Le développement d'un traitement curatif du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est devenu le défi majeur pour le futur mais les réservoirs et une réponse immunitaire insuffisamment efficace constituent des barrières pour l’élimination du virus. La réponse immune contre l’infection VIH dépend en partie de la capacité des cellules hôtes à présenter correctement les épitopes viraux pour induire une réponse spécifique des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL). Cette présentation des épitopes viraux qui pourrait être optimisée par vaccination, dépend du système HLA (Human Leukocyte Antigen) du patient présentant un déterminisme génétique individuel. Correctement pré-stimulés, les CD8 cibleraient et détruiraient efficacement les cellules productrices du virus. Les précédents essais vaccinaux stimulant la réponse CTL n’ont pas montré d’efficacité dans la réponse virologique, probablement parce qu’ils sont composés d’épitopes "génériques" et qu’ils ne prennent pas en compte la variabilité du VIH ni l’immunogénétique des patients.L’objectif de ce travail est d’identifier des épitopes archivés dans l’ADN proviral, susceptibles d’induire une réponse CTL en considérant la variabilité du VIH-1 et la variabilité immunogénétique des patients infectés par le VIH-1 en succès thérapeutique. L’idée, à terme, est d’utiliser les peptides correspondants comme base de vaccin thérapeutique et de permettre au système immunitaire de prendre le relai du traitement antirétroviral pour contrôler l’infection virale.Cent quarante patients infectés par le VIH-1, suivis au CHU de Bordeaux en succès thérapeutique depuis plus de 6 mois ont été inclus dans le projet Provir/Latitude 45 entre 2012 et 2017. Une cartographie de la répartition des sous-types viraux du VIH-1 en Aquitaine a d’abord été réalisée. L’analyse de plus de 3200 génotypes de résistance VIH-1 effectués entre 2012 et 2016 a permis de déterminer que le sous-type viral majoritaire infectant les patients vivants avec le VIH dans la région est le sous-type B, suivi du CRF02_AG qui est majoritaire parmi les sous-types viraux non B. Si l’on se focalise sur les patients inclus dans ce projet on retrouve des répartitions similaires. Suite à cette première analyse, un nouveau virus recombinant composé de CRF06_cpx et de sous-type B a pu être identifié. Il est référencé en tant que CRF98_cpx. Un des patients inclus au sein du projet est d’ailleurs infecté par ce virus. Afin d’identifier des épitopes candidats pouvant servir de base à un vaccin thérapeutique pour l’ensemble de la population ou pour un groupe de la population en fonction de leurs caractéristiques immunogénétiques, nous avons combiné les données des séquences virales avec le typage HLA des patients afin de prédire in silico l’affinité entre un HLA et un peptide via les algorithmes d’IEDB. Pour automatiser l’analyse des données, un logiciel, TutuGenetics, a été développé. Ce logiciel instrumentalise les algorithmes d’IEDB et permet d’étudier la variabilité de la présentation des épitopes par les différents HLA du patient grâce à un score MHC IC50 déterminé pour chaque couple HLA-séquence virale. Ce logiciel a été validé en comparant l’analyse des données issues du séquençage Next Generation Sequencing avec le séquençage Sanger. Finalement, pour les 140 patients inclus dans le projet Provir, TutuGenetics a effectué un découpage des séquences virales par pas de 8 à 10 acides aminés et les valeurs MHC IC50 ont été définies pour toutes les combinaisons HLA-épitope. Une analyse plus fine nous a ensuite permis de déterminer une liste de 15 épitopes avec une forte affinité in silico pour les HLA majoritaires finalement retenue pour une cocktail vaccinal.Ces données in silico vont dans une prochaine phase être confirmées in vitro via des tests d’immunologie fonctionnelle, puis in vivo chez le macaque. / HIV (Human Immunodeficiency Virus) cure is the major challenge of the future but latent reservoir and inefficient immune response do not allow virus elimination. The immune response against HIV infection depends on host cells ability to correctly present viral epitopes to induce specific cytotoxic CD8+ T lymphocytes (CTL) response. This presentation of viral epitopes which could be improved by vaccination depends on the HLA (Human Leukocyte Antigen) system of the patient which is extremely variable. Accurately pre-stimulated, CTL would target and destroy efficiently virus-producing cells. Previous vaccine trials stimulating CTL response haven’t shown efficient virological response, presumably because epitopes used are generic without taking into account HIV-1 or patient’ immunogenetic variability.The aim of this work is to identify epitopes archived in the proviral DNA, considered to induce CTL response according to the HIV-1 and immunogenetic variability of the patients at therapeutic success. The goal is to use these peptides for a therapeutic vaccine and educate the immune system to control the viral replication without any antiretroviral treatment.One hundred and forty patients infected with