purified a recombinant form of the protein and performed kinetic experiments to analyze its biochemical properties. Contrary to what has been previously described, MBP-DDX3 displays a strictly RNA-dependent ATPase activity with kinetic constants similar to those displayed by its yeast counterpart Ded1p. We next evaluated MBP-DDX3 helicase activity towards RNA duplexes or RNA/DNA hybrids, with different length and single strand overhangs. Our preliminary results indicate that DDX3 alone is sufficient to enhance Gag translation in our in vitro system which paves the way to fine biochemistry experiments such as reconstruction of functional initiation complexes assembled onto Gag RNA and evaluation of its role on Gag RNA structure.

Les macrophages sont une cible particulièrement importante de l’infection par le VIH-1 et jouent un rôle crucial dans la physiopathologie de l’infection. Lorsqu’ils sont infectés, leur capacité de survie dans les tissus leur permet de jouer un rôle essentiel dans la dissémination virale et l’établissement de réservoirs viraux au niveau des différents territoires tissulaires. In vitro, les étapes précoces et tardives du cycle de réplication virale dans les macrophages ont été analysées dans le cadre de l’infection par des virus libres. Cependant, les modalités d’infection des macrophages lors d’une transmission intercellulaire reste largement inexplorées. Les travaux présentés ici ont permis d’établir un modèle de transmission intercellulaire du VIH-1 de lymphocytes T infectés vers les macrophages. Nous avons montré que les lymphocytes T infectés sont capables d’interagir étroitement avec les macrophages, conduisant ainsi à la fusion cellulaire de ces deux cellules et permettant le transfert de matériel viral dans les macrophages cibles. Ce transfert viral par fusion cellulaire, rapide et efficace, est restreint aux virus utilisant le corécepteur CCR5 et dépend de l’interaction entre l’enveloppe virale et le récepteur CD4. Les virus transférés sont alors stockés au sein de compartiment cytoplasmique des cellules fusionnées mais nous observons également des évènements précoces d’assemblage et de bourgeonnement du VIH-1 à la membrane plasmique des cellules fusionnées résultant de la fusion des membranes des lymphocytes T infectés et des macrophages cibles. Ces cellules fusionnées acquièrent alors la capacité de fusionner avec les macrophages non infectés environnants permettant la dissémination du VIH-1. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de transmission intercellulaire entre lymphocytes T et macrophages via un mécanisme de double fusion cellulaire dépendant de l’enveloppe virale et des récepteurs CD4 et CCR5. Ces évènements successifs de fusion entre lymphocytes T et macrophages puis entre macrophages permettent la formation de cellules géantes multinucléés capables de produire de grande quantité de virus infectieux. Ces cellules multinculées pourraient correspondre aux macrophages multinuclées observés in vivo dans les organes lymphoïdes et le système nerveux central de patients infectés par le VIH-1 ou de singes infectés par le SIV. Ce mécanisme représente donc un modèle de transmission intercellulaire original permettant la dissémination virale et la formation de macrophages réservoirs durant l’infection par le VIH-1. / Macrophages are important targets of HIV-1 and play crucial roles in physiopathology of infection. Because of their long time survival capacity, infected macrophages participate in virus dissemination and establishment of persistent virus reservoirs in numerous tissues. In vitro, macrophages infection and analysis of the different steps of the virus cycle have been largely documented using cell-free virus infection. However, there is a paucity in knowledge of the mechanisms that control infection and dissemination to macrophages by cell-to-cell transfer. In the work presented here, we establish a model of HIV-1 cell-to-cell transfer from infected T cells to macrophages. We observed that infected T cells are able to interact with macrophages leading to cell fusion for transfer of viral material to macrophages targets. This cell-to-cell fusion transfer, very fast and efficient, is restricted to CCR5-tropic viruses, and mediated by viral envelope-receptor interactions. Transferred viruses can then accumulate in cytoplasmic compartments of newly lymphocyte/macrophages fused cells but we also observed early viral assembly and budding events at the plasma membrane of these fused cells, resulting from the merge of viral material between infected T cells and macrophages. These cells then acquire the ability to fuse with neighboring non-infected macrophages for virus dissemination. Together, these two-sequential envelope-dependent cell fusion process lead to the formation of highly virus-productive multinucleated giant cells reminiscent of the infected multinucleated giant macrophages detected in vivo in lymphoid organs and the central nervous system of HIV-1 infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. These mechanisms may represent an original mode of virus transmission for viral spreading and formation of macrophage virus reservoirs during HIV-1 infection.