HIV-1, followed at the University Hospital of Bordeaux, at therapeutic success for more than 6 months have been included in the Provir/Latitude 45 project between 2012 and 2017. A mapping of the distribution of viral subtypes of HIV-1 in Aquitaine was first performed. Analysis of more than 3200 HIV-1 genotypes conducted from 2012 to 2016 determined that the major viral subtype infecting patients living with HIV in the region is subtype B, followed by CRF02_AG which is predominant among the non-B viral subtypes. Focusing on the patients included in this project led us to find similar distributions. Following this initial analysis, a new recombinant virus composed of CRF06_cpx and subtype B could be identified. It is now referenced as CRF98_cpx. One of the patients included in the project is infected with this virus. In order to identify candidate epitopes that can serve as a therapeutic vaccine for the entire population or for a population group based on their immunogenetic characteristics, we combined the viral sequence data with the HLA typing of patients to predict the affinity in silico between an HLA and a peptide via IEDB algorithms. To automate data analysis, a software package, TutuGenetics, has been developed. This software exploits IEDB algorithms and makes it possible to study the variability of the presentation of epitopes by the different HLAs of the patient thanks to an MHC IC50 score determined for each HLA-viral sequence pair. This software has been validated by comparing the analysis of data from Next Generation Sequencing (NGS) with Sanger sequencing. Finally, for 140 patients included in the Provir project, TutuGenetics sliced the viral sequences in steps of 8 to 10 amino acids and MHC IC50 values were defined for all HLA-epitope combinations. A finer analysis allowed us to determine a list of 15 epitopes with high in silico affinity for major HLAs. These epitopes were selected by applying different filters and only HLA-peptide couples with more than 10 patients sequenced per position and by HLA were kept in this "Optimal_Provir" list.These in silico data will in a next phase be confirmed in vitro via functional immunology tests, then in vivo in macaques.

Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires de la membrane plasmique qui forment un réseau d'interactions protéiques, appelé "Tetraspanin Web", entre tétraspanines ou avec d'autres protéines partenaires. Elles ont également la capacité de s'organiser en microdomaines membranaires appelés TEM (Tetraspanin-Enriched Microdomains). Ces protéines sont impliquées dans plusieurs mécanismes cellulaires et associées à de nombreuses pathologies. La diversité de leurs interacteurs reflète la pléiotropie de leurs fonctions.. Entre autres, elles jouent un rôle déterminant au cours des processus infectieux et notamment lors du bourgeonnement du VIH-1. Des études récentes menées au laboratoire ont plus particulièrement démontré, à l’échelle de la molécule unique, que les tétraspanines CD9 et CD81 étaient spécifiquement recrutées au niveau des sites d'assemblage de la protéine virale Gag. Ces travaux ont été faits dans un système modèle de cellules HeLa transfectées par Gag-GFP, dans lesquelles se forment des sites de bourgeonnement de pseudo-particules virales de type VIH-1. Ces observations soulèvent plusieurs questions quant à l’implication des tétraspanines CD9 et CD81 dans le mécanisme d’assemblage du virus, notamment dans le remodelage de la membrane plasmique de la cellule hôte et sa courbure lors du bourgeonnement, deux phénomènes auxquels les tétraspanines sont associées. Dans ce contexte, le principal objectif de ma thèse a été de déterminer l'organisation structurale des sites d'assemblage du VIH-1 en utilisant une nouvelle méthodologie combinant la microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie super résolue de type dSTORM. La microscopie dSTORM fait partie des techniques basées sur la localisation de molécules individuelles et permet de cartographier des protéines fluorescentes avec une résolution latérale inférieure à 50nm tandis que l'AFM permet de déterminer la topographie membranaire avec une résolution du même ordre. La première partie de ma thèse a consisté à construire ce nouveau montage expérimental, en collaboration avec l'équipe de Marcelo Nollmann. Nous avons confirmé en premier lieu que les sites regroupant Gag-GFP corrélaient bien avec des protrusions membranaires caractérisés par AFM Nous avons montré que les tétraspanines CD9 étaient spécifiquement recrutées au niveau de ces sites de bourgeonnement et que leur recrutement corrélait avec le degré de maturation des bourgeons Gag-GFP qui dépend du diamètre et de la hauteur des sites de bourgeonnement. En plus d’une redistribution des tétraspanines au cours du processus d’assemblage des nouveaux virions, nous avons pu observer une déplétion des tétraspanines CD9 et CD81 à la surface des cellules exprimant la protéine virale Gag-GFP. Ces résultats préliminaires révèlent la capacité des protéines virales Gag à modifier spécifiquement l’environnement de la cellule hôte en modulant la répartition et l’expression des tétraspanines au niveau de la membrane plasmique, suggérant un rôle déterminant des tétraspanines au cours de la réplication du virus VIH-1. / Tetraspanins are transmembrane proteins forming a network of protein-protein interactions at the cell surface, called "Tetraspanin Web". They can also be organized into membrane microdomains named « TEMs » for « Tetraspanin Enriched Microdomains ». These domains are involved in many cellular functions and pathologies. The role of tetraspanins during infection has been described early on, notably TEMs are implicated in various aspects of the HIV-1 life cycle, including entry and budding. It has been demonstrated recently, at the single molecule level, that the CD9 and CD81 tetraspanins are specifically recruited by HIV-1 Gag to viral assembly and release sites. These observations raise crucial questions about the role of these two tetraspanins in this process and their implication in membrane remodelling and/or bending during assembly and budding of the viral particles. In this context, the main objective of my PhD thesis was to investigate the structural organization of HIV-1 assembly/budding sites by a combination of two advanced microscopy techniques: atomic force microscopy (AFM) and direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM). AFM provides information on the membrane topography with lateral resolution lower than a 50 nm. A similar resolution can be reached with dSTORM that is suitable to map fluorescently labeled proteins at the single molecule level. Combination of these two techniques allowed us to characterize the distribution of CD9 clusters within HIV-1 budding sites in the membrane topography context. The first task of my PhD was to build this new combo in collaboration with Marcelo Nollmann's group. We then performed AFM imaging of HeLa cells transfected with the viral protein Gag fused to GFP and demonstrated that Gag-GFP assembly sites correlate with membrane protrusions. In addition, by dSTORM imaging of the same region, we have shown that CD9 tetraspanins were enriched and recruited at Gag assembly sites and that their distribution depends on the assembly stage of the virus-like particles imaged with AFM (the dimensions of the budding sites relates to the assembly stage of the viral particles). Finally, we documented that Gag mediated depletion of both CD9 and CD81 tetraspanins from the surface of HeLa transfected cells. These results reveal the impact of the viral protein Gag on the host cell environment by modulating the partition and expression of tetraspanins within the plasma membrane, reinforcing an important role of tetraspanins during HIV-1 life cycle.

Le remodelage de la membrane plasmique de la cellule-hôte est une des stratégies d’évasion immunitaire utilisée par le VIH-1 pour persister chez un hôte. Une des protéines accessoires du VIH-1, la protéine virale U (Vpu), joue un rôle important dans ce processus en régulant négativement l’expression de plusieurs protéines de surface. Lors d’une étude de protéomique quantitative du protéome de la membrane plasmique des cellules T exprimant Vpu de manière inductible, nous avons identifié le cluster de différenciation 47 (CD47) comme une protéine potentiellement ciblée et régulée négativement par Vpu. CD47 est une protéine multifonctionnelle exprimée de manière ubiquitaire et impliquée dans plusieurs processus cellulaires, telle que l’inhibition de la phagocytose via son interaction avec la protéine régulatrice SIRPα (« signal-regulatory protein alpha »), un récepteur principalement exprimé par les cellules myéloïdes, telles que les macrophages. CD47 module aussi l’apoptose caspase-indépendante directement via son engagement induit par la thrombospondine 1 (TSP-1) ou des anticorps monoclonaux anti-CD47 spécifiques. Les macrophages sont des cellules cibles importantes du VIH-1 qui sont infectés depuis les phases initiales de l’infection malgré l’absence des virus macrophage (M)-tropiques. Plusieurs études ont suggéré que l’infection des macrophages pourrait être le résultat de la phagocytose des lymphocytes T CD4+ infectés. Dans ce contexte, nous avons examiné si la régulation négative de CD47 par Vpu durant l’infection de cellules T pouvait favoriser la phagocytose par les macrophages et ainsi contribuer à leur infection. Nous avons initialement confirmé que CD47 est régulée négativement par le VIH-1, de manière Vpu-dépendante en utilisant des souches virales de laboratoire ainsi que des souches transmises/fondatrices (T/F). De plus, la coculture des cellules T infectées avec des macrophages dérivés de monocytes (MDMs) a démontré que la régulation négative de CD47 par Vpu provoque la capture et la phagocytose des cellules T infectées par les MDMs. Bien que les MDMs soient peu susceptibles à l’infection par les virus T/F, des expériences de coculture de MDMs avec des cellules T infectées par un virus T/F ont montré l’infection des MDMs et la relâche de particules infectieuses. Sur le plan du mécanistique, nous avons démontré que la