Les politiques de santé de la mère et de l’enfant qui se succèdent dans les pays du Sud depuis trois décennies sont basées sur une approche quantitative du risque autour de la procréation. Elles induisent une vision homogène des situations vécues par les femmes. Au contraire, l’approche anthropologique définit le risque comme un construit social. Elle considère que les populations évaluent et priorisent les risques qui les concernent de façon pertinente. Notre recherche étudie, à partir de la parole des femmes et de leur expérience, quels risques autour de la procréation les préoccupent, et quelle est la place du risque VIH parmi ces risques.Notre approche s’appuie sur une enquête ethnographique de longue durée au Burkina Faso, à Bobo-Dioulasso et dans sa région. Nous avons réalisé des entretiens formels et informels auprès des femmes, leur entourage et des informateurs clé. Des observations de contexte en milieu urbain et rural complètent le corpus de données.Nos résultats montrent une forme de banalisation du risque de VIH/sida dans ses aspects biocliniques. Néanmoins, bien que moins visible, la stigmatisation persiste, la maladie constituant toujours une menace dans sa dimension sociale. Analysant les conditions de vie et de travail des femmes pauvres, nos résultats mettent en évidence une exposition au risque articulé au travail féminin, en zone rurale et en ville. Ils montrent précisément le risque lié à l’usage courant et intensif des pesticides qui inquiète particulièrement les femmes. De plus, notre recherche montre comment le système de santé constitue une menace de l’avis des femmes. Cette perception du risque inhérent aux soins s’inscrit dans un contexte plus large de « crise de confiance », à l’égard du système de soins qui crée des « mal traitances », notamment chez les femmes pendant leur grossesse.Cette recherche doctorale rend visible au Burkina Faso des risques perçus par les femmes négligés et « non calculés » par le système de soins. Elle participe à l’inscription des risques liés à l’environnement et aux conditions de travail informel comme des problèmes majeurs de santé publique qui affectent la mère et l’enfant en Afrique de l’Ouest. / Successive Maternal and Child Health policies during last three decades in the Global South were based on a quantitative approach to reproductive risk, with a homogeneous vision of women's life experiences. On the contrary, the anthropological approach defines risk as a social construction and considers that populations assess and prioritize their exposure risks in a relevant manner.Our approach is based on a long-term ethnographic study in Bobo-Dioulasso (Burkina Faso) and its environment. We conducted formal and informal interviews with women, their families and key informants. Contextual observations in urban and rural areas complete the data set.Our results show a form of trivialization of HIV/AIDS risk in its bioclinical aspects. However, although less visible, stigma is persisting, and the social dimension of disease are still a threat. Our research describes the living and working conditions of poor women. It highlights their exposure to risk related to women's work in both rural areas and cities. It specifically examines the risk associated with the current intensive use of pesticides, which particularly concern women.In addition, our research shows how women perceive the healthcare system as a threat. This perception of risk related to care is part of a broader context of « crisis of confidence » in the health care system that creates « mistreatments », especially among pregnant women.This doctoral research reveals the neglected and « not quantified » risks perceived by women. It contributes to the recognition of environment related risks and informal working conditions as major public health problems affecting mothers and children in West Africa.