déplétion de CD47 médiée par Vpu nécessite le domaine transmembranaire (TMD) de la protéine, ainsi que les motifs double-sérine (DSGNES, qui permet le recrutement du complexe E3 ubiquitine ligase SCFβTrCP1/2) et de trafic (ExxxLV) de Vpu. En effet, Vpu forme un complexe avec CD47 via son TMD et cible CD47 pour la dégradation lysosomale, ce qui est cohérent avec un mode d’action par lequel Vpu perturbe le trafic et/ou le renouvellement de CD47 à la membrane plasmique. Pour mieux définir les implications fonctionnelles de la régulation négative de CD47 par Vpu, nous avons par la suite évalué si celle-ci a un effet sur l’apoptose. Ainsi, nous avons confirmé que l’anticorps monoclonal anti-CD47 (clone CC2C6) permet d’induire l’engagement de CD47 et provoquer l’apoptose de manière CD47-dépendante. De plus, nous avons démontré que Vpu inhibe la réponse de cellules T infectées à l’apoptose suite à l’engagement de CD47 par l’anticorps CC2C6. L’ensemble de nos résultats souligne une nouvelle fonction de Vpu dans l’infection des macrophages en augmentant la phagocytose de cellules T infectées via un processus qui implique la régulation négative de CD47 à la surface des lymphocytes. Cette découverte permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes régissant la transmission intercellulaire du VIH-1 et l’établissement de l’infection dans les macrophages durant les phases précoces de l’infection, une étape clé favorisant une transmission virale systémique et potentiellement l’établissement de réservoirs viraux persistants. Nos résultats mettent en évidence également un nouveau mécanisme par lequel le VIH-1 module l’apoptose de cellules infectées pour optimiser sa réplication et sa dissémination. Une meilleure connaissance de ces processus est importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutique et vaccinale contre l’infection par le VIH-1. / Remodelling of the host cell plasma membrane is one of the strategies used by HIV to evade host immune responses. One of the accessory proteins of HIV-1, the viral protein U (Vpu), plays a key role in this process by downregulating the expression of several cell-surface molecules. In the context of plasma membrane profiling studies of T cells inducibly-expressing HIV-1 Vpu, we identified the cluster of differentiation 47 (CD47) as a putative target downregulated by Vpu. CD47 is a ubiquitously expressed multifunctional protein involved in many cellular processes, such as inhibition of phagocytosis via its interaction with the signal-regulatory protein alpha (SIRPα), a surface receptor mainly expressed by myeloid cells, such as macrophages. In addition, CD47 modulates caspase-independent apoptosis directly through its ligation induced by thrombospondin 1 (TSP-1) or specific anti-CD47 monoclonal antibodies (mAbs). Macrophages are important targets of HIV-1, they are infected at early stages of infection despites the absence of macrophage (M)-tropic viruses, and several studies suggested that the infection of macrophages might result from phagocytosis of HIV-1-infected CD4+ T lymphocytes. In this context, we investigated whether Vpu-mediated CD47 downregulation during infection of T cells promotes the phagocytosis by macrophages and contributes to their infection. We firstly confirmed that surface CD47 is downregulated by HIV-1, in a Vpu-dependent manner by using either laboratory adapted or transmitted/founder (T/F) strains. Furthermore, cocultures of HIV-1-infected T cells with monocyte-derived macrophages (MDMs) revealed that CD47 downregulation by Vpu promotes capture and phagocytosis of infected T cells by MDMs. Importantly, while MDMs were weakly susceptible to infection by cell-free T/F virus, coculture experiments of MDMs with T/F virus-infected T cells led to infection of MDMs and release of infectious particles. Mechanistically, Vpu-mediated depletion of CD47 was found to require the transmembrane domain (TMD), the SCFβTrCP1/2 E3 ubiquitin ligase-interacting diserine motif (DSGNES), as well as the trafficking motif (ExxxLV) of Vpu. Indeed, Vpu can form a physical complex with CD47 through its TMD and target CD47 for lysosomal degradation, consistent with a mechanism whereby Vpu alters the trafficking and/or turnover of CD47 at the plasma membrane. To better define the functional implications of the Vpu-mediated CD47 downregulation, we subsequently evaluated whether this would regulate apoptosis. We confirmed that anti-CD47 mAb CC2C6 was able to induce CD47 ligation and promote apoptosis in a CD47-dependent manner. Furthermore, we showed that Vpu inhibited the response of HIV-1-infected cells to apoptosis following CD47 ligation induced by CC2C6 mAb. Altogether, our results highlight a novel function of Vpu in promoting infection of macrophages by increasing the phagocytosis of HIV-1-infected T cells through a process that involves downregulation of surface CD47. This finding provides new insights into the mechanisms governing the intercellular transmission of HIV-1 and the establishment of infection in macrophages during early stages of infection, a key step for a systematic viral transmission and potentially the establishment of persistent viral reservoirs. Our results also identify a new mechanism by which HIV-1 modulates apoptosis of infected T cells to optimize its replication and dissemination. A better understanding of these processes is important for developing novel therapeutic and vaccine strategies against HIV-1 infection.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'infection des cellules dendritiques (CDs) thymiques pourraient jouer un rôle dans la pathogénèse associée au virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Il a déjà été démontré que les cellules dendritiques du thymus peuvent être infectées in vitro par le VIH-1 et que cette infection cause le relargage d'un ou de plusieurs facteurs cytotoxiques dans le surnageant. Les objectifs principaux du présent travail sont séparés en 2 catégories. Tout d'abord, nous avons tenté de mieux caractériser l'entrée du virus dans les cellules dendritiques. Nous avons également essayé d'identifier la nature du ou des facteurs cytotoxiques retrouvés dans le surnageant de cellules dendritiques infectées par le VIH. Nos résultats démontrent qu'une souche du VIH-1 démontrant un tropisme pour les lignées de lymphocytes T peut entrer dans les CDs thymiques par un mécanisme qui ne requiert pas la présence des récepteurs de surface CD4 et CXCR4 habituellement utilisés par cette souche virale. Ce mécanisme d'entrée est utilisé par les virus infectieux aussi bien que les virus inactivés à la chaleur. Cette entrée virale mène à la présence de la gp120 à la surface des cellules. Nos résultats démontrent également que la cytotoxicité associée au surnageant est dûe à une combinaison de facteurs. Au moins, deux cytokines, le FasL et le TNFa ainsi que la protéine virale gp120 semblent jouer un rôle dans cette cytotoxicité. Par analogie avec les observations faites in vitro, l'infection des CDs thymiques in vivo pourrait entraîner la présentation d'antigènes viraux au cours du processus de selection négative des thymocytes et contribuer à l'élimination des lymphocytes réagissant contre le VIH. Cette infection pourrait aussi occasionner le relargage de facteurs cytotoxiques pour les thymocytes. Ces effets pourraient ultimement entraîner une diminution de la réponse immunitaire dirigée contre le VIH ansi qu'une diminution dans le réapprovisionnement en lymphocytes T matures causant ainsi un progression plus rapide de la maladie et ce, plus spécialement chez l'enfant chez lequel le thymus joue un rôle crucial.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La candidose oropharyngée (COP) constitue l’infection fongique opportuniste la plus fréquente chez les patients infectés au VIH-1. Malgré la profonde immunosuppression causée par le VIH-1, l’infection à Candida albicans demeure confinée au niveau de la muqueuse buccale sans dissémination aux organes profonds. La souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMut exprimant le génome tronqué du VIH-1 présente, suite à l’inoculation orale de C. albicans, une COP chronique reproduisant fidèlement l’infection chez les patients séropositifs. Cette souris Tg a donc été utilisée afin de déterminer si les macrophages contribuent au confinement de C. albicans à la muqueuse buccale. Cette étude a permis de démontrer que i) les macrophages sont recrutés aux muqueuses buccale et gastrique en réponse au champignon malgré l’expression du transgène, ii) les macrophages de ces souris Tg présentent une polarisation vers un phénotype d’activation alternative et iii) la production de monoxyde d’azote par les macrophages des souris Tg n’est pas requise pour limiter la prolifération de Candida à la muqueuse buccale et pour restreindre sa dissémination aux organes profonds. Les macrophages ne semblent donc pas directement responsables de l’établissement de l’infection chronique à Candida chez la souris Tg CD4C/HIVMut. / Oropharyngeal candidiasis (OPC) is the most frequent opportunistic fungal infection among HIV-infected patients. Despite the profound immunosuppression caused by HIV-1, Candida albicans infection is limited to the oral epithelium and rarely disseminates to deep organs. The CD4C/HIVMut transgenic (Tg) mice, which expresses the truncated HIV-1 genome, developed a chronic OPC after oral inoculation with C. albicans that closely reproduces infection in seropositive patients. Here, we used this Tg mouse to investigate the contribution of macrophages in limiting candidiasis to the oral mucosa. This study shows that i) macrophages are recruited to the oral and gastric mucosa in response to C. albicans despite transgene expression, ii) the macrophages of this Tg mouse exhibited a polarization toward an alternatively activated phenotype and iii) nitric oxide production by these macrophages is dispensable for limiting chronic oral carriage and for preventing systemic dissemination of the fungi in these Tg mice. Overall, these result indicate that macrophage do not directly determine the susceptibility to chronic carriage of Candida in these CD4C/HIVMut Tg mice.