La crise du sida n'est pas derrière nous, même si l'incendie semble éteint, les cendres elles, restent. Premièrement, parce que l'épidémie n'est nullement endiguée, mais aussi parce que nous continuons d'être hantés par les représentations, les discours, les constructions et les significations que cette pandémie transporte avec elle. Le sida est un phénomène complexe, tenter de le comprendre, c'est faire face en premier lieu à des séries de mots, d'images médiatiquement puissantes qui supplantent d'autres réalités. Pour parvenir à percer cette pandémie, il faut pouvoir en étudier tous les aspects, et parmi ces facettes, l'art a joué un rôle prépondérant dans la crise du sida, notamment parce qu'il a été particulièrement utilisé pour signifier une partie de ces autres réalités cachées. Dans ce travail de recherche, quatre axes se sont dessinés qui parcourent un large spectre des questions posées par le sida et ses représentations, autant, que les enjeux d'expositions, de médiatisation, de discursivité ou encore de significations que cette épidémie contemporaine sans précédent a mis en exergue. Le sida a révélé de nombreux problèmes dans nos sociétés occidentales, sans pour autant qu'ils soient aujourd'hui circonscrits. L'art a joué un rôle majeur dans la prise de conscience durant ces trente-cinq dernières années, en produisant des images et des contres-images. L'art a permis de contre­-représenter une réalité qui de par nos sociétés de pouvoirs nous était tue, il a donné une voix à ce qui reste toujours une épidémie silencieuse et stigmatisante. Représenter (dans) la crise du sida a donc été et est toujours un combat, si ce n'est une forme de guerre culturelle. / The AIDS crisis is not behind us, even if the fire seems to be extinguished, the ashes remain. First, because the epidemic is by no means contained, but also because we continue to be haunted by the representations, discourses, constructions and meanings that this pandemic carries with it. AIDS is a complex phenomenon, trying to understand it, is the deal first with a series of words, images that are media-intensive, which supplant other realities. To achieve to break this pandemic, we must be able to study ail aspects, among these facets, art has played a leading role in the AIDS crisis, especially because it has been particularly used to signify those other hidden realities. ln this research, four axes have emerged that cover a broad spectrum of questions posed by AIDS and its representations, as much as the stakes of exhibitions, media coverage, discursivity or meanings that this unprecedented contemporary epidemic has highlighted. AIDS revealed many problems in our Western societies, without, however, being circumscribed by now. Art has played a major role in raising awareness over the past thirty-five years by making images and counters-images. Art has allowed to counter-represent a realité which through our societies of power, was silent to us, it gave a voice to what always remains a silent and stigmatizing epidemic. Representing (in) the AIDS crisis has therefore been and still is a struggle, if not a form of cultural war.

La investigación plantea la reconstrucción de las trayectorias de enfermedad y atención de cuatro mujeres trans fallecidas en Lima, con el objetivo de indagar sobre los factores sociales y culturales en juego, el cuidado recibido y las narrativas elaboradas en torno a sus fallecimientos. Los fallecimientos se produjeron a causa de enfermedades producto de la infección por VIH, las cuales se desarrollaron en un contexto de soledad, ocultamiento y sin acceso a atención médica especializada. Desde el marco teórico que ofrece la antropología médica crítica y los estudios sobre sufrimiento social, el estudio explica por un lado, el impacto de las inequidades sociales y los procesos de estigmatización en el cuidado que recibieron las mujeres trans fallecidas. Por otro lado, a partir de las narrativas elaboradas por las redes de cuidado alrededor del deceso, nos aproximamos al marco moral desde donde las entrevistadas interpretan y valoran sus experiencias de adversidad vinculadas a su vulnerabilidad al VIH/Sida y a la exclusión. El riesgo al VIH/Sida y la responsabilidad individual en el cuidado de la salud, son ejes narrativos a partir de los cuales explican lo sucedido y mediante los cuales se posicionan y diferencian activamente frente a una idea de colectivo. / Tesis