Cryptococcus neoformans var. grubii est responsable de la majeure partie des infections au Cryptococcus chez les individus infectés au VIH-1. Cryptococcus gattii infecte généralement les personnes immunocompétentes. Afin de comprendre les mécanismes responsables de la susceptibilité différentielle de ces espèces lors de l’infection au VIH-1, nous avons établi et caractérisé un modèle novateur de la cryptococcose chez des souris transgéniques (Tg) CD4C/HIVMutA exprimant des gènes du VIH-1, et qui développent une maladie similaire au SIDA. Les objectifs sont de démontrer une différence significative au niveau de la survie, de la réponse inflammatoire et du recrutement cellulaire pulmonaire en fonction de la présence du transgène et de l’espèce de Cryptococcus inoculée. Des analyses de survie, d’histopathologie et de cytométrie en flux sur les populations cellulaires pulmonaires ont été effectuées. Les souris Tg infectées avec C. neoformans H99 ou C23 ont démontré une survie réduite et une augmentation de la dissémination comparativement aux souris non-Tg, contrairement aux souris Tg infectées au C. gattii R265 ou R272. L’examen histopathologique des poumons de souris Tg infectées au H99 a montré une faible réponse inflammatoire, contrairement aux souris non-Tg. Pour la souche R265, il y avait une très faible réponse inflammatoire chez les deux types de souris. Enfin, l’étude des populations cellulaires du poumon a révélé chez les souris Tg une augmentation des pourcentages de macrophages interstitiels et de cellules polymorphonucléaires, ainsi qu’une diminution des lymphocytes T CD4+ et CD8+, indépendamment de l’infection au Cryptococcus. Ce modèle novateur représente donc un outil très pertinent pour l’étude de l’immunopathogenèse de la cryptococcose dans le contexte du VIH. / Cryptococcus neoformans var. grubii is the most frequent cause of AIDS-associated cyptococcosis worldwide, in sharp contrast to Cryptococcus gattii which usually infects immunocompetent individuals. To understand the mechanisms which cause differential susceptibility to these cryptococcal species in HIV infection, we established and characterized a novel model of cryptococcosis in CD4C/HIVMutA transgenic (Tg) mice expressing HIV-1 gene products and developing an AIDS-like disease. The objectives are to demonstrate significant differences in survival, inflammatory response and lung cell recruitment in Tg mice compared to non-Tg mice when inoculated with different species of Cryptococcus. Tg mice infected with C. neoformans strains H99 or C23 consistently displayed reduced survival and an increase of systemic dissemination compared to non-Tg mice, in contrast with Tg mice infected with C. gattii strains R265 or R272. Histopathologic examination of lungs of Tg mice infected with H99 showed a minimal inflammatory cell response, in contrast with the non-Tg mice infected with H99. In the case of R265, both types of mice failed to induce a strong inflammatory response. Finally, expression of the HIV-1 transgene increased the percentage of pulmonary interstitial macrophages and polymorphonuclear cells, while reducing CD4+ and CD8+ T-lymphocytes, independently of cryptococcal infection. This model therefore provides a powerful new tool to further investigate the immunopathogenesis of cryptococcosis in the specific context of HIV-infection.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.